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1、(10)申请公布号 CN 102994547 A (43)申请公布日 2013.03.27 CN 102994547 A *CN102994547A* (21)申请号 201110265828.6 (22)申请日 2011.09.08 C12N 15/85(2006.01) C12N 15/62(2006.01) C07K 19/00(2006.01) A61K 38/24(2006.01) A61K 38/18(2006.01) A61P 7/06(2006.01) (71)申请人 哈药集团技术中心 地址 150025 黑龙江省哈尔滨市利民开发区 同盛路 98 号 (72)发明人 王锐 张秀。
2、芹 孟庆勇 董敏 刘铁成 梁秋波 李会成 (54) 发明名称 重组人促红素 -CTP 融合蛋白生产工艺及应 用 (57) 摘要 本发明公开了一种重组人促红素 -CTP 融合 蛋白的生产工艺方法， 其特点是重组工程细胞株 的培养方式采用微载体悬浮灌注培养技术或无血 清悬浮流加培养技术。本发明还公开了重组人促 红素 -CTP 融合蛋白的纯化工艺， 通过优化， 获得 简单工艺流程， 以获得高纯度、 高活性的重组人促 红素 -CTP 融合蛋白。本发明还涉及重组人促红 素 -CTP 融合蛋白在猴体内的代谢动力学研究以 及在治疗大鼠肾性贫血上的应用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 6。
3、 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 6 页 附图 4 页 1/2 页 2 1. 一种重组人促红素 -CTP 融合蛋白的生产工艺方法， 其具体步骤包括 ： 将含有编码重 组人促红素 -CTP 融合蛋白基因的表达载体， 采用适当的转化方法转化宿主细胞， 通过优化 筛选获得重组工程细胞株， 并采用微载体悬浮灌注或无血清悬浮流加培养工艺方法进行细 胞培养并收获细胞培养液， 通过经过优化的纯化工艺流程来分离获得高纯度、 高活性的重 组人促红素 -CTP 融合蛋白。 2. 权利要求 1 所述重组人促红素 -CTP 融合蛋白是指将重组人。
4、促红素蛋白的 C 端与人 绒毛膜促性腺激素 亚基羧基末端肽 (CTP)28 个氨基酸的 N 端相连所构成的融合蛋白。 3. 权利要求 1 所述的表达载体是指哺乳动物细胞表达载体， 优选 pcDNA 载体系列。 4. 权利要求 1 所述的宿主细胞指哺乳动物细胞系， 优选 CHO 细胞系。 5. 权利要求 1 所述的转化方法是指电转化、 脂质体转化、 原生质融合等方法， 优选电转 化法。 6. 权利要求 1 所述的微载体悬浮灌注培养工艺方法， 其特征在于细胞生长在微载体 上， 微载体悬浮培养于细胞反应器内， 通过持续不断收获培养液来实现重组蛋白的生产。 其 具体培养过程包括细胞接种阶段、 细胞生长。
5、阶段及细胞生产阶段， 并在培养过程中定期监 测培养条件以保证培养过程实现精准、 稳定控制。 7. 权利要求 6 所述的细胞接种阶段， 其起始细胞接种密度为 2104 5105 个 / 毫 升， 最优为 (3105 个 / 毫升 )， 接种体积为工作体积的 1/3-1/2， 搅拌速度为 40-41 转 / 分 钟， 时间为 12-16 小时。 8. 权利要求 6 所述细胞生长阶段， 是指细胞在有血清培养基扩增阶段， 各项指标的控 制水平为 ： 温度 37， pH 为 7.0-7.3、 溶解氧为 40 -60， 搅拌转数 42-44 转 / 分钟， 培养 时间是 5-7 天。 9. 权利要求 6 。
6、所述的细胞生产阶段， 指当细胞生长每天消耗的葡萄糖浓度达到最大， 进入稳定期通过添加丁酸钠使细胞培养物完成代谢转变， 其中优选丁酸钠浓度为 0.5mM/ L 至 1.0mM/L， 维持至整个细胞生产阶段， 并且生产阶段灌注量为反应器工作体积的 1-1.2 倍， 搅拌速度为 45-47 转 / 分钟， 温度 37， pH 为 6.9-7.1、 溶解氧为 40 -70， 培养时间 为 27 天 -34 天 )。 10. 根据权利要求 6 所述， 监测培养条件是指在整个培养周期每天监测温度、 pH、 葡萄 糖浓度、 乳酸盐浓度、 铵盐浓度、 谷氨酰胺浓度和摩尔渗透压浓度。 11. 权利要求 1 所述。
7、的无血清悬浮流加培养工艺方法是指利用激流式生物反应器和一 次性细胞培养袋使细胞悬浮生长在无血清培养液中， 通过控制各项参数和培养条件定时流 加浓缩培养液使细胞密度进一步提升并更多的累积目的产物的培养过程。 整个培养过程可 分为细胞接种阶段、 体积扩增阶段和流加浓缩培养液降温表达阶段。 12. 权利要求 11 所述的无血清悬浮流加培养工艺方法所用的细胞株为经过悬浮驯化 后可以适应悬浮培养的重组工程细胞株。 13. 权利要求 11 所述的生物反应器是指可以用于悬浮培养的激流式细胞反应器和一 次性无菌塑料培养袋。 14. 权利要求 11 所述的无血清培养液可以是商品化或经过自主优化的无血清基础培 养。
8、液及浓缩流加培养液。 15. 权利要求 11 所述的细胞接种阶段， 其接种体积为工作体积的 1/5 1/10， 摇床转 权 利 要 求 书 CN 102994547 A 2 2/2 页 3 速为 30 转 / 分 50 转 / 分， 控制参数 PH 值 6.9 7.2、 溶解氧 40 70、 温度 36 37 范围。 16. 权利要求 11 所述体积扩增阶段， 是指每天取样测定细胞密度和细胞活率， 并且根 据细胞密度进行扩增， 使细胞密度保持在 2 8106 个 /ml 范围内。 17. 权利要求 11 所述流加浓缩培养液降温表达阶段是指当细胞体积扩增到工作体积 的 1/2 2/3 时， 并且。
9、根据细胞培养液葡萄糖含量补加浓缩培养液。 18.权利要求17所述浓缩培养液添加量按细胞培养液测定葡萄糖含量低于2g/L时， 一 次性补加浓缩培养液使葡萄糖浓度达到 3 5g/L。葡萄糖含量测定每天一次。 19. 权利要求 17 所述流加浓缩培养液降温表达阶段控制参数 PH 值 6.8 7.0、 溶解氧 20 60、 温度 30 35范围。 20. 权利要求 11 所述每天取样检测细胞密度、 细胞活率、 葡萄糖含量、 乳酸含量、 渗透 压。 21. 权利要求 11 所述培养收获标准是细胞活率低于 70即可终止培养。 22.权利要求1所述的经过优化的纯化工作流程， 是指收获的含有EPO-CTP融合。
10、蛋白的 细胞培养液依次经过前处理、 亲和层析、 离子交换层析和凝胶过滤层析四个工艺步骤。 23.权利要求22所述的含有EPO-CTP融合蛋白的细胞培养液可以为微载体悬浮灌注培 养工艺方法获得的， 也可以为无血清悬浮流加培养工艺方法获得的。 24. 根据权利要求 22 所述的前处理方式为过滤、 超滤、 离心等方式。 25. 根据权利要求 22 所述， 亲和层析中， 平衡条件为 TrisHClNaCl 缓冲盐溶液， 优 选 10mM-50mM Tris HCl、 50mM-100mM NaCl 缓冲盐溶液 ； 洗脱条件采用高盐洗脱方式， 优选 盐浓度 0.5M-1.5M NaCl 缓冲盐溶液。 2。
11、6. 根据权利要求 22 所述， 离子交换层析中， 平衡条件为 TrisHCl 缓冲溶液， 优选 10mM-50mM TrisHCl 缓冲溶液 ； 预洗条件采用尿素 - 甘氨酸缓冲溶液， 优选尿素的浓度为 3M-8M、 缓冲液 pH 值优选 pH4.0-pH4.5 ； 洗脱条件采用盐洗脱方式， 优选盐浓度 30mM-300mM NaCl 缓冲盐溶液。 27. 根据权利要求 22 所述， 凝胶过滤层析中， 采用磷酸盐缓冲盐溶液进行平衡和洗脱， 优选缓冲体系为 10mM-50mM PB、 50mM-100mM NaCl 缓冲盐溶液。 28.一种重组人促红素-CTP融合蛋白的应用， 其特征在于重组人。
12、促红素-CTP融合蛋白 其在猴体内半衰期为重组人促红素的 1.5-3 倍， 在治疗大鼠肾性贫血上表现出长效作用。 权 利 要 求 书 CN 102994547 A 3 1/6 页 4 重组人促红素 -CTP 融合蛋白生产工艺及应用 技术领域 0001 本发明属于生物制药工艺领域。 其具体涉及一种重组人促红素与人绒毛膜促性腺 激素 亚基羧基末端肽的融合蛋白的一种生产工艺方法， 包括该融合蛋白的重组工程细 胞株的获得、 细胞培养及蛋白纯化工艺方法以及重组人促红素 -CTP 融合蛋白在猴药代实 验和对大鼠肾性贫血治疗上的应用。 背景技术 0002 EPO 是一种主要由肾脏产生的糖蛋白， 分子量约为 。
13、35KD， 是人体内调节红系造血 的主要激素， 在红系祖细胞的增殖、 分化和成熟中起着重要的调控作用。目前我国对 EPO 需 求量逐年递增， 但是普通 EPO 存在体内半衰期短， 患者给药次数频繁等问题。因此如何延长 其体内半衰期， 以降低给药频次， 成为当前 EPO 药物的研究热点。目前常用的技术手段有 三种， 一是使 EPO 进行 PEG 化 ( 专利号 200880021159.4)， 二是通过氨基酸突变增加糖化位 点 ( 美国安进公司的 Aranesp， 已上市 )， 三是使其与一些大分子蛋白或高糖化片段相连形 成融合蛋白， 目前已有文献报道有 EPO-FC( 见专利申请号 20088。
14、0005733.7)、 EPO-HAS( 见 专利申请号 200410053319.7) 和 EPO-CTP 文献报道 (Development of a Long-Acting Erythropoietin by Fusing the Carboxyl-Terminal Peptide of Human Chorionic Gonadotropin_-Subunit to the Coding Sequence of Human Erythropoietin ) 等。 0003 本发明所述的融合蛋白是参考上述专利及文献基础设计的， 在 EPO 的羧基末端 增加一段带有人绒毛膜促性腺激素 亚基。
15、的肽链。人绒毛膜促性腺激素 (hCG) 是胚胎 滋养层细胞分泌的一类具有重要生理功能的糖蛋白激素， 由两个不同的亚基 、 以非 共价键连接组成， CTP 短肽是人绒毛膜促性腺激素 亚基羧基末端肽。人绒毛膜促性腺 激素 亚基羧基末端肽能够增加唾液酸含量， 增加分子量， 延长半衰期而不影响 EPO 蛋 白活性， 已有文献报道 (Development of a Long-Acting Erythropoietin by Fusing the Carboxyl-Terminal Peptide of Human Chorionic Gonadotropin_-Subunit to the Codin。
16、g Sequence of Human Erythropoietin ) 支持其可使 EPO 半衰期延长 2-3 倍。 0004 由于 EPO 为高糖化蛋白， 其分子量的 40为糖， 融合 CTP 短肽后其糖基化程度更 高， 因此 EPO-CTP 融合蛋白的生产也必须选用糖化修饰较完善的哺乳动物细胞表达系统。 重组糖蛋白类药物的生产目前较成熟的生产表达系统为哺乳动物细胞表达系统， 最常用的 细胞系为中华仓鼠卵巢细胞 (CHO)。目前哺乳动物细胞大规模培养方法可以分为 ： 贴壁培 养、 悬浮培养和固定化培养。贴壁培养是指细胞贴附在一定的固相表面进行单层培养。由 于细胞固定于表面， 不需要复杂的细。
17、胞截流装置， 便于采用灌注培养。 悬浮培养是指细胞在 反应器中自由悬浮生长的过程。悬浮培养系统主要适用于非贴壁依赖性细胞培养。固定化 培养是将动物细胞与水不溶性载体结合起来， 再进行培养的一种方法。 0005 本发明中 EPO-CTP 融合蛋白的生产可采用两种细胞培养方式， 即微载体贴附灌注 培养和悬浮流加培养方式。 其特点是采用剪切力小， 传氧效果好的， 混合方式为摇动式混合 的激流式细胞生物反应器。第一种培养方式采用微载体贴附悬浮灌注培养， 微载体可支持 说 明 书 CN 102994547 A 4 2/6 页 5 细胞高密度、 长时间生长， 且微载体悬浮于培养液内， 可实现较高的传质传氧。
18、效率， 此种培 养方式可不断补充新鲜培养液、 排出代谢废物、 延长细胞表达时间， 并且利用悬浮培养营养 物质、 溶解氧混合均匀的特点， 从而提高重组蛋白产量， 为一种新型实用的生产高糖化重组 蛋白的方法。第二种培养方式为悬浮流加培养， 主要是用于可以通过悬浮驯化并适应悬浮 培养的细胞。 悬浮流加培养工艺操作简单、 可靠灵活， 特别是利用激流式细胞生物反应器传 氧效果好， 一次性反应袋操作方便， 可大大缩短培养周期， 易于放大培养规模， 通过工艺的 简单控制， 即可满足 EPO-CTP 生产需求。 0006 本发明对利用此种生产方法生产的融合蛋白在动物体内的应用进行了研究， 融合 蛋白在食蟹猴体。
19、内的药代实验数据显示出优于普通 EPO 的半衰期。在大鼠肾性贫血治疗 上， 融合蛋白可达到一周给药一次的长效作用。 发明内容 0007 本发明所要解决的问题主要在于优化形成了一种重组人促红素 -CTP 融合蛋白的 生产工艺方法， 包括生产重组人促红素 -CTP 融合蛋白的重组工程细胞株的构建， 并采用载 体贴附灌注培养工艺或悬浮流加工艺及优化的蛋白分离纯化方法获得高活性、 高纯度融合 蛋白， 经实验证明该融合蛋白在治疗过程中可达到减少给药频率的效果。 0008 本发明公开了一种重组人促红素与人绒毛膜促性腺激素 亚基羧基末端肽的融 合蛋白的核甘酸序列及氨基酸序列。 0009 SEQ ID NO 。
20、1 是 EPO-CTP 核甘酸序列 0010 CCGCCACCGGGGTGCACGAATGTCCTGCCTGGCTGTGGCTTCTCCTGTCCCTGCTG TCGCTCCCTCTGGGCCTCCCAGTCCTGGGCGCCCCACCACGCCTCATCTGTGACAGCCGAGTCCTGGAGAGGTACCT CTTGGAGGCCAAGGAGGCCGAGAATATCACGACGGGCTGTGCTGAACACTGCAGCTTGAATGAGAATATCACTGTCC CAGACACCAAAGTTAATTTCTATGCCTGGAAGAGGATGGAGGTCGGGCAGCAGGCCGTAGAAGT。
21、CTGGCAGGGCCT GGCCCTGCTGTCGGAAGCTGTCCTGCGGGGCCAGGCCCTGTTGGTCAACTCTTCCCAGCCGTGGGAGCCCCTGCAG CTGCATGTGGATAAAGCCGTCAGTGGCCTTCGCAGCCTCACCACTCTGCTTCGGGCTCTGGGAGCCCAGAAGGAAG CCATCTCCCCTCCAGATGCGGCCTCAGCTGCTCCACTCCGAACAATCACTGCTGACACTTTCCGCAAACTCTTCCGA GTCTACTCCAATTTCCTCCGGGGAAAGCTGAAGCTGTACACAGGGGAGGCCTGCA。
22、GGACAGGGGACAGATCTTCCT CTTCAAAGGCCCCTCCACCTAGCCTTCCATCTCCATCTCGACTCCCTGGGCCTTCTGACACCCCTATCCTCCCACA AAAAAGGAAAA 0011 ( 方框为起始密码子和终止密码子 ； 阴影斜体为 EcoR I 和 Not I 酶切位点 ) 0012 SEQ ID NO 2 是 EPO-CTP 氨基酸序列 0013 MGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLGAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENITVP DTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLS。
23、EAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAI SPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDRSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ 0014 SEQ ID NO 3 是 EPO 氨基酸序列 0015 MGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLGAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENITVP DTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALG。
24、AQKEAI SPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDR 说 明 书 CN 102994547 A 5 3/6 页 6 0016 SEQ ID NO 4 是 CTP 氨基酸序列 0017 SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ 0018 本发明融合蛋白中， CTP 是人绒毛膜促性腺激素 亚基羧基末端 28 肽， 位置在融 合蛋白的 C 末端。 0019 本发明提供了融合蛋白进行动物细胞大规模、 高密度、 载体贴附灌注培养工艺或 悬浮流加工艺， 其主要步骤包括 ： 0020 (1) 细胞接种阶段 ； 0021 (2) 细胞生长。
25、阶段 ； 0022 (3) 细胞生产阶段 ； 0023 本发明提供了动物细胞大规模培养后的纯化工艺， 具体工艺包括 ： 0024 (1) 前处理 ； 0025 (2) 亲和层析 ； 0026 (3) 离子交换 ； 0027 (4) 凝胶过滤 ； 0028 本发明获得的融合蛋白， 经治疗肾性贫血大鼠实验证明， 该融合蛋白具有和 EPO 一样的生物功效， 且能达到一周给药一次的药效效果。 0029 本发明还提供了 EPO-CTP 食蟹猴药代实验数据， 证明融合蛋白的半衰期优于普 通 EPO， 平均末端半衰期为 12.65h， 市售进口药物利血宝 ( 普通 EPO) 说明书中半衰期为 5.9-7.5。
26、h。 清除率EPO-CTP 0.01ml/h/kg明显优于利血宝8.62ml/h/kg， 说明EPO-CTP在体 内清除速度慢于市售利血宝。平均滞留时间 (MRT)EPO-CTP 70.77h， 利血宝 8.18h， 可以看 出 EPO-CTP 是有一定的长效作用。 附图说明 0030 图 1 是 pMD18-T-EPO-CTP 质粒酶切鉴定 0031 图 2 是 EPO-CTP 融合蛋白结构 0032 图 3 是 EPO-CTP 表达质粒酶切鉴定 0033 图 4 是纯化的 EPO-CTP 融合蛋白电泳 0034 图 5 是 EPO-CTP 融合蛋白免疫印迹分析 0035 图 6 是 EPO。
27、-CTP 融合蛋白平均血清药物浓度 - 时间曲线 0036 图 7 是 EPO-CTP 融合蛋白治疗大鼠药物损伤致肾性贫血体内药效学试验 0037 图 8 是 EPO-CTP 融合蛋白治疗大鼠肾切除损伤致肾性贫血体内药效学试验 0038 具体实例 0039 实施例 1 表达菌株构建方法 0040 将连接到 pMD18-T 载体上的 EPO-CTP 融合蛋白基因， 利用 Not I 和 EcoR I 双酶切 鉴定阳性克隆(图1)， 测序。 获得正确序列的阳性克隆后， 将融合基因连接到pcDNA真核表 达载体上， 构建好的表达菌株提取质粒后可以进行转染CHO细胞。 EPO-CTP融合蛋白结构示 意。
28、图见图 2。 0041 取 EPO-CTP 融合基因的质粒， 使用 Not I 和 EcoR I 进行双酶切 ( 图 3)， 回收小片 段， 同时取 pcDNA 真核表达载体， 使用 Not I 和 EcoR I 进行双酶切回收大片段， 将回收的两 说 明 书 CN 102994547 A 6 4/6 页 7 个片段利用 T4 连接酶连接， 转化进大肠杆菌 DH5 中， 筛选阳性重组子。经双酶切鉴定和 序列测序分析确定后将其命名为 pcDNA-EPO-CTP。该质粒可进行 CHO 细胞的转染。 0042 实施例 2EPO-CTP 融合蛋白转染 CHOK1 细胞系 0043 将重组表达质粒转入哺。
29、乳动物宿主细胞系， 以表达 EPO-CTP 融合蛋白。为了高水 平的稳定表达， 优选的宿主细胞系是 CHOK1。本发明采用电转化， 150g 线性化的 DNA 加 入 5l 鲑鱼精 DNA， CHOK1 宿主细胞 5106 个， 混匀后， 180V 电击两次， 将电转后细胞悬液 铺入带有培养基的平皿中。待平皿中出现克隆簇， 挑取单克隆扩大培养， 在经过 3 次克隆筛 选， 获得相对稳定高表达细胞株。 0044 实施例 3 动物细胞大规模、 高密度、 载体贴附灌注培养 0045 动物细胞微载体贴附灌注培养方法， 主要包括细胞的接种， 起始生长阶段， 改变培 养条件， 后续生长阶段和监测培养条件，。
30、 具体步骤如下 ： 0046 1、 细胞的接种。 0047 细胞库中复苏一支表达EPO-CTP细胞株， 用DMEM培养基加10胎牛血清在T25方 瓶中传代三次， 调整细胞状态。当细胞处在对数生长期时， 用胰蛋白酶消化， 加血清终止消 化， 并添加 10胎牛血清的 DMEM 培养基进行种子链扩增， 细胞扩增按着 T25-T75-T150 方 瓶 -2L 转瓶的顺序逐级传代。用转瓶消化的细胞接种带有微载体的生物反应器。接种后细 胞密度为 3105 个细胞 / 毫升， 0048 2、 起始生长阶段。 0049 细胞接入生产用反应器后， 设定各项培养参数， 温度 37、 PH6.9-7.2、 DO40。
31、-70、 转速 40-70 转 /min， 每天无菌取样， 检测葡萄糖和乳酸含量。 0050 3、 改变培养条件 0051 当葡萄糖含量低于 1g/L 时更换培养液为无血清培养液， 进入表达期， 并进行灌注 式培养， 灌注量为保持葡萄糖含量 2g/L 左右。 0052 4、 后续生产阶段 0053 当培养周期达到30-40天， 或者葡萄糖消耗量24小时低于0.5g/L， 可以终止培养。 0054 5、 监测培养条件 0055 培养过程中需要检测的指标有温度、 pH、 葡萄糖浓度、 乳酸盐浓度、 铵盐浓度、 谷氨 酰胺浓度、 摩尔渗透压浓度、 表达多肽或蛋白质浓度。 0056 实施例 4 纯化工。
32、艺 0057 本发明通过深入而广泛的研究， 通过对 EPO-CTP 蛋白的理化性质的分析， 纯化工 艺条件的摸索， 从而实现了 EPO-CTP 的高效纯化工艺。由于本发明的 EPO-CTP 的表达存在 于发酵上清， 所以发酵液通过离心、 过滤获得发酵上清。本发明的优点在于确定了较佳的 工艺路线， 纯化工艺流程简单 ； 能获得高纯度高活性的 EPO-CTP 融合蛋白， 每升发酵罐培养 液可获得至少 15mg、 唾液酸大于 16mol/mol、 比活性大于 1.6105IU/mg、 纯度大于 95的 EPO-CTP 融合蛋白。纯化工艺具体步骤如下 ： 0058 1、 纯化前处理 0059 取细胞培。
33、养丰收液 30L， 先 4500rpm， 15min， 4离心， 然后采用 0.22m 格式滤芯 过滤， 过滤压力 0.5bar， 最后选择的膜包截留孔径为 10kD 超滤浓缩， 超滤条件控制为进 口端压力 1.5bar， 出口端压力 0.5bar， 浓缩倍数控制在 5-10 倍之间。 说 明 书 CN 102994547 A 7 5/6 页 8 0060 2、 EPO-CTP Blue-FF 纯化 0061 Blue Sepharose 6 Fast Flow 介质用 20mM Tris， 100mM NaCl， pH7.00.5 ； 平衡 缓冲液平衡3倍柱体积(CV)， 上样完毕再用20m。
34、M Tris， 200mM NaCl， pH7.00.5 ； 平衡缓冲 液平衡 5CV， 洗掉不能吸附的杂质蛋白。最后采用 20mMTris， 1.2M NaCl， pH7.00.5 洗脱 液洗脱， 收集洗脱蛋白峰， 将收集的蛋白溶液按 10 倍体积计算超滤除盐， 置换缓冲液采用 20mM Tris， pH7.50.5。 0062 3、 EPO-CTP DEAE-FF 层析纯化 0063 DEAE Sepharose 6 Fast Flow 介质用 20mM Tris， pH7.50.5 平衡缓冲液平衡 3CV， 上样完毕再用 20mM Tris， pH7.50.5 平衡缓冲液平衡 3CV， 。
35、洗掉不能吸附的杂质蛋 白， 然后依次用20mM Tris， 50mM NaCl(pH7.50.5)和6M尿素+1mM甘氨酸(pH4.1-pH4.3) 分别洗脱 5CV， 去除活性低的及其它杂质蛋白。最后采用采用 20mM Tris， 150mMNaCl， pH7.50.5 洗脱液洗脱， 收集洗脱蛋白峰。 0064 4、 EPO-CTP S-200 层析纯化 0065 S-200 介 质 用 20mM 磷 酸 缓 冲 液 +100mM NaCl， pH6.80.2 平 衡 3CV， 取 DEAE Sepharose 6 Fast Flow纯化后的样品上样， 上样完毕再用20mM磷酸缓冲液pH6.。
36、80.2平 衡并洗脱， 收集洗脱蛋白峰。将洗脱后的蛋白用 0.22um 滤膜除菌过滤。通过以上方法， 可 以获得特异性 ( 图 5) 纯度大于 95 ( 图 4) 的重组人促红素 -CTP 融合蛋白。 0066 实施例 5 猴体内生物活性动力学研究 0067 通过皮下注射， EPO-CTP 融合蛋白给药剂量为 150IU/Kg 注射食蟹猴。分别在用药 前和用药后 0.5h、 2h、 5h、 9h、 24h(D1)、 48(D2)、 72(D3)、 96(D4)、 120(D5)、 144(D6)、 168(D7)、 192(D8)、 240(D10) 在猴的前肢或后肢皮下静脉取全血约 1ml。。
37、采用 ELISA 方法对样品进行 测定， 将样品稀释至标准曲线线性区间内测定。食蟹猴给予 EPO-CTP 后， 药后 5h 吸收达到 峰值， 其药物平均末端半衰期 12.65h( 图 6)。 0068 实施例 6 治疗大鼠药物损伤致肾性贫血体内药效学试验 0069 本实验以腺嘌呤250mg/kg每天精确灌胃大鼠3周， 建立大鼠药物损伤肾性贫血模 型。成模动物按 HGB 水平随机分为 5 组， 分别为模型对照组、 阳性 ( 普通 EPO) 对照组、 供试 品低剂量组、 供试品中剂量组和供试品高剂量组， 剂量分别为普通 EPO 为 1350IU/kg， 供试 品低、 中和高剂量分别为 150、 4。
38、50 和 1350IU/kg。并设正常对照组。实验总共 6 组， 每组 7 只， 共 42 只。供试品组每周给药 1 次， 阳性对照组每 2 天给药 1 次， 连续 4 周。给药期间每 天观察动物一般临床症状， 每周监测其血液学、 血生化相关指标， 给药结束对动物进行大体 解剖观察， 行病理组织学检查。试验显示 ( 图 7) 在贫血的治疗方面， 重组人促红素 -CTP 融 合蛋白中、 高剂量组及阳性对照组有改善贫血的作用， 其升高 RBC、 HGB、 HCT 作用， 与给药剂 量有相关性。重组人促红素 -CTP 融合蛋白每周给药一次， 与阳性对照组每两天给药一次相 比， 具有长效的特点， 降低。
39、给药次数， 提高治疗的顺应性。 0070 实施例 7 治疗大鼠肾切除损伤致肾性贫血体内药效学试验 0071 本实验采用 5/6 肾切除法建立大鼠肾切除损伤肾性贫血模型。成模动物按 HGB 水 平随机分为 6 组， 分别为正常对照组、 模型对照组、 阳性 ( 普通 EPO) 对照组、 供试品低剂量 组、 供试品中剂量组和供试品高剂量组。 其中， 正常对照组5只动物， 其余各组均为6只。 剂 量分别为普通 EPO 为 450IU/kg， 供试品低、 中和高剂量分别为 150、 450 和 1350IU/kg。供试 说 明 书 CN 102994547 A 8 6/6 页 9 品和阴性对照均为 1 。
40、次 / 周， 阳性对照品为 1 次 /2 天， 连续注射 4 周。给药期间每天观察 动物一般临床症状 ； 造模结束、 D8、 D15、 D22 药前及给药结束监测血液学指标 ； 造模结束及 给药结束监测血生化相关指标。实验结果 ( 图 8) 证明供试品重组人促红素 -CTP 融合蛋白 450IU/kg、 1350IU/kg及阳性对照药利血宝450IU/kg有改善贫血的作用， 呈剂量依赖性。 供 试品重组人促红素 -CTP 融合蛋白每周给药一次， 与阳性对照药利血宝每两天给药一次相 比， 具有长效的特点， 其降低了给药次数， 提高了治疗的顺应性。 说 明 书 CN 102994547 A 9 1/4 页 10 图 1 图 2 图 3 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 102994547 A 10 2/4 页 11 图 6 说 明 书 附 图 CN 102994547 A 11 3/4 页 12 图 7 说 明 书 附 图 CN 102994547 A 12 4/4 页 13 图 8 说 明 书 附 图 CN 102994547 A 13 。