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1、(10)申请公布号 CN 104313169 A (43)申请公布日 2015.01.28 CN 104313169 A (21)申请号 201410607389.6 (22)申请日 2014.11.03 C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (71)申请人 无锡市疾病预防控制中心 地址 214023 江苏省无锡市金城路 499 号 申请人 无锡市人民医院 (72)发明人 张琦 周伟杰 范晓东 严洁 沈波 (74)专利代理机构 无锡市大为专利商标事务所 ( 普通合伙 ) 32104 代理人 时旭丹 刘品超 (54) 发。
2、明名称 一种快速区分非嗜肺、 嗜肺与嗜肺型军团 菌的三重 PCR 检测方法 (57) 摘要 本发明一种快速区分非嗜肺、 嗜肺与嗜肺 型军团菌的三重 PCR 检测方法， 是一种军团菌属 多重PCR检测方法， 属于微生物分子检测领域。 本 发明利用分别针对军团菌属、 嗜肺军团菌种和嗜 肺军团菌型的 16SrRNA、 danJ 和 ORF9 基因的引 物， 对 dNTPs 和引物浓度比例以及退火温度进行 优化， 建立快速区分非嗜肺、 嗜肺与嗜肺型军团 菌的三重 PCR 方法。本发明方法简便、 快捷、 成本 低、 结果准确可靠， 可以对分离培养到的可疑军团 菌菌株进行快速有效的判定。 (51)Int.。
3、Cl. 权利要求书 1 页 说明书 2 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书2页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104313169 A CN 104313169 A 1/1 页 2 1. 一种快速区分非嗜肺、 嗜肺与嗜肺型军团菌的三重 PCR 检测方法， 其特征在于步 骤为 ： （1） 制备 PCR 模板， 挑取待检测可疑单个菌落于 0.5mL 灭菌无核酸酶的去离子水中， 制 备成菌悬液， 100煮沸 15min， 冷却后备用 ； （2） 引物序列 ： 16S rRNA 基因 ： 上游引物 5 -AAGATTAGCC TGC。
4、GTCCGAT-3 ， 下游引物 5 -GTCAACTTAT CGCGTTTGCT-3 ， 预期扩增片段长度为 654 bp ； danJ 基因 ： 上游引物 5 -AGGTGGTTTT GGCGGATTTG G-3 ， 下游引物 5 -TGAATTCTGA CTTGCCCCAT G-3 ， 预期扩增片段长度为 285 bp ； ORF9 基因 ： 上游引物 5 -CAGGATTACC GCTCATTATT G-3 ， 下游引物 5 -GTAATTCCCA GCCATTTACC AGATC-3 ， 预期扩增片段长度为 561 bp ； （3） PCR反应体系 ： 1.6L dNTP、 浓度均为。
5、2M的三种上、 下游引物均各2L， 模板DNA 2L、 rTaq 酶 0.08L、 10buffer 缓冲液 2L， 无核酸酶的去离子水补足至 20 L ； （4） 扩增条件 ： 95预变性 5 min ； 95 30 s， 52 30 s， 72 40 s 进行 30 个循环 ； 72终末延伸 5 min ； （5） 凝胶电泳 ： 在 1.5% 琼脂糖凝胶、 0.5TBE 缓冲液中电泳， 电泳后凝胶成像获取结 果 ； （6） 判定方法 ： 获得 3 条目的条带为 LP1， 两条目的条带为 LP， 1 条目的条带为非 LP， 0 条目的条带为非军团菌。 权 利 要 求 书 CN 1043131。
6、69 A 2 1/2 页 3 一种快速区分非嗜肺、 嗜肺与嗜肺型军团菌的三重 PCR 检测方法 技术领域 0001 一种快速区分非嗜肺、 嗜肺与嗜肺型军团菌的三重 PCR 检测方法， 是一种军团 菌属多重 PCR 检测方法， 属于微生物分子检测领域。 背景技术 0002 90% 以上的军团菌病是由嗜肺军团菌 （Legionella Pneumophila,LP） 引起， 其中 85% 为 LP1 型军团菌肺炎， 所以嗜肺军团菌和 LP1 型嗜肺军团菌是我们监测的重点。依据 WS394-2012公共场所集中空调通风系统卫生规范 ， 所有公共场所集中空调通风系统冷却 塔水和冷凝水中不得检出嗜肺军团。
7、菌， 该规范的标准检测方法为培养法。 然而， 传统的培养 法在对分离到的可疑军团菌菌落进行判定时存在盲区， 生化检测的不确定性和血清学检测 的多交叉反应性， 导致一些可疑军团菌菌落不能被最终判别。本发明可以弥补生化和血清 学鉴定检测的不足， 快速准确的对分离培养到的可疑军团菌菌落进行判定， 且简单、 方便、 成本低。 发明内容 0003 本发明的目的在于快速准确的对分离培养到的可疑军团菌菌落进行判定， 以克服 传统培养法中生化和血清学鉴定检测的缺点。 0004 本发明的技术方案 ： 一种快速区分非嗜肺 （非 LP） 、 嗜肺 （LP） 与嗜肺 1 型 （LP1） 军 团菌的三重 PCR 检测方。
8、法， 步骤为 ： 1、 制备PCR模板， 挑取待检测可疑单个菌落于0.5mL灭菌无核酸酶的去离子水中， 制备 成菌悬液， 100煮沸 15min， 冷却后备用。 0005 2、 引物序列 ： 16S rRNA 基因 ： 上游引物 5 -AAGATTAGCC TGCGTCCGAT-3 ， 下游引物 5 -GTCAACTTAT CGCGTTTGCT-3 ， 预期扩增片段长度为 654 bp ； danJ 基因 ： 上游引物 5 -AGGTGGTTTT GGCGGATTTG G-3 ， 下游引物 5 -TGAATTCTGA CTTGCCCCAT G-3 ， 预期扩增片段长度为 285 bp ； OR。
9、F9 基因 ： 上游引物 5 -CAGGATTACC GCTCATTATT G-3 ， 下游引物 5 -GTAATTCCCA GCCATTTACC AGATC-3 ， 预期扩增片段长度为 561 bp ； 3、 PCR 反应体系 ： 1.6 L dNTP、 三种上、 下游引物 （使用浓度均为 2M） 均各 2L， 模 板 DNA2L、 、 rTaq 酶 0.08 L、 10buffer 缓冲液 2 L， 无核酸酶的去离子水补足至 20 L ； 4、 扩增条件 ： 95 预变性 5 min ； 95 30 s， 52 30 s， 72 40 s 进行 30 个循 环 ； 72 终末延伸 5 mi。
10、n ； 5、 凝胶电泳 ： 在 1.5% 琼脂糖凝胶， 0.5TBE 缓冲液中电泳， 电泳后凝胶成像获取结 果 ； 说 明 书 CN 104313169 A 3 2/2 页 4 6、 判定方法 ： 获得 3 条目的条带为 LP1， 两条目的条带为 LP， 1 条目的条带为非 LP， 0 条 目的条带为非军团菌。 0006 本发明的有益效果 ： 本方法简便、 快捷、 成本低、 结果准确可靠， 可以对分离培养到 的可疑军团菌菌株进行快速有效的判定， 快速区分非嗜肺、 嗜肺与嗜肺 1 型军团菌。 附图说明 0007 图1 是29株军团菌PCR产物电泳图谱。 M ： 100bp DNA marker 。
11、(最亮的条带为500 bp， 向上、 向下每条带依次增、 减100 bp) ； 1、 18为阴性对照， 2为非嗜肺军团菌L. Jordanis （ATCC33623） ， 3为LP6 （ATCC33216） ， 4为LP1 （ATCC33152） ， 517、 1934为分离到的29株 军团菌。 0008 具体实例方式 实施例 1 一种快速区分非嗜肺、 嗜肺与嗜肺 1 型军团菌的三重 PCR 检测方法， 步骤为、 1、 制备PCR模板， 挑取待检测可疑单个菌落于0.5mL灭菌无核酸酶的去离子水中， 制备 成菌悬液， 100煮沸 15min， 冷却后备用。 0009 2、 引物序列 ： 16S 。
12、rRNA 基因 ： 上游引物 5 -AAGATTAGCC TGCGTCCGAT-3 ， 下游引物 5 -GTCAACTTAT CGCGTTTGCT-3 ， 预期扩增片段长度为 654 bp ； danJ 基因 ： 上游引物 5 -AGGTGGTTTT GGCGGATTTG G-3 ， 下游引物 5 -TGAATTCTGA CTTGCCCCAT G-3 ， 预期扩增片段长度为 285 bp ； ORF9 基因 ： 上游引物 5 -CAGGATTACC GCTCATTATT G-3 ， 下游引物 5 -GTAATTCCCA GCCATTTACC AGATC-3 ， 预期扩增片段长度为 561 bp。
13、。 0010 3、 PCR 反应体系 ： 1.6 L dNTP、 三种上、 下游引物 （使用浓度均为 2M）均各 2L， 模板 DNA 2L、 rTaq 酶 0.08 L、 10buffer 缓冲液 2 L， 无核酸酶的去离子水 补足至 20 L。 0011 4、 扩增条件 ： 95预变性 5 min ； 95 30 s， 52 30 s， 72 40 s 进行 30 个循 环 ； 72终末延伸 5 min。 0012 5、 凝胶电泳 ： 在 1.5% 琼脂糖凝胶、 0.5TBE 缓冲液中电泳， 电泳后凝胶成像获取 结果。 0013 6、 结果判定 ： 获得3条目的条带为LP1， 两条目的条带为LP， 1条目的条带为非LP， 0 条目的条带为非军团菌。 说 明 书 CN 104313169 A 4 1/1 页 5 图 1 说 明 书 附 图 CN 104313169 A 5 。