雌性不育基因FST用于杂交水稻育种的方法.pdf

雌性不育基因FST用于杂交水稻育种的方法
    【技术领域】

    本发明涉及一种雌性不育基因FST用于杂交水稻育种的方法，属于农业生物技术领域，更具体地说属于作物育种领域。

    背景技术

    水稻是世界上第二大谷类作物，全球近50％的人口以其作为主要的营养来源。尽管在水稻育种中，上世纪50～70年代矮秆基因和细胞质雄性不育基因的发现及利用大幅度提高了全世界水稻的单产和总产，解决了相当一部分人的温饱问题。但是近40多年来，全球人口的快速增长也是不容忽视的问题，自20世纪70年代，全球稻米产量增长速度不及人口增长速度，从2002年就开始出现消费量大于产量，库存数量萎缩的态势。2007年水稻价格涨幅超过100％，2008年的大饥荒向人类敲响了警钟。据预测，到2050年，要养活不断增长的人口，世界粮食产量需要翻番。

    粮食产量的提高有两条途径，一条是扩大耕地面积。另一条途径是提高单位面积产量。虽然通过栽培和植保等措施可以在一定程度上提高产量，但这些措施都有赖于品种的增产潜力。因此在人口持续增长和耕地不可再生资源的刚性减少前提下，要实现世界粮食产量翻番的目标，需在水稻育种上取得新的突破。值得注意的是历史上水稻单产的大幅度提高均得益于新种质资源的发掘，实践证明利用杂种优势是保证和提高作物质量和产量的重要手段。

    水稻雄性不育(male sterility，MS)的利用及发展杂交水稻是保障粮食安全的重要举措。我国是水稻杂种优势利用最成功的一个国家，全国杂交稻种植面积占水稻面积的55％，但产量占水稻总产量的65％左右。自1976～2006年，中国已累计推广杂交水稻4亿hm²，增产粮食6000多亿kg，取得了举世瞩目的成就。此外，杂交水稻已在亚洲、非洲、美洲的20多个国家和地区推广种植，截至2007年底，全世界杂交水稻的种植总面积超过200万hm²。

    目前，在杂交水稻育种中，发展和利用的技术体系有三系法和两系法。经过30多年的发展，虽然两种体系已较为成熟，但尚存一些欠缺。主要体现在以下几点：(1)父母本分行或分区种植，开花时须人工赶粉辅助授粉，收获时父母本人工分收，费时费工；(2)制种产量低，不能很好解决种子混杂问题；(3)不适宜规模化、机械化操作，限制了杂交稻在劳动力成本高、机械化程度高的欧美和亚洲发达国家的发展。在目前以人工种植、去杂及收获为主的严格繁殖制种体系下，依然有50％以上的混杂是保持系或恢复系混杂。研究发现，在滇1型水稻不育系大面积繁殖中，72.97％的混杂是保持系机械混杂，保持系混杂是滇1型粳稻不育系混杂的主要类型。但在美国等机械化程度高，以机器操作代替人工的繁殖制种体系下，保持系及恢复系的混杂更为严重。因此，迫切需要一种新的既可有效避免恢复系的混杂，又能适宜机械化操作的制种体系的建立。

    【发明内容】

    本发明的目的是提供一种既能完全杜绝恢复系机械混杂，又适宜机械化的制种新技术，能较好解决目前现有杂交水稻及以自花授粉为主的杂交作物制种体系的缺陷。

    本发明的技术方案是依照目前三系法或两系法程序繁殖水稻雄性不育系(MS包括CMS和GMS)；通过不同的方式繁殖水稻雌性不育系(female sterility，FS)，方式一是采用多年生宿根无性繁殖方式繁殖雌性不育系，方式二是培育转基因雌性不育系，根据启动子相应的光温或化学试剂条件，通过人工调控水稻雌性不育基因FST表达使雌性育性恢复，完成雌性不育系的自身繁殖；将水稻雄性不育系及雌性不育系种植在同一田块中，完成水稻杂交种子的生产，制种时母本即花粉受体是雄性不育系(MS包括CMS和GMS)，父本即花粉供体是雌性不育系(FS)，雌性不育系花粉授给雄性不育系，收获种子为杂交种。

    本发明的特征是同时利用雄性不育(MS)和雌性不育(FS)，构建“MS+FS”的制种模式，即制种时的花粉供体为雌性不育系。雌性不育与雄性不育是两个相对的现象，雌性不育是雌性器官、胚珠或卵细胞发育受阻或直至败育现象，包括隐性和显性两种雌性不育。本发明中所用的雌性不育基因来源于课题组发现的一个具有雌性全不育的隐性水稻突变体G39，遗传上为孢子体不育，相应的野生型植株的基因(FST)为MADS-Box基因家族，FST编码与胚囊正常发育有关的转录调控因子，水稻雌性不育基因FST核苷酸序列是DQ004266，其MADS-Box区域缺失8个碱基(5’-TCGAAGAG-3’)导致雌性不育(fst)，决定或控制雌性不育性(fst)的蛋白质氨基酸序列与FST序列的同源性大于或等于80％。

    本发明中多年生宿根型雌性不育系的基因型为RfRf-fsfs或fsfs，条件表达两用型的转基因雌性不育系的基因型为RfRf-fsfs-CIP::FST或fsfs-CIP::FST；Rf为CMS恢复基因，CIP(the conditional inducible Promoters)为条件诱导型启动子；水稻fst突变体的花器官形态发育正常，花药发育正常并能提供有正常生活力的花粉。本发明所述水稻杂交育种和转基因育种均为常规方法，所需材料易于获取，云南农业大学相关部门对外销售。

    本发明的有益效果是制种时花粉供体即雌性不育系提供可育花粉，花粉受体为雄性不育系。花粉供体由于是雌性不育系，不能正常结实，因而制种田中收获种子完全排除了雌性不育系的混杂。因而本发明建立的育种技术，适宜机械化操作，杜绝了雌性不育系机械混杂，避免了人工去杂成本，能加速杂交水稻的推广应用进程。

    具体实施案例

    具体实施方式为以目前的制种体系(MS)为对照，采用“MS+FS”的制种体系进行试制种，比较两种制种方法杂交种产量及纯度上的差异。

    实施例一

    本发明制种体系(MS+FS)，方法如下所述：

    1)依照目前三系法程序繁殖水稻雄性不育系合系42A；

    2)采用多年生宿根无性繁殖方式繁殖雌性不育系Ansanbyeo/G39//W1944(雌性不育系，简称AGW-fsfs)；

    3)将水稻雄性不育系及雌性不育系种植在同一田块中，种植规格为合系42A∶AGW-fsfs＝12∶2，种植期间不去杂，开花时人工赶粉辅助授粉，其余栽培管理方式同普通制种；制种时母本即花粉受体是雄性不育系，父本即花粉供体是雌性不育系(FS)，雌性不育系花粉授给雄性不育系，收获种子为杂交种；

    4)成熟时考察发现合系42A植株上的结实率及制种产量，并于2007年10-2008年3月将种子种于海南，进行纯度鉴定。

    与目前制种体系(MS)对比试验：合系42A、Ansanbyeo种植于同一田块中，种植规格为合系42A∶Ansanbyeo＝12∶2，种植期间不去杂，开花时人工赶粉辅助授粉，其余栽培管理方式同普通制种。成熟时考察发现合系42A植株上的结实率及制种产量，并于2007年10-2008年3月将种子种于海南，进行纯度鉴定。

    结果见表1，由表1可看出无论在产量及纯度上，“MS+FS”的制种体系都高于“MS”的制种体系，“MS+FS”的制种体系收获杂交种无恢复系机械混杂。

    表1两种制种方法的比较

       制种体系 合系42A结实率 (％)  AGW-fsfs结实率  (％)  制种产量  kg/亩  杂交种纯  度(％)  有无恢复  系混杂  MS 30-60  ——  230  97.5  有  MS+FS 30-60  0  256  99.0  无

    实施例二

    本发明制种体系(MS+FS)，方法如下所述：

    1)依照目前三系法程序繁殖水稻雄性不育系合系42A；

    2)培育转基因雌性不育系Ansanbyeo/G39(条件表达两用型雌性不育系，简称AG-fsfs，基因型为RfRf-fsfs-CIP::FST)，根据启动子表达所需的化学试剂，在开花期人工喷施调花素，调控FST基因表达使雌性育性恢复，完成雌性不育系的自身繁殖；

    3)按照6∶1的比例将合系42A、AG-fsfs(条件表达两用型)的种子混匀，按常规育秧及栽插规格混播混种，种植期间不去杂，开花时不进行人工赶粉辅助授粉，其余栽培管理方式同普通制种；

    4)成熟时考察发现合系42A的结实率及制种产量，并于2007年10-2008年3月将种子种于海南，进行纯度鉴定。

    与目前制种体系(MS)对比试验：合系42A、Ansanbyeo种植于同一田块中，种植规格为合系42A∶Ansanbyeo＝12∶2，种植期间不去杂，开花时人工赶粉辅助授粉，其余栽培管理方式同普通制种。成熟时考察发现合系42A植株上的结实率及制种产量，并于2007年10-2008年3月将种子种于海南，进行纯度鉴定。

    结果见表2，由表2可看出无论在产量及纯度上，“MS+FS”的制种体系都高于“MS”的制种体系，“MS+FS”的制种体系收获杂交种无恢复系机械混杂。

    表2两种制种方法的比较

       制种体系 合系42A结实率 (％) AG-fsfs结实率 (％)  制种产量  kg/亩  杂交种纯  度(％)  有无恢复  系混杂  MS 10-30 ——  110  90.5  有  MS+FS 30-50 0  196  99.0  无

    实施例三

    本发明制种体系(MS+FS)，方法如下所述：

    1)依照目前两系法程序繁殖水稻雄性不育系滇型1号A；

    2)采用多年生宿根无性繁殖方式繁殖雌性不育系南29/G39//W1944(雌性不育系，简称NGW-fsfs)；

    3)将水稻雄性不育系及雌性不育系种植在同一田块中，种植规格为滇型1号A∶NGW-fsfs＝12∶2，种植期间不去杂，开花时人工赶粉辅助授粉，其余栽培管理方式同普通制种；制种时母本即花粉受体是雄性不育系，父本即花粉供体是雌性不育系(FS)，雌性不育系花粉授给雄性不育系，收获种子为杂交种；

    4)成熟时考察发现滇型1号A植株上的结实率及制种产量，并于2007年10-2008年3月将种子种于海南，进行纯度鉴定。

    与目前制种体系(MS)对比试验：滇型1号A、南29种植于同一田块中，种植规格为滇型1号A∶南29＝12∶2，种植期间不去杂，开花时人工赶粉辅助授粉，其余栽培管理方式同普通制种。成熟时考察发现滇型1号A植株上的结实率及制种产量，并于2007年10-2008年3月将种子种于海南，进行纯度鉴定。

    结果见表3，由表3可看出无论在产量及纯度上，“MS+FS”的制种体系都高于“MS”的制种体系，“MS+FS”的制种体系收获杂交种无恢复系机械混杂。

    表3两种制种方法的比较

       制种体系  滇型1号A结实率  (％)  NGW-fsfs结实率  (％)  制种产量  kg/亩  杂交种纯  度(％)  有无恢复  系混杂  MS  30-60  ——  210  97.0  有  MS+FS  30-60  0  246  99.3  无

    实施例四

    本发明制种体系(MS+FS)，方法如下所述：

    1)依照目前两系法程序繁殖水稻雄性不育系滇型1号A；

    2)培育转基因雌性不育系南29/G39(条件表达两样性雌性不育系，简称NG-fsfs，基因型为RfRf-fsfs-CIP::FST)，根据启动子表达所需的短日照(10h)条件，通过人工遮光调控FST基因表达，使其雌性育性恢复，完成雌性不育系的自身繁殖；

    3)按照6∶1的比例将滇型1号A、NG-fsfs(条件表达两用型)的种子混匀，按常规育秧及栽插规格混播混种，种植期间不去杂，开花时不进行人工赶粉辅助授粉，其余栽培管理方式同普通制种；

    4)成熟时考察发现滇型1号A的结实率及制种产量，并于2007年10-2008年3月将种子种于海南，进行纯度鉴定。

    与目前制种体系(MS)对比试验：滇型1号A、南29种植于同一田块中，种植规格为滇型1号A∶Ansanbyeo＝12∶2，种植期间不去杂，开花时人工赶粉辅助授粉，其余栽培管理方式同普通制种。成熟时考察发现滇型1号A植株上的结实率及制种产量，并于2007年10-2008年3月将种子种于海南，进行纯度鉴定。

    结果见表4，由表4可看出无论在产量及纯度上，“MS+FS”的制种体系都高于“MS”的制种体系，“MS+FS”的制种体系收获杂交种无恢复系机械混杂。

    表4两种制种方法的比较

       制种体系  滇型1号A结实率  (％)  NG-ffsfs结实率  (％)  制种产量  kg/亩  杂交种纯  度(％)  有无恢复  系混杂  MS  10-30  ——  115  90.5  有  MS+FS  30-50  0  186  99.0  无

    表4是目前制种体系与“MS+FS”的制种体系用于水稻杂交种生产的比较。由表1～表4可看出，无论在产量及纯度上，“MS+FS”的制种体系都高于“MS”的制种体系，“MS+FS”的制种体系收获杂交种无恢复系机械混杂，且节约成本。

    表4不同鉴定方法的比较