一种从生物样本中快速提取核酸的方法 【技术领域】
本发明涉及一种从生物样本中快速提取核酸的方法。背景技术 DNA 分子是分子生物学研究的基本材料， 依不同的实验目的可采取不同的抽提方 法获取数量和质量不等的 DNA。目前抽提 DNA 的方法一般有以下几种 ：
(1) 阴离子去污剂法 ： 用 SDS 或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性， 可以直接从生 物材料中提取 DNA。细胞中 DNA 与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合， 由于阴离子去 污剂能够破坏这种价键， 所以常用阴离子去污剂提取 DNA， 但阴离子去污剂常常影响后续的 PCR 反应。
(2) 水抽提法 ： 利用核酸溶解于水的性质， 将组织细胞破碎后， 用低盐溶液除去 RNA， 然后将沉淀溶于水中， 使 DNA 充分溶解于水中， 离心后收集上清液。在上清中加入固体 氯化钠调节至 2.6M。 加入 2 倍体积 95％乙醇， 立即用搅拌法搅出， 然后分别用 66％， 80％和 95％乙醇以及丙铜洗涤， 最后在空气中干燥， 既得 DNA 样品， 此法提取的 DNA 中蛋白质含量 较高， 故一般不用。
(3) 苯酚抽提法 ： 苯酚作为蛋白变性剂， 同时抑制了 DNase 的降解作用。用苯酚处 理匀浆液时， 由于蛋白与 DNA 联结键已断， 蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似 相溶。蛋白分子溶于酚相， 而 DNA 溶于水相。离心分层后取出水层， 多次重复操作， 再合并 含 DNA 的水相， 利用核酸不溶于醇的性质， 用乙醇沉淀 DNA。 此时 DNA 是十分粘稠的物质， 可 用玻璃漫漫绕成一团， 取出。此法的特点是使提取的 DNA 保持天然状态。
苯酚抽提法是抽提 DNA 最常规的方法， 但是因为要使用苯酚， 对实验者有害， 因此 目前也有利用吸附过柱的方法提取 DNA 的商业化试剂盒。因为需要蛋白酶 K 处理过程， 一 般需要经过 3-4 小时的抽提过程， 才能进入后续的 PCR 反应。
医院病理科存在大量各种疾病甲醛固定石蜡包埋组织 (formalin fixed and paraffin embedded tissues， FFPET)， 为分子病理研究提供了大量的信息来源， 近年来的 靶向治疗使从石蜡包埋组织中抽提 DNA 成为研究的热点。然而福尔马林固定后的蜡块包埋 组织 DNA 降解严重， 存档 FFPET 组织切片取量有限， 传统酚氯仿提取 DNA 步骤繁杂， 提取过 程损失严重等都制约了石蜡组织在分子病理学中的研究应用， 如何高效、 高质量提取微量 石蜡组织中 DNA 对利用石蜡组织进行分子研究及诊断至关重要。
传统从石蜡组织里抽提 DNA 需要先用二甲苯脱蜡， 然后用无水乙醇去除二甲苯， 脱蜡过程繁琐， 至少需要 3 ～ 4 小时， 而且二甲苯是有机溶剂， 对实验操作者的身体有害。 脱 完蜡后， 标本也需要再经过 3 ～ 4 小时的抽提， 才能进入后续的 PCR 反应。
Chelex-100 是一种由苯乙烯和苯二乙烯共聚体组成的螫合树脂， 其悬液在碱 性环境 (pH10 ～ 11) 和 100 ℃条件下， 可导致细胞膜破裂并使 DNA 变性释放出来， 并且 Chelex-100 可高选择性的结合多价阳离子， 去除样品和缓冲液中的多价金属离子， 避免煮 沸过程中模板 DNA 的降解。Chelex-100 提取 DNA 具有经济、 简便、 高效等优点， 目前已被用
于从全血或血液、 精液或精斑、 混合斑、 毛发、 培养细胞等提取 DNA。但一般也需要经过 2 ～ 3 小时的抽提过程， 才能进入后续的 PCR 反应。
目前已经有采用 Chelex-100 提取石蜡切片中的遗传物质的报道， 如在 2010 年海 南医学学院学报上发表的文章 “四种微量石蜡组织 DNA 提取方法的比较” 一文中， 就采用了 Chelex-100 提取石蜡切片中的 DNA， 但在该文献中， 在采用 Chelex-100 提取前， 还是采用了 二甲苯脱蜡、 乙醇洗涤的步骤， 从而使得步骤繁琐， 操作不够简单快捷。 为此， 发明人提出了 一种简单快捷、 效果良好的从生物样本中提取 DNA 的方法。
但目前尚没有采用 Chelex-100 提取 RNA 的报道， 为此， 发明人提出了一种采用 Chelex-100 简单快速、 效果良好的从生物样本中提取 RNA 的方法。 发明内容 本发明的发明目的在于提出一种核酸的快速提取方法。
为了实现本发明的发明目的， 所采用的技术方案为 ：
本发明涉及一种从生物样本中快速提取 DNA 的方法， 所述的方法包括以下步骤 ：
1. 取少量生物样本， 所述生物样本选自病理组织石蜡切片样本、 血斑精斑或精液 样本、 组织液样本、 脑脊液样本、 血液样本、 血清样本、 血浆样本、 尿液样本、 积液样本、 组织 细胞样本 ；
2. 将生物样本置于 chelex-100 的水溶液中， 所述的 chelex-100 的水溶液的浓度 为 1 ～ 80g/100ml ；
3.80 ～ 100℃条件下加热 1 ～ 50 分钟 ；
4. 将抽提柱放入离心管中， 将步骤 3 中获得的液体加入到抽提柱中， 1000 ～ 20000 转 / 分钟， 离心 2 ～ 120 秒 ；
5. 收集离下的液体， 用于 PCR 反应。
本发明还涉及一种从生物样本中快速提取 RNA 的方法， 其特征在于， 所述的方法 包括以下步骤 ：
1. 取少量生物样本， 所述生物样本选自病理组织石蜡切片样本、 血斑精斑或精液 样本、 组织液样本、 脑脊液样本、 血液样本、 血清样本、 血浆样本、 尿液样本、 积液样本、 毛发 样本、 组织细胞样本 ；
2. 置于 1 ～ 80％ chelex-100 的 DEPC 水溶液中 ；
3.80 ～ 100℃条件下加热 1 ～ 50 分钟 ；
4. 将抽提柱管放入离心管中， 将步骤 (3) 中获得的液体加入到抽提柱管中， 1000 ～ 20000 转 / 分钟， 离心 2 ～ 120 秒 ；
5. 收集离下的液体， 用于 RT-PCR 反应。
其中， 本发明的第一优选技术方案为， 所述的方法抽提柱为， 在抽提柱底部有一层 起物理阻挡的膜。
本 发 明 的 第 二 优 选 技 术 方 案 为， 所 述 的 chelex-100 的 水 溶 液 的 浓 度 为 2 ～ 50g/100ml， 更优选 3 ～ 10g/100ml。
本发明的第三优选技术方案为， 所述的 chelex-100 的 EDPC 水溶液的浓度为 2 ～ 50g/100ml， 优选 3 ～ 10g/100ml。
本发明的第四优选技术方案为， 所述的加热温度为 90 ～ 100℃， 优选 90 ～ 95℃。
本发明的第五优选技术方案为， 所述的加热时间为 5 ～ 30 分钟， 优选 8 ～ 10 分钟。
本发明的第六优选技术方案为， 所述的离心的时间为 2 ～ 120 秒， 优选 10 ～ 30 秒。
本发明的第七优选技术方案为， 所述的离心的转速为 5000 ～ 20000 转 / 分钟， 优 选 10000 ～ 20000 转 / 分钟， 更优选 15000 ～ 20000 转 / 分钟。
其中， 本发明中的生物样本选自病理组织石蜡切片样本、 血斑精斑或精液样本、 组 织液样本、 脑脊液样本、 血液样本、 血清样本、 血浆样本、 尿液样本、 积液样本、 毛发样本、 组 织细胞样本 ； 当生物样本为组织细胞样本或石蜡切片时， 在步骤 1 中采用研磨棒对生物组 织进行研磨， 当提取 RNA 时， 则需要在冰上进行研磨， 以减少 RNA 降解， 提高生物组织中 RNA 的释放， 提高检验效率。
本发明的技术优势为 ：
1. 本发明方法简单， 时间短， 且不使用有害有机溶剂。 传统方法中一般从石蜡包埋 组织中抽提 DNA 需要先用二甲苯脱蜡， 然后用无水乙醇去除二甲苯， 所用的时间长， 过程繁 琐， 至少需要 3 ～ 4 小时才能完成， 而且二甲苯是有机溶剂， 对人体有害。脱完蜡后， 标本需 要再经过蛋白酶 K 的处理， 以去除蛋白质， 这个过程也需要 3 ～ 4 小时， 故通常方法抽提石 蜡包埋组织中 DNA， 进入后续 PCR 反应， 需要 6 ～ 8 小时以上。本发明的方法简便易行， 不使 用挥发性有害有机溶剂二甲苯， 不会对实验人员造成伤害， 并且所需时间大为缩短， 仅需 10 余分钟即可完成 ； 2. 本发明采用高温加热进行提取， 不仅使石蜡变成液态， 而且使组织中的蛋白质 变性， DNA 或 RNA 被释放出来， 省去了需要蛋白酶 K 水解需要 3 ～ 4 个小时的过程 ；
3. 通 常 液 态 石 蜡 和 chelex-100 都 会 对 PCR 或 RT-PCR 反 应 造 成 不 良 影 响， 通 过本发明， 可将液态石蜡和 chelex-100 截留在抽提柱的膜上， 从而消除了液态石蜡和 chelex-100 对 PCR 或 RT-PCR 反应的不良影响， 提高了 PCR 或 RT-PCR 反应的灵敏度 ；
4. 目前尚没有采用 Chelex-100 提取 RNA 的报道， 发明人在本发明中提出了一种采 用 Chelex-100 简单快速、 效果良好的从生物样本中提取 RNA 的方法。
附图说明 图 1 为实施例 1 中采用两种方法抽提的基因组 DNA 琼脂糖凝胶电泳图， 其中， M代 表分子量标记， 1 代表的是用试剂盒抽提的基因组 DNA 琼脂糖凝胶电泳图， 2 代表的是用本 发明的方法抽提的基因组 DNA 琼脂糖凝胶电泳图。
下面对本发明的具体实施方式做进一步的解释和说明， 但并不对本发明的内容构 成限制。本发明所用的试剂均为市售试剂， 所用的实验仪器均为实验室常用仪器。
具体实施方式
实施例 1
1. 用两种方法提取石蜡包埋组织切片中的 DNA， 每种方法抽提 3 个标本， 平行比 较。
1) 用北京百泰克生物技术有限公司生产的石蜡组织切片 DNA 提取试剂盒抽提石 蜡包埋组织切片中的 DNAa. 取 2 片 5um 的医用石蜡 ( 型号 ： 型号 ： BX12M311398， 北京中西远大科技有限公 司生产 ) 包埋组织切片放入 1.5mL 的离心管中。
b. 加入 1ml 二甲苯， 震荡混匀， 55℃水浴 10 分钟。13000 转 5 分钟， 吸弃上清。
c. 重复第 2 步一到三次。
d. 加 1ml 无水乙醇， 震荡混匀。13000 转 5 分钟， 吸弃上清。
e. 重复第 4 步一次。
f. 将沉降下来的标本烘干。
g. 加入 200μl Buffer 1， 混匀。
h. 加入 25μl Proteinase K， 震荡混匀。55℃水浴消化过夜。
i.13000 转离心 5 分钟， 上清转移到一干净的 1.5mL 离心管中。
j. 加入 220μl Buffer 2， 震荡混匀。70℃水浴 10 分钟
k. 加入 220μl 无水乙醇， 混匀。
l. 将抽提柱放入收集管中， 移入第 5 步的混合液体， 室温静置 3 分钟。
m.13000 转离心 2 分钟， 把液体重新转入柱子， 重新过柱。
n.13000 转离心 2 分钟， 弃液体。
o. 把柱子移入新的收集管内， 加入 500μl Buffer 3。
p. 把柱子移入新的收集管内， 13000 转离心 1 分钟， 弃液体。加入 600μl Wash Buffer。(Wash Buffer 按包装预加适量无水乙醇 )
q.13000 转离心 1 分钟， 弃液体。加入 600μl DNA Wash Buffer。
r.13000 转离心 1 分钟， 弃液体。13000 转离心 2 分钟， 开盖挥发 4-5 分钟。
s.、 把柱子移入 1.5mL 的带盖离心管中， 在膜中央加入 40μl Elution Buffer( 须 70℃预热 )。室温静置 3 分钟。
t.13000 转离心 1 分钟， 收集液体， 取 5ul 用于 PCR 反应。
2) 本发明的方法抽提石蜡包埋组织切片中的 DNA
a. 取 2 片 5um 的医用石蜡 ( 型号 ： 型号 ： BX12M311398， 北京中西远大科技有限公 司生产 ) 包埋组织切片 ；
b. 置于 200ul 的溶液 1 中， 所述的溶液为 10％ chelex-100(sigma 公司 ) 的水溶 液；
c.90℃条件下加热 20 分钟 ；
d. 将抽提柱放入离心管中， 将步骤 3 中获得的液体加入到抽提柱里， 12000 转 / 分 钟离心 30 秒 ； 所述的抽提柱为 ：
e. 收集离下的液体， 取 5ul 用于 PCR 反应。
2.DN A 鉴定方法 ：
2.1 DNA 质量的琼脂糖凝胶电泳鉴定 ：
因为石蜡切片中的 DNA 含量较低， 用普通琼脂糖凝胶电泳方法不能检测到 DNA 的 量， 因此将用每种方法抽提的三个标本基因组 DNA， 各取 20μL 混合， 真空抽去部分水分后， 加 5μL 的 DNA loading buffer 混匀上样， 在 2％的琼脂糖凝胶中 80V 电泳 30min， 在紫外凝 胶成像仪下观察所提取 DNA 基因组的质量并拍照存档。图 1 为两种方法抽提的基因组 DNA 琼脂糖凝胶电泳图， 其中， M 代表分子量标记， 1 代表的是用试剂盒抽提的基因组 DNA 琼脂糖凝胶电泳图， 2 代表的是用本发明的方法抽提的基因组 DNA 琼脂糖凝胶电泳图。
2.2 荧光定量 PCR 检测所提取 DNA 基因组的浓度
选 择 针 对 人 β-2actin 基 因 组 DNA 的 引 物 和 TaqMan 荧 光 探 针， 采 用 Primer Express 软件自行设计， 由上海生物工程公司 (Sangong) 合成。引物序列见表 1。
表1： 引物和探针的序列表
上游引物 5′ -GGACCTGACTGACTACCTCATGAA-3′ 下游引物 5′ -CTTAATGTCACGCACGATTTCC-3′ 探针
5′ Fam-CACCGAGCGCGGCTACAGCTTC-TAMARA 3′PCR 反应体系 ： 模板 DNA 2μl， 10×buffer( 无 Mg2+)2.5ul， 2.5mmoL/L dNTP 2ul， 25mmoL/L MgCl2 1.5ul， 引物 10mmol/L 0.5ul， 10mmol/L 探针 0.4ul， 5U/ul Taq 聚合酶 0.5μl， 余下由灭菌去离子水补足
PCR 扩增条件 ： 94℃ 3min， 94℃ 15s， 60℃ 60s， 40 个循环， 60℃检测荧光， 每次 PCR 反应均设阳性、 阴性对照。
共选了三个标本， 每个标本重复 5 次， 分别用荧光定量 PCR 检测人每个标本中 β-2actin 基因组 DNA 的量， 用 Ct 值表示， 比较两种抽提方法所获得的 DNA 的质和量， 实验 结果如表 2 所示。
从表 2 可见， 用本发明方法抽提得到的基因组 DNA 所扩增的 β-2actin 的 Ct 值较 试剂盒抽提的 Ct 值小， 提示用本发明方法抽提得到的基因组 DNA 含量和质量都较试剂盒抽 提的好。
表2： 采用两种方法提取 DNA 的 Ct 值
实施例 2 1. 将精斑样本置于 chelex-100 的水溶液中， 所述的 chelex-100 的水溶液的浓度为 20g/100ml ；
2.95℃条件下加热 10 分钟 ；
3. 将抽提柱放入离心管中， 将步骤 3 中获得的液体加入到抽提柱中， 20000 转 / 分 钟， 离心 20 秒 ；
4. 收集离下的液体， 用于 PCR 反应。
其中， 抽提柱为市售 ； PCR 反应采用和实施例 1 相同的条件， 并得到了相似的实验 结果。
实施例 3
1. 将组织液样本置于 chelex-100 的水溶液中， 所述的 chelex-100 的水溶液的浓 度为 10g/100ml ；
2.100℃条件下加热 50 分钟 ；
3. 将抽提柱放入离心管中， 将步骤 3 中获得的液体加入到抽提柱中， 15000 转 / 分 钟， 离心 30 秒 ；
4. 收集离下的液体， 用于 PCR 反应。
其中， 抽提柱为市售 ； PCR 反应采用和实施例 1 相同的条件， 并得到了相似的实验 结果。 实施例 4
1. 将组织细胞样本用研磨棒进行研磨后， 置于 chelex-100 的水溶液中， 所述的 chelex-100 的水溶液的浓度为 15g/100ml ；
2.80℃条件下加热 10 分钟 ；
3. 将抽提柱放入离心管中， 将步骤 3 中获得的液体加入到抽提柱中， 15000 转 / 分 钟， 离心 30 秒 ；
4. 收集离下的液体， 用于 PCR 反应。
其中， 抽提柱为市售 ； PCR 反应采用和实施例 1 相同的条件， 并得到了相似的实验 结果。
实施例 5
1. 将血斑样本置于 chelex-100 的水溶液中， 所述的 chelex-100 的水溶液的浓度 为 20g/100ml ；
2.95℃条件下加热 10 分钟 ；
3. 将抽提柱放入离心管中， 将步骤 3 中获得的液体加入到抽提柱中， 20000 转 / 分 钟， 离心 20 秒 ；
4. 收集离下的液体， 用于 PCR 反应。
其中， 抽提柱为市售 ； PCR 反应采用和实施例 1 相同的条件， 并得到了相似的实验 结果。
实施例 6
1. 快速提取石蜡包埋组织切片中的 RNA ：
a) 取 3 片 5um 的医用石蜡 ( 型号 ： BX12M311398， 北京中西远大科技有限公司生产 ) 包埋组织切片在冰上研磨后， 放入 1.5mL 的离心管中 ；
b) 置于 200ul 的溶液 1 中， 所述的溶液为 10％ chelex-100 的 DEPC 水溶液 ；
c)90℃条件下加热 20 分钟 ；
d) 将抽提柱管放入离心管中， 将步骤 3 中获得的液体加入到抽提柱管里， 12000 转 / 分钟离心 30 秒 ；
e) 收集离下的液体， 取 5ul 用于 RT-PCR 反应。
2. 荧光定量 RT-PCR 检测所提取 RNA 的浓度
选择针对人 GAPDH 引物和 TaqMan 荧光探针， 采用 Primer Express 软件自行设计， 由上海生物工程公司 (Sangong) 合成。引物序列见表 1。
表 1 为引物、 探针的核苷酸序列 ：
上游引物 下游引物 探针
5′ -CATCTTCCAGGAGCGAGA-3′ 5′ -TGTTGTCATACTTCTCAT-3′ 5′ Fam-CCTCACCACCATGGAGAAGGCT-TAMARA 3′40μL 反应体系中含有 ： 2.5μL 10×PCR reaction buffer(Mg2+free)， 3mmol/L Mg2+， 0.125mmol/L dNTP， 0.25μmol/L 引物， 0.156μmol/L 探针， 聚合酶 2U， UNG 酶 0.2U， RT 酶 100u， 模板量为 3μL， 补充水至 40μL。
PCR 扩增条件 ： 42℃ 30min， 94℃， 5min ； 94℃ 15s， 60℃ 60s， 40 个循环， 60℃检测荧 光， 每次 PCR 反应均设阳性、 阴性对照。
随机选取 8 个石蜡包埋组织切片， 进行 RT-PCR 针对 GAPDH 的 mRNA 扩增， 每个标本 都能扩增出 GAPDH， 提示该方法是快速可行的， 见表 2。
表 2 为本发明样本的 Ct 值 ：
标本号 1 2 3 4 5 6 7 8
Ct 值 32.1382 32.694 29.1025 28.9604 24.662 24.5847 21.0877 21.1414
实施例 7 1. 将精斑样本置于 100μl chelex-100 的 DEPC 水溶液中， 所述的 chelex-100 的DEPC 水溶液的浓度为 20g/100ml ；
2.95℃条件下加热 10 分钟 ；
3. 将抽提柱放入离心管中， 将步骤 3 中获得的液体加入到抽提柱中， 20000 转 / 分 钟， 离心 20 秒 ；
4. 收集离下的液体， 用于 RT-PCR 反应。
其中， 抽提柱为市售 ； RT-PCR 反应采用和实施例 6 相同的条件， 并得到了相似的实 验结果。
实施例 8
1. 将组织液样本置于 200μl chelex-100 的 DEPC 水溶液中， 所述的 chelex-100 的 DEPC 水溶液的浓度为 10g/100ml ；
2.100℃条件下加热 50 分钟 ；
3. 将抽提柱放入离心管中， 将步骤 3 中获得的液体加入到抽提柱中， 15000 转 / 分 钟， 离心 30 秒 ；
4. 收集离下的液体， 用于 RT-PCR 反应。
其中， 抽提柱为市售 ； RT-PCR 反应采用和实施例 6 相同的条件， 并得到了相似的实 验结果。
实施例 9
1. 将组织细胞样本在冰上用研磨棒进行研磨后， 置于 400μl chelex-100 的 DEPC 水溶液中， 所述的 chelex-100 的 DEPC 水溶液的浓度为 15g/100ml ；
2.80℃条件下加热 10 分钟 ；
3. 将抽提柱放入离心管中， 将步骤 3 中获得的液体加入到抽提柱中， 15000 转 / 分 钟， 离心 30 秒 ；
4. 收集离下的液体， 用于 RT-PCR 反应。
其中， 抽提柱为市售 ； RT-PCR 反应采用和实施例 6 相同的条件， 并得到了相似的实 验结果。
实施例 10
1. 将血斑样本置于 800μl chelex-100 的 DEPC 水溶液中， 所述的 chelex-100 的 DEPC 水溶液的浓度为 20g/100ml ；
2.95℃条件下加热 10 分钟 ；
3. 将抽提柱放入离心管中， 将步骤 3 中获得的液体加入到抽提柱中， 20000 转 / 分 钟， 离心 20 秒 ；
4. 收集离下的液体， 用于 RT-PCR 反应。
其中， 抽提柱为市售 ； RT-PCR 反应采用和实施例 6 相同的条件， 并得到了相似的实 验结果。