一种基于OPF水凝胶为液态支架的可注射性心肌组织工程产品 【技术领域】
本发明属于组织工程与再生医学领域，特别涉及一种以低聚乙二醇延胡索酸酯(OPF)水凝胶为支架制造的可注射性心肌组织工程产品。
【发明背景】
缺血性心脏病及随之发生的心力衰竭的发病率及死亡率在全球逐年上升，心血管系统疾病已经成为人群中尤其是老年人致死致残的主要原因之一，是当今医疗界的主要难题之一。目前治疗手段包括药物、冠状动脉介入治疗、冠状动脉旁路手术等，虽然这些手段在一定程度上可以缓解患者症状，但均难以从根本上恢复心肌细胞数量，改善心脏舒缩功能。心脏病患者在晚期往往需要进行器官移植，但因可供移植的器官数量有限，每年均有大批心脏病患者因得不到有效治疗而失去治疗机会。
心肌细胞是终末分化细胞，心梗发生后心肌不能再生，死亡的心肌由无收缩功能的纤维结缔组织代替而导致心功能衰竭。内源性再生机制不足以代偿心肌梗死后的心肌细胞死亡。药物治疗能延缓疾病的自然过程，但并不能逆转。因此，移植外源性细胞再生心肌策略得到越来越多的关注。动物实验和初期的临床研究表明细胞移植可取代坏死心肌细胞，改善心肌梗死区弹性，刺激血管新生，限制梗死区变薄，调整存活心肌细胞对梗死区的反应，防止左室扩大及进展性心衰。细胞移植作为一种治疗心肌梗死的新兴的组织工程学方法，成为近年来各国心血管病研究者关注的焦点。各种来源和不同发育阶段的细胞都已经被尝试移植到健康和患病的心脏中，包括胎儿心肌细胞、骨骼成肌细胞、骨髓细胞、内皮祖细胞、间充质干细胞、内在的心脏干细胞以及小鼠和人胚胎干细胞、克隆的胚胎中获得的c-kit阳性的胎儿肝干细胞。其中胚胎干细胞(ES)具有无限或几乎无限的自我更新能力并具有向心肌细胞分化的潜力使其成为基于细胞的心脏治疗的炙手可热的细胞来源。
虽然很多研究报道表明单纯细胞在心梗部位注射能使各种不同疾病模型中的心脏功能得到恢复，但是仍然存在很多问题。首先是滞留的细胞数变化极大，使得移植物的体积不可预测；其次是移植细胞的大量死亡，许多研究指出大约90％的成功注射到心脏的细胞在第一周内就死亡了。建立简单易行的实验方法，使用可注射的生物材料作为一种细胞移植的基质，来增加细胞滞留及存活，将有助于这一策略应用到临床。目前，有研究证明纤维蛋白胶、Matrigel、海藻酸盐溶液可以改善梗死心肌中细胞移植物的保持力和存活力，控制梗死的扩大以及诱导新血管的生成。
低聚乙二醇延胡索酸酯(oligo(poly(ethylene glycol)fumarate)hydrogels(OPF))是一种具有良好生物相容性与可生物降解能力的新型生物材料。OPF是一种水溶性大单体，由聚乙二醇和延胡索酸酯交替组成，具有很好的亲水性。OPF水凝胶能够携带多种不同的细胞与生长因子，是一种优良的可注射性载体。目前OPF水凝胶主要应用于软骨及骨组织工程，用于研制和开发可注射性心肌组织工程产品至今尚未见报道。
【发明内容】
本产品首次采用OPF水凝胶为支架构建可注射性组织工程心肌产品，将其注射到跳动的心脏缺血损伤心肌内，以期达到改善提高移植细胞滞留及存活，修复大面积心梗疤痕并且改善心脏功能的目的。本发明提供一种基于OPF水凝胶的可注射性组织工程化心肌的产品，其特征是为心肌再生提供一种新的产品。
因此，本发明的第一个发明目的是提供制备作为可注射性液态支架的OPF水凝胶的方法，包括：
(1)OPF的制备
通过聚乙二醇(PEG)，富马酰氯和三乙胺(摩尔比1∶0.9∶0.9)一步法反应制备。共沸蒸馏后，PEG被溶于二氯甲烷且富马酰氯和三乙胺在几个小时中被逐滴加入，同时反应烧瓶维持在0℃。然后室温下搅拌1-2天以保证最大转化。
为了纯化低聚物，通过旋转蒸发除去溶剂，之后在乙酸乙酯中溶解产物。溶液过滤除去反应中氯离子与三乙胺生成的盐，低聚物在乙酸乙酯中重结晶两次。最后纯的OPF在乙醚中沉淀出来，并真空干燥(＜1mmHg)得到粉末固体。
纯化的OPF储存在-20℃并且在使用前通过暴露于环氧乙烷中16小时来灭菌。
(2)可注射性组织工程心肌产品的OPF水凝胶的制备
OPF和交联剂聚乙二醇-二丙烯酸酯(PEG-DA)以2∶1的重量比混合于300μlPBS中，加入等体积的(50μl)的热量自由基引发剂，25mM过硫酸铵(APS)和25mMN，N，N’，N’-四甲基乙二胺(TEMED)的PBS溶液。混合物搅拌后，加入200μl含有6.0×106细胞的PBS悬液使细胞终浓度达到1×107cells/ml。温和混匀后，即为液态地基于OPF水凝胶的可注射性心肌组织工程产品。将悬液注射到心梗部位5-10分钟即可成胶。
本发明的第二个发明目的是提供利用上述方法所制备的可注射性液态支架OPF水凝胶，所述凝胶进一步可携带作为心肌种子细胞的移植细胞。
本发明的第三个发明目的是为心梗治疗提供一种新的心肌组织工程产品，所述的心肌组织工程产品由OPF水凝胶和心肌组织工程的种子细胞组成。具体地说，提供一种改善提高移植细胞滞留及存活，修复大面积心梗疤痕并且改善心脏功能的可注射性组织工程产品，其中所述可注射性组织工程产品携带作为心肌种子细胞的移植细胞。
在一个具体实施方案中，所述的移植细胞可以是任何对心梗修复有效的细胞。例如胎儿心肌细胞、胚胎干细胞、重构胚来源的胚胎干细胞、间充质干细胞或肌肉干细胞定向诱导分化来源的心肌细胞、未诱导的干细胞中的一种或几种。(如自体脂肪来源的间充质干细胞等)
在另一个具体实施方案中，所述的心肌梗死是急性心肌梗死，或是陈旧性心肌梗死。
本发明的第三个发明目的是提供所述的可注射性组织工程产品、或是所述方法制备的产品用于制备制备治疗治疗心肌梗死的药物的用途。其中，心肌梗死是急性心肌梗死，或是陈旧性心肌梗死。
有益效果
本发明采用了OPF水凝胶作为可注射性液态支架，结合不同来源的种子细胞再生组织工程化心肌。该支架材料可以提高种子细胞的滞留率和存活率，促进心肌组织再生，增加梗死区室壁厚度、重塑原有心室形状、改善心脏功能。该产品具有可注射性的特征，便于治疗操作，避免心脏停跳、体外循环等操作所带来的风险。本发明操作工艺简单、实施条件温和，为心肌组织工程提供了一种新的产品，对组织工程化心肌治疗心脏疾患的临床开展具有重要意义。
【附图说明】
图1.固体粉末状的OPF
图2.OPF水凝胶的组织相容性检测(HE染色)
A.1周，×40；B.2周，×40；C.3周，×40；D.4周，×40；
图3.携带细胞的OPF水凝胶
图4.大鼠心梗模型的制备
A.大鼠冠状动脉前降支结扎；
B.心电图示ST段抬高提示心梗形成；
图5.超声心动图检测心功能(二尖瓣水平短轴切面)
A.OPF水凝胶携带细胞注射组；B.OPF水凝胶注射组；C.PBS携带细胞注射；D.PBS注射组
【具体实施方式】
现在仅用参考下面非限制性的实施例的方式进一步描述本发明。但是应当理解，下面的实施例仅仅是作为例证的，不应以任何方式当作对上述本发明总体的限制。除非有其它说明，本发明的实施例使用本领域中的传统分子生物学、细胞生物学、组织工程学等等。这些技术是技术人员熟知的，并在文献中有详细解释。参见，例如，Lanza，Langer and Vacanti″Principlesof Tissue Engineering″(2006)；Atala and Lanza″Methods of Tissue Engineering″(2006)。
实施例1：OPF的制备
将30g分子量为1000的聚乙二醇溶解在250ml甲苯中，共沸蒸馏后，将干燥的聚乙二醇溶解在250ml无水的二氯甲烷中。然后在5小时内将富马酰氯(0.3mol)和三乙胺逐滴加入到聚乙二醇溶液中，同时反应烧瓶维持在0℃，室温下搅拌1-2天以保证最大转化。反应过后，通过旋转蒸发除去溶剂，之后在500ml乙酸乙酯中溶解产物。溶液过滤除去反应中氯离子与三乙胺生成的盐，低聚物在乙酸乙酯中重结晶两次。最后纯的OPF在乙醚中沉淀出来，并真空干燥(＜1mmHg)得到粉末固体(图1)。
纯化的OPF储存在-20℃并且在使用前通过暴露于环氧乙烷中16小时来灭菌。
实施例2：OPF水凝胶的组织相容性检测
OPF水凝胶0.1ml注射植入S-D大鼠的心肌中，分别于1、2、4周处死，每次取2只，取出标本后进行石蜡切片，作HE染色观察炎性反应的情况。术后1周切片可见OPF水凝胶广泛分布在心肌组织间隙，其间掺杂少许炎性细胞(图2A)；术后2周组可见OPF水凝胶部分降解，周围存在炎性细胞浸润(图2B)；术后4周组未能见到明显的OPF水凝胶，可见少量炎性细胞浸润(图2C)。
实施例3小鼠胚胎干细胞(mES)来源的心肌细胞的制备
小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的制备：处死孕13d-15d的BALB/C小鼠，无菌条件下取胚胎后去其头部和内脏，用PBS充分洗涤，并将其剪碎后悬浮于0.25％胰酶溶液中分阶段消化。适时终止消化，吸取上层悬液并离心收集细胞。台盼蓝拒染法鉴定细胞活力，计数后以5×108cells/L重悬于含10％FBS的H-DMEM培养基中，37℃、5％CO2及饱和湿度的细胞培养箱内培养过夜。次日将细胞冻存备用或直接制备为饲养层细胞：用含10mg/L丝裂霉素C的培养基处理MEF 2.5-3h，PBS充分洗涤以去除残留成分。加入含10％FBS的H-DMEM培养基即为MEF饲养层。
小鼠胚胎干细胞(mES)扩增及诱导分化为心肌细胞：复苏mES接种于备用的MEF饲养层，加入内含20％胎牛血清(FBS)、0.1mmol/Lβ-巯基乙醇、1％非必需氨基酸及1×106U/L白血病抑制因子(LIF)的H-DMEM培养基维持培养。为保持其理想的未分化状态，当mES集落达到60％-70％融合时传代。mES细胞达到足够数量后诱导分化。取对数生长期mES，经0.25％胰酶消化制成单细胞悬液，置于经0.1％明胶包被的100mm组织培养皿中，37℃孵育30min，因饲养层细胞在较短时间内贴壁，吸取上层细胞悬液接种至另一细菌培养皿内，此时悬浮细胞大部分为mES。继续培养48h，即可见多个悬浮的EB形成。接下来加入0.1％稳定型维生素C条件培养基，继续悬浮培养7d，每隔2d换液。悬浮培养7d后，分别将EB接种至60mm培养皿(3个/cm2)，然后再添加该条件培养基继续贴壁培养，定期换液。每日观察EB分化情况，7d后出现跳动的心肌合胞体，12d后80％EB为跳动的心肌合胞体。用0.1％II型胶原酶消化心肌合胞体1-2h后即为单细胞悬液。
纯化小鼠胚胎干细胞(mES)来源的心肌细胞：9份Percoll液与1份8.5％NaCL混合为储存液，用0.85％NaCL稀释为使用浓度，40.5％为未分化为心肌的ES细胞密度，58.5％为心肌细胞在Percoll液中的漂浮密度。将3ml 58.5％的Percoll液加到离心管的底层，3ml 40.5％的Percoll液缓慢地加到58.5％的Percoll液上面，再将3ml收集的心肌细胞轻轻地加到顶层，1200g/min离心20min。收集分离的第4、5层细胞，用PBS洗2次，离心去除Percoll液，加完全培养基重悬。
小鼠胚胎干细胞(mES)来源的心肌细胞荧光标记：DAPI荧光染料用PBS配置为10mg/ml的储存液，取0.1ml加入20ml的细胞悬液中，使其终浓度为50ug/ml，37℃避光孵育30min，荧光显微镜下观察可见细胞核染色成功。
实施例4携带细胞的OPF水凝胶的制备
OPF和交联剂聚乙二醇-二丙烯酸酯(PEG-DA)以2∶1的重量比混合于300μlPBS中，加入等体积的(50μl)的热量自由基引发剂，25mM过硫酸铵(APS)和25mMN，N，N’，N’-四甲基乙二胺(TEMED)的PBS溶液。混合物搅拌后，加入200μl含有6.0×106细胞的PBS悬液使小鼠胚胎干细胞(mES)来源的心肌细胞终浓度达到1×107cells/ml。温和混匀后，即为液态的基于OPF水凝胶的可注射性心肌组织工程产品(图3)。将悬液注射到心梗部位5-10分钟即可成胶。
实施例5：动物的选择和心梗的制备
实验用S-D大鼠(225-300g左右)，戊巴比妥钠(40mg/kg体重)进行腹腔麻醉，与动物微量呼吸机连接。行开胸术，剪开心包，充分暴露心脏。在左心耳下缘2mm处，用0-7号丝线缝扎。结扎后左室壁变苍白，室壁运动减弱(图4A)。心电监护见I、II导联的ST段明显抬高，表明冠状动脉梗死动物模型制备成功(图4B)。
实施例6：OPF水凝胶携带细胞改善心脏功能检测
将240g左右的S-D大鼠18只随机分为OPF水凝胶携带细胞注射组、PBS携带细胞注射组、OPF水凝胶注射组、PBS注射组。随机选取S-D大鼠6只，雌雄不限，戊巴比妥钠35mg/kg体重腹腔注射麻醉。通过大鼠冠状动脉结扎，致心肌梗死30min后，心肌缺血处注射携带细胞的OPF水凝胶。小鼠胚胎干细胞(mES)来源的心肌细胞与壳聚糖水凝胶混合制备的可注射的心肌组织工程心梗部位注射移植后24小时病理结果提示细胞滞留率及存活率比较单纯用PBS重悬细胞注射移植组明显提高，其4周病理结果提示小鼠胚胎干细胞来源的大量新生心肌细胞继续存在并与宿主细胞形成细胞连接。大鼠心肌梗死区室壁厚度明显提高，未发现室壁瘤形成。术后4周对其心脏进行超声检查，心功能明显改善(图5)。