Α乳清蛋白组合物.pdf

本发明涉及包含单体α-乳清蛋白复合物，优选地包含LAC的药用组合物，LAC为α-乳清蛋白与具有选择性细胞毒活性的脂肪酸或脂质的活性复合物。本发明的组合物包含小量的寡聚体/多聚体α-乳清蛋白复合物，复合物优选地为LAC。基于α-乳清蛋白复合物，优选地为基于LAC的组合物的选择性细胞毒性，这样的组合物适用于制备用于疗法的药物。包含单体LAC的药物由于选择性细胞毒活性用于治疗细菌和病毒感染，并且尤其是用于治疗癌症。本申请进一步涉及生产包含单体α-乳清蛋白复合物，优选地包含LAC的具有细胞毒活性的组合物的方法。

1.  一种药用组合物，其包含α-乳清蛋白与脂肪酸或脂质的单体α-乳清蛋白复合物，所述α-乳清蛋白为牛α-乳清蛋白或其功能等价物，其中组合物包含至少95％重量的单体α-乳清蛋白。

2.  权利要求1的组合物，其中组合物包含至少98％重量的单体α-乳清蛋白。

3.  权利要求1的组合物，其中组合物中多聚体或寡聚体α-乳清蛋白的量低于通过方法例如PAGE和免疫印迹法的检测水平。

4.  权利要求1的组合物，其中测定为LD50的细胞毒活性少于0.1mg/ml。

5.  权利要求1的组合物，其中测定为LD50的细胞毒活性少于0.04mg/ml。

6.  权利要求1的组合物，其中脂肪酸或脂质为选自C16:1:6顺式和反式、C16:1:9顺式和反式、C16:1:11顺式和反式，C18:1:6顺式或trans、C18:1:9顺式和反式、C18:1:11顺式和反式、C18:1:13顺式和反式、C20:1:9顺式和反式、C20:1:11顺式和反式、C20:1:13顺式和反式的单-饱和酸。

7.  权利要求1的组合物，其中功能等价物的至少70％与牛α-乳清蛋白相同。

8.  权利要求1的组合物，其中功能等价物包含至少40个氨基酸的牛α-乳清蛋白的至少一个连续序列。

9.  权利要求1的组合物，其中功能等价物包含选自牛α-乳清蛋白的氨基酸4-8、34-38、48-58、75-88、91-97和氨基酸103-121的牛α-乳清蛋白的至少两个氨基酸节段序列。

10.  权利要求1的组合物，其中α-乳清蛋白的功能等价物选自马、羊、牛、骆驼和猪α-乳清蛋白。

11.  权利要求1的组合物，其中α-乳清蛋白为牛α-乳清蛋白。

12.  权利要求1的组合物，其中蛋白质浓度大于5mg/ml。

13.  一种产生包含α-乳清蛋白与脂肪酸或脂质的单体α-乳清蛋白复合物的药用组合物的方法，所述α-乳清蛋白为牛α-乳清蛋白或其功能等价物，其中组合物包含至少95％重量的单体α-乳清蛋白，方法包括以下步骤：
a.得到包含至少95％重量的单体α-乳清蛋白的α-乳清蛋白组合物，
b.通过以下步骤将所述α-乳清蛋白转化为α-乳清蛋白复合物
i.自所述α-乳清蛋白释放钙和
ii.使脂肪酸或脂质结合于所述α-乳清蛋白，和
c.纯化α-乳清蛋白复合物。

14.  包含α-乳清蛋白与脂肪酸或脂质的单体α-乳清蛋白复合物的组合物在制备药物中的用途，所述α-乳清蛋白为牛α-乳清蛋白或其功能等价物，其中组合物包含至少95％重量的单体α-乳清蛋白。

15.  权利要求14的用途，所述用途为治疗呼吸道感染。

16.  权利要求14的用途，所述用途为治疗疣。

17.  权利要求14的用途，所述用途为治疗乳头状瘤。

18.  权利要求14的用途，所述用途为治疗癌症。

19.  权利要求14的用途，所述用途为治疗膀胱癌。

20.  权利要求14的用途，所述用途为抑制血管生成。

21.  一种治疗方法，其包括给予包含以下成分的药物
i.包含α-乳清蛋白与脂肪酸或脂质的单体α-乳清蛋白复合物的组合物，所述α-乳清蛋白为牛α-乳清蛋白或其功能等价物，其中组合物包含至少95％重量的单体α-乳清蛋白和
ii.药用赋形剂。

22.  一种组合物，其包含α-乳清蛋白与脂肪酸或脂质的单体α-乳清蛋白复合物，所述α-乳清蛋白为牛α-乳清蛋白或其功能等价物，其中组合物包含至少95％重量的单体α-乳清蛋白。

α-乳清蛋白组合物
在所述申请或本申请中引用的所有专利和非专利参考文献在此也通过参照全部结合到本文中。
发明领域
本发明涉及包含单体α-乳清蛋白复合物，优选地包含LAC的药用组合物，LAC为α-乳清蛋白与具有选择性细胞毒活性的脂肪酸或脂质的活性复合物。本发明的组合物包含小量的寡聚体/多聚体α-乳清蛋白复合物，复合物优选地为LAC。基于α-乳清蛋白复合物，优选地为基于LAC的组合物的选择性细胞毒性，这样的组合物适用于制备用于疗法的药物。包含单体LAC的药物由于选择性细胞毒活性而用于治疗细菌和病毒感染，并且尤其是用于治疗癌症。
本申请进一步涉及生产包含单体α-乳清蛋白复合物，优选地包含具有细胞毒活性的LAC的组合物的方法。
发明背景
单体α-乳清蛋白(LA)为母乳乳清中最丰富的蛋白质。在许多哺乳动物种群的成熟单体α-乳清蛋白包含123个氨基酸残基(14.2kDa)。人、牛、马、羊(caprine)和骆驼(camelide)α-乳清蛋白都包含123个氨基酸残基，而猪α-乳清蛋白包含122个氨基。人、牛、羊和猪α-乳清蛋白也包含19个氨基酸前导序列。该14kDa蛋白质已被广泛表征并且晶体结构已被解析。
α-乳清蛋白的晶体结构已经揭示出蛋白质由4个α-螺旋和1个三股β-片层组成，后者存在于蛋白质的C-末端。主α-螺旋域包含氨基酸5-11、23-34、86-98及短α-螺旋片段；氨基酸18-20、115-118。β-域含有由氨基酸40-50和短76-82螺旋组成的三股反平行β-片层。
α-乳清蛋白为金属蛋白质并且包含高亲和性Ca²⁺结合部位以及几个锌结合部位。高亲和性Ca²⁺结合部位跨越氨基酸残基77-89。具体地讲，残基79、82、84、87和88看来似乎与Ca²⁺结合有关(Permyakov等，α-乳清蛋白：结构与功能(α-Lactalbumin：structure and function).FEBS Letters 473(2000)269-274.)。α-乳清蛋白结合其它生理学上有意义的阳离子例如Mg²⁺、Mn²⁺、Na⁺和K⁺，这些离子可与Ca²⁺竞争高亲和性结合部位。
天然单体为乳糖合酶复合物的调节亚基并且改变半乳糖基转移酶自N-乙酰葡糖胺至葡萄糖的受体特异性，伴随乳糖的随后合成。
已经显示α-乳清蛋白与脂肪酸或脂质的多聚体复合物可具有细胞杀伤能力。来自含有寡聚体复合物的母乳的组分被称作多聚体α-乳清蛋白或者MAL或HAM-LET(人α-乳清蛋白使肿瘤细胞致死)并且据报道具有与单体形式不同的生物学性能。它是一种选择性地在肿瘤细胞而不是在健康的分化细胞体外诱导细胞凋亡的分子复合体。
多聚体LA的诱导细胞凋亡活性被意外发现。在关于母乳对细菌粘附作用的研究期间，意外地发现母乳在转化和非转化的未成熟细胞系诱导细胞凋亡。母乳的诱导细胞凋亡活性与通过在低pH下沉淀并通过离子交换层析纯化，作为1M NaCl洗脱后的单峰得到的母乳酪蛋白组分分离。洗脱液经光谱分析显示含有以apo-样构型存在的部分未折叠态α-乳清蛋白(M.Svensson等，(1999)J Biol Chem，274，6388-96)，伴随天然样二级结构，但是没有侧链的特异性三级堆积(M.Svensson等，(1999)J Biol Chem，274，6388-96)。在诱导细胞凋亡与折叠变化之间的连接通过天然α-乳清蛋白蓄意转化为细胞凋亡诱导形式得到证实(M.Svensson等，(2000)Proc Natl Acad Sci USA，97，4221-6)。HAMLET被显示结合于肿瘤细胞的表面，转移进入细胞质中并在细胞核中蓄积，其中它引起DNA断裂(M.Svensson等，(2000)Proc Natl AcadSci USA，97，4221-6)。
据报导寡聚体复合物在抗菌(WO96/04929)和癌症治疗(A.Hakansson等，Proc.Natl.Acad.Sci USA，(1995)92，8064-8068)两个领域具有治疗用途。具体地讲，寡聚体形式诱导癌细胞和未成熟细胞而不是健康细胞中的程序性细胞死亡。这些观察结果提示蛋白质在构象转换后获得新的生物学性能。
已知α-乳清蛋白当暴露于低pH时经历构象转换。A态或熔球态具有天然二级结构，但是比天然状态较少很好地定义三级结构。类似状态的α-乳清蛋白也可在中性pH下、在除去紧密结合的Ca²⁺离子、还原二硫键时或在升高的温度下形成。
也已经发现其它试剂和具体地说是脂质例如油酸用于将人α-乳清蛋白转化为HAMLET。具体地讲，先前已经报导需要用油酸(C18:1:9顺式)生产HAMLET(M.Svensson等，(2000)Proc Natl Acad Sci USA，97，4221-6)。
Ca²⁺结合于单一非常高亲和性Ca²⁺结合部位对于蛋白质保持天然构型是重要的。高亲和性Ca²⁺结合部位在许多哺乳动物种类包括人、牛、马、猪、羊和骆驼的α-乳清蛋白是100％保守型的。连接Ca²⁺的七分之五的氧由位点82、87和88的Asp残基的侧链羧酸酯和Lys 79与Asp 84的羰基氧提供，并且两个水分子供给剩余的配体。所结合的Ca²⁺使α-螺旋区和板非常接近，并且两个二硫键位于Ca²⁺结合部位的侧面，这使分子的该部分相当不易弯曲。结合其它阳离子例如Mg²⁺、Mn²⁺、Na⁺和K⁺也在α-乳清蛋白引起构型变化，尽管这些变化比起对于结合Ca²⁺更小。
先前已经发现将人α-乳清蛋白转化为具有诱导细胞凋亡活性的LAC要求构象或折叠变化、存在脂肪酸或脂质和寡聚化两者。构象或折叠变化便利地受到除去钙离子或采用没有钙离子的变体的影响。然而，一旦变化已经发生，存在钙或功能性钙结合部位不造成任何活性丧失。据报导寡聚体复合物在抗菌(WO96/04929)和癌症治疗(A.Hakansson等，Proc.Natl.Acad.Sci USA，(1995)92，8064-8068)两个领域具有治疗用途。具体地讲，寡聚体形式的LAC可诱导癌细胞和未成熟细胞而不是诱导(或仅仅是低程度诱导)成熟、健康细胞中的程序性细胞死亡。这些观察结果提示蛋白质在与脂肪酸或脂质形成活性复合物时获得新的生物学性能。因此，试剂例如脂肪酸或脂质，如油酸，可用于将LA转化为LAC。
先前已经认为抗癌细胞和未成熟细胞的细胞毒活性仅为多聚体人LAC的特征(A.Hakansson等，Proc.Natl.Acad.Sci USA，(1995)92，8064-8068，M.Svensson等，JBC(1999)274，6388-6396，A.Hakansson等.Molecular Microbiology(2000)35，589-600)。采用SDS-PAGE和MALDI-MS，Hakansson等(2000)分析了包含单体和寡聚体LAC两者的组合物。确定活性细胞毒组分包含寡聚体形式的LAC并且LAC的细胞杀伤活性仅归因于寡聚体形式(A.Hakansson等.MolecularMicrobiology(2000)35，589-600)。
Xu等(2005)在两篇单独的论文中显示，市售可得到的牛α-乳清蛋白和自牛乳纯化的α-乳清蛋白可被转化为显示潜在的细胞增殖抑制作用和可诱导细胞死亡的形式(Xu等，Biosci.Biotechnol.Biochem.(2005)69，1082-1089和Xu等，Biosci.Biotechnol.Biochem.(2005)69，1189-1192)。仅有多聚体形式的α-乳清蛋白呈现这些细胞毒生物活性；单体形式不呈现任何细胞杀伤活性(Xu等，Biosci.Biotechnol.Biochem.(2005)69，1082-1089和Xu等，Biosci.Biotechnol.Biochem.(2005)69，1189-1192)。
据报导寡聚体复合物在抗菌(WO96/04929)和癌症治疗(A.Hakansson等，Proc.Natl.Acad.Sci USA，(1995)92，8064-8068)两个领域具有治疗用途。具体地讲，寡聚体形式的LAC可诱导癌细胞和未成熟细胞而不是诱导(或仅仅是低程度诱导)成熟、健康细胞中的程序性细胞死亡。这些观察结果提示蛋白质在与脂肪酸或脂质形成活性复合物时获得新的生物学性能。因此，试剂例如脂肪酸或脂质，如油酸，可用于将LA转化为LAC。
发明概述
本发明涉及这样的发现，即单体LAC可包含与多聚体LAC相似的生物活性，包括选择性细胞毒活性，例如对癌细胞和未成熟细胞的细胞毒活性。
本发明的一个方面涉及包含单体LAC的药用组合物，LAC为α-乳清蛋白与脂肪酸或脂质的复合物，所述α-乳清蛋白为人α-乳清蛋白或牛α-乳清蛋白或其功能等价物，其中组合物包含至少50％重量的单体LAC。
优选地单体LAC组合物具有选择性细胞毒活性，其中作为LD50测量的效力少于0.1mg/ml。
在一个优选的实施方案中，α-乳清蛋白为由SEQ ID NO 1标示的牛α-乳清蛋白。在另一个实施方案中，α-乳清蛋白为由SEQ ID NO 2标示的人α-乳清蛋白。
本发明的另一个方面涉及生产包含单体LAC的组合物的方法，LAC为α-乳清蛋白与脂肪酸或脂质的复合物，所述α-乳清蛋白为SEQID NO：1或SEQ ID NO：2的α-乳清蛋白或其功能等价物，其包含至少70％同一性的序列，其中组合物包含至少50％重量的单体LAC，该方法包括以下步骤：
a.得到包含至少95％重量的单体α-乳清蛋白的α-乳清蛋白组合物，
b.通过以下步骤将所述α-乳清蛋白转化为LAC
i.自所述α-乳清蛋白释放钙和
ii.使脂肪酸或脂质结合于所述α-乳清蛋白，和
c.纯化LAC。
在其它同等优选的实施方案中，LAC可按照在丹麦专利申请PA20070693的实施例3和4中描述的方法产生。
在还一个方面，本发明涉及包含单体LAC的组合物用于制备药物的用途，LAC为α-乳清蛋白与脂肪酸或脂质的复合物，所述α-乳清蛋白为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的α-乳清蛋白或其功能等价物，其包含至少70％同一性的序列，其中组合物包含至少50％重量的单体LAC。
本发明的又一方面涉及治疗方法，其包括给予包含以下成分的药物：
i.包含单体LAC的药用组合物，LAC为α-乳清蛋白LA与脂肪酸或脂质的复合物，所述α-乳清蛋白具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或其功能等价物，其包含至少70％同一性的序列，其中组合物包含至少50％重量的单体LAC和
ii.药用赋形剂。
当在此使用时：
如在此使用的术语“α-乳清蛋白”具有与多肽三级结构无关的α-乳清蛋白多肽的含义。牛和人α-乳清蛋白的序列分别由SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2定义。1A显示人和牛α-乳清蛋白的序列排比。因此人α-乳清蛋白为具有任何三级结构的序列SEQ ID NO 2的任何多肽。类似地，牛α-乳清蛋白为具有任何三级结构的序列SEQ ID NO 1的任何多肽。
如在此使用的术语“LA”具有优选地以天然三级结构存在和优选地具有结合于高亲和性钙结合部位的钙的α-乳清蛋白多肽的含义。LA不为与任何脂肪酸或脂质的复合物并且优选地不具有细胞杀伤能力。如在此使用的术语“hLA”和“bLA”分别具有人LA和牛LA的含义。
A-态α-乳清蛋白具有例如当在低pH下溶解时采用的部分折叠态α-乳清蛋白的含义，而apo-态为例如当在中性pH和低盐浓度下除去蛋白质结合的钙时采用的部分折叠态α-乳清蛋白。
如在此使用的术语“LAC”具有α-乳清蛋白与脂肪酸或脂质的活性复合物的含义。所谓“活性”指的是复合物具有细胞凋亡诱导能力(在下文“α-乳清蛋白”部分可见更多细节)。如在此使用的术语hLAC和bLAC分别具有人LAC和牛LAC的含义。优选地，LAC具有在70μl中少于15μg/100.000个细胞的细胞杀伤活性。在一个优选的实施方案中，LD50为在70μl中少于10μg/100.000个细胞。本发明的α-乳清蛋白组合物更优选具有测量为少于5μg/100.000个细胞的LD50的细胞毒活性。最优选的是其中作为LD50测量的细胞毒活性在70μl中为1-5μg/100.000个细胞的组合物。
发明详述
在此申请人描述了包含α-乳清蛋白复合物，优选地包含与多聚体或寡聚体LAC的含量相比较具有占优势含量的单体LAC的LAC的组合物。
单体α-乳清蛋白具有约14kDa的分子量。例如当单体通过离子交换柱时，α-乳清蛋白的单体可多聚化或寡聚化以形成更高分子量的分子(therapy(A.Hakansson等，Proc.Natl.Acad.Sci USA，(1995)92，8064-8068)。这些多聚体形式被证明具有选择性的细胞毒活性(A.Hakansson等，Proc.Natl.Acad.Sci USA，(1995)92，8064-8068)。
类似地，本发明的单体α-乳清蛋白复合物优选地由单体α-乳清蛋白和脂质或脂肪酸组成。
通常，本发明的单体α-乳清蛋白分子仅由一个α-乳清蛋白多肽，例如以下描述的任何α-乳清蛋白多肽。优选地，本发明的单体α-乳清蛋白分子具有14-15kDa范围内的分子量。通常，α-乳清蛋白的二聚体恰好包含两个α-乳清蛋白多肽，例如以下描述的任何α-乳清蛋白多肽。优选地，α-乳清蛋白的二聚体具有28-30kDa范围内的分子量。通常，α-乳清蛋白的三聚体恰好包含三个α-乳清蛋白多肽，例如以下描述的任何一种α-乳清蛋白多肽。优选地，三聚体具有42-45kDa范围内的分子量。类似的情形适用于更高的寡聚体。
LAC单体和寡聚体的含量通过重量，即蛋白质复合物的质量计算。在其中α-乳清蛋白分子的相对含量如下的实例中，包含6个单体α-乳清蛋白、1个二聚体α-乳清蛋白和1个三聚体α-乳清蛋白的组合物中，单体α-乳清蛋白的含量为6x14/(6x14+2x14+3x14)x100％＝84/154x100％＝54.5％。
本发明的α-乳清蛋白组合物，优选LAC，包含多于50％(重量％)单体LAC，例如包含多于60％，例如多于70％，优选地多于80％或多于90％重量的单体LAC，优选地多于95％重量的单体LAC。
在尤其优选的实施方案中，组合物包含多于96％(重量％)的单体α-乳清蛋白(优选LAC)，更优选地包含多于97％或多于98％，最优选地包含多于99％的单体α-乳清蛋白(优选LAC)，因此组合物优选地为基本上纯的单体α-乳清蛋白，优选地LAC组合物包含小量的多聚体或寡聚体α-乳清蛋白(优选LAC)。在实施例1中描述并通过图4B和4表征的α-乳清蛋白复合物组合物显示了其中多聚体或寡聚体α-乳清蛋白(优选LAC)的含量不能通过尺寸排阻层析(SEC)或通过蛋白质印迹法检测的组合物。
优选的是组合物中多聚体或寡聚体α-乳清蛋白(优选LAC)的量低于通过方法例如PAGE或免疫印迹法检测的水平。
本发明的一个方面涉及包含单体α-乳清蛋白(优选LAC)的组合物，LAC为α-乳清蛋白与脂肪酸或脂质的复合物，所述α-乳清蛋白为牛或人α-乳清蛋白或其功能等价物，其中组合物包含至少95％重量的单体LAC。在一个优选的实施方案中，所述α-乳清蛋白为牛α-乳清蛋白。
野生型牛α-乳清蛋白，即天然存在的非突变型蛋白质形式被标示为SEQ ID NO：1和野生型人α-乳清蛋白，即天然存在的非突变型蛋白质形式被标示为SEQ ID NO：2。本发明也包括α-乳清蛋白的功能同系物，后者包含与SEQ ID NO：1的至少70％的序列同一性或者包含与SEQ ID NO：2的至少70％的序列同一性，以及α-乳清蛋白的功能同系物与脂肪酸或脂质的活性复合物。包括前导序列的野生型牛α-乳清蛋白，即包含19个氨基酸前导序列的天然存在的非突变型蛋白质被标示为SEQ ID NO：3，而包括前导序列的野生型人α-乳清蛋白，即包含19个氨基酸前导序列的天然存在的非突变型蛋白质被标示为SEQ ID NO：4。
功能同系物可被定义为序列不同于野生型α-乳清蛋白例如野生型人α-乳清蛋白或野生型牛乳清蛋白，但是功能上仍然是胜任的α-乳清蛋白。功能同系物可为野生型α-乳清蛋白的突变型或另一种可供选择的剪接变体。在另一方面，α-乳清蛋白的功能同系物如下文所述定义。功能同系物可为(但不限于)α-乳清蛋白与一种或多种突变型和/或一种或多种先体外后体内(ex vivo)引入的序列缺失和/或添加的重组型。
在本发明的优选实施方案中，α-乳清蛋白可为人或牛α-乳清蛋白，其中α-乳清蛋白为天然存在的乳α-乳清蛋白或者α-乳清蛋白已被重组产生。
α-乳清蛋白
α-乳清蛋白如在背景部分中描述的那样在乳汁中含量高度丰富。来自不同哺乳动物种类的α-乳清蛋白的序列是完全保守的。来自啮齿类动物(小鼠、大鼠、兔、豚鼠)、灵长类、猫和狗的序列显示高度的同一性。来自马、羊、牛、猪和人的氨基酸序列显示大约75-95％的同一性(Pettersson，Jenny，BBRC 345(2006)260-270)。
来自任何种类，优选地来自任何哺乳动物种类的α-乳清蛋白可按照本发明用于产生单体α-乳清蛋白，优选地为产生LAC。对于本发明，来自不同于牛或人种类的任何种类的α-乳清蛋白被认为是牛或人α-乳清蛋白的功能等价物(参见以下)。α-乳清蛋白与进化有关并且共有约35-40％的序列同源性以及4个二硫键与溶菌酶C的位置。
在本发明的一个实施方案中，牛或人α-乳清蛋白的功能等价物选自马、羊、牛、骆驼和猪。在一个最优选的实施方案中，α-乳清蛋白为牛。图1B显示牛和人α-乳清蛋白的蛋白质序列的对比。
人野生型α-乳清蛋白被标示为SEQ ID NO：2和牛野生型α-乳清蛋白被标记为SEQ ID NO：1。在本发明一个优选的实施方案中，α-乳清蛋白为牛α-乳清蛋白和在本发明另一个实施方案中，α-乳清蛋白为人α-乳清蛋白。在一个更优选的实施方案中，α-乳清蛋白为如由SEQID NO：1标示的牛野生型α-乳清蛋白和在本发明另一个优选的实施方案中，α-乳清蛋白为如由SEQ ID NO：2标示的人α-乳清蛋白。
在另一个优选的实施方案中，α-乳清蛋白为重组野生型人α-乳清蛋白和在本发明一个同等优选的实施方案中，α-乳清蛋白为重组野生型牛α-乳清蛋白。α-乳清蛋白变体包括本领域技术人员已知的任何形式的α-乳清蛋白及其任何功能同系物。例如，α-乳清蛋白变体包括剪接变体和等位变体及单核苷酸多晶型。
α-乳清蛋白的功能同系物可为呈现与SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2的至少一些序列同一性，并且当与脂肪酸或脂质复合时与LAC共有一种或多种功能，例如细胞凋亡诱导能力的任何蛋白质(下文可见更多细节)。
LAC的细胞凋亡诱导能力例如可如丹麦专利申请PA 2007 0693或如在实施例：单体α-乳清蛋白组合物的细胞毒性中描述的那样测量。α-乳清蛋白的DNA断裂能力可如在(Pettersson，Jenny，BBRC 345(2006)260-270)中描述的那样，采用305nm UV-光源，用溴化乙锭观察。其为野生型LAC功能的α-乳清蛋白的组蛋白结合活性可如在丹麦专利申请PA 2007 0693中所述测量。
用于本发明的α-乳清蛋白可来源于任何合适的来源，例如α-乳清蛋白可为天然存在的α-乳清蛋白或者α-乳清蛋白可为如在下文详细描述的重组产生的α-乳清蛋白。在一个优选的实施方案中，α-乳清蛋白为自母乳纯化的人α-乳清蛋白和在另一个同等优选的实施方案中，α-乳清蛋白为自牛乳纯化的牛α-乳清蛋白。在一个优选的实施方案中，α-乳清蛋白为重组牛α-乳清蛋白。在一个更优选的实施方案中，α-乳清蛋白为重组牛野生型α-乳清蛋白。
α-乳清蛋白的功能等价物
在本发明一个优选的实施方案中，α-乳清蛋白为牛α-乳清蛋白，在一个更优选的实施方案中，α-乳清蛋白为由SEQ ID NO：1标示的牛野生型α-乳清蛋白。在一个非常优选的实施方案中，α-乳清蛋白为重组野生型人α-乳清蛋白。在本发明另一个优选的实施方案中，α-乳清蛋白为人α-乳清蛋白，在一个更优选的实施方案中，α-乳清蛋白为由SEQ ID NO：2标示的人野生型α-乳清蛋白。在一个非常优选的实施方案中，α-乳清蛋白为重组野生型牛α-乳清蛋白。
从以上显而易见的是牛或人α-乳清蛋白序列的合理数目的修饰或改变不干扰本发明的α-乳清蛋白分子的活性。这样的α-乳清蛋白分子在此称作牛或人α-乳清蛋白的功能等价物，并可为例如如在下文描述的天然牛或人α-乳清蛋白的变体和片断。
α-乳清蛋白的功能同系物可为呈现与SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.2的至少一些序列同一性并与α-乳清蛋白共有一种或多种以下功能的任何蛋白质，例如：
·在乳糖合成中起辅因子作用
·当转化为LAC时呈现细胞杀伤活性
·当转化为LAC时诱导细胞凋亡的能力
·当转化为LAC时的组蛋白结合活性
几种方法可用于确定LAC是否具有细胞杀伤活性。
几种方法可用于确定LAC是否具有组蛋白结合活性。
优选地，功能同系物呈现与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2的至少一些序列同一性并具有细胞杀伤能力。
优选地，例如通过序列比对评价的不同的密切相关种类的α-乳清蛋白之间的进化保存性可用于查明进化压对个体残基的作用程度。优选地，α-乳清蛋白序列在其中例如α-乳清蛋白功能被保存但是不限于包括啮齿类、猴和猿的哺乳动物的种类之间进行比较。高选择性压力下的残基更可能代表比在种类之间变化的残基不易于被置换的必需氨基酸。例如，采用来自EBML-EBI的ClustalW，比较猪α-乳清蛋白和人α-乳清蛋白(图1A)可进行这样的比对。从以上显而易见的是牛或人α-乳清蛋白序列的合理数目的修饰或改变不干扰本发明α-乳清蛋白分子的活性。这样的α-乳清蛋白分子在此称作牛或人α-乳清蛋白的功能等价物，并可为例如如在下文描述的天然牛或人α-乳清蛋白的变体和片断。
可使用例如功能试验以确定α-乳清蛋白功能是否被保存。本领域技术人员已知的功能试验可用于证明未复合α-乳清蛋白的功能保存。这样的功能试验测定α-乳清蛋白在乳糖生产中起乳糖合酶复合物调节亚基作用的能力。
本领域技术人员已知的功能试验可用于证明以与脂肪酸或脂质的复合物形式存在的α-乳清蛋白的功能保存。本领域技术人员已知的用于评价α-乳清蛋白功能的功能试验包括(但不限于)以上和在丹麦专利申请PA 2007 0693中描述的实验。
如在此使用的表达“变体”指与碱性蛋白同系的多肽或蛋白质，其适当地为牛或人α-乳清蛋白，但是不同于其从中产生的其中序列中的一个或多个氨基酸被其它氨基酸取代的碱基序列。
氨基酸置换可被认为是“保守的”，其中氨基酸用具有广泛相似性能的不同氨基酸替代。非保守性置换为其中氨基酸用不同类型的氨基酸替代。广义上说，较少有未改变多肽生物活性的非保守性置换是可能的。图1A显示牛、人、马、羊、牛、骆驼和猪α-乳清蛋白的蛋白序列比对，其中相同残基(“*”)和保守性(“:”)与半保守性(“.”)置换的残基被标明。
因此，在本发明的一个实施方案中，优选α-乳清蛋白的功能同系物包含具有与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2高度序列同一性的序列，其中没有一个图1A中标明“*”的保守残基被置换。在该实施方案中进一步优选的是图1A中标明“:”的残基未被置换或仅被保守性置换所置换，更优选用如下文定义的具有高度相似性的氨基酸置换。
因此，在一个实施方案中，优选牛α-乳清蛋白的功能同系物具有与SEQ ID NO：1高度序列同一性的序列，其中残基E1、L3、E7、V8、L15、Y18、V21、S22、V27、Q39、A40、I41、N44、I59、K62、Q65、I85、M90、N102、S112、D116、K122未被置换或仅被保守性置换所置换，更优选仅用如下文定义的具有高度相似性的氨基酸置换。
本发明更进一步优选的是α-乳清蛋白的功能同系物具有与SEQID NO：1或SEQ ID NO：2高度序列同一性的序列，其中图1A中标明“.”的残基未被置换或仅被保守性置换，例如用如下文定义的具有更低程度或高度相似性的氨基酸置换。因此，优选牛α-乳清蛋白的功能同系物具有与SEQ ID NO：1高度序列同一性的序列，其中残基D14、K16、G17、G20、P24、S47、N56、D63、D64、N74、V92和A109未被置换或仅被保守性置换，例如用如下文定义的具有更低程度或高度相似性的氨基酸置换。
也包含在本发明中的是α-乳清蛋白的功能同系物可具有与SEQID NO：1或SEQ ID NO：2高度序列同一性的序列，其中图1A中未标记残基可用任何其它的氨基酸置换。因此，人α-乳清蛋白的功能同系物可具有与SEQ ID NO：1高度序列同一性的序列，其中残基F9、R10、E11、G19、W25、T29、T30、T33、Q43、D46、T48、N66、P67、H68、S70、I89、K98、V99、L118和L123未被置换或用任何其它的氨基酸置换。
本领域技术人员将认识到如何制备和评价一个氨基酸置换具有一个或多个共有化学和/或物理特性的另一个氨基酸的‘保守性’氨基酸置换。保守性氨基酸置换不太可能影响蛋白质的功能性。氨基酸可按照共有特性分组。保守性氨基酸置换为预定氨基酸组中的一个氨基酸置换相同组中的另一个氨基酸，其中预定组中的氨基酸呈现相似或基本相似的特性。
保守性氨基酸置换涉及具有相似侧链的残基的可互换性。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的一组氨基酸为丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸为天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳族侧链的一组氨基酸为苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸为赖氨酸、精氨酸和组氨酸；以及具有含硫侧链的一组氨基酸为半胱氨酸和蛋氨酸。优选的保守性氨基酸置换组为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸，和天冬酰胺-谷氨酰胺。
在如在此应用的术语“保守性氨基酸置换”的含义中，一个氨基酸可置换下文表示的氨基酸组中的另一个氨基酸：
较低水平的相似性：
极性：
i)具有极性侧链的氨基酸(Asp、Glu、Lys、Arg、His、Asn、Gln、Ser、Thr、Tyr和Cys)
ii)具有非极性侧链的氨基酸(Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Pro和Met)
亲水性或疏水性：
iii)疏水性氨基酸(Ala、Cys、Gly、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Tyr、Val)
iv)亲水性氨基酸(Arg、Ser、Thr、Asn、Asp、Gln、Glu、His、Lys)
电荷：
v)中性氨基酸(Ala、Asn、Cys、Gln、Gly、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val)
vi)碱性氨基酸(Arg、His、Lys)
vii)酸性氨基酸(Asp、Glu)
高度相似性：
viii)酸性氨基酸及其酰胺(Gln、Asn、Glu、Asp)
ix)具有脂肪族侧链的氨基酸(Gly、Ala、Val、Leu，Ile)
x)具有芳族侧链的氨基酸(Phe、Tyr、Trp)
xi)具有碱性侧链的氨基酸(Lys、Arg、His)
xii)具有羟基侧链的氨基酸(Ser、Thr)
xiii)具有含硫侧链的氨基酸(Cys、Met)。
优选的保守性氨基酸置换组为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
因此，本发明的其变体或片断可在其序列或片断的相同变体中，或在其序列或片断的不同变体中，包含至少一个置换，例如相互独立引入的多个置换。
从以上概述显而易见的是其相同变体或片断可包含来自多于一组如上文定义的保守性氨基酸的多于一个保守性氨基酸置换。
除了20个标准氨基酸和2个特殊氨基酸，硒代半胱氨酸和吡咯赖氨酸(pyrrolysine)以外，存在巨大数目的体内未掺入到蛋白质中的“非标准氨基酸”。非标准氨基酸的实例包括含硫的牛磺酸和神经递质GABA与多巴胺。其它实例为羊毛硫氨酸、2-氨基异丁酸和脱氢丙氨酸。另外的非标准氨基酸为鸟氨酸和瓜氨酸。
非标准氨基酸通常通过修饰标准氨基酸形成。例如，通过将半胱氨酸脱羧可形成牛磺酸，而多巴胺自酪氨酸合成和羟脯氨酸通过翻译后修饰脯氨酸(通常在胶原蛋白中)制备。非天然氨基酸的实例为列于例如37C.F.R.部分1.822(b)(4)的那些，其全部通过参照结合到本文中。
在此描述的基本和非标准氨基酸残基两者可以“D”或“L”异构形式存在。
本发明的功能等价物被构思为可包括包含非标准氨基酸的任何氨基酸。在优选的实施方案中，功能等价物仅包含标准氨基酸。
基本和/或非标准氨基酸可通过肽键或非肽键连接。术语肽也包括通过如本领域已知的化学或酶催化的的反应引入的翻译后修饰。如果要求，这样的翻译后修饰可在分配前引入。如在此特别说明的氨基酸优选地以L-立体异构形式存在。可使用氨基酸类似物替代20种天然存在的氨基酸。几种这样的类似物是已知的，包括氟苯丙氨酸、正亮氨酸、铃兰氨酸、S-氨乙基半胱氨酸、4-甲基色氨酸等。
适当地，变体将与预定的牛α-乳清蛋白序列至少60％相同，优选至少70％相同并且因此，变体优选地具有至少75％序列同一性，例如至少80％序列同一性，例如至少85％序列同一性，例如至少90％序列同一性，例如至少91％序列同一性，例如至少91％序列同一性，例如至少92％序列同一性，例如至少93％序列同一性，例如至少94％序列同一性，例如至少95％序列同一性，例如至少96％序列同一性，例如至少97％序列同一性，例如至少98％序列同一性，例如至少99％序列同一性。
序列同一性可采用若干熟知的算法和应用若干不同的空位罚分(gap penalties)计算。序列同一性相对于全长SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2计算。在备选方法中，相对于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2计算，其中编码信号肽的序列不包括在内。不受理论束缚，预测信号肽包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的氨基酸1-24。任何序列比对工具，例如(但不限于)FASTA、BLAST或LALIGN，可用于寻找同系物和计算序列同一性。另外，合适时，任何通常已知的置换矩阵，例如(但不限于)PAM、BLOSSUM或PSSM矩阵，可用于寻找算法。
例如，PSSM(位置特异性分数矩阵)可通过PSI-BLAST程序应用。另外，采用一定范围的用于空位开放和延伸的罚分可实施序列比对。例如，BLAST算法可用于5-12范围内的空位开放罚分和1-2范围内的空位延伸罚分。
本发明范围内的功能同系物为与如用SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2标示的牛α-乳清蛋白或人α-乳清蛋白呈现一些序列同一性的多肽，优选地它们与t SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2具有高度序列同一性，例如功能同系物可与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2具有共有至少70％序列同一性的序列，优选地功能同系物具有至少75％的序列同一性，例如至少80％序列同一性，例如至少85％序列同一性，例如至少90％序列同一性，例如至少91％序列同一性，例如至少91％序列同一性，例如至少92％序列同一性，例如至少93％序列同一性，例如至少94％序列同一性，例如至少95％序列同一性，例如至少96％序列同一性，例如至少97％序列同一性，例如至少98％序列同一性，例如至少99％序列同一性。
功能等价物可进一步包括化学修饰例如遍在蛋白化(ubiquitination)、标示(例如用放射性核素、各种酶等)、聚乙二醇化(用聚乙二醇衍生)，或者通过正常地在人蛋白质中不存在的氨基酸例如鸟氨酸的嵌入(或者通过化学合成置换)。
除了在此描述的肽基化合物以外，可配制空间上相似的化合物以模拟肽结构的关键部分并且这样的化合物也可以相同方式用作本发明的肽。这可通过本领域技术人员已知的建模技术和化学设计达到。例如，酯化和其它烷基化可用于修饰例如二精氨酸肽骨架的氨基末端，以模拟四肽结构。应该理解所有这样的空间相似结构处于本发明的范围内。
N-末端烷基化和C-末端酯化的肽也包含在本发明的范围内。功能等价物也包括糖基化和用相同分子形成的共价或聚集共轭物，包括二聚体或不相关的化学部分。这样的功能等价物通过本领域已知的方法，将官能度连接于存在于片段的基团，包括N-和C-末端中的任何一个或两者来制备。
术语“其片段”可指给定氨基酸序列的任何部分。片段可包含多于一个来自全长蛋白质、连接在一起的部分。合适的片段可为缺失或添加突变体。添加至少一个氨基酸可为优选地添加2-250个氨基酸，例如10-20个氨基酸，例如20-30个氨基酸，例如40-50个氨基酸。片段可包括来自蛋白质的小区域或这些区域的组合。
合适的片段可为缺失或添加突变体。添加或缺失至少一个氨基酸可优选为添加或缺失2-250个氨基酸，例如10-20个氨基酸，例如20-30个氨基酸，例如40-50个氨基酸。缺失和/或添加可-相互独立地-为在序列中和/或序列的末端缺失和/或添加。
功能同系物可为如用SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2标示的α-乳清蛋白的共有至少70％的缺失突变体，并且因此功能同系物优选地具有至少75％的序列同一性，例如至少80％序列同一性，例如至少85％序列同一性，例如至少90％序列同一性，例如至少91％序列同一性，例如至少91％序列同一性，例如至少92％序列同一性，例如至少93％序列同一性，例如至少94％序列同一性，例如至少95％序列同一性，例如至少96％序列同一性，例如至少97％序列同一性，例如至少98％序列同一性，例如至少99％序列同一性。
缺失突变体适当地全长包含至少20或40个保守性氨基酸，并且更优选地包含至少80或100个保守性氨基酸。因此这样的片段可为如用SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2标示序列的，包含至少20个保守性氨基酸，例如至少30个保守性氨基酸，例如至少40个保守性氨基酸，例如至少50个保守性氨基酸，例如至少60个保守性氨基酸，例如至少70个保守性氨基酸，例如至少80个保守性氨基酸，例如至少90个保守性氨基酸，例如至少95个保守性氨基酸，例如至少100个保守性氨基酸，例如至少105个氨基酸，例如至少110个保守性氨基酸，例如至少115个保守性氨基酸，例如至少120个保守性氨基酸的更短序列，其中所述缺失突变体优选地与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2共有至少75％的序列同一性，例如至少80％序列同一性，例如至少85％序列同一性，例如至少90％序列同一性，例如至少91％序列同一性，例如至少91％序列同一性，例如至少92％序列同一性，例如至少93％序列同一性，例如至少94％序列同一性，例如至少95％序列同一性，例如至少96％序列同一性，例如至少97％序列同一性，例如至少98％序列同一性，例如99％序列同一性。
优选α-乳清蛋白的功能同系物包含至多500个，更优选地至多400个，甚至更优选地至多300个，还更优选地至多200个，例如至多175个，例如至多160个，例如至多150个氨基酸，例如至多142个氨基酸。
术语“其片段”可指给定氨基酸序列的任何部分。片段可包括多于一个来自全长蛋白质、连接在一起的部分。这些部分将适当地包含至少5个和优选地包含至少10个来自碱性序列的连续氨基酸。它们可包括来自蛋白质的小区域或这些区域的组合。
在本发明的一个实施方案中，α-乳清蛋白片段包含一个或多个氨基酸节段。节段可选自包含氨基酸5-11、23-34、86-98的主要α-螺旋域和短的α-螺旋节段；氨基酸18-20、115-118或来自β-域，β-域含有三股反平行片层：氨基酸40-50和短的76-82螺旋或钙结合域76-89或者这些域之间的任何节段：氨基酸1-4、12-17、21-22、35-39、51-76、82-84、99-114或119-123。优选地，α-乳清蛋白片段包含至少两个以上提及的节段，更优选地包含至少三个指定的节段，更优选包含四个或者最优选包含五或全部六个所提及的节段。
在人α-乳清蛋白中α和β域之间形成界面的区域由结构中的氨基酸35-39和83-87限定。因此，牛α-乳清蛋白类似的合适片断将包括这些区域，并且优选自天然蛋白质的氨基酸35-87的整个区域，例如自天然蛋白质的氨基酸20-100，例如自天然蛋白质的氨基酸10-110，例如自天然蛋白质的氨基酸5-115，例如自氨基酸1-123的整个区域。分子的该区域在牛和人蛋白质之间有差别，其中三个碱性氨基酸中的一个(R70)在牛α-乳清蛋白中变为S70，因此消除了一个潜在的配位侧链。
缺失和/或添加可-相互独立地-在序列中和/或在序列的末端缺失和/或添加。
高亲和性Ca²⁺结合部位在来自不同种类的α-乳清蛋白中是100％保守的(Acharya K.R.等，(1991)J Mol Bio3 221，5i1-581)，说明该功能对蛋白质的重要性。如在背景部分中描述的那样，其用5个不同的氨基酸和2个水分子配位。
在一个特殊的实施方案中，本发明变体为其中钙结合部位已被修饰以致于对钙的亲和性减少或不再有功能的变体。α-乳清蛋白中的钙结合部位用残基K79、D82、D84、D87和D88配位。因此通过例如除去更多个酸性残基中的一个来修饰这些残基可减少所述部位对钙的亲和性或者完全消除功能并且该类型的突变体为本发明的一个实施方案。在一个特殊的实施方案中，在蛋白质序列中的氨基酸87位的天冬氨酸残基被突变为非酸性残基，并且具体地讲是非极性或不带电的极性侧链。为了将突变蛋白质中的结构变形减至最小，D87也可用天冬酰胺(N)替代。因此用于本发明复合物的变体可为α-乳清蛋白的D87A和D87N变体或包含该突变的片段。
LAC看来好象在钙存在和不存在时是有活性的。对此的两种解释似乎是合理的。在第一种和最可能的情况中，LAC通过脂肪酸(参见以下)的伸展和结合略微紊乱的α-螺旋域形成。然后Ca²⁺-结合部位可保持与在脂肪酸不存在时相似的构型并且Ca²⁺可结合于那里。第二种可能性是Ca²⁺部位被破坏并且通过在LAC中产生新的Ca²⁺部位解释所观察到的Ca²⁺结合。脂肪酸的头基团可潜在地与氨基酸残基一起配位钙。
因此似乎Ca²⁺-结合部位不涉及α-乳清蛋白转变为细胞凋亡相关的构型并且与Ca²⁺结合于LAC有关的结构变化不妨碍生物功能。因此在一可供选择的实施方案中，通过包含如以上描述的氨基酸节段76-89保护Ca²⁺结合部位。
α-乳清蛋白复合物
本发明的α-乳清蛋白组合物包含含有SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2的牛或人α-乳清蛋白或其功能等价物与脂质或脂肪酸的α-乳清蛋白复合物(LAC)。
在本发明优选的实施方案中，α-乳清蛋白与脂肪酸复合。脂肪酸为通常具有长的未分支脂肪链的羧酸。因为脂肪酸的生物合成涉及乙酰基-CoA，其中乙酸单位含有两个C-原子，大多数天然脂肪酸具有4-80范围内的偶数个C原子的C原子。脂肪酸的脂肪链可为饱和或不饱和的。饱和脂肪酸用氢饱和并且因此没有双键。不饱和脂肪酸可为具有一个双键的单不饱和(或MUFAs)或者具有2个或更多个双键的多不饱和(PUFAs)的。本发明的脂肪酸可为饱和脂肪酸或不饱和脂肪酸。
在本发明优选的实施方案中，脂肪酸选自C4-C30，例如C6-C28，例如C8-C26，例如C10-C24，例如C12-C22，例如C14-C20，例如C16-C20，例如选自C16、C17、C18和C20，例如选自C16、C18和C20。
脂肪酸通常用链的C-原子数和双键的数目、位置与构型描述。例如，硬脂酸具有18C-原子的链和没有双键并且可描述为C18:0，油酸具有18C-原子的链和一个双键并且可描述为C18:1，亚油酸具有18C-原子的链和两个双键并且可描述为C18:2等。
双键位于从羧基端开始计数的第x个碳-碳键。拉丁前缀顺式(cis)(在这侧)或反式(trans)(跨越)通过描述氢原子相对于所述双键的取向来描述双键的构型。以顺式构型存在的双键为优选。双键位置通常表示为最后的数目，跟在表示双键的数目的整数之后。因此，例如具有在碳9和10之间含一个双键的18碳链的油酸可描述为C18:1:9顺式和具有分别在碳9和10、12和13及15和16之间含三个双键的18碳链的α-亚麻酸可描述为C18:3:9，12，15。顺式或反式可表示在双键位置后。如果存在多于一个双键并且它们全部具有相同的构型，那么术语顺式和反式可在指明全部双键位置后表示并且因此与全部双键的构型有关。因此，例如具有含2个双键的18碳链的亚油酸，其分别在碳9与10和12与13之间为顺式双键，可描述为C18:2:9，12顺式。
在本发明优选的实施方案中，脂肪酸具有0-6范围内的双键，例如1-5范围内的双键，例如双键数选自1、2、3或4个双键。在本发明更优选的实施方案中，脂肪酸具有1或3个双键。在本发明最优选的实施方案中，脂肪酸具有1个双键。
饱和脂肪酸的实例为：
丁酸(丁酸)：CH₃(CH₂)₂COOH或C4:0
己酸(己酸)：CH₃(CH₂)₄COOH或C6:0
辛酸(辛酸)：CH₃(CH₂)₆COOH或C8:0
癸酸(癸酸)：CH₃(CH₂)₈COOH或C10:0
月桂酸(十二烷酸)：CH₃(CH₂)₁₀COOH或C12:0
肉豆蔻酸(十四烷酸)：CH₃(CH₂)₁₂COOH或C14:0
棕榈酸(十六烷酸)：CH₃(CH₂)₁₄COOH或C16:0
硬脂酸(十八烷酸)：CH₃(CH₂)₁₆COOH或C18:0
花生酸(二十烷酸)：CH₃(CH₂)₁₈COOH或C20:0
山萮酸(二十二烷酸)：CH₃(CH₂)₂₀COOH或C22:0
不饱和脂肪酸对本发明是优选的。
可用于本发明的不饱和脂肪酸的实例包括例如：
油酸：CH₃(CH₂)₇CH＝CH(CH₂)₇COOH或C18:1:9顺式
亚油酸：CH₃(CH₂)₄CH＝CHCH₂CH＝CH(CH₂)₇COOH或C18:2:9，12顺式
α-亚麻酸：CH₃CH₂CH＝CHCH₂CH＝CHCH₂CH＝CH(CH₂)₇COOH或C18:3:9，12，15顺式
花生四烯酸：
CH₃(CH₂)₄CH＝CHCH₂CH＝CHCH₂CH＝CHCH₂CH＝CH(CH₂)₃COOH或C20:4
二十碳五烯酸或C20:5
二十二碳六烯酸C22:6
芥酸(顺13-二十二碳烯酸)：CH₃(CH₂)₇CH＝CH(CH₂)₁₁COOH或C22:1
异油酸：C18:1:11顺式
棕榈油酸：16:1:9顺式
洋芫荽子酸：C18:1:6顺式
十八碳四烯酸：C18:4:6，9，12，15顺式
十七碳烯酸：17:1:10顺式
十八碳四烯酸：18:4:6，9，12，15顺式
二十碳烯酸：20:1:11顺式
在一个实施方案中，单-饱和酸与α-乳清蛋白复合。更优选单-饱和酸选自：C16:1:6顺式和反式、C16:1:9顺式和反式、C16:1:11顺式和反式，C18:1:6顺式和反式、C18:1:9顺式和反式、C18:1:11顺式和反式、C18:1:13顺式和反式、C20:1:9顺式和反式、C20:1:11顺式和反式、C20:1:13顺式和反式。
在一个优选的实施方案中，与α-乳清蛋白复合的单-饱和酸以顺式构型存在，这样的脂肪酸选自：C16:1:6顺式、C16:1:9顺式、C16:1:11顺式、C18:1:6顺式、C18:1:9顺式、C18:1:11顺式、C18:1:13顺式、C20:1:9顺式、C20:1:11顺式、C20:1:13顺式。
在另一个优选的实施方案中，与α-乳清蛋白复合的脂肪酸为以顺式构型存在的不饱和脂肪酸，其优选选自C18:1:9顺式、C18:1:11顺式、C18:1:6顺式、C16:1:9顺式、C18:3:6，9，12顺式、C18:3:9，12，15顺式、C18:2:9，12顺式。
在另一个优选的实施方案中，与α-乳清蛋白复合的脂肪酸选自包含1-5个顺式双键的C16-C20脂肪酸。因此，脂肪酸例如可选自异油酸C18:1:11顺式、亚油酸C18:2:9，12顺式、α-亚麻酸C18:3:9，12，15、棕榈油酸C16:1:9顺式、十七碳烯酸C17:1:10顺式、γ-亚麻酸C18:3:6，9，12顺式、十八碳四烯酸C18:4:6，9，12，15顺式、二十碳烯酸C20:1:11顺式和二十碳五烯酸C20:5:5，8，11，14，17顺式，例如选自异油酸C18:1:11顺式、亚油酸C18:2:9，12顺式、α-亚麻酸C18:3:9，12，15。
在本发明一个非常优选的实施方案中，与α-乳清蛋白复合的脂肪酸为不饱和C16或C18脂肪酸，优选地为C18脂肪酸，其中所有双键为顺式双键。在该实施方案中，脂肪酸可优选地包含1个，例如2个，例如3个，例如4个双键，其中所有双键为顺式双键。因此，脂肪酸可例如选自C18:1:9顺式、C18:1:11顺式、C18:1:6顺式、C16:1:9顺式、C18:3:6，9，12顺式、C18:3:9，12，15顺式、C18:2:9，12顺式和C18:4:6，9，12，15顺式，优选地选自C18:1:9顺式、C18:1:11顺式、C18:1:6顺式、C18:3:6，9，12顺式、C18:3:9，12，15顺式、C18:2:9，12顺式和C18:4:6，9，12，15顺式，例如选自C18:1:9顺式、C18:1:11顺式、C18:3:6，9，12顺式、C18:3:9，12，15顺式和C18:2:9，12顺式。
本发明最优选的脂肪酸为C18:1:9顺式和C18:1:11顺式。C18:1:9顺式对本发明复合物是高度优选的。
在一个可供选择的实施方案中，多元饱和酸(polysatued acid)与α-乳清蛋白复合。优选地，多元饱和酸(polysatuated acid)选自C18:2:9，12顺式、C18:3:9，12，15顺式、C18:3:6，9，12顺式和C20:4:5，8，11，15顺式。
在一个实施方案中，脂肪酸为人造脂肪酸。
脂肪酸或脂质在α-乳清蛋白中的结合部位可位于α-螺旋与β-片层域之间的沟，其变得暴露于脱辅基蛋白质。申请人相信辅因子例如油酸结合于α和β域之间的界面，并且结合的辅因子酸锁定分子的该区域，同时使得α-域保持天然样构型。
分子的该区域在牛和人蛋白质之间有差别，其中三个碱性氨基酸之一(R70)在牛α-乳清蛋白中变为S70，因此消除一个潜在的配位侧链。
活性复合物优选地在有助于改变蛋白质折叠和其中脂肪酸或脂质辅因子是可得到的局部环境中产生。
α-乳清蛋白，优选LAC，复合物组合物的产生
本发明α-乳清蛋白组合物可通过任何合适的方法产生。天然来源的α-乳清蛋白为来自不同哺乳动物种类，优选选自马、羊、牛和猪，最优选地为牛的乳液。或者α-乳清蛋白可重组产生(更多细节参见下文“重组产生”部分)或者作为市售产品自几个公司得到。
纯化
蛋白质纯化通常包括除去或分离污染有核酸、噬菌体和/或病毒、其它蛋白质和/或其它生物大分子的一个或多个步骤。自包含LA的成分例如乳液或培养基或宿主细胞提取物得到LA可包括一个或多个蛋白质分离步骤(参见下文“重组产生”部分)。任何合适的蛋白质分离步骤可用于本发明。技术人员将通常易于能够辨别有用的LA蛋白质分离步骤，如果需要这样的话。
用于本发明的蛋白质分离步骤通常可采用用于蛋白质纯化的方法，包括例如层析法，如气相层析法、液相层析法、离子交换层析法和/或亲和层析法；过滤法例如凝胶过滤和超滤、沉淀例如硫酸铵沉淀和/或梯度分离例如蔗糖梯度分离。LA的纯化可包括以任何组合形式存在的以上提及方法中的一个或多个。
以上提及的方法是技术人员熟知的并且例如可如在包含标题“抗体纯化”、“重组蛋白质手册”、“蛋白质纯化”、“离子交换层析”、“亲和层析法”、“疏水作用层析”、“凝胶过滤”、“反相层析法”、“膨胀床吸附”和“层析聚焦”的由Amersham Biosciences编写和可得自GE的“蛋白质分离手册集”中描述的那样实施。
具体地讲，LA的纯化例如可包括一个或多个离心步骤。所述离心例如可用于脱脂目的和/或除去细胞/细胞碎片等和/或分离上清液与沉淀。
具体地讲，LA的纯化例如可包括一个或多个沉淀步骤，例如以10-75％，优选地以30-60％范围内，例如以40-45％范围内的浓度采用硫酸铵沉淀。当采用40-45％范围内的硫酸铵浓度实施沉淀时，LA通常存在于上清液中。
LA的纯化可包括一个或多个过滤步骤，例如通过滤纸过滤和/或采用具有0.1μm-100μm范围内，例如0.5-50μm范围内，例如0.5-20μm范围内，例如0.5-1μm范围内孔径大小的另一个滤器过滤。
LA的纯化可包括一个或多个层析步骤，例如以上提及的任何一种层析方法。在一个优选的实施方案中，方法包括疏水作用层析法。
重组产生
LA的功能等价物优选经重组产生。在一个优选的实施方案中，野生型LA也可重组产生。有用的重组产生方法包括本领域已知的常规方法，例如通过在合适的宿主细胞如适合于产生重组蛋白质的大肠杆菌、酿酒酵母(S.cerevisiae)或裂变酵母(S.pombe)或昆虫或哺乳动物细胞表达异种LA的功能同系物(参见以下)。技术人员将通常易于能够辨别通常用于产生重组蛋白质并且特别是LA的有用重组技术。
在一个实施方案中，LA在转基因植物或动物中产生。所谓的转基因植物或动物在这里意指已被基因修饰以包含和表达编码人或牛LA或其功能同系物的核酸的植物或动物。
在本发明一个优选的实施方案中，LA或其功能同系物由宿主细胞重组产生。
因此，在本发明的一个方面，LA通过包含切实可行地与能够在所述宿主细胞定向表达的第二核酸相关的第一核酸序列编码的α-乳清蛋白或其功能同系物的宿主细胞产生。第二核酸序列因此可包含或者甚至由操纵在所述细胞表达所研究蛋白质的启动子组成。技术人员应易于能够鉴别用于给定宿主细胞的有用的第二核酸序列。
产生重组LA或其功能同系物的方法通常包括以下步骤：
-提供宿主细胞，
-制备包含切实可行地与能够在宿主细胞定向表达所研究的所述蛋白质的第二核酸连接的第一核酸编码的LA或其功能同系物的基因表达构件，
-用所述构件转化宿主细胞，
-培养宿主细胞，从而得到LA或其功能同系物的表达。
包含LA的组合物因此可为所述宿主细胞的提取物或自所述宿主细胞提取物和/或自培养基纯化的组分。
因此产生的重组LA可通过任何常规方法分离，例如通过上文描述的任何蛋白质纯化方法。技术人员应能够鉴别用于任何所研究蛋白质纯化的合适的蛋白质分离步骤。
在本发明的一个实施方案中，重组产生的LA或其功能同系物由宿主细胞分泌。
当LA或其功能同系物被分泌时，产生所研究重组蛋白质的方法可包括以下步骤
-提供宿主细胞，
-制备包含切实可行地与能够在所述宿主细胞中定向表达所述LA或其功能同系物的第二核酸连接的第一核酸编码的LA或其功能同系物的基因表达构件，
-用所述构件转化所述宿主细胞，
-在培养基中培养宿主细胞，从而得到LA或其功能同系物的表达和蛋白质分泌进入培养基，
-从而得到包含LA或其功能同系物的培养基。
在本发明的该实施方案中，包含LA或其功能同系物的组合物因此可为培养基或自培养基制备的组合物。
在本发明的另一个实施方案中，所述组合物为自动物、其部分或细胞制备的提取物或这样提取物的分离流分。
在本发明的一个优选实施方案中，LA为在宿主细胞体外重组产生并且自细胞溶胞产物、细胞提取物或自组织培养上清液分离。在一个更优选的实施方案中，LA通过以其表达所研究蛋白质的这样的方式修饰的宿主细胞产生。在本发明的一个甚至更优选实施方案中，所述宿主细胞被转化为产生和分泌LA。
因此在一个优选的实施方案中，LA制备优选地为重组制备，其中LA制备通过以下步骤得到：
-制备包含切实可行地与能够在宿主细胞中定向表达的第二核酸连接的第一核酸编码的人或牛α-乳清蛋白肽或其功能同系物的基因表达构件，
-用所述构件转化宿主细胞培养物，
-在培养基中培养宿主细胞培养物，因而得到多肽的表达和分泌进入培养基，
-得到包含多种α-乳清蛋白分子和核酸的组合物。
在一个实施方案中，LA制备优选地为重组制备，其中LA制备通过以下步骤得到：
-制备包含切实可行地与能够在宿主细胞中定向表达的第二核酸连接的第一核酸编码的人或牛α-乳清蛋白肽或其功能同系物的基因表达构件，
-用所述构件转化宿主细胞培养物，
-体外或以转基因植物或动物的形式培养宿主细胞培养物，从而得到LA的表达，
-得到包含多种LA分子和核酸的组合物。
本发明核酸编码的α-乳清蛋白可衍生于人或牛α-乳清蛋白基因或如上文定义其它动物种类的α-乳清蛋白基因。
在一个优选的实施方案中，基因表达构件适合于在哺乳动物细胞系或者转基因植物或动物中表达。在一个实施方案中，宿主细胞培养物在转基因动物中表达。在这里所谓的转基因植物或动物意指已经被基因修饰而包含和表达如上文定义的核酸编码的人或牛α-乳清蛋白或其功能同系物的植物或动物。
在一个优选的实施方案中，本发明的基因表达构件包含病毒基载体例如DNA病毒基载体、RNA病毒基载体或嵌合病毒基载体。DNA病毒的实例为巨细胞病毒、单纯疱疹、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barrvirus)、猴病毒40、牛乳头状瘤病毒、腺相关病毒、腺病毒、牛痘病毒和杆状病毒。然而，基因表达构件可例如仅包含质粒基载体。
本发明的一个方面提供了特征为包含一个或多个来自人或牛α-乳清蛋白基因包括其功能衍生物的内含子序列的编码人或牛α-乳清蛋白或其功能同系物的表达构件。另外，它可包含衍生于病毒基因或真核基因，包括哺乳动物和昆虫基因的启动区。
优选选择的启动区不同于天然人或牛α-乳清蛋白启动子，并且优选地使人或牛α-乳清蛋白的产量最佳化，选择启动区以对所研究的载体和宿主细胞起最佳作用。
在一个优选的实施方案中，启动区选自鲁斯氏肉瘤病毒长末端重复启动子和巨细胞病毒即刻早期启动子以及延伸因子-1α启动子。
在另一个实施方案中，启动区衍生于微生物例如其它病毒、酵母和细菌的基因。
为了得到更大产量的重组LA或其功能同系物，启动区可包含增强子元件，例如小鼠血管内皮生长因子基因5’末端非翻译区的QBISP163因子。
用于产生本发明重组LA的一个方法特征在于宿主细胞培养物可为真核的，例如哺乳动物细胞培养物或酵母细胞培养物。
有用的哺乳动物细胞例如可为人胚胎肾细胞(HEK细胞)，例如美国典型培养物保藏中心的保藏编号为CRL-1573和CRL-10852的细胞系、鸡胚成纤维细胞、仓鼠卵巢细胞、幼仓鼠肾细胞、人宫颈癌细胞、人黑色素瘤细胞、人肾细胞、人脐血管内皮细胞、人脑内皮细胞、人口腔肿瘤细胞、猴肾细胞、小鼠成纤维细胞、小鼠肾细胞、小鼠结缔组织细胞、小鼠少突神经胶质(oligodendritic)细胞、小鼠巨噬细胞、小鼠成纤维细胞、小鼠成神经细胞瘤细胞、小鼠前B细胞、小鼠B细胞淋巴瘤细胞、小鼠浆细胞瘤细胞、小鼠畸胎瘤细胞、大鼠星形细胞瘤细胞、大鼠乳腺上皮细胞、COS、CHO、BHK、293、VERO、HeLa、MDCK、WI38和NIH 3T3细胞。
然而，优选宿主细胞为原核细胞或酵母细胞。原核细胞例如可为大肠杆菌。酵母细胞例如可为酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母(Pichia)或汉逊氏酵母(Hansenula)。
当重组产生的α-乳清蛋白用于本发明时，优选所述重组产生的α-乳清蛋白具有与天然存在的α-乳清蛋白相似的粒度分布模式。
以上提及的方法是技术人员熟知的并且例如可如在分子生物学中的通行方法(the Current Protocols in Molecular Biology)，2001，JohnWiley and Sons有限公司.Frederick M.Ausubel等编辑中所述实施。
重组产生的LA例如可如在上文“α-乳清蛋白的纯化”部分中所述纯化并且重组产生的LA可如下文所述用于制备LAC。
产生α-乳清蛋白复合物的方法
本发明的LAC为α-乳清蛋白与脂肪酸或脂质的活性复合物。技术人员已知的功能试验可用于证实以与脂肪酸或脂质的复合物形式存在的α-乳清蛋白的功能活性。本领域技术人员已知的用于评价α-乳清蛋白功能的功能试验包括(但不限于)在上文和实施例6和7中描述的试验例如细胞杀伤试验或组蛋白试验。
一种自牛乳起始产生α-乳清蛋白复合物组合物，优选地为LAC组合物的优选方法可包括离心、沉淀、过滤和疏水作用层析步骤。一种优选的自乳液产生α-乳清蛋白的方法在实施例1中得到描述。在α-乳清蛋白纯化后，将α-乳清蛋白转化为α-乳清蛋白复合物，优选地为LAC。该转化可通过一系列包括自α-乳清蛋白释放Ca²⁺离子的步骤实施。然后使α-乳清蛋白结合例如在离子交换基质上的脂质辅因子。第三，活性复合物可通过例如采用高盐浓度的洗脱进行分离(参见实施例1)。
钙释放
通过本领域技术人员已知的任何合适的方法可得到钙的释放。
在一个实施方案中，通过使LA与钙螯合剂接触可达到钙的释放。钙螯合剂可选自包括(但不限于)1，2-双(2-氨基苯氧基)-乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸(BAPTA)或乙二醇-双(氨基乙基醚)-N，N，N′，N′-四乙酸(EGTA)或乙二胺四乙酸(EDTA)的钙螯合剂。在本发明一个非常优选的实施方案中，钙螯合剂为乙二胺四乙酸(EDTA)。
在一个优选的实施方案中，钙螯合剂为乙二胺四乙酸。
在本发明一个特殊的实施方案中，通过采用α-乳清蛋白的功能同系物得到钙释放，其中钙结合部位已经以减少α-乳清蛋白的所述功能同系物结合钙的能力的方式被修饰。具体地讲，钙结合部位的氨基酸(K79、D82、D84、D87和D88)已经被修饰以致于对钙的亲和性被减少，或者其不再是有功能的。在该特殊的实施方案中，涉及自LA释放钙的步骤是过时的并且LA转化为LAC包括伴随同时或连续暴露于阴离子交换介质使脂肪酸或脂质结合于LA。
α-乳清蛋白组合物可采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、免疫印迹(蛋白质印迹)和尺寸排阻层析(SEC)、MALDI-MS或任何其它方法进行进一步分析，从而可分析α-乳清蛋白组合物的含量。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、免疫印迹(蛋白质印迹)和尺寸排阻层析(SEC)进行α-乳清蛋白组合物的分析显示在图3和4中。
接着，纯化的α-乳清蛋白复合物可被过滤、浓缩和缓冲变为具有以高浓度存在的α-乳清蛋白复合物的稳定溶液。
在优选的实施方案中，组合物为0.01-90％例如0.1-80％NaCl，例如0.2-70％NaCl，例如0.3-60％NaCl，例如0.4-50％NaCl，例如0.5-40％NaCl，例如0.6-30％NaCl，例如0.7-20％NaCl，例如0.8-10％NaCl，例如0.85-5％NaCl，例如约0.9％NaCl的含盐组合物。在一个优选的实施方案中，组合物为0.9％NaCl溶液。
本发明的α-乳清蛋白复合物(优选LAC)组合物优选地具有多于1mg/ml，例如多于2mg/ml，优选地多于5mg/ml，例如多于6mg/ml或7mg/ml如多于8mg/ml，更优选地约为9mg/ml的浓度。在另一个实施方案中，本发明的α-乳清蛋白复合物(优选LAC)组合物优选地具有约7mg/ml的浓度。
不受理论束缚，申请人已经发现α-乳清蛋白复合物(优选LAC)组合物中的单体/多聚α-乳清蛋白的比率通过受到转化方法的单体/多聚α-乳清蛋白的比率控制。因此，自α-乳清蛋白初始纯化方法得到的单体/多聚α-乳清蛋白的比率是重要的。在实施例1中，如在图3A中可见的疏水作用层析(HIC)的输出主要地是单体，导致单体α-乳清蛋白复合物组合物(图3B)，而产生混合的单体/多聚α-乳清蛋白组合物的纯化方法导致混合的单体/多聚α-乳清蛋白复合物组合物(数据未显示)。在用于实施例1的方法中，α-乳清蛋白按照载荷6mg/ml凝胶(90mg/cm²)的HIC得到，而混合的单体/多聚α-乳清蛋白组合物按照载荷2mg/ml凝胶(32mg/cm²)的HIC得到。通过高浓度起始产物可助于产生单体α-乳清蛋白复合物，由此以适合于转化导致以单体形式存在的α-乳清蛋白复合物的单体形式获得即刻HIC纯化α-乳清蛋白。
因此本发明的一个方面涉及产生本发明组合物的方法，所述组合物包含多于95％(重量％)单体α-乳清蛋白复合物(与多聚体或寡聚体LAC的含量比较)，优选为LAC。
一个实施方案涉及产生包含单体LAC的组合物的方法，LAC为α-乳清蛋白与脂肪酸或脂质的单体复合物，所述α-乳清蛋白为SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2的牛或人α-乳清蛋白或其功能等价物，其中组合物包含至少50％重量的单体α-乳清蛋白，方法包括以下步骤：
b.得到包含至少95％重量的单体α-乳清蛋白的α-乳清蛋白组合物，
c.通过以下步骤将所述α-乳清蛋白转化为LAC
i.自所述α-乳清蛋白释放钙和
ii.使脂肪酸或脂质结合于所述α-乳清蛋白，和
d.纯化LAC。
步骤ci和cii可以任何顺序连续或同时进行。
包含至少95％重量的单体α-乳清蛋白的α-乳清蛋白组合物可优选地通过疏水作用层析法得到，其中柱子载荷多于2mg/ml，优选地多于4mg/ml，例如至少6mg/ml。载荷或者可以mg/cm²测量，从而优选的载荷为超过40mg/cm²，例如多于50或者优选地多于60mg/cm²。甚至进一步优选的是载荷多于70mg/cm²或多于80mg/cm²。
在一些实施方案中，用于本发明产生α-乳清蛋白复合物，优选地用于产生LAC的方法包括通过层析法例如如在丹麦专利申请PA 200700693中实施例3和4中描述的将α-乳清蛋白转化为α-乳清蛋白复合物。在这些实施方案中，可得到更高载荷的α-乳清蛋白和高产量的α-乳清蛋白复合物(优选LAC)。
因此，为了产生LAC，用于转化的柱子可载荷多于20mgα-乳清蛋白/cm²离子交换介质，例如至少30mg/cm²，例如多于40mg/cm²，例如至少50mg/cm²，例如多于60mg/cm²，例如至少70mg/cm²，例如多于80mg/cm²，例如至少90mgα-乳清蛋白/cm²离子交换介质。在本发明的一个实施方案中，乳清蛋白复合物与以上提及载荷的产率为至少50％，例如至少55％，例如多于60％，例如至少65％，例如多于70％，例如至少75％，例如多于80％。因此，在一个优选的实施方案中，当载荷为30mgα-乳清蛋白/cm²离子交换介质时，产率为至少60％，优选地为至少70％，例如至少75％，例如至少80％。也优选当载荷为42mgα-乳清蛋白/cm²离子交换介质时，产率为至少60％，优选地为至少70％，例如至少75％，例如至少80％，例如至少90％。在另一个实施方案中，优选当载荷为90mgα-乳清蛋白/cm²离子交换介质时，产率为至少20％，优选地为至少30％，例如至少60％，优选地为至少70％，例如至少75％，例如至少80％。
另外优选组合物仅包含非常小量的(如果有的话)污染的生物大分子例如蛋白质。因此优选至少50％，例如至少60％，例如至少70％，例如至少80％，例如至少90％重量的组合物蛋白质为LAC。
细胞毒性
如在背景部分中描述的，除了其对细菌和病毒感染的作用以外，已经证实多聚体α-乳清蛋白(MAL)或HAMLET对癌细胞和未成熟细胞具有选择性细胞毒活性。已经显示活性复合物的形成依赖于辅因子油酸并通过消除来自环境的Ca²⁺进行刺激。
申请人在此描述了对癌细胞具有相似细胞毒活性的单体α-乳清蛋白复合物，优选LAC的产生。单体α-乳清蛋白复合物(优选LAC)组合物的细胞毒性可采用本领域熟知的任何合适的细胞毒性试验评价。这样试验的一个实例，即ViaLight试验在实施例2中得到描述。方法的综述概述于图5中。
能够杀伤50％给定细胞群的α-乳清蛋白的剂量基于所测量的荧光数据进行计算。α-乳清蛋白组合物的效力通过LD50剂量反映，其中低的LD50剂量是高效力组合物的特征，即组合物在杀伤癌细胞中是高度有效的，在这种情况下采用癌细胞系L1210，尽管显而易见的是几种不同的细胞系适合于该目的。这样分析的结果描绘于图6和7中及在实施例2，表1的表格中。
在一个实施方案中，作为α-乳清蛋白复合物(优选LAC)组合物的LD50测量的细胞毒活性在70μl中少于15μg/100.000细胞。在一个优选的实施方案中，LD50为在70μl中少于10μg/100.000细胞。本发明的α-乳清蛋白复合物(优选LAC)组合物更优选具有作为LD50测量的少于5μg/100.000细胞的细胞毒活性。最优选的是其中作为LD50测量的细胞毒活性在70μl中为1-5μg/100.000细胞的组合物。
LD50可作为在预定体积中杀伤50％细胞群要求的化合物浓度例如α-乳清蛋白复合物(优选LAC)组合物的量计算。在表1实施例2中显示的结果显示本发明组合物当对70μl中100,000细胞的细胞群测量时优选地具有少于0.1mg/ml的LD50浓度，例如当对70μl中100.000细胞的细胞群测量时LD50少于0.9mg/ml。在特别优选的实施方案中，当对70μl中100,000细胞的细胞群测量时，LD50浓度少于0.08，当对70μl中100,000细胞的细胞群测量时，更优选LD50浓少于0.06，最优选少于0.04mg/ml。
药用制剂
含有本发明组合物的药用组合物可通过常规技术制备，例如如在雷明顿：药学科学与实践(Remington：The Science and Practice ofPharmacy)1995，E.W.Martin编辑，Mack出版公司，第19版，Easton，Pa中描述的那样。组合物可以常规形式例如胶囊剂、片剂、气雾剂、溶液剂、混旋剂或局部应用的形式出现。
术语“药物”和“药用组合物”在此可互换使用。
本发明提供包含α-乳清蛋白复合物(优选LAC)的药用组合物。
本发明的一个方面涉及药用组合物。药用组合物可以多种不同方式配制，这取决于具体药用组合物的目的。
例如药用组合物可以其因此用于特定给药形式的方式配制。优选的给药形式在下文描述。
在一个实施方案中，药用组合物被配制为液体。例如组合物可为蛋白质溶液或者组合物可为蛋白质悬浮液。所述液体可适合于非肠道给药，例如适合于注射或者输注。
液体可为任何有用的液体，然而通常优选的是液体为含水液体。对于多种目的，尤其是当液体应当用于非肠道给药时，进一步优选的液体为无菌的。无菌性可通过任何常规方法例如过滤、照射或者加热赋予。另外，优选液体已经经受病毒减少步骤，尤其是当液体被配制用于非肠道给药时。
病毒减少例如可通过纳米过滤或经合适滤器如包含几层的Planova滤器进行病毒过滤来实施。Planova滤器可为任何合适的大小例如75N、35N、20N或15N或者可使用不同大小的滤器，例如Planova20N。病毒减少也可包括用另一个滤器例如采用具有0.01-1μm范围内，例如在0.05-0.5μm范围内，例如约0.1μm孔径大小的滤器预滤的步骤。病毒减少也可包括酸处理步骤。
药用组合物可以其可更便利于使用者的单一剂量单位包装。因此，用于大剂量注射的药用组合物可以例如至多10ml，优选地至多8ml，更优选地至多6ml，例如至多5ml，例如至多4ml，例如至多3ml，例如约2.2ml的剂量单位包装。
药用组合物可以任何合适的容器包装。在一个实例中，单剂量药用组合物可包装于注射器或用于输注的容器中。
在本发明的另一个实施方案中，药用组合物为干燥组合物。干燥组合物可如此使用，但是对于多数目的组合物为干燥组合物时仅用于贮存。使用前，干燥组合物可被溶解或悬浮于合适的液体组成例如无菌水中。
本发明的药用组合物也可包含第一核酸序列编码的LAC，例如上文提及的任何LAC。所述第一核酸序列优选地切实可行地与第一核酸在用药用组合物治疗的个体，更优选地在所述患病个体的细胞定向表达的第二核酸序列有关。因此，优选的是第二核酸序列能够使第一核酸序列在人体中定向表达。在其中临床病症为癌症的本发明实施方案中，优选的是第二核酸序列能够使第一核酸序列在癌细胞例如恶性癌细胞中定向表达。另外优选的是第一和第二核酸序列都包含在合适的载体中。
也包含在本发明中的是药用组合物可以例如洗剂、霜剂、软膏剂、喷雾剂例如气溶胶喷雾剂或鼻喷雾剂、直肠或阴道栓剂、滴剂例如眼滴剂或鼻滴剂、贴剂、封闭敷料等形式局部用于部位的位点。
药学上可接受的添加剂
包含α-乳清蛋白复合物(优选LAC)的药用组合物可通过任何常规技术制备，例如如在雷明顿：药学科学与实践(Remington：The Scienceand Practice of Pharmacy)1995，E.W.Martin编辑，Mack出版公司，第19版，Easton，Pa中描述的那样。
术语“药物”和“药用组合物”在此可互换使用。
药学上可接受的添加剂可为任何常规使用的药学上可接受的添加剂，其应根据具体剂型、打算的给药途径等进行选择。例如药学上可接受的添加剂可为在Nema等，1997中提及的任何添加剂。另外，药学上可接受的添加剂可为来自FDA的“非活性组分目录表”的任何可接受的添加剂，其例如在互联网址http://www.fda.gov/cder/drug/iig/default.htm中是可得到的。
在本发明的一些实施方案中，合乎需要的是药用组合物包含等渗剂。尤其是当药用组合物被制备用于经注射或输注给药时，通常合乎需要的是加入等渗剂。
因此，组合物可包含至少一种其为等渗剂的药学上可接受的添加剂。
药用组合物可为等渗的、低渗的或高渗的。然而，通常优选的是当给药时，用于输注或注射的药用组合物为基本上等渗的。因此，对于贮存，药用组合物可优选地为等渗或高渗的。如果药用组合物对于贮存是高渗的，其可在给药前被稀释变为等渗溶液。
等渗剂可为离子型等渗剂例如盐或非离子型等渗剂例如糖类。
离子型等渗剂的实例包括(但不限于)NaCl、CaCl₂、KCl和MgCl₂。非离子型等渗剂的实例包括(但不限于)甘露醇和甘油。
然而，在本发明的其它实施方案中，药用组合物可不包含缓冲剂或者仅包含微摩尔量的缓冲剂。
在一个优选的实施方案中，缓冲剂为TRIS。TRIS缓冲剂在多种其它名称例如氨丁三醇(tromethamine)包括氨丁三醇USP、THAM、Trizma、三甲醇氨基甲烷(Trisamine)、Tris amino和氨丁三醇(trometamol)下是已知的。名称TRIS包括所有上述名称。
缓冲剂另外可例如选自USP可适配的用于非肠道用途的缓冲剂，尤其是当药用制剂用于非肠道用途时。例如缓冲剂可选自一元酸如乙酸、苯甲酸、葡萄糖酸、甘油酸和乳酸；二元酸如乌头酸、己二酸、抗坏血酸、碳酸、谷氨酸、苹果酸、琥珀酸和酒石酸；多元酸例如枸橼酸和磷酸以及碱例如氨、二乙醇胺、甘氨酸、三乙醇胺和TRIS。
药用组合物可包含至少一种为稳定剂的药学上可接受的添加剂。
例如稳定剂可选自泊洛沙姆、吐温-20、吐温-40、吐温-60、吐温-80、苄泽、金属离子、氨基酸、聚乙二醇、曲通、EDTA、抗坏血酸、曲通X-100、NP40或CHAPS。
本发明的药用组合物也可包含一种或多种冷冻保护剂。具体地讲，当组合物包含冻干蛋白质或者组合物应该冷冻贮存时，可以合乎需要的是向药用组合物中加入冷冻保护剂。
冷冻保护剂可为任何有用的冷冻保护剂，例如冷冻保护剂可选自葡聚糖、甘油、聚乙二醇、蔗糖、海藻糖和甘露醇。
因此，药学上可接受的添加剂可包含一种或多种选自等渗盐、高渗盐、缓冲剂和稳定剂的添加剂。另外，药学上可接受的添加剂可包括一种或多种选自等渗剂、缓冲剂、稳定剂和冷冻保护剂的添加剂。例如药学上可接受的添加剂包括一水合葡萄糖、甘氨酸、NaCl和聚乙二醇3350。
制剂
尽管本发明组合物作为原料组合物给药是可能的，优选其为药用制剂的形式。因此，本发明还提供用于医疗用途的药用制剂，其包含如在此定义的本发明组合物或其药学上可接受的盐与药学上可接受的载体。
口服给药
本发明组合物可以广泛种类的口服给药剂型配制。药用组合物和剂型可包含本发明组合物或其药学上可接受的盐或其作为活性组分的晶型。药学上可接受的载体可为固体或液体。固体形式制剂包括散剂、片剂、丸剂、胶囊剂、扁囊剂、栓剂和可分散颗粒剂。固体载体可为一种或多种也可作为稀释剂、矫味剂、稳定剂、润滑剂、悬浮剂、粘合剂、防腐剂、湿润剂、片剂崩解剂或包囊材料起作用的物质。
优选地，组合物为本发明组合物或组合物的约0.5％-75％重量，剩余部分包含合适的药用赋形剂。对于口服给药，这样的赋形剂包括药用等级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、明胶、蔗糖、碳酸镁等。
在散剂中，载体为与细分的活性组分混合的细分固体。在片剂中，活性组分与具有必要粘合能力的以适当比例存在的载体混合并压制为要求的形状和大小。散剂和片剂优选地包含1-约70％t的活性组分。合适的载体为碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可脂等。术语“制剂”打算包括活性组分与作为载体提供其中包含或不含载体的活性组分被与其相关的载体所包裹的胶囊的包囊材料的制剂。类似地，扁囊剂和锭剂被包括在内。片剂、散剂、胶囊剂、丸剂、扁囊剂和锭剂可作为适合于口服给药的固体形式。也可制备多单位剂量颗粒剂。以上的片剂和颗粒剂芯可用糖等的浓缩溶液包衣。所述芯也可用改变在胃肠道中溶出度的聚合物例如具有5.5以上pka的阴离子型聚合物包衣。这样的聚合物为羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、乙酸邻苯二甲酸纤维素和以商品名Eudragit S100和L100销售的聚合物。在明胶胶囊制剂中，这些可为软或硬的。在前者情况中，活性化合物与油混合，而在后者情况中，多单位剂量颗粒剂被填充于其中。
本发明滴剂可包括无菌或非无菌水或油溶液剂或混旋剂，且可通过使活性组分溶于合适的水溶液中制备，任选地包含杀菌剂和/或杀真菌剂和/或任何其它合适的防腐剂，和任选地包含表面活性剂。然后可将生成的溶液经过滤澄清，转移至合适的容器，然后密封并经保持在98-100度下半小时加压灭菌。或者，溶液可经过滤灭菌并转移至无菌容器中。适合于包含在滴剂中的杀菌剂和杀真菌剂的实例为硝酸苯汞或醋酸苯汞(0.002％)、苯扎氯铵(0.01％)和醋酸氯己定(0.01％)。用于制备油溶液剂的合适溶剂包括甘油、稀乙醇和丙二醇。
也包括在内的是打算在使用前不久被转化为用于口服给药的液体形式制剂的固体形式制剂。这样的液体形式包括溶液剂、混旋剂和乳剂。除活性组分以外，这些制剂可包含着色剂、矫味剂、稳定剂、缓冲剂、人造和天然甜味剂、分散剂、增稠剂、增溶剂等。
适合于口服给药的其它形式包括液体形式制剂，包括乳剂、糖浆剂、酏剂、水溶液剂、水混旋剂、牙膏、凝胶牙膏、口香糖；或者打算在使用前不久被转化为液体形式制剂的固体形式制剂。乳剂可以在丙二醇水溶液中的溶液制备并可包含乳化剂例如卵磷脂、脱水山梨糖醇单油酸酯或阿拉伯胶。水溶液剂可通过将活性组分溶解于水中并加入合适的着色剂、矫味剂、稳定剂和增稠剂制备。水混旋剂可通过使细分的活性组分分散于含有粘性材料例如天然或合成树胶、树脂、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和其它熟知悬浮剂的水中制备。固体形式制剂包括溶液剂、混旋剂和乳剂并且除活性组分外可包含着色剂、矫味剂、稳定剂、缓冲剂、人造和天然甜味剂、分散剂、增稠剂、增溶剂等。
非肠道给药
本发明组合物可配制用于非肠道给药(例如通过注射，如大剂量快速推注或者连续输注)并且可以安瓿、预填充注射器、小体积输注的单位剂型或以含有所添加防腐剂的多剂量容器呈现。组合物可采取这样的形式例如在油或水媒介物中的混旋剂、溶液剂或乳剂，例如在聚乙二醇水溶液中的溶液剂。油或非水载体、稀释剂、溶剂或媒介物的实例包括丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油)和可注射有机酯(例如油酸乙酯)并可包含配制试剂例如防腐剂、湿润剂、乳化剂或悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性组分可以通过无菌分离无菌固体或者通过自用于使用前用合适的媒介物例如无菌、无热原水构成的溶液冷冻干燥得到的粉末形式存在。
用于非肠道制剂的油类包括石油产品、动物油、植物油或合成的油类。用于这样制剂的油类的具体实例包括花生油、豆油、芝麻油、棉籽油、玉米油、橄榄油、凡士林和矿物油。用于非肠道制剂的合适的脂肪酸包括油酸、硬脂酸和异硬脂酸。油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯是合适脂肪酸酯的实例。
用于非肠道制剂的合适脂肪酸盐(soaps)包括脂肪族碱金属、铵和三乙醇胺盐，并且合适的去污剂包括(a)阳离子型去污剂例如二甲基二烷基铵卤化物和烷基吡啶鎓卤化物；(b)阴离子型去污剂例如烷基、芳基和烯烃磺酸盐；烷基、烯烃、醚和甘油一酸酯硫酸盐及磺基琥珀酸盐；(c)非离子型去污剂例如氧化脂肪胺、脂肪酰链烷醇胺和聚氧乙烯聚丙烯共聚物；(d)两性去污剂例如β-氨基丙酸烷基酯和2-烷基-咪唑啉季铵盐；和(e)它们的混合物。
非肠道制剂一般应在溶液中包含约0.5-25％重量的活性组分。可使用防腐剂和缓冲剂。为了在注射部位减小或消除刺激，这样的组合物可包含一种或多种具有约12-17亲水-亲脂平衡(HLB)的非离子型表明活性剂。在这样制剂中表面活性剂的量一般在约5-15％重量范围内。合适的表面活性剂包括聚乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯例如脱水山梨糖醇单油酸酯和通过环氧乙烷与环氧丙烷与丙二醇缩合形成的疏水性碱的高分子量加成产物。非肠道制剂可以单位剂量或多剂量密封容器，例如安瓿和小瓶的形式呈现并可贮存于仅需要在使用前立即加入无菌液体赋形剂例如注射用水的冷冻干燥(冻干)条件下。临时注射溶液剂和混旋剂可自先前描述种类的无菌散剂、颗粒剂和片剂制备。
局部给药
本发明的组合物也可局部传递。用于局部给药的区域包括皮肤表面以及阴道、直肠、鼻、口腔和咽喉的粘膜组织。用于经皮肤和粘膜局部给药的组合物不应产生刺激症状例如肿胀或发红。
局部组合物可包括适合于局部给药的药学上可接受的载体。因此，组合物可采取例如混旋剂、溶液剂、软膏剂、洗剂、性润滑剂、霜剂、泡沫、气溶胶、喷雾剂、栓剂、植入片、吸入剂、片剂、胶囊剂、干燥散剂、糖浆剂、香膏或锭剂的形式。用于制备这样组合物的方法是制药工业中熟知的。
本发明的组合物可配制为软膏剂、霜剂或洗剂或者配制为经皮贴剂用于局部给予表皮。软膏剂和霜剂例如可用加入适当增稠剂和/或胶凝剂的水或油基质配制。洗剂可用水或油基质配制并且通常也包含一种或多种乳化剂、稳定剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂或着色剂。适合于口腔局部给药的制剂包括在矫味基质，通常为在蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶中包含活性药物的糖锭剂；在惰性基质例如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶中包含活性组分的锭剂；及在合适的液体载体中包含活性组分的漱口剂。
本发明的霜剂、软膏剂或糊剂为用于外部涂抹的活性组分的半固体制剂。它们可通过使以细分或粉末形式单独或以在水或非水液体中的溶液或悬浮液形式存在的活性组分借助于适当的机械与油脂性或非油脂性基质混合制备。基质可包括碳氢化合物例如硬、软或液体石蜡、甘油、蜂蜡、金属脂肪酸盐；粘液质；天然来源的油例如杏仁油、玉米油、花生油、蓖麻油或橄榄油；羊毛脂或其衍生物或脂肪酸例如与醇如丙二醇或大粒凝胶一起的硬脂酸或油酸。制剂可加入任何合适的表面活性剂例如阴离子型、阳离子型或非离子型表面活性剂如脱水山梨糖醇酯或其聚氧乙烯衍生物。悬浮剂例如天然树胶、纤维素衍生物或无机材料例如S型(silicaceous)硅石及其它组分例如羊毛脂也可包含在内。
本发明洗剂包括适用于皮肤或眼部的那些洗剂。眼洗剂可包括任选地含有杀菌剂的无菌水溶液剂并可通过与用于制备滴剂的那些方法相似的方法制备。用于皮肤的洗剂或擦剂也可包含促使干燥和冷却皮肤的试剂例如醇或丙酮和/或增湿剂例如甘油或油类如蓖麻油或花生油。
经皮传递
在此描述的药物-化学改性剂复合物可经皮给药。经皮给药通常包括传递药物使药物经皮肤通道进入患者的全身循环。皮肤位点包括用于经皮给予药物的解剖学区域并且包括前臂、腹部、胸、背、屁股、乳头状区域等。
经皮传递通过使复合物源暴露于患者皮肤延长的时间期间实现。经皮贴剂具有向人体提供药物-化学改性剂复合物控制传递的增加优势。参见经皮药物传递：发展的论点和研究首创(Transdermal DrugDelivery：Developmental Issues and Research Initiatives)，Hadgraft和Guy(编辑)，Marcel Dekker有限公司，(1989)；控制药物传递：基础与应用(Controlled Drug Delivery：Fundamentals and Applications)，Robinson和Lee(编辑)，Marcel Dekker有限公司，(1987)；和药物的经皮传递(Transdermal Delivery of Drugs)，第1-3卷，Kydonieus和Berner(编辑)，CRC出版社，(1987)。这样的剂型可通过溶解、分散或者加入在适当介质例如弹性体型基质材料中的药物-化学改性剂复合物制备。吸收增强剂也可用于增加化合物的经皮流动。这样流动的速率可通过提供控速膜或者使化合物分散于聚合物基质或凝胶中得到控制。
被动经皮药物传递
发现多种类型的经皮贴剂用于在此描述的方法中。例如，一种简单的胶粘贴剂可自背衬材料和丙烯酸酯粘合剂制备。药物-化学改性剂复合物与任何增强剂被配制为粘性制膜液并使之彻底混合。溶液被直接浇铸到背衬材料上并在烘箱中蒸发制膜(casting)溶剂，留下粘性薄膜。释放衬层可附着完成系统。
或者，聚氨基甲酸酯基质贴剂可用于传递药物-化学改性剂复合物。该贴剂的这些层包括背衬、聚氨基甲酸酯药物/增强剂基质、膜、粘合剂和释放衬层。聚氨基甲酸酯基质采用室温固化聚氨基甲酸酯预聚物制备。向预聚物加入水、醇和复合物导致形成可直接仅浇铸背衬材料的胶粘坚固弹性体。
本发明的另一个实施方案将采用水凝胶基质贴剂。通常，水凝胶基质将包含醇、水、药物和几种亲水性聚合物。该水凝胶基质可在背衬与粘性层之间被加入到经皮贴剂中。
也发现液体储库型贴剂用于在此描述的方法中。该贴剂包含不可渗透或半渗透的热封背衬材料、热封膜、基于丙烯酸酯的压合敏感皮肤胶粘剂和硅化处理的释放衬层。背衬被热封到膜上形成然后可用复合物、增强剂、胶凝剂和其它赋形剂的溶液填充的储库。
泡沫基质贴剂在设计和组分上与液体储库系统相似，除了胶凝的药物-化学改性剂溶液被限定于薄的泡沫层，一般为聚氨基甲酸酯。该泡沫层位于背衬和贴剂的周边已被热封的膜之间。
对于被动传递系统，释放速率一般地由置于储库和皮肤之间的膜、通过自骨架给药器(monolithic device)扩散，或者通过传递系统中用作控速屏障的皮肤本身进行控制。参见U.S.专利第4816258、4927408、4904475、4588580、4788062号等。药物传递速率部分取决于膜的性质。例如，药物的体内跨膜传递速率通常高于经皮肤的屏障。复合物自装置向膜传递的速率最有利地通过采用置于储库和皮肤之间的限速膜控制。假定皮肤对复合物具有足够的渗透性(即通过皮肤吸收大于通过膜的速率)，膜将用于控制患者经受的给药速率。
合适的渗透膜材料可基于要求的渗透性程度、复合物的性质和与构建装置有关的机械考虑进行选择。例证性的渗透膜材料包括广泛种类的天然和合成的聚合物例如聚二甲基硅氧烷(硅橡胶)、乙烯-醋酸乙烯共聚物(EVA)、聚氨基甲酸酯、聚氨基甲酸酯聚醚共聚物、聚乙烯、聚酰胺、聚氯乙烯(PVC)、聚丙烯、聚碳酸酯、聚四氟乙烯(PTFE)；纤维素材料例如纤维素三乙酸酯和纤维素硝酸酯/醋酸酯，及水凝胶例如2-羟基乙基甲基丙烯酸酯(HEMA)。
在装置中可包含其它项目，例如治疗产品的其它常规组分，取决于要求的装置特性。例如，本发明组合物也可包含一种或多种防腐剂或抑菌剂例如羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、氯甲酚、苯扎氯铵等。这些药用组合物也可包含其它活性组分例如抗菌剂，尤其是抗生素、麻醉剂、镇痛剂和止痒剂。
作为栓剂给药
本发明的组合物可配制为栓剂给药。首先使低熔点蜡例如脂肪酸甘油酯与可可脂的混合物熔融并且例如通过搅拌使活性组分均匀分散。然后将熔融的均匀混合物倾入到合适大小的模具中，使之冷却并固化。
活性组合物可配制为包含例如约0.5％-50％用聚乙二醇(PEG)载体(例如PEG 1000[96％]和PEG 4000[4％]处理的本发明组合物的栓剂。
本发明的组合物可配制为用于阴道给药。阴道栓剂、棉塞、霜剂、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾剂除含活性组分以外，适宜时还包含如本领域已知的此类载体。
呼吸道给药
本发明的组合物可配制为用于鼻给药。溶液剂或混旋剂通过例如用滴管、吸管或喷雾器的常规方法直接用于鼻腔。制剂可以单或多剂量形式提供。在滴管或吸管的后者情况中，这可通过患者给予合适的、预定体积的溶液剂或混旋剂达到。在喷雾器的情况中，这可例如通过计量雾化喷雾器泵达到。
本发明的组合物可配制为用于气雾剂给药，具体地讲是呼吸道并且包括鼻内给药。组合物通常具有例如5微米或更小等级的小粒度。这样的粒度可通过本领域已知的方法例如微粉化得到。活性组分以含有合适的抛射剂例如氯氟烃(chlorofluorocarbon)(CFC)如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷或二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适气体的加压包装形式提供。气雾剂也可便利地包含表面活性剂例如卵磷脂。药物剂量可通过计量阀控制。或者活性组分可以干燥粉末例如组合物在合适的粉末基质如乳糖、淀粉、淀粉衍生物例如羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷(PVP)中的粉末混合物形式提供。粉末载体将在鼻腔形成凝胶。粉末组合物可以单位剂型例如以如粉末可通过吸入器从中给药的明胶或泡罩包装的胶囊剂或药筒形式呈现。
当要求时，制剂可用适合于缓释或控释给予活性组分的肠包衣制备。
药用制剂优选地以单位剂型的形式存在。在这样的形式中，制剂被亚分为含有合适量活性组分的单位剂量。单位剂型可为包装的制剂、含有独立量制剂的包装例如小包装的片剂、胶囊剂和在小瓶或安瓿中的粉末。而且，单位剂型可为胶囊剂、片剂、扁囊剂或锭剂本身，或者可为以包装形式存在的合适数目的任何这些剂型。
药学上可接受的盐
本化合物药学上可接受的盐，当它们可制备时，也打算包含在本发明范围内。这些盐为在它们用于药学用途时是可接受的那些盐。所谓盐指的是保持母体化合物生物活性的盐并且盐在其用途和用于治疗疾病时没有不适当或有害的作用。
药学上可接受的盐以标准方法制备。如果母体化合物为碱，用过量的有机或无机酸在合适的溶剂中处理。如果母体化合物为酸，用无机或有机碱在合适的溶剂中处理。
本发明化合物可以其以有效量存在的碱金属或碱土金属盐的形式与药学上可接受的载体或稀释剂共存、同时，或一起给予，并且尤其优选以其药用组合物的形式，通过口服、直肠或非肠道(包括皮下)途径给药。
用于本发明药用组合物的药学上可接受的酸加成盐的实例包括例如衍生于无机酸如盐酸、氢溴酸、磷酸、偏磷酸、硝酸和硫酸及有机酸如酒石酸、乙酸、枸橼酸、苹果酸、乳酸、富马酸、苯甲酸、乙醇酸、葡糖酸、琥珀酸、对-甲苯磺酸和芳基磺酸的那些盐。
给药形式
可制备药用组合物，以使其适合于一种或多种特殊的给药方法。另外，在此描述的治疗方法可包括不同的给药方法。
一般来说，其中LAC可以以活性LAC可到达疾病部位的方式给予个体的任何给药方法可用于本发明。
在治疗方法中药物传递的主要途径为静脉内、口服和局部给药，如以下描述的那样。也期待其它给药方法，例如皮下注射或通过吸入，这些方法有效地将药物传递至靶部位或将药物引入血流。
给予本发明药用制剂的粘膜可为被给予生物活性物质的哺乳动物的任何粘膜，例如鼻、阴道、眼、口腔、生殖道、肺、胃肠道或直肠，优选地为鼻、口腔或阴道的粘膜。
本发明的组合物可非肠道给药，即通过静脉、肌内、皮下、鼻内、直肠内、阴道内或腹膜内给药。非肠道给药的皮下和肌内形式通常为优选的。用于这样给药的合适剂型可通过常规技术制备。组合物也可通过吸入给药，即通过鼻内和口腔吸入给药。
用于这样给药的合适剂型例如气溶胶制剂或计量剂量吸入器可通过常规技术制备。
本发明的组合物可与至少一种其它化合物一起给药。化合物可同时或者作为分开的制剂或者以单位剂型联合给药或者顺序给药。
治疗
本发明的组合物可用于制备药物。这样的药物可用于治疗其中选择性细胞毒性是合乎需要的多种疾病。显然，α-乳清蛋白复合物能够防止细菌附着和病毒扩散。药物在实施方案中可用于治疗细菌和/或病毒感染。在另一个实施方案中，药物用于治疗癌症。
细菌感染
显然，α-乳清蛋白复合物能够防止细菌附着于细胞表面，例如上皮细胞或者通过另一种方式发挥对微生物的杀菌作用。
由细菌感染引起的疾病包括炭疽、细菌性脑膜炎、布鲁氏菌病、弯曲杆菌病、猫抓病、霍乱、白喉、流行性斑疹伤寒、淋病、脓疱疮、军团菌病、麻风(韩森氏病)、钩端螺旋体病、李斯特菌病、莱姆病、类鼻疽、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染、诺卡菌病、百日咳(百日咳)、瘟疫、肺炎球菌性肺炎、鹦鹉热、Q热、落基山斑点热(RMSF)、沙门氏杆菌病、猩红热、志贺氏菌病、梅毒、破伤风、沙眼、结核病、兔热病、伤寒、斑疹伤寒；尿路感染。
在一个实施方案中，本发明的组合物用于治疗细菌感染。
尤其是肺炎链球菌和流感嗜血杆菌是严重感染的重要原因。在一个优选的实施方案中，本发明的组合物用于制备用于治疗由例如肺炎链球菌或流感嗜血杆菌引起感染的药物。
病毒感染
α-乳清蛋白复合物的选择性细胞毒活性可抑制病毒感染的细胞，从而随着病毒复制前细胞被消灭，病毒的扩散受到抑制。
由病毒感染引起的疾病包括AIDS、AIDS相关复症、水痘(水痘)、感冒、巨细胞病毒感染、科罗拉多蜱热、登革热、埃博拉出血热、流行性腮腺炎、Explodicitis、手足口病、肝炎、单纯疱疹、带状疱疹、HPV、流行性感冒(Flu)、拉沙热、麻诊、马尔堡出血热、传染性单核细胞增多症、腮腺炎、脊髓灰质炎、渐进多病灶性脑白质病(leukencephalopathy)、狂犬病、]风疹、SARS、天花(天花)、病毒性脑炎、病毒性胃肠炎、病毒性脑膜炎、病毒性肺炎、西尼罗河病、黄热病。
在一个实施方案中，本发明的组合物用于治疗病毒感染。
不同类型的病毒例如呼吸道病毒、胃肠道病毒、免疫缺陷病毒如HIV和脑病毒如病毒性脑膜炎或其它内部器官病毒可采用本发明的组合物治疗。
呼吸道感染
呼吸道感染例如脑膜炎、中耳炎和窦炎由通过鼻咽进入的细菌引起。
呼吸道病毒感染可由例如腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感、Phinoviruses和冠状病毒引起。
在一个实施方案中，本发明的组合物用于治疗呼吸道感染。本发明的药物可以烟雾的形式被吸入到上呼吸道中。
肿瘤治疗
在一个实施方案中，良性或恶性两种类型肿瘤可进一步基于α-乳清蛋白复合物的选择性细胞毒活性采用本发明的组合物进行治疗。
疣
疣通常为小的粗糙肿瘤，一般在手和足，象花椰菜。疣为常见的并且由病毒感染引起，具体地讲由人乳头瘤病毒(HPV)引起。它们一般在几个月后消失但是可持续数年并可复发。
一些不同类型的疣已被鉴别，其在形状和损害部位方面有差别，包括：
普通疣(寻常疣)：具有粗糙化表面的隆起疣，最常见于手和膝。
扁平疣(扁平疣)：小的光滑平整疣，褐色或肉色，可以大数目出现；最常见于面部、颈、手、腕和膝。
丝状或指疣：丝状或指样疣，最常见于面部，尤其是睑和唇附近。
足底疣(疣，足疣)：硬质的有时疼痛的肿块，通常在中心具有多个黑斑，通常仅在足底发现压点。
马赛克样疣：一群紧密群集的足底型疣，通常在手或足底。
外阴疣(性病湿疣，尖锐湿疣，尖锐疣)：影响生殖器区域的疣。
在一个优选的实施方案中，本发明的组合物用于治疗疣，其优选地通过局部敷涂本发明药物治疗。
乳头状瘤
乳头状瘤指良性上皮瘤，其可或不可由人乳头瘤病毒引起。另一些原因为例如脉络膜丛乳头状瘤(CPP)。
通常与HPV有关的两种类型乳头状瘤为鳞状细胞乳头瘤和移行细胞乳头状瘤(也称作“膀胱乳头状瘤”)。
在一个优选的实施方案中，本发明的单体α-乳清蛋白复合物(优选LAC)组合物用于治疗乳头状瘤，其优选通过局部敷涂本发明的药物治疗。
癌症
癌性疾病在科学上称为瘤形成或赘生物并且可为良性或恶性的。癌症通过象肿瘤细胞的类型分类并且因此假定组织为肿瘤的起源。应用以下常见种类：
癌：衍生于上皮细胞的恶性肿瘤。该组包括最常见的癌症，包括常见形式的乳腺、前列腺、肺和结肠癌。
淋巴瘤和白血病：衍生于血液和骨髓细胞的恶性肿瘤。
肉瘤：衍生于结缔组织或间充质细胞的恶性肿瘤。
间皮瘤：衍生于间皮细胞内衬腹膜和胸膜的肿瘤。
神经胶质瘤：衍生于神经胶质的肿瘤，最常见类型为脑细胞瘤。
生殖细胞瘤：衍生于生殖细胞的肿瘤，通常存在于睾丸和卵巢。
绒毛膜癌：衍生于胎盘的恶性肿瘤。
在一个优选的实施方案中，本发明的单体α-乳清蛋白复合物(优选LAC)组合物用于治疗癌症。
本发明用于治疗癌症的药物优选地直接用于肿瘤。
粘膜肿瘤
就性质例如p.H.等而论，存在于粘膜表面的病症可能十分独特。粘膜表面尤其是存在于鼻道、口腔、咽喉、食管、肺、胃、结肠、阴道和膀胱内。
可按照本发明治疗的具体粘膜表面包括具有肿瘤的咽喉、肺、结肠和膀胱表面。
膀胱表面
膀胱癌指几种类型膀胱恶性生长中的任何一种。最常见类型的膀胱癌开始于膀胱内的细胞内衬并且称为尿道上皮细胞或移行细胞癌(UCC或TCC)。
在一个更优选的实施方案中，本发明的单体α-乳清蛋白复合物(优选LAC)组合物用于治疗膀胱癌。
成胶质细胞瘤
神经胶质瘤为一种由神经胶质细胞产生的原发性中枢神经系统(CNS)肿瘤类型。包含神经胶质瘤的最常见部位为脑，但是它们也可影响脊髓或者CNS的任何其它部分例如视神经。
在一个更优选的实施方案中，本发明的单体α-乳清蛋白复合物(优选LAC)组合物用于治疗神经胶质瘤/成神经胶质瘤。
血管生成
肿瘤血管新生为深入癌性生长，供给养分和氧并除去废物的血管网的增生。当肿瘤细胞释放向正常宿主组织发射信号的分子，激活基因和蛋白质以促进新血管生长时，开始血管生成过程。一系列天然的血管生成抑制剂已被发现并且确信防止和/或抑制癌细胞的生长和扩散。
发现α-乳清蛋白复合物可抑制血管生成进一步扩散和α-乳清蛋白在治疗和/或抑制癌症中的可应用性。
在一实施方案中，本发明的单体α-乳清蛋白复合物(优选LAC)组合物用于治疗血管生成。
治疗方法
本发明的一个方面涉及治疗有需要的个体的方法，其包括：
给予包含以下的药物：
i.包含单体α-乳清蛋白复合物(优选LAC)的组合物，LAC为α-乳清蛋白与脂肪酸或脂质的复合物，所述α-乳清蛋白为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的牛或人α-乳清蛋白或其功能等价物，其中组合物包含至少95％重量的单体α-乳清蛋白复合物，优选地为LAC，和
ii.药用赋形剂。
按照本发明，有需要的个体为患有或处于获得任何以上提及疾病的风险的任何个体。因此本发明的治疗可为治疗性治疗和/或预防性治疗两者。
给药方案
所给予的单体α-乳清蛋白复合物，优选LAC的剂量要求将随着所使用的特殊药物组合物、给药途径和所治疗的具体患者而变化。理论上，通过本方法治疗的患者将以最大耐受剂量，通常为不高于出现抗药性之前要求的剂量，接受药用有效量的化合物。
对于所述化合物在此公开的所有用法，每天口服剂量方案优选地为约0.01-80mg/kg总体重。每天非肠道剂量方案可为约0.001-80mg/kg总体重。每天局部剂量方案优选地为0.1mg-150mg，每天给药1-4次，优选地为2或3次。每天吸入剂量方案优选地为约0.01mg/kg-1mg/kg每天。本领域技术人员也应认识到化合物或其药学上可接受盐的个体剂量的最佳量和间隔将通过所治疗病症的性质和程度、给药的形式、途径和部位及所治疗的具体患者来确定并且这样的最佳方案可通过常规技术确定。本领域技术人员也应意识到最佳疗程，即所给予一定天数的化合物或其药学上可接受盐的每天给药次数可由本领域技术人员采用治疗确定试验的常规过程确定。
活性化合物的每天剂量可以变化并且取决于给药途径的类型，但是作为常规，对个人给药为1-100mg/剂量的活性化合物，和在局部给药为2-200mg/剂量。每24小时的使用次数取决于给药途径，但是可以变化，例如在鼻子局部应用的情况中为每24小时3-8次，即取决于治疗使用中所治疗身体产生粘痰的流动性。
如在此使用的术语“单位剂型”指适合作为人和动物患者的单一剂量的物理分散单位，每一个单位含有单独或与其它药物联合的以足以产生要求作用的量计算的预定量的化合物，以及药学上可接受的稀释剂、载体或媒介物。本发明单位剂型的规格取决于所使用的特殊的一种或多种化合物和欲达到的作用以及与宿主体内每一种化合物相关的药物动力学。所给予的剂量应为“有效量”或在个体患者中达到“有效水平”的必要的量。
因为“有效水平”用作给药的优选重点，实际剂量和计划可以变化，这取决于在药物代谢动力学、药物分布和代谢方面的个体差异。“有效水平”可被例如定义为患者体内要求的与一种或多种本发明化合物浓度相符的血液或组织水平。
绘图的详细描述
图1A.马、猪、骆驼、人、牛和羊α-乳清蛋白的序列比对。图1B：人和牛α-乳清蛋白的序列比对。
图2.生产方法的图解概述。
图3.在转化为α-乳清蛋白复合物之前(A)和之后(B)α-乳清蛋白组合物的尺寸排阻色谱(SEC)层析图。(A)自4个连续HIC纯化的bLA的SEC-HPLC层析图，用40mg/cm²以上树脂的bLA载荷操作，显示单一的单体bLA峰，保留时间为24.6分钟。B)自A中显示的纯化bLA库产生的bLAC的SEC-HPLC层析图。
图4.bLA和bLAC的蛋白质印迹。泳道1：Presicion Plus Merker(BioRad)，泳道2：纯化的bLA(Fluka 61289)，泳道3-5：如在实施例1中所述纯化的bLA，泳道6-8：用载荷32mg/cm²纯化的bLA，导致如在实施例3中显示的在23分钟洗脱的二聚体峰-在23分钟洗脱泳道6峰流分，在24.6分钟洗脱泳道7中间体流分、泳道8峰流分，在4℃贮存泳道9bLAC产物，在-20℃贮存泳道10bLAC产物。单体带移行仅约10kDa表观分子量和二聚体带为15kDa。单体bLA样品已通过Bruker Microflex设备上的MALDI-MS采用标准方法分析，具有如对单体bLA预期的14196Da的质量。二聚体带移行为具有通过采用SEC标示，用已知分子量的分子操作的线性试验测定的28kDa的表观分子量。
图5.细胞毒性试验概述。
图6A.通过发光性(ViaLight)和锥虫蓝排斥测量的人α-乳清蛋白(hLAC)组合物N177-58B的细胞毒性试验。图6B.通过发光性(ViaLight)测量的牛α-乳清蛋白复合物(bLAC)组合物N262-34B的细胞毒性试验。
图7A.α-乳清蛋白复合物(hLAC)组合物N177-58B和牛α-乳清蛋白复合物(bLAC)组合物N262-01E的细胞毒性试验。图7B.牛α-乳清蛋白(bLAC)组合物N262-35B-093和N262-35B-094的细胞毒性试验。
图8.用32mg/cm²载荷，自牛乳纯化的bLA(A)的SEC-HPLC层析图并在转化后生成bLAC产物(B)。bLA和bLAC产物两者显示在23分钟洗脱的二聚体峰，而单体bLA和bLAC在24.6±0.5分钟洗脱。样品通过蛋白质印迹分析(图4)。
图9.在不同盐浓度下，于bLA转化为bLAC期间洗脱的峰表征。bLA/bLAC二聚体的保留时间＝23分钟；bLA/bLAC单体的保留时间＝25分钟。
实施例
实施例1
牛α-乳清蛋白的纯化和转化为bLAC
通过以3500xg离心30分钟使全脂牛奶(2L)脱脂。将脱脂牛奶进行硫酸铵沉淀过夜(264g/L＝40-45％饱和度)，之后，使沉淀物在3500xg离心30分钟。收获硫酸铵沉淀上清液并首先通过纸滤器过滤以除去任何剩余的沉淀物或脂肪，随后通过具有Polysep II介质1.0/0.5μm的Millipore Optiscale滤器。
通过加入32.55mL EDTA(0.25M)+24.97mL Tris-EDTA(Tris50mM，EDTA 1mM，pH 7.5)+67.45mL每100mL硫酸铵沉淀上清液使硫酸铵沉淀上清液达到适合于HIC层析法。条件介质被调节至pH7.5。
通过在装填300mL苯基琼脂糖6FF High Sub(GE Healthcare)的床高为15cm和面积为19.6cm²的GE Healthcare XK50/30柱上应用条件介质，采用疏水作用层析纯化牛α-乳清蛋白。整个层析操作以流速40cm/hr和载荷40mg bLA每cm²实施。
在应用条件介质前，柱用5个柱体积(CV)的平衡溶液(Tris 50mM，EDTA 1mM，pH 7.5)平衡。
柱平衡后应用经过调节的硫酸铵沉淀上清液，之后用3CV的平衡溶液(Tris 50mM，EDTA 1mM，pH 7.5)洗涤柱。用2CV的洗脱溶液(Tris 50mM，CaCl₂ 1mM，pH 7.5)洗脱结合于树脂的bLA。用流分收集器收集洗脱的bLA，主峰样品体积为约150-200mL。回收bLA约600mg。
在层析操作后，用水洗涤柱并用NaOH(1M)再生。
从平衡至再生的层析操作持续约415分钟。
在转化之前通过Mini kleenpak 20滤器(Pall)过滤自HIC纯化回收的bLA。
在装填200mL DEAE Trisacryl加M(Pall Biosepra)树脂(床高为10cm和面积为19.6cm²)的GE Healthcare XK50/20柱上进行α-乳清蛋白的转化。整个层析操作以流速40cm/hr和载荷15mg bLA每cm²实施。
在应用自第一个HIC操作回收的bLA之前，柱用油酸预先处理。首先采用3CV的平衡溶液(Tris 10mM，NaCl 0.1M，pH 8.5)平衡柱。通过在柱上应用200μL油酸与2.5mL乙醇和200mL 10mM Tris(pH8.5)的溶液160mL实施油酸预处理，之后，先后用2CV的平衡溶液(Tris 10mM，NaCl 0.1M，pH 8.5)和3个梯度阶梯洗脱液洗涤柱。阶梯1为0-15％洗脱液(Tris 10mM，NaCl 1M，pH 8.5)1CV，阶梯2为15％洗脱液(Tris 10mM，NaCl 1M，pH 8.5)2CV，然后是2CV的100％洗脱液(Tris 10mM，NaCl 1M，pH 8.5)。阶梯洗脱后，柱用3CV的平衡溶液(Tris 10mM，NaCl 0.1M，pH 8.5)平衡。
在柱用油酸预处理后，在bLA应用到柱上之前，通过加入50mLTris(100mM)+50mL EDTA(0.25M)和300mL Milli-Q H₂O每100mL HIC回收液(pH 8.5和传导率为6.0±0.5mS/cm)调节通过HIC得到的bLA。
在应用经过调节处理的含有HIC回收液的bLA之后，先后用2CV的平衡溶液(Tris 10mM，NaCl 0.1M，pH 8.5)和3个梯度阶梯的洗脱液洗涤柱。阶梯1为0-15％洗脱液(Tris 10mM，NaCl 1M，pH 8.5)1CV，阶梯2为15％洗脱液(Tris 10mM，NaCl 1M，pH 8.5)2CV，然后是4CV的100％洗脱液(Tris 10mM，NaCl 1M，pH 8.5)。
用流分收集器收集bLAC，主峰样品体积为约150-200mL。回收的bLAC为约160mg。
在每一批次的bLA转化后，柱用2CV的乙酸(1M)、2CV的100mM Tris(pH 8.5)、2CV的NaOH(0.5M)、4CV的100mM Tris(pH 8.5)和2-3CV的20％乙醇(柱子贮存于其中)再生。
从预处理平衡至再生的转化层析操作持续约560分钟。
在缓冲液变化和浓缩前采用Mini kleenpak 20滤器(Pall)过滤bLAC。
转化的牛α-乳清蛋白被缓冲液改变并采用CrossFlow设备浓缩。采用KvickStart 5kDa超滤膜实施过滤。截留物质(retentate)流速为80mL/分钟，TMP限度为4.0巴和载荷＜9.6mg/cm²。将转化的牛α-乳清蛋白被浓缩为约9mg/mL和缓冲液经7次变化为0.9％NaCl。
通过蛋白质印迹测定单体和/或多聚体bLAC
以与油酸的复合物形式存在的牛α-乳清蛋白的单体和/或多聚体组合物(bLAC)可通过蛋白质印迹显象。单体和多聚体形式的bLAC可在16％SDS凝胶(PAGEgel)上分离并随后采用供应商(PAGEgel)推荐的标准方法印迹到PVDF膜上。单体和多聚体形式可通过采用HRP-标示稀释1∶6000的羊抗-牛-乳清蛋白(Bethyl A10-128P)并用化学发光底物(SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate，Pierce)检测在膜上免疫检测来显象(参见图3)。
通过SEC-HPLC测定单体和/或多聚体bLAC
以与油酸的复合物形式存在的牛α-乳清蛋白的单体/多聚体组合物(bLAC)可通过SEC-HPLC显象。单体和多聚体形式的bLAC可通过将25μL bLAC注射到Superdex 75，Tricorn 10/300柱(GE Health Care)上分离。柱用洗脱缓冲液(Tris 10mM，NaCl 140mM，NaN₃0.001％，pH7.4)平衡，直到得到稳定的基线。在应用bLAC样品后，用40mL洗脱缓冲液(Tris 10mM，NaCl 140mM，NaN₃0.001％，pH7.4)以38cm/hr的流速洗脱样品，导致每个样品运行时间为80分钟。在24.6±0.5分钟后洗脱单体形式的bLAC，而在23±0.5分钟后洗脱二聚体(参见图2)。
实施例2
单体α-乳清蛋白组合物的细胞毒性
按照以下的概述和在图4中所示，通过采用来自Cambrex的ViaLightPLUS细胞增殖和细胞毒性试剂盒(Cell Proliferation andCytotoxicity BioAssay Kit)，以生存力试验测试α-乳清蛋白组合物的细胞毒活性。LAC制剂的效力自它们杀死在用5％胎牛血清、1％非必需氨基酸和2mM丙酮酸钠补充的RPMI 1640培养基(不含HEPES)中培养的鼠淋巴细胞性白血病细胞系L1210(ATCC目录号CCL-219)的能力测定。
对于每一种测试的LAC制剂，以0.9％NaCl溶液制备适当的系列稀释液。将20μL的每一种稀释液(一式三份)在96-孔白壁细胞培养板上与在不含血清和HEPES的RPMI 1640培养基中含有100000或200000PBS-洗涤的L1210细胞的50μL细胞悬浮液混合。在37℃和5％CO₂下温育1小时后，向每孔加入5μL胎牛血清以钝化所有的细胞外LAC。在37℃和5％CO₂下温育另外1小时后，使细胞进一步经历细胞凋亡，然后测定培养物的生存力。
培养物的生存力可通过锥虫蓝排斥或者通过测定相对于用20μL0.9％NaCl溶液替代LAC处理的对照组培养基存在的ATP的量测定。ATP存在于所有的代谢活性细胞中。在死亡细胞中ATP迅速消失并且因此可假定仅有活的细胞包含ATP。因此，在ATP的相对水平与活细胞百分数之间存在直接的关联。ATP的相对量采用来自Cambrex的ViaLight PLUS试剂盒和发光计测定。为了定量ATP，采用以下反应：

发射光作为发光计上的发光测量。发光与ATP浓度线性相关。当采用该方法时，自培养箱取出板并使之冷却至室温10分钟。每孔加入来自ViaLight PLUS试剂盒的50μL溶解试剂并把板在室温下温育10分钟。然后向每孔加入来自ViaLight PLUS试剂盒的100μL AMRPLUS溶液并把板在室温下温育5分钟。以发光计读取板，总读取时间为1秒。
可从生成的数据将LAC剂量(μg每100000细胞或pg每细胞)对生存力或发光作图并可确定LD50(在所采用的条件和具体暴光时间下对50％的L1210细胞致死的LAC剂量)。发现得自发光测量方法的结果与通过锥虫蓝排斥得到的结果相当。
试验几个批次的α-乳清蛋白得到的结果显示在下表中。

表1.对L1210细胞的细胞毒活性。
实施例3
作为α-乳清蛋白复合物中单体/多聚体bLAC比率的决定因素的HIC载荷
单体/多聚体bLAC比率可通过经如在实施例1中描述的疏水作用层析纯化的bLA的单体/多聚体组合物控制。
2mg/mL凝胶(32mg/cm²)的载荷导致含有二聚体和单体两者形式的bLA(图8)，而6mg/mL树脂(90mg/cm²)的载荷结果为仅含有单体bLA(实施例1，图3)。如在实施例1中描述的那样实施bLA的转化。
实施例4
在每一次样品调节处理前新鲜制备3.5mM的油酸溶液。将油酸(20μL)与乙醇96％(0.25mL)和Tris-HCl(10mM)pH 8.5，NaCl(0.1M)(20mL)混合。
通过疏水作用层析(HIC)纯化的bLA用EDTA，Tris(0.1M pH 8.5)和油酸溶液调节处理。不同样品调节处理的描述显示在表4中。
表2：bLA样品调节处理

在应用到AIEC柱上之前，将调节处理的样品在室温下混合约30分钟。
用Q Sepharose XL树脂(GE healthcare)新近装填柱。将于表2中显示的不同bLA样品应用到该柱上。以下为AIEC操作的层析参数。
柱            用Q Sepharose XL(GE HealthCare#17-5072-99)装填
              8mL Tricorn 10/100
bLA载荷       LAC-034：34mL调节处理的样品(31mg/cm²)
              LAC-035/041：23mL调节处理的样品(30mg/cm²)
              LAC-042：33mL调节处理的样品(42mg/cm²)
              LAC-047：70mL调节处理的样品(90mg/cm²)
bLAC洗脱图    洗涤：平衡溶液                   (2CV)
分级梯度      梯度等级1：45％溶剂B(在溶剂A中)  (2CV)
              梯度等级2：70％溶剂B(在溶剂A中)  (2CV)
              梯度等级3：100％溶剂B            (2CV)
几种再生策略被试验：
再生                乙酸(1M)                (2CV)
在LAC034/035之前    用洗涤溶液              (2CV)
                    NaOH(0.5M)洗涤          (2CV)
                    用洗涤溶液              (2CV)
                    乙醇(20％)洗涤          (2CV)
再生                乙酸(1M)                (2CV)
在LAC041/042/047    用洗涤溶液              (2CV)
之前                NaOH(0.5M)洗涤          (2CV)
                    用洗涤溶液              (2-10CV)
                    乙醇(20％)              (2CV)
                    乙醇(70％)              (2CV)
                    乙醇(20％)洗涤          (2CV)
溶剂A               Tris(10mM)
                    NaCl(0.1M)
                    pH＝8.5(22℃)
溶剂B               Tris(10mM)
                    NaCl(1M)
                    pH＝8.5(22℃)
用70％乙醇的该再生方法以除去疏水结合的物质如油酸或bLAC。
产率和效力
按照标准方法，通过尺寸排阻HPLC(SE-HPLC)操作测定转化操作的产率。
通过细胞杀伤测定所转化的bLA的效力。如在下文实施例5中描述的那样实施细胞杀伤测定。通过细胞杀伤试验测定的bLAC效力以pg bLAC每细胞给出(LD50)。在以细胞杀伤测定试验前，采用NAP-25脱盐柱(GE HealthCare)将bLAC溶液对NaCl(0.9％)脱盐。
结果：转化操作的比较
在Q sepharose XL的几种转化操作层析图可见于图9。在所有操作中，EDTA的最终浓度为1mM。
转化操作的结果概述于表3中。对以70％溶剂B(在溶剂A中)洗脱的峰进行产率和细胞杀伤能力计算。
表3：转化操作概述

*在括号中，样品ID在脱盐后用于细胞杀伤测定。
**用0.2mM油酸转化
从表3显示的结果可见转化率超过80％。
相当于2.9、4.1和8.8mg/mL Q sepharose XL的不同bLA载荷30、42和90mg/cm²以LAC-041、-042和-047试验。发现转化率在最高载荷(LAC-047)时仍然超过80％。
SE-HPLC
从bLA至bLAC的不同转化操作洗脱的峰通过SE-HPLC分析。这些分析用于转化前和转化后的bLA/bLAC定量以确定操作的产率(参看表3)。该分析也给出转化后bLAC纯度即单体、二聚体或聚集形式的指标。当转化操作在不同bLA载荷下实施时，这尤其重要。
当查看SE-HPLC层析图(图9)时，可见以70％B-缓冲液回收的bLAC主要以单体形式存在。存在一个在较高载荷下仅回收bLAC单体的趋势。然后在第一个等级梯度以45％B-缓冲液回收含有较低量bLA单体的bLA二聚体。在45％B-缓冲液洗脱液中没有恢复细胞杀伤活性。
序列表
<110>Nya Hamlet Pharma A/B
<120>α-乳清蛋白组合物
<130>P1470PC00
<160>4
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>123
<212>PRT
<213>Bo taurus
<400>1
Glu Gln Leu Thr Lys Cys Glu Val Phe Arg Glu Leu Lys Asp Leu Lys
1               5                   10                  15
Gly Tyr Gly Gly Val Ser Leu Pro Glu Trp Val Cys Thr Thr Phe His
            20                  25                  30
Thr Ser Gly Tyr Asp Thr Gln Ala Ile Val Gln Asn Asn Asp Ser Thr
        35                  40                  45
Glu Tyr Gly Leu Phe Gln Ile Asn Asn Lys Ile Trp Cys Lys Asp Asp
    50                  55                  60
Gln Asn Pro His Ser Ser Asn Ile Cys Asn Ile Ser Cys Asp Lys Phe
65                  70                  75                  80
Leu Asp Asp Asp Leu Thr Asp Asp Ile Met Cys Val Lys Lys Ile Leu
                85                  90                  95
Asp Lys Val Gly Ile Asn Tyr Trp Leu Ala His Lys Ala Leu Cys Ser
            100                 105                 110
Glu Lys Leu Asp Gln Trp Leu Cys Glu Lys Leu
        115                 120
<210>2
<211>123
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>2
Lys Gln Phe Thr Lys Cys Glu Leu Ser Gln Leu Leu Lys Asp Ile Asp
1               5                   10                  15
Gly Tyr Gly Gly Ile Ala Leu Pro Glu Leu Ile Cys Thr Met Phe His
            20                  25                  30
Thr Ser Gly Tyr Asp Thr Gln Ala Ile Val Glu Asn Asn Glu Ser Thr
        35                  40                  45
Glu Tyr Gly Leu Phe Gln Ile Ser Asn Lys Leu Trp Cys Lys Ser Ser
    50                  55                  60
Gln Val Pro Gln Ser Arg Asn Ile Cys Asp Ile Ser Cys Asp Lys Phe
65                  70                  75                  80
Leu Asp Asp Asp Ile Thr Asp Asp Ile Met Cys Ala Lys Lys Ile Leu
                85                  90                  95
Asp Ile Lys Gly Ile Asp Tyr Trp Leu Ala His Lys Ala Leu Cys Thr
            100                 105                 110
Glu Lys Leu Glu Gln Trp Leu Cys Glu Lys Leu
        115                 120
<210>3
<211>142
<212>PRT
<213>Bo taurus
<400>3
Met Met Ser Phe Val Ser Leu Leu Leu Val Gly Ile Leu Phe His Ala
1               5                   10                  15
Thr Gln Ala Glu Gln Leu Thr Lys Cys Glu Val Phe Arg Glu Leu Lys
            20                  25                  30
Asp Leu Lys Gly Tyr Gly Gly Val Ser Leu Pro Glu Trp Val Cys Thr
        35                  40                  45
Thr Phe His Thr Ser Gly Tyr Asp Thr Gln Ala Ile Val Gln Asn Asn
    50                  55                  60
Asp Ser Thr Glu Tyr Gly Leu Phe Gln Ile Asn Asn Lys Ile Trp Cys
65                  70                  75                  80
Lys Asp Asp Gln Asn Pro His Ser Ser Asn Ile Cys Asn Ile Ser Cys
                85                  90                  95
Asp Lys Phe Leu Asp Asp Asp Leu Thr Asp Asp Ile Met Cys Val Lys
            100                 105                 110
Lys Ile Leu Asp Lys Val Gly Ile Asn Tyr Trp Leu Ala His Lys Ala
        115                 120                 125
Leu Cys Ser Glu Lys Leu Asp Gln Trp Leu Cys Glu Lys Leu
    130                 135                 140
<210>4
<211>142
<212>PRT
<213>人
<400>4
Met Arg Phe Phe Val Pro Leu Phe Leu Val Gly Ile Leu Phe Pro Ala
1               5                   10                  15
Ile Leu Ala Lys Gln Phe Thr Lys Cys Glu Leu Ser Gln Leu Leu Lys
            20                  25                  30
Asp Ile Asp Gly Tyr Gly Gly Ile Ala Leu Pro Glu Leu Ile Cys Thr
        35                  40                  45
Met Phe His Thr Ser Gly Tyr Asp Thr Gln Ala Ile Val Glu Asn Asn
    50                  55                  60
Glu Ser Thr Glu Tyr Gly Leu Phe Gln Ile Ser Asn Lys Leu Trp Cys
65                  70                  75                  80
Lys Ser Ser Gln Val Pro Gln Ser Arg Asn Ile Cys Asp Ile Ser Cys
                85                  90                  95
Asp Lys Phe Leu Asp Asp Asp Ile Thr Asp Asp Ile Met Cys Ala Lys
            100                 105                 110
Lys Ile Leu Asp Ile Lys Gly Ile Asp Tyr Trp Leu Ala His Lys Ala
        115                 120                 125
Leu Cys Thr Glu Lys Leu Glu Gln Trp Leu Cys Glu Lys Leu
    130                 135                 140
3
1