人工改造的鸡新城疫病毒F基因及其重组表达载体和应用 【技术领域】
本发明涉及一种cDNA，尤其涉及一种人工改造的鸡新城疫病毒E48F9株F基因以及含有该F基因的重组真核表达载体，本发明还涉及它们作为DNA疫苗在预防或治疗鸡新城疫疾病中的应用，属于鸡新城疫疾病的防制领域。
背景技术
新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)属于副黏病毒科腮腺炎病毒属，是一种高致病性病毒，对禽类危害较大，是世界公认的两大重要禽病之一。本病的病死率极高，强毒力毒株常可以引起易感鸡群100％感染，并造成100％死亡，已经遍布世界各地。目前，我国对于鸡新城疫主要采用油佐剂灭活疫苗或弱毒活疫苗等传统疫苗进行免疫预防。灭活疫苗具有保护率高、免疫期长、研制周期短等优点，但其最大的不足是疫苗接种后诱导产生的抗体与自然感染鸡无法区分，难以用现行的血清学检测方法进行疫情监测，从而影响鸡新城疫的流行病学调查，不利于对疾病的发生和流行进行控制，而且灭活疫苗的成本高、接种反应大，存在因灭活不全而散毒的危险。常规弱毒活疫苗也存在散毒问题，某些疫苗株毒性较强，能造成免疫鸡群轻微感染以及低日龄鸡的发病，为疾病的流行和毒株变异埋下安全隐患。因此，有必要探寻新型疫苗以弥补上述不足，而DNA疫苗则为实现这一目标提供了可能，鸡新城疫DNA疫苗的开发和应用将为防制当前流行的新城疫提供有效的工具和手段。
对于DNA疫苗而言，抗原蛋白的表达水平对其免疫原性和保护效力起着十分关键的作用。有相当多的文献报道，免疫原基因密码子的优化可以显著地改善蛋白的表达效率。Leder等对HPV16L1、L2的密码子进行了优化，分别用哺乳动物细胞及植物细胞偏爱密码子取代原有基因的相应密码子，用合成基因转染哺乳动物细胞后，使用哺乳动物细胞偏爱密码子合成的基因蛋白表达水平较原野生型病毒基因增加了104～105倍。而用植物细胞偏爱密码合成的基因其蛋白表达水平也至少提高了100倍。Andre等人工合成人免疫缺陷病I型病毒(HIV)gp120基因，该基因中原来存在的大多数密码子被替换为人体偏好的密码子，体外试验表明改造后的基因表达效率比原始基因显著提高，在动物试验中合成基因所诱导的抗体滴度和CTL反应显著高于原始基因。随后，大量的研究证明用经过密码子优化的DNA疫苗接种模型动物，所诱导的免疫应答显著提高。密码子优化的人免疫缺陷病病毒的gp120、Gag、Gag-pol、Tat、Rev和Nef基因，用于构建DNA疫苗或重组病毒活载体疫苗后，其特异性细胞和体液免疫反应均获得了显著改善，目前几乎所有的HIV重组疫苗都采用了密码子优化免疫原基因。密码子优化免疫原基因在人的乳头瘤病毒、犬乳头瘤病毒、狂犬病病毒以及SARS冠状病毒DNA疫苗相继得到应用。密码子优化免疫原基因增强免疫反应的机制不仅仅涉及翻译过程密码子移动速度加快，真核生物偏嗜性密码子优化往往导致mRNA中CG含量的大幅度提高，因而彻底改变RNA的二级结构，一方面有可能增加mRNA的稳定性，另一方面还有可能增加mRNA转录后从细胞核向细胞浆的转运效率。此外，CG含量的增加还有可能增加CpG的出现频率，进一步发挥DNA疫苗本身免疫佐剂的作用。
由于核酸疫苗可诱导机体产生全面的免疫应答，并且对不同亚型的病原体具有交叉防御作用，同时兼备安全、可靠、生产方便等优点，故被认为是继减毒活疫苗、灭活疫苗和基因工程亚单位疫苗之后的第三代疫苗。但是，DNA疫苗也存在其自身的局限性，目的基因的免疫原性较弱以及其蛋白表达水平不高严重制约了它的发展。
蛋白的表达水平与其引起的免疫反应直接相关，而编码氨基酸密码子的摇摆性导致了不同物种的细胞在蛋白翻译过程中具有密码子使用的偏嗜性，动物细胞在蛋白翻译过程中与病毒蛋白氨基酸密码子使用频率存在着明显差异。基因的修饰可以显著地改善蛋白的表达效率。为了探索解决这一问题的新途径，提高F基因的表达量从而增强其免疫原性。
研究表明，NDV F基因密码子的优化可显著提高F基因表达水平和新城疫病毒F48E9株DNA疫苗诱导的保护性抗体免疫反应水平，显著增强免疫保护效果。因此，通过基因修饰的新城疫病毒F48E9株DNA疫苗将有着良好的的应用前景。
原有地NDV F基因在真核细胞中的表达效率不高，需要对其进行分子改造和修饰，以提高其在真核细胞中的表达效率，以提高NDVF48E9株DNA疫苗在鸡体内的表达水平和免疫保护效果。
【发明内容】
本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，将新城疫病毒F48E9株F基因进行分子改造和修饰，提供一种更适合在鸡体细胞中高效表达的新城疫病毒人工F基因。
本发明首先所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
本发明在不改变原有新城疫病毒F基因(SEQ ID NO.1)所编码的氨基酸序列的前提下，按照鸡体内密码子的选择取向对鸡新城疫病毒F48E9株F基因密码子进行优化，规避了一些可能降低表达的序列，得到了一种新的适合在鸡体细胞中高效表达的鸡新城疫病毒人工F基因序列。
具体的，本发明将NDV F48E9株F基因ORF的密码子全部替换为鸡体内偏嗜的密码子，在上游引入EcoR V酶切位点和Kozak序列，下游引入XbalI酶切位点和TGA终止密码子，并把终止密码子下游碱基A改为G，得到一种适合在鸡体细胞中高效表达的鸡新城疫病毒人工F基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示。
优化后的F基因(SEQ ID NO：2)GC含量由原来优化前的44.28％变为65.46％，大大提高了F基因中的GC含量；同时，在起始密码子ATG上游引入了一段影响其起始效率的Kozak序列，并在3′端引入了鸡体偏嗜的终止密码子(TGA)，改变了可能影响其翻译终止效率终止密码子下游碱基。重新设计合成的基因也去除或改变了mRNA去稳定的序列，消除了稀有密码子，从而使蛋白的生产更有效、更经济。
本发明所要解决第二个技术问题是提供一种含有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的重组真核表达载体。
本发明所要解决第二个技术问题是通过以下技术方案来实现的：
一种重组真核表达载体，含有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
本发明的重组真核表达载体可通过本领域的常规方法构建而成，即：将SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列插入到真核表达载体合适的限制性酶切位点之间，使SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列可操作的与真核表达载体相连接并在真核表达载体相关元件的调控下获得正确表达。
作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列插入到真核表达载体pVAX1多克隆位点区的EcoRV和XbaI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于CMV启动子的下游并受其调控，得到重组真核表达载体pVAX1-optiF。
本发明所构建的重组真核表达载体可通过常规的方法转染宿主细胞，所述的宿主细胞可为293或COS7细胞，再通过间接免疫荧光技术和Western-blot技术来鉴定其表达情况，表达出的目的蛋白具有新城疫病毒天然蛋白的生物学活性和免疫原性。
本发明所要解决第三个技术问题是大量制备更适于转染鸡体细胞和刺激鸡体免疫系统的DNA疫苗。
本发明所要解决第三个技术问题是通过以下技术方案来实现的：
提取含有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的质粒DNA，纯化，即得DNA疫苗。
本发明优选的技术方案的整体描述：
应用RT-PCR技术扩增自国内来航鸡分离的新城疫病毒F48E9株基因组。以NDV F48E9株的基因组cDNA为模版，经根据Genbank中发表的新城疫病毒F48E9株F基因(ID：AY508514)序列设计一对引物(上游：5′-ATA GAT ATC ATG GGC CCC AAA TCT TCT-3′；下游：5′-CTA TCT AGA GGC CAC TAC AAG AAT CTG A-3′)来扩增野生型F基因，将F基因克隆到pMD-18T载体中，然后通过酶切和测序鉴定正确后记为pMD-18T-F。
利用Genestar软件将NDV F48E9株F基因的ORF翻译为氨基酸序列，根据密码子使用频率表，将F基因的密码子全部替换为鸡体内偏嗜的密码子，以鸡偏嗜密码子将氨基酸序列反翻译为DNA序列；在上游引入EcoR V酶切位点和Kozak序列，下游引入Xbal I酶切位点和鸡体偏嗜的终止密码子TGA，紧接着终止密码子的下游碱基A改为G。利用Genestar软件核查设计的序列，进行氨基酸比对和酶切位点检查，合成最终序列(SEQ ID NO：2)并克隆到pMD-18T载体中，酶切和测序鉴定正确后记为pMD-18T-optiF。
将pMD-18T-F与pMD-18T-optiF分别经EcoR V和XbalI酶切处理后回收目的片段，并把回收的目的片段与经同样酶切处理的表达载体pVAX1连接，经酶切、鉴定后得到重组质粒分别命名为pVAX1-F和pVAX1-optiF，即得到新城疫病毒F基因DNA疫苗。
将pVAX1-F和pVAX1-optiF两种重组质粒分别在脂质体LipofectamineTM 2000介导下转染COS 7细胞，通过间接免疫荧光和Western-blot技术来检测重组质粒的体外表达情况；经间接免疫荧光试验、SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及Western-blot检测证明重组质粒pVAX1-optiF在体外能正确表达，表达的重组蛋白具有鸡新城疫病毒天然蛋白的生物学活性和免疫原性。
在采用间接免疫荧光技术检测F基因的体外表达时发现，转染重组质粒pVAX1-optiF的细胞中荧光细胞数目明显多于pVAX1-F，这与Western-blot检测的结果是一致的。体外表达结果表明，密码子优化的F基因在鸡体细胞中表达蛋白的水平显著高于野生型F基因，由于将密码子改造为鸡体嗜好的密码子后，加快了翻译过程密码子移动速度，同时由于GC含量大幅度提高彻底改变了RNA的二级结构，这不仅增加了mRNA的稳定性，还可能增加mRNA转录后从细胞核向细胞浆的转运效率，最终使蛋白的表达量大大提高。
本发明的鸡新城疫病毒F48E9株F-DNA疫苗(pVAX1-optiF)能够在体外瞬时表达细胞COS 7高效表达，所表达的重组蛋白具有鸡新城疫病毒天然蛋白的生物学活性和免疫原性。将所得到的重组质粒(pVAX1-optiF)制成DNA疫苗，免疫鸡实验结果表明，本发明鸡新城疫病毒F48E9株优化的F-DNA疫苗能有效诱导机体产生特异性的体液和细胞免疫应答，在免疫剂量为200μg的条件下使免疫鸡获得100％的抵抗高致病力NDV致死性攻击的保护，并可有效阻止病毒在体内的增殖，试验结果说明，本发明的DNA疫苗能够有效防治鸡新城疫。
特异性抗体水平与新城疫免疫的保护率高度相关。将两种质粒免疫鸡后发现pVAX1-optiF免疫鸡的特异性抗体产生比较迅速，而且上升的幅度比较大，从一免后2周开始，诱导产生的抗体水平显著高于pVAX1-F免疫鸡，而且随后差距越来越大。由此可见，优化的F基因比野生型F基因表达出了更多的F蛋白，从而诱导产生出更高的特异性抗体。因此，在动物体内免疫原基因蛋白表达量的提高是改善DNA疫苗免疫效果的重要途径之一。
淋巴细胞转化率是考察机体细胞免疫状态的重要指标之一，本试验免疫鸡脾淋巴细胞特异性增殖结果显示，二免后2周，pVAX1-F和pVAX1-optiF免疫鸡后所测的OD570值分别为0.3804±0.0344和0.5804±0.0789，PBS对照组和pVAX1对照组分别为0.2541±0.0535和0.2664a±0.0410，两重组质粒免疫组淋巴细胞转化率都显著高于对照组，说明DAN免疫质粒确实在一定程度上激活了机体的细胞免疫系统，而pVAX1-optiF免疫鸡脾细胞对Con A表现出更明显的反应性，说明免疫原基因的密码子优化后诱发了较强的细胞免疫。CD4+是T淋巴细胞的一个亚群，是免疫应答的中心细胞。主要识别由MHC II类分子递呈的抗原，诱导Th I型细胞因子的分泌，辅助B细胞合成抗体；CD8+T细胞又称细胞毒性T淋巴细胞，其主要功能是特异性直接杀伤靶细胞，它主要识别由MHC I类分子递呈的抗原短肽，在T淋巴细胞免疫应答中发挥重要功能。因此，动物体内CD8+T细胞的含量是评价动物机体细胞免疫状况的一个重要指标。
本试验在对免疫鸡外周血淋巴细胞亚群动态变化的检测中发现，用质粒pVAX1-optiF免疫鸡的CD4+和CD8+T淋巴细胞百分数在免疫后27d均显著高于pVAX1-F免疫鸡的，并且这两个免疫质粒试验组又显著高于pVAX1质粒免疫对照组和PBS空白对照组，说明构建的质粒在动物细胞中得到了表达，激活包括CD8+的CTL，CD4+的Th1细胞及产生IgG2a为主的B淋巴细胞。成熟T细胞表面可表达2种不同类型的T细胞抗原受体(TCR)，一种是TCRαβ，另一种是由γ链和δ链组成的异二聚体分子TCRγδ。外周血中的TCRγδT细胞仅占成熟T细胞的0.5％～10％，TCRγδ识别病原体表面抗原分子后，增殖分化为效应细胞，释放细胞毒性效应分子如穿孔素、颗粒酶，表达Fas/FasL以及分泌IFN-γ，最终清除感染细胞和病原微生物。全身性γδT细胞可以快速被募集并易于活化，它们可以在局部释放IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IFN-7、GM-CSF、TNF-α等多种细胞因子，参与免疫调节，增强机体非特异性免疫防御功能。初免27d后，pVAX1-optiF免疫鸡外周血TCRγδT细胞百分率比pVAX1-F免疫鸡明显增高(9.1522％±1.2547％对6.3989％±1.1625％，P＜0.05)，并且这两个免疫质粒试验组又显著高于pVAX1质粒免疫对照组和PBS空白对照组。当机体在受到病毒感染时，γδT细胞活化并增殖，活化的γδT细胞识别并杀伤病毒感染的靶细胞，所以推测pVAX1-optiF免疫鸡机体内含有更多的TCRγδT细胞而具有更强的抗病毒能力。
评价一个疫苗的好坏，最关键的还是看疫苗对免疫动物的保护效果，本发明二免后2周分别对所有试验鸡以105EID50NDV的F48E9强毒进行滴鼻攻毒后，最终PBS对照组和pVAX1对照组全部死亡，而pVAX1-F组12只存活2只，最终的保护率为16.7％；而pVAX1-optiF组的最终保护率为100％，达到完全保护。
实验结果表明，采用F基因密码子的优化可显著提高F基因表达水平和新城疫病毒F48E9株DNA疫苗诱导的保护性抗体免疫反应水平，显著增强免疫保护效果。
用优化的鸡新城疫病毒F48E9株F基因的新城疫DNA疫苗，其效果与传统疫苗一样。比起用SPF鸡胚或细胞培养物制备的传统NDV疫苗，DNA疫苗的制备简单、方便，整个制备过程的经济消耗也较低，表达产物经过粗提即可应用。因此，本发明新城疫DNA疫苗与现有的疫苗相比将具有更好的应用前景。
DNA疫苗利用的仅仅是病毒的一段抗原基因，不是完整的病毒基因组，不具有感染性，是可以在动物细胞中表达抗原性蛋白的的安全疫苗，不存在散毒的危险。本发明DNA疫苗将为防制当前流行的鸡新城疫疾病提供有效的工具和手段，并可为防制畜禽其它疾病提供有效的参考和经验，投入应用后既能有效地防止新城疫流行造成的经济损失，同时也降低了养殖成本，具有重要的科学意义和应用价值，并能带来更好的经济效益和社会效益。
本发明DNA疫苗的用法与用量：用法：经由大腿肌肉注射。用量：雏鸡0.2mL/羽(浓度为1mg/mL)，成年鸡0.4mL/羽(浓度为0.5mg/mL)。
【附图说明】
图1鸡新城疫病毒F基因与载体构建图谱。
图2NDV F片段的PCR结果；1为DNA分子量标准DL2000(TaKaRa公司)；2为超纯水为模板PCR对照；3为NDV F基因1.7Kb。
图3重组表达载体酶切鉴定结果；1为15000DNA分子标准；2和3分别为EcoR V和Xbal I消化pVAX1-F与pVAX1-optiF的产物，目的片段为1.7Kb。
图4重组表达载体体外表达间接免疫荧光鉴定结果。
图5重组表达载体体外表达Western-blot鉴定结果；1：蛋白质分子质量标准；2和3：pVAX1-F和pVAX1-optiF在COS 7细胞瞬时表达产物；4：pVAX1空载体转染COS 7细胞对照；5：COS 7空细胞对照。
图6DNA疫苗免疫鸡和对照鸡外周血中和抗体在免疫和攻毒前后的动态变化结果。
图7DNA疫苗免疫鸡和对照鸡外周血CD4+T淋巴细胞含量在免疫和攻毒前后的变化结果。
图8DNA疫苗免疫鸡和对照鸡外周血CD8+T淋巴细胞含量在免疫和攻毒前后的变化结果。
图9DNA疫苗免疫鸡和对照鸡外周血TCRγδT淋巴细胞含量在免疫和攻毒前后的变化结果。
图10DNA疫苗免疫鸡、对照鸡及正常未攻毒鸡在NDV F48E9株病毒攻击后死亡或7d后存活鸡胃、肠和法氏囊病理组织学变化。A1.胃的正常外观；A2.肠的正常外观；A3.法氏囊正常外观；B1.腺胃深层复管腺集合窦内有上皮细胞坏死的碎片；B2.肠腺间有大量嗜酸性粒细胞浸润；B3.法氏囊-部分滤泡淋巴细胞坏死减少出现小空泡，静脉淤血，间质水肿增宽；C1.浅层单管腺间有少量纤维素渗出；C2.肠-轻度淤血；C3.法氏囊无明显病理变化；D1.腺胃浅层单管腺及固有膜内有大量出血；D2.肠绒毛皮细胞坏死脱落，严重淤血出血；D3.法氏囊-淋巴滤泡体积缩小，淋巴细胞大量坏死缺失只剩网状纤维支架，小静脉淤血；E1.腺胃-深层复管腺上皮细胞坏死脱落至集合窦内及腺管间；E2.肠-大范围出血淤血及充血，上皮细胞坏死，大量淋巴细胞浸润；E3.法氏囊-淋巴细胞大量坏死减少，滤泡内呈空泡状，间质水肿增宽；H&E染色；20倍放大。
【具体实施方式】
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1质粒、细菌、病毒与细胞
质粒pVAX1购自invitrogen公司(Catalog Number：V26020)；NDV F48E9株病毒购自中国兽医药品监察所(菌种保存号：AV1611)；DH5α宿主菌、COS7细胞均由本实验室保存。
1.1.2试剂
限制性内切酶EcoR V、Xba1 I和DNA分子质量标准(DL 2000和DL 15000)等均为宝生物工程(大连)有限公司产品；脂质体Lipofectamine2000转染试剂盒购自Invitrogen公司；RPMI1640和灭活过滤除菌的胎牛血清购自GIBCO公司。NDV阳性血清由本实验室保存；淋巴细胞分离液、MTT试剂盒、FITC标记兔抗鸡IgG、HRP标记羊抗鼠IgG购自Sigma公司；FITC标记的抗鸡CD4+、CD8+和TCRγδ表面标记的单克隆抗体购自Southernbiotech公司，蛋白质分子质量标准PageRulerTM Protein Ladder为Fragment s公司产品；新城疫抗体检测试剂盒购自北京爱德士元亨生物科技有限公司。
1.1.3SPF鸡胚和SPF鸡
SPF鸡胚和SPF鸡由哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供，2周龄SPF鸡实验期间饲养于负压隔离器中。
1.2方法
1.2.1F基因的密码子优化和表达载体构建
将NDV F48E9株F基因ORF的密码子全部替换为鸡体内偏嗜的密码子，在上游引入EcoR V酶切位点和Kozak序列，下游引入Xba1I酶切位点和TGA终止密码子，并把终止密码子下游碱基A改为G。改造后的基因人工合成后并克隆到pMD-18T载体中，命名为pMD-18ToptiF。用EcoR V和Xba1 I对pMD-18ToptiF进行双酶切处理，将回收的optiF目的片段插入经过同样双酶切处理的pVAX1真核表达载体中，获得pVAX1-optiF(图1)。将NDV F48E9株F基因同样克隆到pMD-18T载体中(命名为pMD-18TF)，经过同样的酶切处理获得pVAX1-F真核表达载体。
1.2.2重组质粒的体外表达与鉴定
将pVAX1、pVAX1-F和pVAX1-optiF三种质粒分别在脂质体LipofectamineTM 2000介导下转染COS 7细胞，具体操作按说明书进行。
在6孔板中转染后72h的细胞，经PBS(pH7.4)洗2次，用中性甲醛固定15min后，PBS洗涤2次，加上适量1∶100稀释的NDV阳性血清，37℃作用60min，PBS洗涤3次，每次5min，然后加入适量1∶5000稀释的FITC标记的羊抗鸡二抗，37℃作用60min，PBS洗涤3次，加入适量碱性甘油，荧光显微镜下观察荧光。
同时将转染后72h后收集的转染细胞，经PBS洗1次，在细胞沉淀中加入适量的1×SDS-PAGE上样缓冲液混匀，煮沸8min，利用12％的SDS-PAGE胶电泳分离蛋白，采用半干转移转印硝酸纤维膜，5％的脱脂乳封闭60min，加入NDV阳性血清作为一抗作用60min，洗涤3次后，加入IRDye800标记的羊抗鸡IgG为二抗，避光作用60min，洗涤次3后，采用红外荧光扫描成像系统(Odyssey，LI-COR)进行扫描。
1.2.3SPF鸡的免疫
将2周龄SPF鸡随机分为4组，每组18只，前3组分别免疫pVAX1、pVAX1-F和pVAX1-optiF，采用股四头肌多点注射，每只鸡200μg，第4组注射PBS作为空对照；一免后两周以相同的剂量加强免疫。一免后12d和二免后12d每组各杀3只鸡取脾做淋巴细胞增殖试验。加强免疫两周后以105EID50的F48E9株NDV强毒进行滴鼻攻毒(每组12只)，每只鸡的攻毒剂量为100μL，攻毒后连续观察14d计算发病率、死亡率。试验期间对鸡的体液免疫和细胞免疫状况进行监测。
1.2.4免疫鸡血清特异性IgG抗体测定(ELISA)
试验期间每周采集免疫鸡血清，用间接ELISA测定血清中抗F蛋白的抗体效价，具体操作按新城疫抗体检测试剂盒说明书进行，待测血清均作1∶100稀释。
1.2.5免疫鸡外周血T淋巴细胞亚类的检测
自第一次免疫后每隔9d和攻毒后9d采集外周抗凝血，用淋巴细胞分离液分离出淋巴细胞，以荧光素标记的抗鸡CD4+、CD8+和TCRγδ表面标记的单克隆抗体与淋巴细胞作用后，利用流式细胞技术(BD，FACSCalibur)进行淋巴细胞亚群和TCRγδT细胞数量的检测。
1.2.6免疫鸡淋巴细胞增殖试验
每次免疫后12d每组剖杀3只鸡，取脾细胞，参照淋巴细胞增殖试验MTT试剂盒操作说明书进行淋巴细胞增殖试验。其主要过程是：无菌取试验鸡脾脏，用铜网(200目)研磨挤压制成单细胞悬液，用台盼蓝法进行细胞活力测定，计数；以RPMI1640培养液(含200IU/青霉素、200μg/mL链霉素、2mmol/L L-谷氨酰胺)稀释至2×107个/mL。取制备的细胞悬液，以每孔80μl加入96孔培养板，每孔再加入20μl含75μg/mL ConA的RPMI 1640培养液，每个样品做4个重复孔，试验细胞在CO2箱中37℃培养60h后加MTT，继续培养3h后，小心吸净每孔内的液体，保留底部的沉淀，然后每孔加入MTTSOLVENT溶液100μl，室温震荡15min。待结晶充分溶解后，测定每孔OD570，结果以4孔平均值和标准差表示。
1.2.7数据处理
所有统计分析均采用SPSS17.0统计软件，统计学上的差异显著性是通过均数t检验来确定的，P＜0.05就被认为是差异显著。
2实验结果
2.1载体的构建及目的基因的体外表达
2.1.1人工合成密码子优化的F基因
优化后的基因中GC含量由原来优化前的44.28％变为65.46％，优化前后两个基因的核苷酸同源性为71.3％。
2.1.2载体的构建和鉴定
酶切和测序鉴定结果表明，获得的真核表达质粒pVAX1-F和pVAX1-optiF与预期的结果一致，经EcoR V和Xba1 I双酶切后都得到了1700bp左右的条带(图2、图3)。
2.1.3pVAX1-F和pVAX1-optiF的体外表达
间接免疫荧光结果显示，在重组质粒pVAX1-F和pVAX1-optiF转染的细胞中均可观察到特异性荧光，转染pVAX1质粒的COS 7细胞和未转染的COS 7细胞均没有检测到荧光信号(图4)。pVAX1-F和pVAX1-optiF的体外表达结果表明，optiF转染的细胞视野中阳性细胞数量多于F48E9株的F基因转染的细胞。
从Western-blot结果看到，2种重组质粒都检测到了分子量约为58ku的表达蛋白(图5)，optiF的基因表达量要高于F48E9株的F基因；而未转染的COS-7细胞和转染pVAX1的COS 7细胞均没有检测到目的蛋白的表达。
2.2动物试验
2.2.1免疫及强毒攻击前后的IgG抗体变化
图6的结果显示，pVAX1-F和pVAX1-optiF免疫后，免疫鸡血清IgG抗体逐渐升高，特别是pVAX1-optiF组的抗体滴度从免疫初时，特异性抗体滴度上升的幅度就较快，一免后两周开始，pVAX1-optiF组的特异性抗体水平就显著高于对照组和pVAX1-F组的(P＜0.05)。而且在二免后两周IgG抗体滴度迅速提高，pVAX1-F和pVAX1-optiF二免后2周免疫鸡血清IgG抗体ELISA检测结果OD650平均值分别为0.2838和0.7624，极显著高于两对照组的0.0805和0.0924(P＜0.01)，而且pVAX1-optiF组免疫鸡的特异性抗体水平也极显著高于pVAX1-F组免疫鸡的(P＜0.01)。攻毒后pVAX1-optiF组和pVAX1-F组免疫鸡的抗体水平比攻毒前有较大提高，其攻毒后1周免疫鸡血清IgG抗体ELISA检测结果OD650平均值分别为0.9473和1.0619。
2.2.2免疫鸡脾淋巴细胞增殖反应
淋巴细胞增殖试验结果显示，和对照组pVAX1及PBS相比，PVAX1-optiF和PVAX1-F接种组对ConA均表现出较明显的反应性，其中PVAX1-optiF免疫鸡脾细胞的增殖反应要比pVAX1-F免疫鸡强，特别是在二免后两周，PVAX1-optiF免疫鸡的脾细胞增殖反应显著强于pVAX1-F免疫组的(P＜0.05)(见表1)
表1鸡免疫后脾淋巴细胞的增殖反应
注：数据经t检验分析，均以x±s表示，表中同一列标有不同字母的数值之间差异显著(P＜0.05)
2.2.3免疫鸡外周血CD4+、CD8+和TCRγδT细胞数量的动态变化
免疫鸡外周血T淋巴细胞亚类的检测结果显示：初免后9天，所有接种鸡外周血CD4+T淋巴细胞含量(见图7)、CD8+T淋巴细胞含量(见图8)以及TCRγδT细胞含量(见图9)没有明显差异；初免后18天，pVAX1-F和pVAX1-optiF接种组的CD4+、CD8+及TCRγδT淋巴细胞含量都高于对照组，但四组之间都没有显著差异；初免后27d(即二免后13d)，pVAX1-optiF接种鸡外周血CD4+、CD8+和TCRγδT细胞含量都显著高于pVAX1-F接种组(P＜0.01)，并且两重组质粒接种鸡的这3个指标都显著高于pVAX1对照组和PBS空白对照组(P＜0.01)。攻毒后9d，pVAX1-optiF和pVAX1-F试验鸡外周血CD4+、CD8+、TCRγδT淋巴细胞含量与攻毒前相比有明显提高，差异显著(P＜0.01)。
2.2.4试验鸡对NDV F48E9株攻击的保护作用
二免后2周分别对所有试验鸡以105EID50的F48E9株NDV强毒进行滴鼻攻毒。结果显示，所有的试验组在攻毒后前3d都没有出现发病鸡，攻毒4d后，除pVAX1-optiF组外，所有组都出现了症状明显的发病鸡。最终PBS对照组和pVAX1对照组全部发病，并且在攻毒后6d内全死亡，pVAX1-F组12只存活2只，最终的保护率为16.7％；而pVAX1-optiF组的最终保护率为100％(见表2)。
表2pVAX1-F和pVAX1-optiF免疫鸡对NDV F48E9株强毒攻击的保护作用
【序列表】
<110>中国农业科学院哈尔滨兽医研究所
<120>人工改造的鸡新城疫病毒F基因及其重组表达载体和应用
<130>KLPI08078
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1662
<212>DNA
<213>Newcastle disease virus
<400>1
atgggcccca aatcttctac caatgtccca gcacctctga tgctgaccgt caggattgcg 60
ctggcactga gctgtgtccg tctgacaaat tctctcgatg gaaggcctct tgcagctgca 120
gggattgtag taacgggaga caaagcagtc aacatataca cctcatctca gacagggtca 180
ataatagtca agttactccc aaatatgcct aaggataaag aggcgtgtgc aaaagccccg 240
ttggaggcat acaacaggac actgactact ttgctcaccc cccttggtga ttctatccgc 300
aggatacaag agtctgcgac tacgtccgga ggaaggaggc agagacgctt tataggtgcc 360
attatcggca gtgtagctct tggggttgcc acagatgccc agataacagc agcctcagct 420
ctgatacaag ccaaccagaa tgctgccaac atcctccggc ttaaagagag cattgctgca 480
actaatgaag ctgtacatga agtcactgac ggattatcgc aactagcagt ggcagttggg 540
aagatgcagc agtttgttaa tgaccagttt aataacacag ctcaggaatt ggactgtata 600
aaaattacac agcaggttgg tgtagaactc aacctgtacc taactgaatt gactacagta 660
ttcgggccac aaatcacttc ccctgcctta actcagctga ctatccaggc gctttacaat 720
ctagctggtg gtaatatgga ttatttgttg actaagttag gtgttgggaa caaccaactc 780
agctcattaa tcggtagcgg cttgatcacc ggtaacccta ttctgtacga ttcacagact 840
caactcttag gtatacaggt aactttaccc tcagtcggta acctaaataa tatgcgtgct 900
acctacttgg agaccttgtc tgtaagcaca accaagggat ttgcctcagc acttgtccca 960
aaagtggtga cacaggtcgg gtctgtgata gaggaacttg acacctcata ctgtgtagag 1020
accgatttgg atttatattg tacaagaata gtgacattcc ctatgtctcc tggtatttat 1080
tcctgtctga gcggtaatac atcagcttgc atgtattcaa agactgaagg tgcacttact 1140
acgccatata tgactatcaa gggctcagtt attgccaatt gcaagatgac aacatgcaga 1200
tgtgcagacc ctccgggtat catatcgcaa aattatggag aagctgtgtc tctaatagat 1260
aggcactcat gcaatgtctt atccttagac gggataactt tgaggctcag tggagaattt 1320
gacgtaactt atcaaaagaa tatctcaata ttagattctc aggtaatagt gacaggcaat 1380
ctcgatatct caactgaact tgggaatgtc aacaactcga taagtaatgc tttggataag 1440
ttagaggaaa gcaatagcaa acttgacaaa gtcaatgtca agctgaccgg cacgtctgct 1500
ctcattacct atatagtttt aactatcata tctcttgttt gtggtatact tagcctggtt 1560
ctagcatgct atctgatgta taagcaaaag gcgcaacaaa agaccttatt atggcttggg 1620
aataataccc taaatcagat gagggccact acaagaatct ga 1662
<210>2
<211>1671
<212>DNA
<213>artifical sequence
<400>2
atagatatcg ccaccatggg gcccaagagc agcaccaacg tgcccgcccc cctgatgctg 60
accgtgcgca tcgccctggc cctgagctgc gtgcgcctga ccaacagcct ggacggccgc 120
cccctggccg ccgccggcat cgtggtgacc ggcgacaagg ccgtgaacat ctacaccagc 180
agccagaccg gcagcatcat cgtgaagctg ctgcccaaca tgcccaagga caaggaggcc 240
tgcgccaagg cccccctgga ggcctacaac cgcaccctga ccaccctgct gacccccctg 300
ggcgacagca tccgccgcat ccaggagagc gccaccacca gcggcggccg ccgccagcgc 360
cgcttcatcg gcgccatcat cggcagcgtg gccctgggcg tggccaccgc cgcccagatc 420
accgccgcca gcgccctgat ccaggcccac cagaacgccg ccaacatcct gcgcctgaag 480
gagagcatcg ccgccaccaa cgaggccgtg cacgaggtga ccgacggcct gagccagctg 540
gccgtggccg tgggcaagat gcagcagttc gtgaacgacc agttcaacaa caccgcccag 600
gagctggact gcatcaagat cacccagcag gtgggcgtga agctgaacct gtacctgacc 660
gagctgacca ccgtgttccg cccccagatc accagccccg ccctgaccca gctgaccatc 720
caggccctgt acaacctggc cggcggcaac atggactacc tgctgaccaa gctgggcgtg 780
ggcaacaacc agctgagcag cctgatcggc agcggcctga tcaccggcaa ccccatcctg 840
tacgacagcc agacccagct gctgggcatc caggtgaccc tgcccagcgt gggcaacctg 900
aacaacatgc gcgccaccta cctggagacc ctgagcgtga gcaccaccaa gggcttcgcc 960
agcgccctga tccccaaggt ggtgacccag gtgggcagcg tgatcgagga gctggacacc 1020
agctactgcg tggagaccga cctggacctg tactgcaccc gcatcgtgac cttccccatg 1080
agccccggca tctacagctg cctgagcggc aacaccagcg cctgcatgta cagcaagacc 1140
gagggcgccc tgaccacccc ctacatgacc atcaagggca gcgtgatcgc caactgcaag 1200
atgaccacct gccgctgcgc cgaccccccc ggcatcatca gccagaacta cggcgaggcc 1260
gtgagcctga tcgaccgcca cagctgcaac gtgctgagcc tggacggcat caccctgcgc 1320
ctgagcggcg agttcgacgt gacctaccag aagaacatca gcatcctgga cagccaggtg 1380
atcgtgaccg gcaacctgga catcagcacc gagctgggca acgtgaacaa cagcatcagc 1440
aacgccctgg acaagctgga ggagagcaac agcaagctgg acaaggtgaa cgtgaagctg 1500
accggcacca gcgccctgat cacctacatc gtgctgacca tcatcagcct ggtgtgcggc 1560
atcctgagcc tggtgctggc ctgctacctg atgtacaagc agaaggccca gcagaagacc 1620
ctgctgtggc tgggcaacaa caccctgaac cagatgcgta agagatctct a 1671