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1、(10)申请公布号 CN 103975059 A (43)申请公布日 2014.08.06 CN 103975059 A (21)申请号 201380003873.1 (22)申请日 2013.01.30 61/592,949 2012.01.31 US C12N 11/04(2006.01) (71)申请人 罗格辛研究所 地址 美国纽约 (72)发明人 L盖兹达 M拉腊莫尔 T汉密尔顿 B史密斯 (74)专利代理机构 中国国际贸易促进委员会专 利商标事务所 11038 代理人 李瑛 (54) 发明名称 用于制造大珠粒的改进方法 (57) 摘要 本发明涉及用于制备琼脂糖涂覆的、 琼脂糖 珠粒的。
2、改进方法， 所述珠粒含有细胞。 优选地自动 化的方法涉及将制造的珠粒置于温度梯度的矿物 油样品中， 使得所述温度随着所述珠粒通过所述 油移动而下降。优选地， 在该方法中使用 “喇叭形 工具” 和 “秸秆形工具” 。 (30)优先权数据 (85)PCT国际申请进入国家阶段日 2014.05.15 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/US2013/023802 2013.01.30 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2013/116306 EN 2013.08.08 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 10 页 附图 7 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)。
3、发明专利申请 权利要求书1页 说明书10页 附图7页 (10)申请公布号 CN 103975059 A CN 103975059 A 1/1 页 2 1. 用于生产物质组合物的方法， 所述物质组合物包含在含有琼脂糖的珠粒中的细胞样 品， 其中所述珠粒被琼脂糖涂覆， 所述方法包括 ： (a) 将第一琼脂糖样品与所述细胞混合， 以形成悬浮液 ； (b) 从所述悬浮液形成珠粒 ； (c) 用第二琼脂糖溶液涂覆所述珠粒， 和 (d) 将所述涂覆的珠粒分配至矿物油样品中， 其中将所述矿物油样品保持在温度梯度 下， 使得所述珠粒从较高温度的矿物油移动至较低温度的矿物油。 2. 权利要求 1 的方法， 其中。
4、所述细胞是分泌细胞。 3. 权利要求 1 的方法， 其中所述细胞是癌细胞。 4. 权利要求 1 的方法， 其中所述细胞是癌干细胞。 5. 权利要求 1 的方法， 其中所述细胞是胰岛细胞。 6. 权利要求 1 的方法， 其中所述细胞是干细胞。 7. 权利要求 6 的方法， 其中所述细胞是胚胎干细胞。 8. 权利要求 1 的方法， 其中所述细胞是多能细胞。 9. 权利要求 1 的方法， 进一步包括在用第二琼脂糖溶液涂覆所述珠粒之前， 用喇叭形 工具从所述悬浮液中取出所述珠粒。 10. 权利要求 1 的方法， 进一步包括用喇叭形工具从所述矿物油中取出所述珠粒。 11.权利要求1的方法， 其中所述温度。
5、梯度从约20至约50， 较高温度在所述梯度开 始时。 12. 权利要求 11 的方法， 其中所述较高温度变化范围从约 20至约 35。 13.权利要求1的方法， 其中所述较高温度从约20至约30， 并且所述较低温度从约 0至约 -8。 14. 权利要求 13 的方法， 其中所述较高温度从约 20至约 25， 并且所述较低温度从 约 0至约 -2。 15. 可用于将物体从一个点转移至另一个点的装置， 其包括具有中空纵轴的整体构造， 所述中空纵轴在一端具有连接所述中空纵轴的倒圆锥， 而在第二端具有适于连接真空装置 的装置， 所述在第二端的装置具有大于所述纵轴和倒圆锥装置两者的直径。 16. 可用于。
6、将物体从一个点转移至另一个点的装置， 该装置包括具有中空纵轴和两端 的整体构造， 其第一端适于连接至真空装置， 而第二端适于接收待转移的物体， 所述转移装 置进一步包括适于接纳用于流体源的连接装置的内部装置， 和用于阻止递送设备的装置， 所述递送设备用于转移所述流体。 权 利 要 求 书 CN 103975059 A 2 1/10 页 3 用于制造大珠粒的改进方法 0001 相关申请 0002 本申请要求 2012 年 1 月 31 日提交的美国临时申请 No.61/592,949 的优先权， 将 其全文并入作为参考。 发明领域 0003 本发明涉及用于制备物质组合物的改进方法， 所述物质组合。
7、物包含包裹在可渗透 的珠粒或其他结构中的细胞(特别是分泌细胞)， 然后用琼脂糖进行涂覆。 所述珠粒可以包 含琼脂糖或由琼脂糖组成。Litex 琼脂糖对于该珠粒尤为优选。 0004 发明背景 0005 含有包裹在可渗透介质中的活细胞的物质组合物的制造已经显示出在多 个领域中是重要的， 如糖尿病治疗、 癌症治疗和干细胞维持。在这点上， 参见， 例如， Reissue40,555 ； 美国专利 No.7,838,291 ； 6,818,230 ； 6,808,705 ； 6,303,151 ； 6,224,912 ； 5,888,497 ； 和 5,643,569， 以及公开的专利申请 2007/0。
8、071732， 将其全部并入作为参考。 0006 用于制备这些物质组合物 ( 下文中称为 “包胶物 (encapsulate)” ) 的方法是基本 上相同的， 与所用的细胞类型无关。分离或获得目标细胞后， 将这些细胞悬浮于诸如琼脂 糖、 胶原蛋白或其组合这样的试剂的水溶液中， 或置于诸如明胶海绵这样的材料上。 当使用 水溶液时， 通过将所述悬浮液置于矿物油中， 形成含有目标细胞的半固体珠粒。 如果使用明 胶海绵， 则将含有该细胞的产品滚成球形， 此后将琼脂糖倒在其上面， 以形成珠粒。 0007 然后使所述珠粒接触在例如特富龙勺子中的琼脂糖溶液。 将所述珠粒在该混合物 中滚动， 以形成在上文引用。
9、的现有技术中被称为琼脂糖涂覆的大珠粒的物质。 0008 例如， 由教导了包裹分泌细胞 ( 如， 胰岛素生成胰岛和癌细胞 ) 的 RE40,555 和美 国专利 No.5,888,497 所示的最初教导后面已经有了改进， 包括包裹干细胞， 如美国专利 No.7,838,291 所示的， 并且通过所用材料的改进， 如例如公开的专利申请 2007/0071732 中 所看到的 ； 然而， 对于改进用于制备这些有用材料的方法存在着日益需求。 0009 这个领域非常需要的一个改进是使人工方法自动化的能力。 0010 在使制造方法自动化的过程中， 本发明人已经研发了专用工具， 其有助于该制造 方法。此外，。
10、 他们已经发现了在通过将大珠粒置于温度梯度下的矿物油容器中来完成该方 法中， 可以生产具有比认为可能的更均匀的形状和平滑质地的大珠粒。 0011 将在以下的公开内容中看到这是怎样完成的。 0012 附图简述 0013 图 1 显示了将细胞和琼脂糖自动分配至含有矿物油的多孔阵列中。 0014 图 2a-2c 呈现了本发明的 “喇叭形工具” 的优选实施方案的不同视图。 0015 图 3 显示了所述喇叭形工具的第二个实施方案。 0016 图 4a 和 4b 显示了本发明的秸秆形工具的不同实施方案。 0017 图 5 描绘了本发明方法的概述。 0018 图 6 显示了用于维持本发明操作中的温度梯度的装。
11、置。 说 明 书 CN 103975059 A 3 2/10 页 4 0019 图 7 描绘了来自用不同浓度和类型的琼脂糖制得的珠粒的胰岛素生成水平。 0020 优选实施方案的详述 0021 参考上文引用的美国专利， 其全部描述了用于制备大珠粒的人工方法， 所述大珠 粒含有不同类型的细胞， 如本文中限定的分泌细胞。 如下文中描述的， 本文中描述的本发明 通过用含有保持在温度梯度下的矿物油的容器替代使琼脂糖涂覆的琼脂糖珠粒与勺子中 或特富龙表面上的矿物油接触的最后一个步骤改变了那些方法。 0022 如这些专利中描述的大珠粒也可以通过机器人或经由自动化来制得。 本文中描述 了一种这样的方法。 00。
12、23 在一个实施方案中， 如图 1 中所描绘的， 机器人分配器， 如移液管阵列， 将分泌细 胞分配至多孔平板， 如标准 96 孔平板中。然后将熔化的琼脂糖加入孔中。然后经由例如自 动化装置 ( 如， 多移液管阵列 ) 将所述细胞和熔化的琼脂糖转移至含有矿物油的装置 ( 如， 单孔或多孔容器， 如 96 孔平板 ) 中， 以形成珠粒。 0024 然后从孔中取出珠粒， 优选通过使用图 “2a-c 和 3” 中描绘的所谓的 “喇叭形工 具” 。设计了如下文详细阐述的喇叭形工具， 使得不破坏珠粒的表面。 0025 在进一步的实施方案中， 在孔的底部提供了出口装置， 所述珠粒通过其离开孔， 并 且可以用。
13、于随后的步骤中。在再进一步的实施方案中， 从上文讨论的方法获得的珠粒可以 经由自动化装置(如， 可移动的平台)转移至矿物油的顶部， 并且还经由自动化系统从含有 矿物油的装置中取出。 0026 在通过喇叭形工具捡出或通过出口装置， 并且通过用合适的溶液 ( 如， 平衡盐溶 液 ) 冲洗除去任何粘附的矿物油后， 将珠粒置于含有新的、 温热的琼脂糖的孔中。接着， 将 珠粒和温热琼脂糖一起取出， 优选使用如图4a和4b中所示的所谓的 “秸秆形工具” ， 使用温 和的吸取， 并且分配至受控温度梯度下的含有矿物油的容器中。 0027 含有矿物油的容器可以是， 例如， 试管、 比色皿、 烧杯， 或合适的任何。
14、其他物体， 尽 管优选各种大小的试管和比色皿。用于制备容器 ( 即， 试管、 比色皿等 ) 的材料可以不同。 玻璃尤为优选， 尽管可以使用其他材料， 如涂覆了提供亲水层的物质的那些。 0028 可以通过本领域已知的任何方法来维持容器中的温度梯度。 关键在于容器顶部的 矿物油的温度高于其底部的。梯度的温度和数量将根据例如容器的长度、 包裹的细胞的类 型、 所用的琼脂糖类型等而改变。对于设定这些值重要的因素包括， 例如， 所包裹细胞是活 的的温度、 所用的琼脂糖将固化的温度等等。梯度开始的温度优选为 20至 80， 更优选 20至50， 并且甚至更优选地， 20至40。 理想地， 起始温度为约20。
15、至约25。 容器 底部的温度可以改变， 例如变化范围为 0至 -10， 更优选 0至 -8， 并且最优选约 0 至约 -2。最高和最低温度之间的总差异优选为 20至 50， 更优选约 20至约 30。 0029 作为本申请一部分的附图将详细论述前面的描述。 0030 图 1 显示了怎样将细胞和琼脂糖两者分配至平板的孔中。经由例如洗涤或抽吸或 经由上文讨论的出口装置除去矿物油后， 将上文提及的并且如图2a-2c和3中所示的 “喇叭 形工具” 插入孔中， 以取出具有包裹的细胞的珠粒。 这种喇叭形工具在一端具有连接的真空 源， 其没有破坏珠粒的表面， 使得有助于取出。 0031 由一层琼脂糖和细胞组。
16、成的珠粒经由所谓的 “喇叭形工具” 沉积至新的孔中， 所述 新的孔中充满加热过的琼脂糖， 其作为第二层， 或涂覆琼脂糖。 将珠粒和温热的琼脂糖一起 说 明 书 CN 103975059 A 4 3/10 页 5 取出， 优选地通过使用 “秸秆形工具” ， 如图 4a 和 4b 中所示那些中的一种， 优选地借助温和 的抽吸来取出， 并且将珠粒分配至含有温度梯度矿物油的容器中。可以通过例如图 5 中所 示的装置来维持温度梯度， 但本领域技术人员将熟知其他选择。当大珠粒穿过容器并且到 达底部时， 可以使用延长形式的喇叭形工具， 使用抽吸， 以取出大珠粒， 用于在介质中洗涤， 或如上文所述的， 可以使。
17、用用于取出珠粒的出口装置。在这一点上， 大珠粒准备好待使用， 尽管在不同的情况中， 可能优选允许细胞在珠粒内增殖和 / 或成熟， 直至存在足够的数量 或直至细胞表达特定的产物。这个时间段可以为例如一周至数月。 0032 现在参照所要求的发明的附图， 图 2a、 2b、 2c 和 3 显示了根据本发明的所谓的 “喇 叭形工具” 的设备的不同视图。 0033 参照图 2a， 显示了一种喇叭形工具 40。将工具描述为 “喇叭形工具” 源自倒圆锥 部分 41 类似喇叭。在一端， 提供了倒圆锥部分 41， 具有连接圆锥端 41 的轮缘 42。圆锥端 41 连接中空的、 纵向部分 43， 其适于流体， 如。
18、空气穿过其中。 0034 如图 2a 所示， 中空的纵向部分 43 沿着整个设备延伸。可以看到环圈装置 44 放置 在沿着喇叭形工具长度的相对于倒圆锥端的约 2/3 至 3/4 处。环圈装置 44， 以及本文中描 述的几个结构元件， 是制造方法的人工制品， 并且没有影响装置的功能。 0035 然而， 环圈装置 44， 标志着纵向装置增大其圆周的点。45 表示的设备的部分对应 于联接端， 其在操作中连接工具和流体源， 例如， 空气， 如真空。连接孔 46 具有装置任何部 分最宽的周长， 并且用于完成与例如真空装置的连接。提供了内部结构， 如图 2c 中呈现的 那些， 以促进真空装置的连接。这些结。
19、构可以根据所使用的仪器而变化。 0036 观察到设备中的隆起装置 47 以及一系列均匀间隔的突出物 48a、 b 和 c， 与环圈装 置 44 一样， 都是制造的人工制品 ； 然而， 这些突出物也用于帮助将相连的工具固定在正确 的位置， 例如， 固定在分配支架中。 0037 在图2b和2c中， 都可以看到设备的内部， 其中可以看到实际上设备沿着其长度是 中空的。图 2c 中的倒圆锥区段的视图更详细地显示了怎样逐渐变细至圆周略小于设计来 吸取的物质 ( 例如， 珠粒 ) 的点。 0038 在操作中， 设备40经由连接端46连接于例如真空泵装置， 并且将其垂直地置于待 取出的物质， 如珠粒上。真空。
20、泵装置 ( 未显示 ) 除去工具内的任何空气， 并且允许吸入珠 粒， 例如， 通过控制由真空形成的抽吸力来吸入， 倒圆锥端 41 的构造允许从一个位置取出 珠粒， 如半软的琼脂糖珠粒， 并且移动至另一个位置， 如涂覆琼脂糖的溶液。 在该点上， 通过 例如给纵向装置 45 提供空气来改变真空压力， 其起到将珠粒从锥形端 41 排入琼脂糖溶液 中的作用， 而没有给珠粒的构造带来任何变化。 0039 图 3 显示了图 2a-2c 的设备的另一个实施方案。通过不同于图 2a-2c 的实施方案 的制造方法制备的这个设备呈现出沿着纵向部分 43 的隆起装置。此外， 将注意到环圈装置 以及隆起装置 47 和。
21、 48a-c 中存在变化。然后， 倒锥形端 41 及其轮缘， 以及联接端 45 和连 接孔， 以图 2a-2c 的相当结构的相同方式来起作用。 0040 图 4a 和 4b 描绘了下文中称为 “秸秆形工具” 的设备。现在参照图 4a， 显示了秸秆 形工具 50。该工具呈现出沿着中空纵轴 51、 联接端 52 和接收端 53 的基本上是圆柱形的几 何结构。 0041 秸秆形工具包括凹入的空间 54， 其沿着纵轴 51 延伸， 在接收端 53 开口。 说 明 书 CN 103975059 A 5 4/10 页 6 0042 接收空间 54 沿着纵轴延伸， 并且其连接管道部分 55， 其可以具有小于。
22、接收空间的 直径。该管道部分 55 连接连接装置 52， 并且 “52” 、“54” 和 “55” 的组合形成工作通道， 其 接受流体， 如空气或另一种气体压力的变化。在操作中， 连接装置 52 与能够改变秸秆形工 具中的流体压力的设备， 如空气泵连在一起。然后将秸秆形工具置于目标物， 如珠粒上， 并 且在压力改变时， 通过秸秆形工具取出珠粒。应当注意到接收端 53 的开口的直径足够大， 使得能够捡出目标物， 例如， 珠粒， 并且允许珠粒在工具的纵向空腔中垂直移动。一旦珠粒 被移动至所需位置， 第二次的压力变化使珠粒掉下， 并且允许重新使用秸秆形工具。 0043 图 4a 和 4b 在连接装置。
23、 52 的构造上是不同的 ； 然而， 构造的差异是由制造方法形 成的， 并且没有影响设备的运行。 0044 在每个设备中， 虚线表示秸秆形工具适用于接收选择的真空连接装置。描绘了凹 入的通道 56， 其能够接纳连接装置， 如可扩展的 O- 环。此外， 该设备的特征是装置 57， 用于 阻挡移液管的前进。这种 “移液管搁架” 停止了移液管或其他递送装置通过流体， 例如， 空 气。 0045 以下实施例应当认为是本文中所述的本发明的示例， 而不是限制。 0046 实施例 1 0047 将粉末状琼脂糖(Litex HSB-LV)溶解于最小必需培养基中， 至0.8或4.5(w/ v)浓度， 然后在12。
24、1下高压灭菌20分钟。 这产生了粘性的熔化溶液。 将琼脂糖溶液冷却， 并且分别维持在 51-53或 61-63。 0048 将总共 150,000RENCA( 肾癌 ) 细胞加入孔中， 此后加入 0.25ml0.8琼脂糖溶液， 以形成悬浮液， 并且然后将这种细胞 / 琼脂糖悬浮液分配至塑料碗中的室温矿物油中， 或 分配至之前装满了室温矿物油的深孔 96 塑料平板中。 0049 形成了含有 RENCA 细胞的琼脂糖大珠粒， 作为具有光滑表面并且均匀分布细胞的 圆珠。然后从大珠粒吸去矿物油， 用 RPMI 细胞培养基洗涤大珠粒。 0050 大珠粒的涂层使用了 4.5 w/v 溶液。用于涂层的琼脂糖。
25、与用于珠粒的是相同类 型 ； 然而， 应当注意到它们可以不同。 0051 为了进行制备珠粒的人工模式， 将上文制得的珠粒在含有 1.0ml4.5琼脂糖的塑 料勺子中滚动， 所述琼脂糖维持在 61-63， 此后将其滴入室温矿物油中。 0052 在本发明的方法中， 将涂层材料维持于61-63， 并且转移至24孔平板。 然后使用 图 2a 中所示的以及在上文讨论的 “喇叭形工具” ， 从室温矿物油中取出珠粒并且在洗涤珠 粒除去矿物油后将其置于第二个涂层琼脂糖溶液中。图 4a 中描绘的秸秆形工具与温和抽 吸一起使用， 以取出珠粒， 并与 0.5ml 琼脂糖一起， 置于含有维持在温度梯度下的矿物油的 容。
26、器中。 0053 将大珠粒从秸秆形工具中分配至矿物油梯度的顶部， 其维持在不同温度， 如下文 所讨论的。随着大珠粒下降通过矿物油， 涂层在珠粒上固化， 形成球形。矿物油的温度从容 器顶部降至底部， 底部温度低， 同样在下文有所讨论。然后使用图 2a 的喇叭形工具从容器 中取出琼脂糖 / 琼脂糖大珠粒， 然后在培养基中洗涤。所得到的大珠粒随后就可用于常规 组织培养。 0054 实施例 2 0055 使用了一系列不同实验， 所述实验使用上文所述的温度梯度。 说 明 书 CN 103975059 A 6 5/10 页 7 0056 0057 0058 如上文讨论的， 回收和洗涤珠粒后， 测试其代谢活。
27、性。使用标准 MTT 试验进行了这 一评价， 该试验是本领域公知的。对于未包胶的细胞， 在天 0 时测定了代谢活性， 而对于 包胶物， 在生产后 7 天时测定。结果概括于以下。 0059 实验对照123456789 游离细胞0.603 0.682 0.682 0.682 0.669 07230.723 0.517 0.686 0.686 包胶物0.507 0.411 0.299 0.279 0.261 0.182 0.173 0.448 0.167 0.415 0060 结果表明当落入梯度中时， 尽管包胶的细胞存活， 与起始温度无关， 但代谢活性与 梯度开始的温度成反比， 即， 温度越高， 所。
28、得到的代谢活性越低。 0061 实施例 3 0062 鉴于确定了矿物油梯度的最佳起始温度为约 25， 而结束温度为约 -2， 在一组 实验中使用这些温度， 以确定代谢活性和肿瘤抑制能力。 0063 以上文所示的相同方式来测定代谢活性。 0064 通过将 RENCA 细胞接种于 6 孔平板 (15,000 细胞 / 孔 ) 的 4ml 新鲜培养基或相同 量的取自培养5天后的包胶物的培养基中来测定肿瘤抑制活性。 在37和5CO2大气下， 将游离 RENCA 细胞在培养基中培养 5 天。然后用甲醇固定 RENCA 细胞， 用 0.33 (w/v) 天 然红染色， 并且在 540nm 测定吸光值， 使。
29、用 630nm 作为参照波长。将抑制限定为处理过的和 新鲜培养基之间的 Abs540nm-630nm的百分比差异。 0065 以下的结果表示代谢活性数据。 “游离细胞” 是指根本未用琼脂糖处理的 RENCA 细 胞， 而 “第 1 涂层” 是指未涂覆的珠粒。 说 明 书 CN 103975059 A 7 6/10 页 8 0066 0067 在下表中， 测定了肿瘤抑制能力 ： 0068 0069 结果表明根据本发明生产的琼脂糖珠粒在所有相关方面中都与人工生产的珠粒 等同。 0070 实施例 4 0071 根据上文所述的本发明和通过引用的现有技术表示的人工方法， 生产了珠粒。 在7 个月的时间段。
30、中， 随机选择了 10 个珠粒， 以测定其直径。下表中呈现的结果显示出根据本 发明生产的珠粒具有更一致的直径， 并且因此具有更一致的涂层。 说 明 书 CN 103975059 A 8 7/10 页 9 0072 0073 此外， 检查时， 发现了本发明的方法导致降低的细胞污染。为了详细阐述， 已经发 现了当根据现有技术的人工方法制备珠粒时， 存在细胞没有完全包胶的问题。当细胞是癌 说 明 书 CN 103975059 A 9 8/10 页 10 细胞时， 形成了斑块或肿瘤集落， 由于污染， 培养物中具有斑块或肿瘤集落的珠粒必须丢 弃。 0074 在8个月的时间段中， 人工制得了56批珠粒， 。
31、每批含有一定数量的培养皿培养物。 每批中至少一个培养物受到污染。相反， 在相同时间段中使用本发明的方法制得了 62 批。 那 62 批中只有 12 个显示出任何类型的污染。 0075 实施例 5 0076 以下实施例详细描述了三个不同组的琼脂糖涂覆的、 含有胰岛的琼脂糖珠粒的生 产。 0077 从超过两岁并且具有多子 (multiple parities) 历史的动物制备胰岛。 0078 给动物的胰腺灌注胶原蛋白酶 / 中性蛋白酶 ( 胶原蛋白酶 P， 1.0g/L， 或 Liberase MTF/ 嗜热菌蛋白酶， 7.5U/g 胰腺 )， 和 0.01g/L DNA 酶 I， 或 2.5mg。
32、/ 胰阿法链道酶溶液， 这 些酶在 Hanks 平衡盐溶液 (GBSS) 或冷贮藏纯化母液中制备。 0079 定量后， 将胰岛分离成2000IEQ等份， 然后重悬浮于1.5Seakem Gold(下文称为 “SG” )、 0.8 SG 或 0.8 Litex( 下文中称为 “Li” ) 之一的 0.5ml 溶液中。本文中所用的 “IEQ” 表示具有150m直径的胰岛。 因此， 具有300m直径的胰岛为2IEQ， 而具有75m直 径的为 .5IEQ。Litex 琼脂糖具有以下特性 ： 当使用 1.5溶液时， 在 5.8 至 8.7cP 的 1.5 凝胶下， 凝胶强度 1000g/cm2， 1.5。
33、溶液的胶凝温度为 40-43， EEO( 电内渗 ) 值为 0.06 至 0.12， 并且硫酸盐含量 0.30。在最小必需培养基加 25mM HEPES 中制备了溶液。 0080 在无菌矿物油表面下排出悬浮液， 以产生四个、 0.125ml 球形珠， 直径大约 5-6mm， 其各自含有 500IEQ。 0081 将这些未涂覆的琼脂糖珠粒在 37、 潮湿的、 5 CO2大气下培养。5-7 天后， 使用 第二层5SG琼脂糖， 产生琼脂糖涂覆的、 含有胰岛的琼脂糖珠粒， 具有8-9mm的最终直径。 0082 将这些珠粒在 37、 潮湿的、 5 CO2大气下培养， 直至用于以下的实验中。将其置 于培养。
34、基 (11mM 葡萄糖， 补充了 2.5热灭活的猪血清和 1抗生素 / 抗真菌剂 ) 中。每周 更换培养基， 并且每周更换后 24 小时分析培养基样品， 用于下文讨论的试验。 0083 实施例 6 0084 如之前实施例中所示， 从样品获取培养基样品， 并且使用商业可获得的猪胰岛素 ELISA 测试了胰岛素含量。结果描绘于图 6 中。将看到关于胰岛素产生， 0.8 Li 中包胶的 胰岛优于 0.8 SG 和 1.5 SG 中包胶的胰岛。 0085 实施例 7 0086 将上文呈现的体外实验扩展至体内实验， 如本文中讨论的。 0087 将成年 (8 周大的大鼠 ) 用于这些实验中。将动物分成 “。
35、只有胰岛素” 的对照组或 珠粒接受者。所有动物经由尾静脉注射接受了 65mg/kg 的链脲霉素， 以诱发糖尿病。 0088 通过测试受试者动物血液的非禁食葡萄糖水平来证实糖尿病的存在。连续 3 天存 在超过 400mg/dL 的葡萄糖水平表示存在糖尿病。在 2 周内没有呈现出糖尿病的任何动物 接受第二次剂量的链脲霉素， 此后所有动物变成糖尿病的。 0089 根据Grzda等， Cell Transplant,16:609-620(2007)， 选择用于接受植入物的动物 接受了珠粒， 将该篇文献全部并入作为参考。为了详细阐明， 使用异氟烷， 将 12-13 周大的 动物麻醉。沿着腹膜腔中线切开后。
36、， 将珠粒置于其中。 说 明 书 CN 103975059 A 10 9/10 页 11 0090 每只动物中放置的珠粒数量不同， 这取决于在植入前 3 天时间段内给予特定动物 的胰岛素的最高剂量， 除以每个大珠粒的平均胰岛素产生 ( 基于植入前 4 周时间段内珠粒 产生的胰岛素 )。鼠接受了提供在植入前 (1x) 或 1.7x 该剂量已经接受的精确胰岛素剂量 需要的珠粒量。雌性和雄性动物接受了等于 1x 的珠粒， 但只有雄性接受了 1.7x， 部分是因 为雄性大鼠重量大于雌性大鼠。 0091 相对于不同的植入物类型(1.5SG、 0.8SG、 0.8Li)， 在植入前胰岛素需求中 不存在显著。
37、差异 ； 然而， 对于 1.5 SG 珠， 需要更多大珠粒， 0.8 Li 需要最少。 0092 植入后， 将动物饲养 90 天， 定期监控血糖和体重。 0093 与接受胰岛素对照的鼠相比， 雌性鼠 ( 全部都在 1x 组中 ) 显示出立即的、 持续的 血糖水平正常化。1x 组中的雄性大鼠， 呈现出立即的， 但暂时的血糖水平调整的提高， 其在 约 30 天植入后恢复至植入前水平。 0094 实施例 8 0095 将受体动物处死后， 进行了对大珠粒的研究， 并检测了结构完整性和功能能力。 0096 交叉检测显示出回收的 1540 个大珠粒中只有两个显示出任何结构损伤。 0097 之前的实施例描述。
38、了本发明的各种特征， 其涉及含有分泌细胞的涂覆琼脂糖的琼 脂糖大珠粒， 其中用于大珠粒的琼脂糖具有 Litex 琼脂糖的特性， 如上文所示。 0098 如本文中所示， 术语 “大珠粒” 是指基本上是球形的、 具有约 4 至约 10-12mm 直径 ( 最优选约 6 至约 8mm 直径 ) 的结构。第二层琼脂糖优选约 0.05 至约 5mm 厚， 最优选约 0.5mm 至约 5mm 厚， 甚至更优选约 1.0mm 至约 3mm， 并且最优选约 1.0mm 至约 2.0mm 后。第 二层琼脂糖可以是， 但不需要是， 用于制备珠粒的相同琼脂糖。 0099 “大珠粒” 用作优选结构 ； 然而， 包胶分。
39、泌细胞并且优选地涂覆第二层琼脂糖的任 何固体的琼脂糖结构都是本发明的特征。 0100 分泌细胞可以不同。可以包胶产生所需的、 分泌产物的任何细胞或细胞器。胰岛、 癌细胞和干细胞是可以使用的材料类型的示例。每个珠粒可以含有不同数量的细胞器， 例 如， 对于胰岛， 约 50 至约 5000 个胰岛等价物 ( 下文中称为 “IEQ” )， 更优选地， 约 100 至约 2500IEQ， 甚至更优选约 250 至约 1000， 并且最优选约 475 至约 550IEQ。尤其约 500IEQ 是 最优选的。 0101 此外， 本发明的一个特征是用于制备大珠粒的改进方法， 与所用的琼脂糖无关。 将 细胞与。
40、琼脂糖混合， 并且随后形成悬浮液， 其随后用于形成珠粒。然后用琼脂糖涂覆珠粒， 例如， 大珠粒， 此后， 将所得到的涂覆过的珠粒分配至温度梯度下的矿物油样品中， 使得所 述珠粒在较高温度下接触矿物油， 并且随后跌到较低温度的油中。所述珠粒可以含有所需 的任何细胞类型， 但不限于分泌细胞、 癌细胞、 胰岛、 干细胞， 如多能干细胞， 等等。 0102 在特别优选的实施方案中， 使用如本文中所述的 “喇叭形” 和 “秸秆形” 工具来分 别取出未涂覆的和涂覆的珠粒。 0103 矿物油的温度梯度可以改变。优选地， 所述梯度从 20至 50， 即， 该最高和最低 温度之间的差异落入该范围内。更优选地， 。
41、该差异为 20至 35。 0104 油的最高温度可以改变， 但优选在 20至 30之间， 更优选在 20至 35之间。 相似地， 最低温度可以改变， 并且从 0变成 -8， 并且更优选地， 从 0变成 -2。 0105 本发明的其他特征将是本领域技术人员清楚的， 并且不需要进一步详细说明。 说 明 书 CN 103975059 A 11 10/10 页 12 0106 已经使用的术语和表述用作描述的术语， 而不是限制， 使用这样的术语和表述没 有意图排除所示和所述特征及其部分的任何等价物， 应当认识到各种变化在本发明的范围 内都是可能的。 说 明 书 CN 103975059 A 12 1/7。
42、 页 13 图 1 图 2a 说 明 书 附 图 CN 103975059 A 13 2/7 页 14 图 2b 图 2c 说 明 书 附 图 CN 103975059 A 14 3/7 页 15 图 3 说 明 书 附 图 CN 103975059 A 15 4/7 页 16 图 4a 图 4b 说 明 书 附 图 CN 103975059 A 16 5/7 页 17 图 5 说 明 书 附 图 CN 103975059 A 17 6/7 页 18 图 6 说 明 书 附 图 CN 103975059 A 18 7/7 页 19 图 7 说 明 书 附 图 CN 103975059 A 19 。