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1、(10)申请公布号 CN 104178447 A (43)申请公布日 2014.12.03 CN 104178447 A (21)申请号 201410445527.5 (22)申请日 2014.09.03 C12N 1/38(2006.01) C12R 1/46(2006.01) C12R 1/25(2006.01) C12R 1/225(2006.01) C12R 1/245(2006.01) (71)申请人 安徽农业大学 地址 230036 安徽省合肥市长江西路 130 号 (72)发明人 付瑞燕 尤元丽 黄洁洁 (74)专利代理机构 北京双收知识产权代理有限 公司 11241 代理人 王。
2、菊珍 (54) 发明名称 一种提高乳酸菌胆盐耐受性的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种提高细胞壁中含谷氨酰胺 和赖氨酸的乳酸菌胆盐耐受性的方法， 所述方法 为含有谷氨酰胺转氨酶的培养基培养所述乳酸 菌。本发明中涉及的所述乳酸菌包括乳酸乳球菌 8148 菌株、 植物乳杆菌亚种菌株、 罗伊氏乳杆菌 和干酪乳杆菌等所有细胞壁中含谷氨酰胺和赖氨 酸的乳酸菌类菌钟， 本发明优选谷氨酰胺转氨酶 在培养基中的终浓度为 3 25U/mL， 同时通过谷 氨酰胺转氨酶母液多次添加到培养基的方法进一 步了提高乳酸菌胆盐耐受性。本发明所述方法简 单， 成本较低， 易于工业化生产， 通过所述方法可 以显著提高现有市。
3、售的乳酸菌类益生菌对胆盐的 抗性， 有助于其在肠道内发挥功能。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 附图2页 (10)申请公布号 CN 104178447 A CN 104178447 A 1/1 页 2 1. 一种提高乳酸菌胆盐耐受性的方法， 所述乳酸菌的细胞壁肽聚糖中含谷氨酰胺和赖 氨酸， 其特征在于 ： 所述方法是用含有谷氨酰胺转氨酶的培养基培养所述乳酸菌。 2. 根据权利要求 1 所述的提高乳酸菌胆盐耐受性的方法， 其特征在于 ： 至少一次添加 所述谷氨酰胺转氨。
4、酶。 3. 根据权利要求 2 所述的提高乳酸菌胆盐耐受性的方法， 其特征在于 ： 所述谷氨酰胺 转氨酶分 2 到 5 次添加。 4. 根据权利要求 1 所述的提高乳酸菌胆盐耐受性的方法， 其特征在于 ： 所述谷氨酰胺 转氨酶在制备培养基开始到培养结束前的时间内添加。 5. 根据权利要求 1 所述的提高乳酸菌胆盐耐受性的方法， 其特征在于 ： 所述乳酸菌包 括乳酸乳球菌 8148 菌株、 植物乳杆菌亚种菌株、 罗伊氏乳杆菌和干酪乳杆菌。 6. 根据权利要求 1-5 任意一项所述的提高乳酸菌胆盐耐受性的方法， 其特征在于 ： 所 述谷氨酰胺转氨酶在培养基中的终浓度为 3 25U/mL。 7. 根据。
5、权利要求 6 所述的提高乳酸菌胆盐耐受性的方法， 其特征在于 ： 所述谷氨酰胺 转氨酶在培养基中的终浓度为 12U/mL。 8. 根据权利要求 1 所述的提高乳酸菌胆盐耐受性的方法， 其特征在于 ： 还包括用水和 谷氨酰胺转氨酶配制成 50 500U/mL 的谷氨酰胺转氨酶母液， 用滤膜过滤， 通过过滤后的 谷氨酰胺转氨酶母液将谷氨酰胺转氨酶添加到所述乳酸菌培养基中。 9. 根据权利要求 1 所述的提高乳酸菌胆盐耐受性的方法， 其特征在于 ： 所述培养基为 液体培养基或固体培养基。 10. 根据权利要求 9 所述的提高乳酸菌胆盐耐受性的方法， 其特征在于 ： 所述培养基包 括 MRS 液体培养。
6、基、 GM17 液体培养基和 MRS 固体培养基。 权 利 要 求 书 CN 104178447 A 2 1/7 页 3 一种提高乳酸菌胆盐耐受性的方法 技术领域 0001 本发明涉及提高乳酸菌胆盐耐受性的方法， 特别涉及一种提高细胞壁肽聚糖中含 谷氨酰胺和赖氨酸的乳酸菌耐受胆盐性的方法。 背景技术 0002 益生菌是指来源于宿主并对宿主健康有一定促进作用的微生物活体。 而已经被证 明是益生菌的菌株中， 大部分属于乳酸菌。 大量研究表明， 能够作为人类胃肠道中益生菌的 乳酸菌具有抗氧化、 降低胆固醇、 增强免疫力、 抗肿瘤等重要生物学功能。益生菌能够在宿 主体内有多大程度的存活量， 和到达部位。
7、后的繁殖能力决定着其对宿主提供益处的力度或 效果。 这就要求制品中的乳酸菌能够通过上消化道以大量的存活菌到达肠道并且定植于肠 粘膜， 以发挥其益处， 因而乳酸菌细胞应该具有对胆盐的耐受性。 0003 胆盐(Bile salt)是由肝细胞分泌的胆汁酸与甘氨酸或牛磺酸结合而形成的钠盐 或钾盐。 胆盐的主要作用是帮助消化脂肪， 所以胆盐对细胞膜中磷脂、 脂肪酸和膜蛋白具有 一定的破坏作用， 从而改变了细胞膜的渗透性， 对细胞造成伤害， 使乳酸菌类益生菌死亡。 因而， 对胆盐具有一定的耐受性是乳酸菌能够在肠道存活、 生长并发挥功效的先决条件之 一， 即 ： 能够在正常生理胆盐浓度胁迫后生长和代谢的菌株。
8、才可能在肠道中存活。因此， 提 高乳酸菌对胆盐的耐受性是乳酸菌制品研制与开发的技术关键。 0004 现有的方法主要包括从自然界分离筛选耐胆盐的乳酸菌菌株， 对现有的商业化菌 株进行定向选育、 诱变或基因操作， 以及利用微胶囊包裹菌株， 以提高其耐胆盐的能力。这 些方法在应用性方面都存在一些问题， 如分离筛选兼具益生性和耐胆盐的菌株难度较大， 后续的安全性评价也需要时间和成本， 并且存在着由于安全性不达标导致不能应用的问 题 ； 对于第二种方法， 由于现在的消费者对纯天然绿色食品的青睐和对基因修饰食品的排 斥， 如果对已实际应用的菌株进行定向选育、 诱变或基因操作， 存在着消费者接受度较低的 风。
9、险 ； 而第三种方法， 目前国内外已经发展了多种微胶囊化技术应用于益生菌， 但各自都存 在着一些缺点， 不能兼顾工业化生产与保持细菌活性之间固有的矛盾。 0005 谷氨酰胺转氨酶 (transglutaminase， 简称 TG) 是由 331 个氨基组成的分子量约 38000 的具有活性中心的单体蛋白质， 其可催化蛋白质多肽发生分子内和分子间发生共价 交联， 从而改善蛋白质的结构和功能， 对蛋白质的性质如 ： 发泡性， 乳化性， 乳化稳定性， 热 稳定性、 保水性和凝胶能力等效果显著， 进而改善食品的风味、 口感、 质地和外观等。 0006 目前， 还尚未公开采用谷氨酰胺转氨酶处理乳酸菌以提。
10、高其胆盐耐受性的相关文 献资料。 发明内容 0007 本发明提供一种可以提高细胞壁肽聚糖中含谷氨酰胺和赖氨酸的乳酸菌耐受胆 盐能力的方法， 所述方法具有操作简单， 成本低， 实用性强等特点。 0008 一种提高细胞壁肽聚糖中含谷氨酰胺和赖氨酸的乳酸菌胆盐耐受性的方法， 所述 说 明 书 CN 104178447 A 3 2/7 页 4 方法为 ： 用含有谷氨酰胺转氨酶的培养基培养所述乳酸菌 ； 0009 进一步， 所述谷氨酰胺转氨酶分至少两次添加 ； 0010 再进一步， 所述谷氨酰胺转氨酶优选分 2 到 5 次添加 ； 0011 所述谷氨酰胺转氨酶在制备培养基开始到培养结束前的时间内添加。 。
11、0012 所述乳酸菌具体包括乳酸乳球菌 8148 菌株、 植物乳杆菌植物亚种菌株、 罗伊氏乳 杆菌和干酪乳杆菌等细胞壁肽聚糖中含谷氨酰胺和赖氨酸的乳酸菌类菌钟 ； 0013 在最后一次添加所述谷氨酰胺转氨酶后， 使谷氨酰胺转氨酶在培养基中的终浓度 为 3 25U/mL ； 0014 优选谷氨酰胺转氨酶在培养基中的终浓度为 3 25U/mL ； 0015 进一步优选谷氨酰胺转氨酶在培养基中的终浓度为 12U/mL ； 0016 进一步提高乳酸菌胆盐耐受性的方法还包括用水配制成 50 500U/mL 的谷氨酰 胺转氨酶母液， 用滤膜过滤， 将谷氨酰胺转氨酶母液添加到所述乳酸菌培养基中 ； 0017。
12、 上述乳酸菌的培养基包括 MRS 液体培养基、 GM17 液体培养基和 MRS 固体培养基。 0018 本发明的有益效果 0019 其一 ： 0020 发明人发现凡是细胞壁肽聚糖中含谷氨酰胺和赖氨酸的乳酸菌类益生菌， 都可以 采用本发明的方法， 有效地提高其对胆盐的耐受性。 0021 采用谷氨酰胺转氨酶处理后能提高乳酸乳球菌和植物乳杆菌等的胆盐耐受性原 理如下 ： 0022 革兰氏阳性细菌细胞壁的结构简单， 主要是由肽聚糖层所构成， 肽聚糖是异型多 糖大分子， 每一肽聚糖单体含有三个组成部分， 即双糖单位、 由四个氨基酸连起来的短肽 “尾” 和肽 “桥” 。不同的革兰氏阳性菌可能具有组成不同的。
13、短肽 “尾” 和肽 “桥” 。特别是一 些革兰氏阳性菌的短肽” 尾” 的组成是 L- 丙氨酸 D- 谷氨酰胺 L- 赖氨酸 D- 丙氨酸， 这其中恰巧具有了谷氨酰胺转氨酶的催化底物谷氨酰胺和赖氨酸。因此， 发明人研究后认 为， 采用谷氨酰胺转氨酶处理乳酸菌后， 使乳酸菌的细胞壁交联度增加， 加密的细胞壁可有 效阻挡胆盐分子穿过细胞壁去损伤细胞膜， 从而赋予了采用谷氨酰胺转氨酶处理后的乳酸 菌抗胆盐的优良特性。 0023 本发明虽然能提高乳酸菌的胆盐耐受性， 但是对酸胁迫效果不明显。酸胁迫和胆 盐胁迫对细胞的损伤原因差异很大。酸胁迫会导致胞内 pH 值降低， 抑制胞内酶活和转运系 统的活性， 造。
14、成糖酵解速率降低， 从而影响细胞能量的产生。同时， 胞内低 pH 值会诱导细胞 消耗自身的能量来将胞内过多的 H+泵出胞外， 必然会进一步加重能量的消耗， 从而严重抑 制细胞生长。 胆盐的主要作用是帮助人体消化脂肪， 所以胆盐对细胞膜中磷脂、 脂肪酸和膜 蛋白具有一定的破坏作用， 从而改变了细胞膜的渗透性， 对细胞造成伤害。 研究结果也证明 了谷氨酰胺转氨酶处理对乳酸菌细胞的酸胁迫没有效果。 0024 其二 ： 0025 谷氨酰胺转氨酶， 谷氨酰胺转氨酶广泛存在于动物组织， 可催化蛋白质中 L- 赖氨 酸和谷氨酰胺之间的结合反应， 因而能使蛋白质或多肽之间发生共价交联， 形成共价化合 物的聚合。
15、物。人们一直都在食用含有谷氨酰胺转氨酶催化形成 - 谷氨酰赖氨酸异肽键的 食物如水产加工品、 火腿、 香肠、 面类、 豆腐等， 因此， 用谷氨酰胺转氨酶处理乳酸菌类益生 说 明 书 CN 104178447 A 4 3/7 页 5 菌菌株对人体是安全的。 0026 乳酸乳球菌一直以来这两个亚种被人们用来作为乳制品发酵剂， 具有重要的经济 价值， 同时， 它也是目前乳酸菌中研究最为深入的模式菌株， 因此用其得到的实验结果在很 大程度上能反映出乳酸菌的共性。植物乳杆菌是人体肠道内天然存在的一种细菌， 服用植 物乳杆菌后， 对健康人群和病患者具有特定的医疗保健作用。 目前， 大量的植物乳杆菌菌株 作。
16、为益生菌已经得到商业化应用。 0027 综上所述， 本发明在食品安全方面是绝对安全的， 并且所研究的几种乳酸菌具有 这一类乳酸菌的代表性。 0028 其三 ： 0029 本发明方法简单， 成本较低， 易于工业化生产， 通过所述方法可以显著提高现有市 售的乳酸菌类益生菌对胆盐的抗性， 有助于其在肠道内发挥功能。 例如 ： 按照本实施例1中 的方法用 12U/mL 谷氨酰胺转氨酶处理后的乳酸乳球菌在生长 10h 时对 0.04胆盐耐受性 比未处理的提高了 5.63 倍 ； 按照实施例 2 中的方法处理后的植物乳杆菌植物亚种在生长 10h 时对 0.04胆盐耐受性比未处理的提高了 7.59 倍。 附。
17、图说明 0030 图 1 ： 0.04胆盐胁迫 2h 对乳酸乳球菌 8148 菌株生长的影响情况图 ； 0031 图 2 ： 谷氨酰胺转氨酶加入方式对乳酸乳球菌 8148 菌株 0.04胆盐胁迫 2h 耐受 性的影响情况图 ； 0032 图 3 ： 不同浓度谷氨酰胺转氨酶处理对乳酸乳球菌 8148 菌株 0.04胆盐胁迫 2h 耐受性的影响情况图 ； 0033 图 4 ： 不同浓度谷氨酰胺转氨酶处理对植物乳杆菌植物亚种菌株 0.04胆盐胁迫 2h 耐受性的影响情况图。 具体实施方式 0034 实施例 1 0035 一种通过谷氨酰胺转氨酶处理乳酸乳球菌 8148 菌株， 提高其耐受胆盐能力的方 。
18、法。 0036 本实施例中， M17 肉汤培养基粉末购买自青岛海博。M17 肉汤培养基是用 42.3g M17 肉汤培养基粉末加热溶解于 1000ml 蒸馏水中 ,121高压灭菌 15 分钟 , 备用。 0037 所述乳酸乳球菌 8148 菌株来自中国工业微生物菌种保藏管理中心， CICC 编号 20406。 0038 本发明的操作步骤依次为 ： 0039 1、 配制 GM17 液体培养基 ： 具体方法是在 M17 肉汤培养基中添加终浓度为 5g/L 葡 萄糖， 得到 GM17 液体培养基。 0040 2、 接种 ： 将活化好的乳酸乳球菌 8148 菌株以 5的量接种于 GM17 培养基中， 。
19、30 下静置培养 4h 作为种子液。 0041 3、 培养 ： 再以 5的接种量将种子液接种于 GM17 培养基中培养乳酸乳球菌 8148 菌株。 说 明 书 CN 104178447 A 5 4/7 页 6 0042 4、 谷氨酰胺转氨酶溶液配制 ： 用水配制成 200U/mL 的谷氨酰胺转氨酶母液， 用 0.45m 滤膜过滤后， 放置 42的条件下冷藏备用。 0043 5、 谷氨酰胺转氨酶处理 ： 分别于2h、 4h、 6h加入等量步骤4得到的谷氨酰胺转氨酶 母液， 使谷氨酰胺转氨酶在培养基中的终浓度为 3 25U/mL。 0044 6、 静置培养 ： 静置培养至 8h， 得到谷氨酰胺转氨。
20、酶处理后的乳酸乳球菌 8148 菌 株。 0045 其中， 本实施例选择 GM17 培养基是由于乳酸乳球菌 8148 菌株在 GM17 培养基的生 长较好， 本实施例的方法不限于培养基， 本实施例的 GM17 培养基可以替换为凡是能够使乳 酸乳球菌 8148 菌株生长的液体培养基。 0046 胁迫抗性的测定一般采用存活率法， 此法需要多次 10 倍稀释， 误差难以避免。为 减少由于稀释带来的误差， 本发明采用基于比浊法的耐受率法来测定乳酸乳球菌 8148 菌 株的胆盐耐受性。乳酸乳球菌 8148 菌株在 0.04胆盐胁迫 2h 后直接接种 GM17 培养基进 行培养。由于胆盐对细胞的损伤， 导。
21、致活细胞数减少， 延滞期明显延长， 对数期生长速率相 对较慢， 但是最终生物量与未胁迫的对照组一致。 细胞对胆盐的耐受性越强， 则生物量与未 受胁迫的对照组的越接近， 耐受率越高， 即抗性越强， 反之亦然。如图 1 所示， 胆盐耐受率曲 线呈现出前期迅速降低至最低值， 后期逐渐升高至100的特点。 曲线的后期足以反映出细 胞经胆盐胁迫后活细胞的生长能力， 即对胆盐胁迫的耐受性。 因此， 胆盐耐受率曲线的后期 上升阶段的情况可以用来表征细胞对胆盐胁迫的抗性大小。 0047 胆盐耐受率的具体测定方法为 ： 菌株培养 8h 后， 将 5mL 菌液离心， 离心条件为 4000r/min,10min， 。
22、弃上清液， 将细胞沉淀用生理盐水洗涤一次， 重悬于含 0.04 (w/v) 胆 盐的生理盐水中， 置 37下水浴 2h。在 4000r/min,10min 下离心， 生理盐水洗涤一次。用 5mL 的培养基重悬细胞沉淀， 充分混匀作为种子液， 以 5的接种量接种于培养基中， 于 0h、 9h、 10h、 11h、 12h、 13h 测生物量 OD600。同时用生理盐水代替胆盐溶液进行相同的实验操作， 以此作为对照。根据公式计算胆盐胁迫耐受率。 0048 胆盐胁迫耐受率 ( ) OD胁迫/OD对照*100 0049 对照实验 ： 第一组为不加谷氨酰胺转氨酶的实验组， 即按照实施例 1 的步骤 1,。
23、2,3,6 操作后， 按照上述方法测定其胆盐胁迫耐受率 ； 第二组为一次性添加谷氨酰胺转 氨酶至终浓度的实验组， 即 ： 将实施例 1 中的步骤 5 替换为 “在培养的 0 时刻在培养基中一 次性添加谷氨酰胺转氨酶至终浓度 3-25U/mL” ， 其他同实施例 1 ； 第三组为实施例 1 的实验 组 ； 0050 其中， 第二组和第三组中， 添加谷氨酰胺转氨酶至终浓度 9U/mL 的实验结果如表 1 记载。 0051 表 1 谷氨酰胺转氨酶加入方式对乳酸乳球菌 8148 菌株 0.04胆盐耐受性的影 响 0052 说 明 书 CN 104178447 A 6 5/7 页 7 0053 由附图 。
24、2 和表 1 可见， 在培养的 0 时刻一次性添加谷氨酰胺转氨酶和培养过程中 分三次加入终浓度为9U/mL的谷氨酰胺转氨酶， 均可以明显提高乳酸乳球菌8148菌株对胆 盐的耐受性。并且， 培养过程中分三次加入的效果明显要优于在培养的 0 时刻一次性加入。 0054 发明人也测定了不同浓度谷氨酰胺转氨酶对乳酸乳球菌 8148 菌株对 0.04胆盐 胁迫 2h 耐受性的影响， 数据见附图 3， 结果表明， 培养过程中分三次等量添加谷氨酰胺转氨 酶， 在 0 12U/mL 范围内， 随着所添加的谷氨酰胺转氨酶浓度的增加， 乳酸乳球菌 8148 菌 株 0.04胆盐耐受性也随之提高， 尤其是添加 12。
25、U/mL 的效果更加显著。但是， 当谷氨酰胺 转氨酶添加浓度为 15 和 20U/mL 时， 效果反而低于谷氨酰胺转氨酶添加浓度为 6U/mL 的， 并 且谷氨酰胺转氨酶添加浓度为 20U/mL 的效果比 15U/mL 的更差。 0055 实施例 2 0056 一种通过谷氨酰胺转氨酶处理植物乳杆菌植物亚种菌株， 提高其耐受胆盐能力的 方法。 0057 本实施例中， MRS 肉汤培养基粉末购买自青岛海博。所述植物乳杆菌植物亚种菌 株来自中国工业微生物菌种保藏管理中心， CICC 编号 6073。 0058 本发明的操作步骤依次为 ： 0059 1、 配制MRS液体培养基 ： 具体方法是称取52.。
26、4g MRS肉汤培养基粉末， 加热溶解于 1000ml 蒸馏水中 ,121高压灭菌 15 分钟， 得到 MRS 液体培养基。 0060 2、 接种 ： 将活化好的植物乳杆菌植物亚种菌株以 5的量接种于 MRS 液体培养基 中， 30下静置培养 9.5h 作为种子液。 0061 3、 培养 ： 再以 5的接种量接种于 MRS 液体培养基中， 培养植物乳杆菌植物亚种菌 株。 0062 4、 谷氨酰胺转氨酶溶液配制 ： 用水配制成 200U/mL 的谷氨酰胺转氨酶母液， 用 0.45um 滤膜过滤后， 放置 42的条件下冷藏备用。 0063 5、 谷氨酰胺转氨酶处理 ： 分别于植物乳杆菌植物亚种菌株。
27、培养 2h、 4h、 6h 时加入 步骤 4 得到的谷氨酰胺转氨酶母液， 最后一次添加谷氨酰胺转氨酶后， 使谷氨酰胺转氨酶 在培养基中的终浓度为 3 25U/mL。 0064 6、 静置培养 ： 静置培养至 8h， 得到谷氨酰胺转氨酶处理后的植物乳杆菌植物亚种 菌株。 0065 其中， 本实施例选择 MRS 液体培养基是由于植物乳杆菌植物亚种菌株在 MRS 液体 培养基的生长较好， 本实施例的方法不限于培养基， 本实施例中的 MRS 液体培养基可以替 换为凡是能够使植物乳杆菌植物亚种菌株生长的液体培养基。 0066 发明人对实施例 2， 即采用谷氨酰胺转氨酶处理后的植物乳杆菌植物亚种菌株做 了。
28、 0.04胆盐胁迫 2h 实验， 结果见附图 4。 说 明 书 CN 104178447 A 7 6/7 页 8 0067 从附图 4 可以看出， 培养过程中分三次等量添加谷氨酰胺转氨酶 12U/mL 对植物 乳杆菌植物亚种提高抗胆盐能力的效果最好， 但是， 当谷氨酰胺转氨酶添加浓度为 15U/mL 时， 效果反而低于谷氨酰胺转氨酶添加浓度为 9U/mL 的。因此， 此法对乳杆菌类益生菌提高 胆盐抗性同样有效。 0068 实施例 3 0069 一种通过谷氨酰胺转氨酶处理植物乳杆菌植物亚种菌株， 提高其耐受胆盐能力的 方法。 0070 本实施例中， MRS 肉汤培养基购买自青岛海博， 所述植物乳。
29、杆菌植物亚种菌株来自 中国工业微生物菌种保藏管理中心， CICC 编号 6073。 0071 本发明的操作步骤依次为 ： 0072 1、 配制MRS液体培养基 ： 具体方法是称取52.4g MRS肉汤培养基粉末， 加热溶解于 1000ml 蒸馏水中 ,121高压灭菌 15 分钟， 得到 MRS 液体培养基。 0073 2、 接种 ： 将活化好的植物乳杆菌植物亚种菌株以 5的量接种于 MRS 液体培养基 中， 30下静置培养 9.5h 作为种子液。 0074 3、 培养 ： 再以 5的接种量接种于 MRS 液体培养基中， 培养植物乳杆菌植物亚种菌 株。 0075 4、 谷氨酰胺转氨酶溶液配制 ：。
30、 用水配制成 100U/mL 的谷氨酰胺转氨酶母液， 用滤 膜过滤， 备用。 0076 5、 谷氨酰胺转氨酶处理 ： 从培养植物乳杆菌植物亚种菌株开始到培养结束前 1h 的任意时间内， 向液体培养基中分二到五次加入的谷氨酰胺转氨酶母液， 最后一次添加谷 氨酰胺转氨酶母液后， 使谷氨酰胺转氨酶的终浓度为 3 25U/mL。 0077 6、 静置培养 ： 静置培养后得到谷氨酰胺转氨酶处理后的植物乳杆菌植物亚种菌 株。 0078 实施例 4 0079 一种通过谷氨酰胺转氨酶处理罗伊氏乳杆菌， 提高其耐受胆盐能力的方法。 0080 其中， 所述罗伊氏乳杆菌来自中国工业微生物菌种保藏管理中心， CICC。
31、 编号 6123。 0081 本发明的操作步骤依次为 ： 0082 1、 接种 ： 将活化好的罗伊氏乳杆菌接种于购买的 MRS 肉汤培养基中， 培养罗伊氏 乳杆菌。 0083 2、 谷氨酰胺转氨酶溶液配制 ： 用水配制成 50 500U/mL 的谷氨酰胺转氨酶母液， 用滤膜过滤， 备用。 0084 3、 谷氨酰胺转氨酶处理 ： 从培养罗伊氏乳杆菌的 0 时刻到培养结束前的任意时间 内， 向液体培养基中至少一次加入的谷氨酰胺转氨酶母液， 最后一次添加谷氨酰胺转氨酶 0085 母液后， 使谷氨酰胺转氨酶的终浓度为 3 25U/mL。 0086 4、 静置培养 ： 静置培养后得到谷氨酰胺转氨酶处理后。
32、的罗伊氏乳杆菌。 0087 通过上述步骤处理后所述菌株的胆盐耐受性明显提高。 0088 实施例 5 0089 一种通过谷氨酰胺转氨酶处理干酪乳杆菌， 提高其耐受胆盐能力的方法。 说 明 书 CN 104178447 A 8 7/7 页 9 0090 其中， 所述干酪乳杆菌来自中国工业微生物菌种保藏管理中心， CICC 编号 6108。 0091 本发明的操作步骤依次为 ： 0092 1、 制备 MRS 液体培养基 ： 称取 52.4g MRS 肉汤培养基粉末， 加热溶解于 1000ml 蒸 馏水中 ,121高压灭菌 15 分钟， 得到 MRS 液体培养基。 0093 2、 谷氨酰胺转氨酶处理 。
33、： 向MRS液体培养基中分N次加入的谷氨酰胺转氨酶， 最后 一次添加谷氨酰胺转氨酶后， 使谷氨酰胺转氨酶的终浓度为325U/mL， 其中N为大于1的 整数。 0094 3、 接种 ： 将活化好的干酪乳杆菌接种于 MRS 液体培养基中， 培养干酪乳杆菌。 0095 4、 静置培养 ： 静置培养后得到谷氨酰胺转氨酶处理后的干酪乳杆菌。 0096 通过上述步骤处理后所述菌株的胆盐耐受性明显提高。 0097 发明人通过与实施例 1、 实施例 2、 实施例 3、 实施例 4 和实施例 5 相同或相似的实 验， 发现本发明的方法并不是适用于所有的乳酸菌， 仅仅适用于部分乳酸菌， 随后发明人对 适用于本发明。
34、的乳酸菌类益生菌种类进行了研究， 结果发现， 乳酸乳球菌 8148 菌株、 植物 乳杆菌植物亚种等适用于本发明的乳酸菌的细胞壁肽聚糖具有共性。研究结果显示， 植物 乳杆菌植物亚种菌株每 mg 肽聚糖中含 13.36g 谷氨酰胺和 19.05g 赖氨酸， 乳酸乳球菌 8148菌株也含有谷氨酰胺和赖氨酸 ； 文献报道乳酸乳球菌8148的衍生菌株MG1363， 其细胞 壁肽聚糖中也含有谷氨酰胺和赖氨酸， 适用于本发明， 同理， 罗伊氏乳杆菌和干酪乳杆菌的 细胞壁肽聚糖中也同时含有谷氨酰胺和赖氨酸。反之， 对照则是乳酸乳球菌 NFL 菌株， 经测 定， 其细胞壁肽聚糖中不含谷氨酰胺， 只有赖氨酸， 赖。
35、氨酸含量为 64.62g/mg 肽聚糖， 用 谷氨酰胺转氨酶处理乳酸乳球菌 NFL 菌株的培养基后， 其胆盐抗性没有变化。 0098 测定结果表明适用于本发明的乳酸菌， 其细胞壁肽聚糖中须同时含有谷氨酰胺和 赖氨酸。 0099 实施例 6 0100 一种通过谷氨酰胺转氨酶处理细胞壁肽聚糖中含谷氨酰胺和赖氨酸的乳酸菌， 提 高其耐受胆盐能力的方法。 0101 本发明的操作步骤依次为 ： 0102 1. 菌株的选择 ： 首先， 满足本实施例的菌株属于乳酸菌， 其次， 所述菌株的细胞壁 的肽聚糖中同时含有谷氨酰胺和赖氨酸。 0103 2. 制备 MRS 固体培养基 ： 称取 52.4g MRS 肉汤。
36、培养基粉末和 15g 琼脂粉， 加热溶 解于 1000ml 蒸馏水中 ,121高压灭菌 15 分钟， 得到 MRS 液体培养基。 0104 3.谷氨酰胺转氨酶处理 ： 向灭菌后凉至45的MRS液体培养基中一次性加入谷氨 酰胺转氨酶， 使谷氨酰胺转氨酶的终浓度为 3 25U/mL。 0105 4. 接种 ： 将活化好的干酪乳杆菌接种于 MRS 固体培养基中， 混匀后， 快速倒进培养 皿中， 制备成平板， 培养乳酸菌。 0106 5. 静置培养 ： 静置培养后得到谷氨酰胺转氨酶处理后的乳酸菌。 0107 通过上述步骤处理后乳酸菌的胆盐耐受性明显提高。 0108 以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述， 并非对本发明的范 围进行限定， 在不脱离本发明设计精神的前提下， 本领域普通技术人员对本发明的技术方 案作出的各种变形和改进， 均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。 说 明 书 CN 104178447 A 9 1/2 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104178447 A 10 2/2 页 11 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 104178447 A 11 。