吸附灭活流感疫苗及其制备方法.pdf

本发明公开：对于新型流感病毒、特别是免疫原性低的新型病毒，以低的抗原水平即可有效且引起副作用反应少的吸附灭活全病毒流感疫苗及其制备方法。本发明尤其公开：含有由碳酸钠和硫酸铝钾制备的氢氧化铝凝胶以及分离的全病毒体流感病毒作为有效成分的吸附灭活流感疫苗、以及上述吸附灭活流感疫苗的制备方法，该方法的特征在于使用不含有表面活性剂和醚类的溶剂进行各步骤。

1.  吸附灭活流感疫苗，该流感疫苗含有由碳酸钠和硫酸铝钾制备的氢氧化铝凝胶、以及全病毒体流感病毒作为有效成分。

2.  权利要求1所述的疫苗，其中，全病毒体流感病毒是在表面活性剂和醚类的非存在下，由病毒悬浮液纯化而成。

3.  权利要求1或2所述的疫苗，其中，该疫苗具有以下性状：
(1)全病毒体流感病毒与氢氧化铝凝胶的吸附率为90％以上，以及
(2)全病毒体流感病毒的血凝素活性为总血凝素活性的80％以上。

4.  权利要求1～3中任一项所述的疫苗，其中，铝浓度为0.1mg/mL以上且低于0.8mg/mL，全病毒体流感病毒的浓度为3.4～100μgHA/mL。

5.  权利要求1～4中任一项所述的疫苗，其中，与氢氧化铝凝胶混合前的病毒原液中的流感病毒具有下述性状：
(i)通过解析性蔗糖密度梯度离心法分析病毒原液时，总血凝素活性的80％以上聚集在病毒颗粒组分中，以及
(ii)将病毒原液供给凝胶过滤高效液相色谱时，280nm的吸收波谱为没有肩的单一的峰。

6.  权利要求1～5中任一项所述的疫苗，其中，在将与氢氧化铝凝胶混合前的病毒原液用20000～30000倍倍率的电子显微镜观察时，病毒原液中的流感病毒中，病毒的80％以上保持全病毒体形态。

7.  权利要求1～6中任一项所述的疫苗，其中，流感病毒是由选自H2和H4～H16型以及选自N1～N9型的组合而形成的亚型。

8.  吸附灭活流感疫苗的制备方法，该吸附灭活流感疫苗含有全病毒体流感病毒作为有效成分，制备方法的特征在于：使用不含有表面活性剂和醚类的溶剂进行下述(1)～(5)的步骤：
(1)培养流感病毒以制备病毒悬浮液的步骤；
(2)通过过滤或离心纯化上述病毒悬浮液的步骤；
(3)用福尔马林使上述纯化的病毒液灭活的步骤；
(4)将上述灭活的病毒液过滤，制备病毒原液的步骤；以及
(5)将上述病毒原液中的流感病毒吸附于氢氧化铝凝胶上的步骤。

9.  权利要求8所述的制备方法，其中，氢氧化铝凝胶由碳酸钠和硫酸铝钾制备而成。

10.  权利要求8或9中任一项所述的制备方法，其中，流感病毒是由选自H2和H4～H16型以及选自N1～N9型的组合而形成的亚型。

11.  预防或减轻流感的方法，该方法包含将有效量的吸附灭活流感疫苗给予对象，其中，所述吸附灭活流感疫苗含有由碳酸钠和硫酸铝钾制备的氢氧化铝凝胶、以及全病毒体流感病毒作为有效成分。

12.  权利要求11所述的方法，其中，全病毒体流感病毒是在表面活性剂和醚类的非存在下，由病毒悬浮液纯化而成。

13.  权利要求11或12所述的方法，其中，该方法具有下述性状：
(1)全病毒体流感病毒与氢氧化铝凝胶的吸附率为90％以上；以及
(2)总血凝素活性为80％以上。

14.  权利要求11～13中任一项所述的方法，其中，铝浓度为0.1mg/mL以上且低于0.8mg/mL，全病毒体流感病毒的浓度为3.4～100μgHA/mL。

15.  权利要求11～14中任一项所述的方法，其中，与氢氧化铝凝胶混合前的病毒原液中的流感病毒具有下述性状：
(i)通过解析性蔗糖密度梯度离心法分析病毒原液时，总血凝素活性的80％以上聚集在病毒颗粒组分中；以及
(ii)将病毒原液供给凝胶过滤高效液相色谱时，280nm的吸收波谱为没有肩的单一的峰。

16.  权利要求11～15中任一项所述的方法，其中，在将与氢氧化铝凝胶混合前的病毒原液用20000～30000倍倍率的电子显微镜观察时，病毒原液中的流感病毒中，病毒的80％以上保持全病毒体形态。

17.  权利要求11～16中任一项所述的方法，其中，流感病毒是由选自H2和H4～H16型以及选自N1～N9型的组合而形成的亚型。

18.  由碳酸钠和硫酸铝钾制备的氢氧化铝凝胶以及全病毒体流感病毒在吸附灭活流感疫苗的制备中的应用。

19.  权利要求18中所述的应用，其中，全病毒体流感病毒是在表面活性剂和醚类的非存在下，由病毒悬浮液纯化而成。

20.  权利要求18或19中所述的应用，其中，该应用具有下述性状：
(1)全病毒体流感病毒与氢氧化铝凝胶的吸附率为90％以上；以及
(2)总血凝素活性为80％以上。

21.  权利要求18～20中任一项所述的应用，其中，铝浓度为0.1mg/mL以上且低于0.8mg/mL，全病毒体流感病毒的浓度为3.4～100μg HA/mL。

22.  权利要求18～21中任一项所述的应用，其中，与氢氧化铝凝胶混合前的病毒原液中的流感病毒具有下述性状：
(i)通过解析性蔗糖密度梯度离心法分析病毒原液时，总血凝素活性的80％以上聚集在病毒颗粒组分中；以及
(ii)将病毒原液供给凝胶过滤高效液相色谱时，280nm的吸收波谱为没有肩的单一的峰。

23.  权利要求18～22中任一项所述的应用，其中，在将与氢氧化铝凝胶混合前的病毒原液用20000～30000倍倍率的电子显微镜观察时，病毒原液中的流感病毒中，病毒的80％以上保持全病毒体形态。

24.  权利要求18～23中任一项所述的应用，其中，流感病毒是由选自H2和H4～H16型以及选自N1～N9型的组合而形成的亚型。

25.  商业包装，该商业包装包含上述权利要求1～7中任一项所述的吸附灭活流感疫苗、以及记载了可将或应将该疫苗用于预防或减轻流感的说明。

吸附灭活流感疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及吸附灭活全病毒流感疫苗及其制备方法。
背景技术
流感病毒是属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、具有直径约100nm颗粒大小的RNA有包膜病毒，根据其内部蛋白的抗原性分为A、B和C型。流感病毒含有被具脂双层结构的病毒包膜包围的、与内部核壳或核蛋白缔合的核糖核酸(RNA)的芯，以及外部糖蛋白。病毒包膜的内层主要由基质蛋白构成，外层大部分由来自宿主的脂类物质构成。流感病毒的RNA具有分节结构。目前在世界大流行的流感由A型流感病毒引起。A型具有血细胞凝集素(HA)和神经氨酸酶(NA)两种包膜糖蛋白，根据其抗原性的不同，HA分为16种亚型，NA分为9种亚型。
对于A型流感病毒目前对其了解到：在人以外的鸟、猪、马等动物间分布，因此人与动物的病毒之间发生基因重组，结果出现具有新抗原性的亚型病毒(新型病毒)，并且该新型病毒在不具有免疫的人群中大流行。目前，已知有西班牙流感(Hsw1N1)、亚洲流感(H2N2)、香港流感(H3N2)流行。近年来以东南亚为中心，观测到H5N1亚型高病原性禽流感的发生、流行，目前有1.5亿只以上的大量家禽死亡或被淘汰。并且也有人被感染的例子，仅至2006年9月可确诊的就已经达到246人。另人感到威胁的是其死亡率，246人中有144人死亡。通常，禽流感病毒并不容易感染人，其性质基本上不发生变化。但是，由于病毒的变异，获得了对人的易感染性，在人群中大流行时，则可能发生前所未有的惨剧。鉴于其大流行，新型流感疫苗的开发成为当务之急。但是，1997年在香港首次报道了人的感染病例以来，虽然疫苗开发被认为是当务之急，但是并不容易进展。其最大原因是H5N1亚型禽流感病毒的免疫原性低，因此以往的禽流感疫苗存在难以将足够的疫苗效果赋予接种者的问题。因此，提高免疫原性的一些对策是很重要的。
流感疫苗大致分为两种。一种是目前所使用的流感疫苗，是含有亚病毒体的片段疫苗，该亚病毒体是将纯化病毒颗粒用有机溶剂/表面活性剂或其它试剂分解、使脂包膜溶解而形成；或者是含有纯化HA和NA的亚单位疫苗。主要给予肌内或皮下。另一种是将纯化的病毒颗粒用福尔马林等试剂进行化学灭活的疫苗，也称为全病毒疫苗。这种情况下，病毒基因或病毒蛋白被化学改性，只是使感染性消失，因此病毒以保持颗粒形状的状态形成疫苗抗原。全病毒疫苗与片段疫苗相比，免疫原性高，特别是对于尚未有感染经历、即不具有免疫记忆的初次个体可引发良好的免疫应答。人对于新型流感不具有免疫记忆，因此，从有效性角度考虑，优选全病毒疫苗的该特征。但是，全病毒疫苗的免疫性高的特性意味着其生物活性高，与接种时的局部肿胀、红肿、或发热等副反应密切相关。即，如果可以确立全病毒疫苗在产生高免疫原性的同时可以降低其副反应的一些方法，则可以开发有效且安全性高的疫苗。
新型流感疫苗的剂型有望是具有高免疫原性的全病毒疫苗。但是，当为H5N1亚型时，有即使通过该全病毒疫苗也难以在人体内激发良好的免疫应答的报道，因此必须考虑进一步提高免疫原性的方案。
佐剂是为了提高抗原的免疫原性而添加到疫苗中的免疫增强剂，目前探讨了很多物质。例如，为了提高流感疫苗的有效性，还研究了结合使用铝佐剂(专利文献7)。还已知使用聚氧乙烯醚(Tween(注册商标))等非离子表面活性剂作为粘膜给予用疫苗的佐剂(专利文献8)。
有几种侯选佐剂，可以添加到DPT疫苗或乙型肝炎疫苗中、长期、广泛的安全性已得到确认的铝佐剂得到最广泛的探讨。铝佐剂具有免疫活化作用，同时通过吸附抗原可以将少量的抗原保留在局部，具有所谓的贮库效应(deposit effect)，因此具有可降低疫苗的抗原水平的优异特性。对于以全人类为接种对象的大流行疫苗，如何将疫苗供给更多的人是一个大的课题，该特性在疫苗设计上有较大优势。因此，如果使用铝佐剂作为疫苗，则抗原与铝凝胶的吸附性成为极重要的因素。
专利文献1：WO91/03552
专利文献2：WO01/004333
专利文献3：WO00/060050
专利文献4：WO2001/083794
专利文献5：WO2002/067983
专利文献6：WO2002/074336
专利文献7：WO00/015251
专利文献8：WO99/52549
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于提供对于新型流感病毒、特别是免疫原性低的新型病毒，以低的抗原水平即可有效、且引起副作用反应少的吸附灭活全病毒流感疫苗及其制备方法。
解决课题的方法
本发明人等对上述问题进行了深入的研究，结果发现：通过将提高对人的免疫原性、引起副作用少的佐剂与灭活全病毒体病毒组合，可实现上述目的，从而完成了本发明。即，本发明如下所示。
[1]吸附灭活流感疫苗，该流感疫苗含有由碳酸钠和硫酸铝钾制备的氢氧化铝凝胶、以及全病毒体流感病毒作为有效成分。
[2][1]所述的疫苗，其中，全病毒体流感病毒是在表面活性剂和醚类的非存在下，由病毒悬浮液纯化而成。
[3][1]或[2]所述的疫苗，其中，该疫苗具有以下性状：(1)全病毒体流感病毒与氢氧化铝凝胶的吸附率为90％以上，以及(2)全病毒体流感病毒的血凝素活性为总血凝素活性的80％以上。
[4][1]～[3]中任一项所述的疫苗，其中，铝浓度为0.1mg/mL以上且低于0.8mg/mL，全病毒体流感病毒的浓度为3.4～100μgHA/mL。
[5][1]～[4]中任一项所述的疫苗，其中，与氢氧化铝凝胶混合前的病毒原液中的流感病毒具有下述性状：
(i)通过解析性蔗糖密度梯度离心法分析病毒原液时，总血凝素活性的80％以上聚集在病毒颗粒组分中，以及
(ii)将病毒原液供给凝胶过滤高效液相色谱时，280nm的吸收波谱为没有肩的单一的峰。
[6][1]～[5]中任一项所述的疫苗，其中，在将与氢氧化铝凝胶混合前的病毒原液用20000～30000倍倍率的电子显微镜观察时，病毒原液中的流感病毒中，病毒的80％以上保持全病毒体形态。
[7][1]～[6]中任一项所述的疫苗，其中，流感病毒是由选自H2和H4～H16型以及选自N1～N9型的组合而形成的亚型。
[8]吸附灭活流感疫苗的制备方法，该吸附灭活流感疫苗含有全病毒体流感病毒作为有效成分，制备方法的特征在于：使用不含有表面活性剂和醚类的溶剂进行下述(1)～(5)的步骤：
(1)培养流感病毒以制备病毒悬浮液的步骤；
(2)通过过滤或离心纯化上述病毒悬浮液的步骤；
(3)用福尔马林使上述纯化的病毒液灭活的步骤；
(4)将上述灭活的病毒液过滤，制备病毒原液的步骤；以及
(5)将上述病毒原液中的流感病毒吸附于氢氧化铝凝胶上的步骤。
[9][8]所述的制备方法，其中，氢氧化铝凝胶由碳酸钠和硫酸铝钾制备而成。
[10][8]或[9]中任一项所述的制备方法，其中，流感病毒是由选自H2和H4～H16型以及选自N1～N9型的组合而形成的亚型。
[11]预防或减轻流感的方法，该方法包含将有效量的吸附灭活流感疫苗给予对象，其中，所述淀灭活流感疫苗含有由碳酸钠和硫酸铝钾制备的氢氧化铝凝胶、以及全病毒体流感病毒作为有效成分。
[12][11]所述的方法，其中，全病毒体流感病毒是在表面活性剂和醚类的非存在下，由病毒悬浮液纯化而成。
[13][11]或[12]所述的方法，其中，该方法具有下述性状：
(1)全病毒体流感病毒与氢氧化铝凝胶的吸附率为90％以上；以及
(2)总血凝素活性为80％以上。
[14][11]～[13]中任一项所述的方法，其中，铝浓度为0.1mg/mL以上且低于0.8mg/mL，全病毒体流感病毒的浓度为3.4～100μgHA/mL。
[15][11]～[14]中任一项所述的方法，其中，与氢氧化铝凝胶混合前的病毒原液中的流感病毒具有下述性状：
(i)通过解析性蔗糖密度梯度离心法分析病毒原液时，总血凝素活性的80％以上聚集在病毒颗粒组分中；以及
(ii)将病毒原液供给凝胶过滤高效液相色谱时，280nm的吸收波谱为没有肩的单一的峰。
[16][11]～[15]中任一项所述的方法，其中，在将与氢氧化铝凝胶混合前的病毒原液用20000～30000倍倍率的电子显微镜观察时，病毒原液中的流感病毒中，病毒的80％以上保持全病毒体形态。
[17][11]～[16]中任一项所述的方法，其中，流感病毒是由选自H2和H4～H16型以及选自N1～N9型的组合而形成的亚型。
[18]由碳酸钠和硫酸铝钾制备的氢氧化铝凝胶以及全病毒体流感病毒在吸附灭活流感疫苗的制备中的应用。
[19][18]中所述的应用，其中，全病毒体流感病毒是在表面活性剂和醚类的非存在下，由病毒悬浮液纯化而成。
[20][18]或[19]中所述的应用，其中，该应用具有下述性状：
(1)全病毒体流感病毒与氢氧化铝凝胶的吸附率为90％以上；以及
(2)总血凝素活性为80％以上。
[21][18]～[20]中任一项所述的应用，其中，铝浓度为0.1mg/mL以上且低于0.8mg/mL，全病毒体流感病毒的浓度为3.4～100μgHA/mL。
[22][18]～[21]中任一项所述的应用，其中，与氢氧化铝凝胶混合前的病毒原液中的流感病毒具有下述性状：
(i)通过解析性蔗糖密度梯度离心法分析病毒原液时，总血凝素活性的80％以上聚集在病毒颗粒组分中；以及
(ii)将病毒原液供给凝胶过滤高效液相色谱时，280nm的吸收波谱为没有肩的单一的峰。
[23][18]～[22]中任一项所述的应用，其中，在将与氢氧化铝凝胶混合前的病毒原液用20000～30000倍倍率的电子显微镜观察时，病毒原液中的流感病毒中，病毒的80％以上保持全病毒体形态。
[24][18]～[23]中任一项所述的应用，其中，流感病毒是由选自H2和H4～H16型以及选自N1～N9型的组合而形成的亚型。
[25]商业包装，该商业包装包含上述[1]～[7]中任一项所述的吸附灭活流感疫苗、以及记载了可将或应将该疫苗用于预防或减轻流感的说明。
发明效果
根据本发明，可以提供以全病毒体流感病毒为有效成分、可以以少的抗原水平诱导对人的有效的免疫应答、且引起副反应少的新型流感疫苗、吸附灭活全病毒流感疫苗，可以确实地应对新型流感的世界性流行。本发明的疫苗含有由碳酸钠和硫酸铝钾制备的氢氧化铝凝胶(盐)作为佐剂，因此可以以少的抗原水平诱导对人的有效的免疫应答，可充分确保流感疫苗的供应量。根据本发明的吸附灭活全病毒流感疫苗的制备方法，通过良好保持病毒颗粒的抗原性，可以提供诱导有效的免疫应答、且引起副反应少的新型流感疫苗。

附图简述
图1表示本发明的病毒原液和疫苗的制备步骤的概略图。
图2表示比较例的病毒原液和疫苗的制备步骤的概略图。
图3是表示使用实施例2和比较例2的凝胶制备的疫苗在动物中的免疫原性的图表。
图4是表示使用通过B法制备的吸附灭活新型流感疫苗、以20岁～40岁健康成年男性为对象实施I期试验的结果的图表。
图5是由实施例1(A法)、比较例1(B法)分别制备的病毒原液的电子显微镜照片。
图6是表示对于由实施例1(A法)、比较例1(B法)分别制备的病毒原液进行解析性蔗糖密度梯度离心的分析结果的图表。
图7A和图7B是分别表示对于由实施例1(A法)和比较例1(B法)制备的病毒原液进行凝胶过滤HPLC分析的结果的图表。
图8是表示I期临床试验中、疫苗接种后中和抗体效价的图表。
图9是表示接种疫苗的小鼠的HI抗体生成的图表。
图10是表示豚鼠的异常毒性试验结果的图表。
图11是表示使用实施例2和比较例2的凝胶制备的疫苗中病毒的吸附率的图表。
实施发明的最佳方式
本发明提供吸附灭活流感疫苗，该疫苗含有由碳酸钠和硫酸铝钾制备的氢氧化铝凝胶、以及全病毒体流感病毒作为有效成分。
本发明的疫苗的特征在于：含有由碳酸钠和硫酸铝钾制备的氢氧化铝凝胶作为佐剂。使用所述凝胶，则可以显著提高全病毒体病毒的吸附率，提高疫苗对人的免疫原性。作为佐剂的原料的碳酸钠和硫酸铝钾可以无限定地使用通常用于制备氢氧化铝凝胶而使用的试剂。硫酸铝钾优选使用被称为钾明矾的硫酸铝钾12水合物AlK(SO₄)₂·12H₂O。氢氧化铝凝胶的制备方法如后所述。
本发明的疫苗的特征在于：含有全病毒体流感病毒作为抗原。本发明中，流感病毒包含目前已知的所有亚型、以及将来可分离、鉴定的亚型。从目前未见在人群中流行、有效防止今后对人的感染的角度考虑，流感病毒优选为由选自除H1和H3之外的H1～H16(即H2和H4～H16)型和选自N1～N9型的组合而形成的亚型。这些亚型也被称为新型流感病毒。上述亚型更优选选自H5、H7和H9型与选自N1～N9型的组合。流感病毒可以是属于同一亚型的一种病毒株，也可以是属于同一亚型的2种以上的病毒株，还可以是属于不同亚型的2种以上的病毒株。
本发明中，全病毒体流感病毒是指保持病毒的形态，从培养流感病毒得到的病毒悬浮液中纯化而成的病毒颗粒。因此，本发明的流感疫苗是指除去含有亚病毒体的片段疫苗、以及含有纯化HA或NA的亚单位疫苗之外的疫苗，也称为全病毒疫苗。
如上所述，本发明人等发现：通过对上述全病毒疫苗使用具有高吸附率的佐剂，可以获得以低的抗原水平即可有效且引起副作用反应少的疫苗，特别是与其它疫苗比较时，即使在人以外的哺乳动物中未见免疫原性的差别，对人的免疫应答也产生很大的差异，从而完成了本发明。
上述全病毒体流感病毒优选在表面活性剂和醚类的非存在下，由病毒悬浮液纯化而成。将为了供给与氢氧化铝凝胶的吸附而纯化或浓缩的、含有全病毒体流感病毒的病毒液称为“病毒原液”。流感病毒的纯化或浓缩方法如后所述。
为了制成以低的抗原水平即可有效且引起副反应少的疫苗，本发明的疫苗优选具有以下的(1)和(2)的性状。
(1)全病毒体流感病毒与氢氧化铝凝胶的吸附率为90％以上。该吸附率超过90％，则与上述全病毒体病毒的协同效果增大。其中，吸附率是指将氢氧化铝凝胶和全病毒体流感病毒在生理盐水中、在4～8℃下混合过夜，然后回收上清，测定上清的血凝素(HA)效价或蛋白质量，或者测定吸附在凝胶上的蛋白质量而求出的值。吸附率的详细测定方法在实施例中有记载。吸附率更优选95％以上，进一步优选97％以上。在全病毒体病毒相对于凝胶为过饱和的条件下混合时，吸附率可能低于90％，因此本发明中，在获得了低于90％吸附率时，可以适当减少抗原水平以达到90％以上。
(2)全病毒体流感病毒的血凝素活性相对于总血凝素活性为80％以上。更优选85％以上，进一步优选90％以上。该比例通过以下的操作进行测定。在吸附到凝胶上之前，将灭活的病毒液通过蔗糖密度梯度离心等进行分级。通常，全病毒体病毒聚集在40％左右的蔗糖浓度中，因此，所述比率可通过用该组分中的血凝素量除以所有组分的血凝素量来求出。另外，血凝素量可以以红血球聚集能力为指标、以HA效价的形式测定。总血凝素的80％以上存在于全病毒体流感病毒中，这成为疫苗中的病毒颗粒几乎保持完整形态的指标。本发明的疫苗中，上述良好的全病毒体性在获得上述协同效果方面是很重要的。
对于病毒体的形态，可通过下述方法确认。
i)将病毒原液供给凝胶过滤高效液相色谱时，280nm的吸收波谱为没有肩的单一的峰。吸收波谱是否为没有肩的单一峰，这可通过肉眼观察由该高效液相色谱得到的谱图，按照该领域的常规判断标准来确认。
ii)将病毒原液在20000～30000倍倍率的电子显微镜下观察时，病毒的80％以上保持完整的颗粒形态。病毒的完整的颗粒形态是以在病毒体周围观察到HA和NA的突起为指标，观察20～30个左右的病毒，求出完整的颗粒形态的病毒比例。
本发明的疫苗优选铝浓度为0.1mg/mL以上且低于0.8mg/mL，更优选0.2mg/mL以上且低于0.8mg/mL。上述浓度是由作为原料的钾明矾的用量计算而得到的值。或者，铝的浓度也可通过原子吸光分析求出。
本发明的疫苗优选全病毒体流感病毒的浓度为3.4～100μgHA/mL，更优选10～30μg HA/mL。上述浓度是通过测定全病毒体病毒蛋白的HA浓度而得到的值。蛋白质的测定方法在实施例中有记载。
本发明的疫苗除全病毒体流感病毒和氢氧化铝凝胶之外，可以进一步含有作为药物可接受的载体。上述载体可使用在疫苗制备中通常使用的载体，具体可例举盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、等渗性缓冲液以及它们的组合。还可以向其中适当配合防腐剂(例如硫柳汞)、等渗剂、pH调节剂和灭活剂(例如福尔马林)等。
本发明的疫苗可以全身给予，也可以局部给予。全身给予时，可以注射到肌内、皮下、皮内等。局部给予时，可以给予鼻腔内、咽头部。给予方法例如有喷雾、涂布等。
对本发明的疫苗的给予对象没有特别限定，例如有包含人类的哺乳类、鸟类等。
使用本发明的疫苗可以预防流感或减轻其症状。本发明提供预防或减轻流感的方法，该方法包含将有效免疫致敏量的本发明的疫苗给予对象的步骤。
疫苗的给予方法如上述例举所示。给予量可考虑对象的年龄、性别、体重等来确定，作为抗原，通常可以将1.7～50μg HA、优选5～15μg HA给予1次或2次以上。优选给予多次，这种情况下优选间隔1～4周进行给予。
本发明提供上述吸附灭活流感疫苗的制备方法。本发明的制备方法的特征在于：在制备全病毒体流感病毒作为抗原、将该病毒体吸附到作为佐剂的氢氧化铝凝胶上的整个步骤中，使用不含有表面活性剂和醚类的溶剂。其中，表面活性剂是指在疫苗的制备领域中通常使用的所有的表面活性剂，例如有阴离子性表面活性剂、阳离子性表面活性剂、非离子性表面活性剂等。为了不降低疫苗的免疫原性，大多使用非离子性表面活性剂，例如常用聚氧乙烯醚(Tween(注册商标))等。本发明的制备方法中不使用这些表面活性剂。另外，醚类是指在疫苗的制备领域中通常使用的所有的醚，例如有二乙醚等。本发明的制备方法中不使用这些醚类。
(1)培养流感病毒以制备病毒悬浮液的步骤
流感病毒可以是由感染动物或患者分离的病毒株，也可以是在基因工程中由培养细胞建立的重组病毒。流感病毒的培养方法可以是将病毒接种到鸡胚的尿囊腔内进行培养，也可以用病毒转染培养细胞并对该细胞进行培养。采用鸡胚时，培养条件是在30～37℃下培养1～7天左右；采用培养细胞时，根据所使用的细胞设定培养基、温度、培养时间。培养结束后通过常规方法回收病毒悬浮液。
(2)通过过滤或离心来纯化上述病毒悬浮液的步骤
对所得病毒悬浮液进行离心或过滤以得到澄清的溶液。根据需要为了浓缩还可进行超滤。之后，为了纯化病毒进行蔗糖密度梯度离心等超离心，由此获得纯化病毒液。
(3)用福尔马林灭活上述纯化的病毒液的步骤
对纯化病毒液进行灭活处理。病毒的灭活方法例如有福尔马林处理、紫外线照射、β-丙内酯等，优选用福尔马林进行处理。福尔马林处理的条件可适当设定，例如使用0.02％(v/v)的福尔马林溶液，在低温下对病毒进行数周的温育处理。
(4)过滤上述灭活的病毒液以制备病毒原液的步骤
本步骤中，过滤病毒液以制备病毒原液。根据需要在过滤的同时还可以对病毒进行浓缩。所述过滤包括超滤等。超滤可按照常规方法进行。
(5)使上述病毒原液中的流感病毒吸附在氢氧化铝凝胶上的步骤
流感病毒与氢氧化铝凝胶的吸附可以是将调节成规定的蛋白质浓度的病毒原液与氢氧化铝凝胶的悬浮液在4～8℃左右的低温下混合数小时至一晚。氢氧化铝凝胶可使用公知的物质，如上所述，优选由碳酸钠和硫酸铝钾制备的氢氧化铝凝胶。
实施例
以下，通过实施例详细说明本发明，但本发明并不受这些实施例的任何限定。
实施例1病毒原液的制备和试制疫苗的制备(步骤A法)
按照细菌制剂协会共通的方法制备病毒原液和试制疫苗，其概略如图1所示。
比较例1病毒原液的制备和试制疫苗的制备(步骤B法)
在实施例1和图1中，在病毒悬浮液的纯化步骤中使用Tween(注册商标)80，除此之外与实施例1同样，制备病毒原液和试制疫苗。其概略如图2所示。
实施例2氢氧化铝凝胶的制备
将143.1g碳酸钠溶解于9L生理盐水中，过滤以制备碳酸钠溶液。将316.0g硫酸铝钾12水合物(钾明矾)溶解于9L生理盐水中，过滤以制备硫酸铝钾溶液。将所得碳酸钠溶液和硫酸铝钾溶液混合并搅拌。洗涤所得氢氧化铝凝胶，作为本发明的佐剂使用。
比较例2氢氧化铝凝胶的制备
在室温下，边搅拌边向50.0mL 0.21M氯化铝水溶液(pH 2.95)中缓慢滴加63.1mL 0.50M NaOH水溶液，添加时间为55分钟。添加完成时的pH为9.00。将上述溶液在室温下进一步搅拌30分钟。此时的pH为9.00。将搅拌后的溶液在4℃下静置21.5小时，得到113mL氢氧化铝凝胶(pH 8.4)。将所得氢氧化铝凝胶在4℃下以2000rpm的转数离心10分钟，通过过滤收集沉淀物。向12.5mL上述沉淀物中加入29.25mL 0.01M PBS(pH 7.1)，确认pH升高至9.4，在121℃下高压灭菌20分钟。高压灭菌后的氢氧化铝凝胶的pH为8.4。
实施例3吸附灭活全病毒疫苗的制备
将实施例1所得的病毒原液和实施例2所得的氢氧化铝凝胶混合，得到吸附灭活全病毒疫苗。
比较例3吸附灭活全病毒疫苗的制备
将比较例1所得的病毒原液和比较例2所得的氢氧化铝凝胶混合，获得吸附灭活全病毒疫苗。
试验例1病毒对凝胶的吸附率
接着，使用新型流感病毒(NIBRG-14株)的灭活全病毒体研究抗原对各种铝凝胶的抗原吸附率。除钾明矾制氢氧化铝凝胶(实施例2)、氯化铝制氢氧化铝凝胶(比较例2)之外，对于下述市售氢氧化铝凝胶和磷酸铝凝胶也进行测定，比较抗原吸附率。
(试验材料)
(1)铝凝胶：
1)氢氧化铝凝胶“Aluminum Hydroxide Gel(A-8222)”(SIGMA制备)13mg-Al/mL
2)氢氧化铝凝胶“Alhydrogel(2％)”(Brenntag Biosector制备)10.8mg-Al/mL
3)磷酸铝凝胶“Adju-Phos”(Superfos Biosector制备)4.4mg-Al/mL
(2)病毒悬浮液
NIBRG-14株灭活全病毒体流感病毒疫苗原液(FPBM Z0401，按照实施例1所述的方法制备)。
(3)稀释液：
1)0.01M PBS(-)
2)生理盐水
(试验方法)
将上述铝凝胶与上述病毒悬浮液混合，回收上清。测定上清的蛋白质含量和HA效价，分别计算吸附率。
(抗原对铝凝胶的吸附率的测定方法)
(1)凝胶与抗原的混合
在铝凝胶悬浮液(相当于0.3mg-Al的量)、病毒悬浮液(相当于11.7、33.3或100μg-蛋白的量)中加入稀释液，使总液量为1mL，在冷室(4～8℃)中混合过夜。
(2)上清回收
离心混合液(TOMY微量高速离心机MC-150，1000rpm，5分钟)，回收上清。回收的上清作为蛋白质含量测定用材料或HA效价测定用材料。
(3)蛋白质含量测定
使用Micro BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce Biotechnology公司)测定上清的蛋白质含量。标准物质使用试剂盒所附的BSA溶液。
(4)HA效价测定
上清的HA效价是按照日本国立感染症研究所“病原体检测手册”的“流感HA效价的测定”的项目进行测定的。血细胞悬浮液使用0.5％鸡红细胞悬浮液。
(5)吸附率计算
用各检样的上清中的抗原含量除以不含有凝胶的对照检样的上清中的抗原含量，来计算吸附率(％)。
(结果)
使用0.01M-PBS作为稀释液时的蛋白质含量、由HA含量计算出的与各种市售铝凝胶的吸附率的结果如表1所示。
[表1]

对灭活的NIBRG-14(H5N1亚型株)或A/Wyoming/3/2003(H3N2亚型株)与氯化铝制氢氧化铝凝胶(比较例2中制备)和钾明矾制氢氧化铝凝胶(实施例2中制备)的吸附率进行比较。使灭活的两种病毒的终蛋白质浓度为100μg/mL、铝的终浓度为0.3mg/mL进行混合，在室温下温育15分钟。通过离心分离凝胶组分和上清，测定残留在上清中的蛋白质量，由此计算吸附率。结果如图11所示。A/Wyoming/3/2003与各种氢氧化铝凝胶均良好地吸附，但是NIBRG-14与氯化铝制氢氧化铝凝胶的吸附性差，只与钾明矾制氢氧化铝凝胶显示良好的吸附。由此显示，当H5N1亚型株为抗原时，优选使用钾明矾制氢氧化铝凝胶。
试验例2疫苗在动物中的免疫原性
为了比较评价制备方法不同的氢氧化铝盐带来的佐剂效果，制备添加了以氢氧化铝凝胶(比较例2中制备)和钾明矾作为原料的氢氧化铝凝胶(实施例2中制备)2种铝凝胶的灭活病毒抗原。将这些抗原按照每只ddY小鼠0.5、0.05μg(蛋白质量)的量、间隔3周免疫2次。二次免疫2周后采血，使用所得血清测定HI抗体效价(图3)。
由图3显示，在任何的给予组中，使用钾明矾制氢氧化铝凝胶作为佐剂的均显示高抗体应答。
参考例1疫苗对人的有效性
使用比较例3(B法)中制备的吸附新型流感疫苗试验药物，以20岁～40岁的健康成人男性为对象实施I期试验。将该疫苗以3周的间隔皮下接种2次。按照每次接种1.7μg HA(低用量)、5μg HA(中用量)和15μg HA(高用量)的三种抗原量进行比较。按照疫苗接种前后对强烈反映病毒感染防御能力的中和抗体效价进行比较，以此作为指标。其结果如图4所示，给予2次15μg HA的疫苗后，抗体效价为1∶40以上的转阳率为40％以下，并不另人满意。
参考例2疫苗对动物的有效性
以HA抗体效价作为指标，对实施例3(A法)和比较例3(B法)中分别制备的新型流感疫苗对小鼠和兔的免疫原性进行评价。使用小鼠的试验中，对每组8～10只BLAB/c小鼠以3周的间隔下肢肌内接种2次含有灭活病毒抗原的氢氧化铝凝胶(明矾)佐剂疫苗，浓度为0.04～3μg HA/只。二次免疫14天后测定小鼠血清的HI抗体效价，各组10只的平均HI抗体效价显示在表中。使用兔的试验中，对每组3只的白色家兔肌内分别给予15μg HA疫苗。结果如表2所示，试验动物中，无法区分由A法、B法制备的疫苗的免疫原性的差异。
[表2]

试验例3电子显微镜观察
将实施例1(A法)、比较例1(B法)中分别制备的原液置于铺有Formvar膜的电子显微镜观察用载网(grid)上，用2％磷钨酸染色后，以加速电压120KV进行观察(图5)。结果，以病毒体周围观察到HA和NA突起的病毒体作为完整病毒体时，在用A法制备的原液中，80％以上为完全病毒体，而用B法制备的原液中，几乎未见完整病毒体。
试验例4蔗糖密度梯度离心
对于由实施例1(A法)、比较例1(B法)分别制备的原液实施解析性蔗糖密度梯度离心。
在15～60％的蔗糖密度梯度上铺设(layer)1mL 180μg/mL蛋白质浓度的原液，在4℃下、以18000rpm离心约16小时。按照每种组分约0.5mL进行分级，测定各组分的蔗糖浓度、HA活性和蛋白质浓度。HA效价是使用鸡红细胞测定3次，将其几何平均值制表。对于蛋白质浓度，在将50μL各组分转印至PVDF膜后，用考马斯亮蓝染色，进行密度分析(图6)。
在各原液中，蔗糖浓度约为40％的组分中可见HA活性和蛋白质的峰。在A法中使用的HA活性的80％以上聚集在病毒峰中，在B法中，聚集率停留在50％以下。另外，B法中，在蔗糖浓度约17％的组分中也可见蛋白质的峰，但未见HA活性。
试验例5凝胶过滤HPLC
对于由实施例1(A法)、比较例1(B法)中分别制备的原液实施凝胶过滤HPLC。将原液用流动相(PBS)稀释，使蛋白质浓度为100μg/mL，以此作为试样，对于A法、B法中分别制备的原液，按照以下条件、通过液相色谱法进行分析。
检测器：紫外吸光光度计(测定波长：210，280nm)
柱：Tosoh制备的HPLC分析柱TSKgel G3000PWXL
柱温：25℃附近的恒温
流动相：0.01mol/L磷酸钠缓冲溶液(注1)PBS(pH7.4)
流量：每分钟约0.5mL
(注1)0.01mol/L磷酸钠缓冲溶液：将0.238g磷酸二氢钾、2.955g磷酸氢二钠十二水合盐溶解于水中，制成1000mL。
附图表示原液的凝胶过滤色谱(图7A和图7B，上部分：210nm，下部分：280nm)。图7中，保留时间9.9分钟观察到预想为病毒体病毒的峰。在B法中，在保留时间10.9分钟时观察到肩。
试验例6临床试验的免疫原性
制备添加了实施例1中制备的氢氧化铝凝胶的吸附新型流感疫苗试验药物，以20～40岁的健康成人男性为对象实施I期试验(图8)。将该疫苗以3周的间隔皮下或肌内接种2次。以每次接种1.7μg HA(低用量)、5μg HA(中用量)和15μg HA(高用量)三种抗原量进行比较。在疫苗接种前后对强烈反映出病毒感染防御能力的中和抗体效价进行比较，以此作为指标。高用量接种群中，皮下接种群为73％，肌内接种群中，所有例子中抗体效价升高4倍以上。中用量接种群中，皮下接种群为58％，肌内接肿群中可见抗体效价升高至75％。由此可以确认，添加了氢氧化铝凝胶的吸附流感疫苗在很多情况下对人也会引发免疫应答。
试验例7小鼠HI抗体的生成
以HI抗体效价作为指标，对于添加实施例1中制备的氢氧化铝凝胶(明矾)作为佐剂的新型流感疫苗对小鼠的免疫原性进行评价。小鼠每组10只，以3周的间隔于下肢皮下或肌内2次接种含有0.04～3μg HA/只灭活病毒抗原的有明矾制剂和无明矾制剂。二次免疫14天后测定小鼠血清的HI抗体效价，各组10只的平均HI抗体效价如图9所示。图9中，在皮下和肌内给予的任何组中，与无明矾制剂相比，有明矾制剂给予组的HI抗体效价高。由此可知，通过添加明矾，与未添加组相比，可引发高的抗体效价。
试验例8疫苗的安全性
异常毒性试验
在豚鼠中进行添加实施例1中制备的氢氧化铝凝胶(明矾)作为佐剂的新型流感疫苗的异常毒性试验。检样是30μg HA/mL灭活病毒抗原+0.3mg/mL明矾、30μg HA/mL灭活病毒抗原、0.3mg/mL明矾和生理盐水。将5mL各检样分别接种给各3只豚鼠，观察体重变化。各组3只的体重变化的平均值如图10所示。接种后第1天，在有明矾、无明矾制剂接种组中均见体重减少，有明矾制剂中，自第2天起体重增加，第7天升高至生理盐水接种组。在无明矾接种组中，至第7天均未升高至生理盐水接种组。由此可认为，抗原与明矾结合可抑制其副反应。
产业实用性
根据本发明，可以提供以低的抗原水平即可对人诱导有效的免疫应答、且引起副反应少的新型流感疫苗，可以确实地应对新型流感的世界性流行。
本申请是以在日本申请的日本特愿2006-271295(申请日：2006年10月2日)为基础，其全部内容均包含在本说明书中。