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本披露涉及对白蛋白具有结合亲和力的一类工程化多肽。本披露还涉及利用这些和其他化合物与白蛋白在不同环境中的结合的新的方法和用途，其中一些对于治疗或诊断包括人类的哺乳动物中的疾病具有重要性。

权利要求书一种白蛋白结合多肽，包含选自以下的一个氨基酸序列：
i)LAX3AKX6X7ANX10  ELDX14YGVSDF  YKRLIX26KAKTVEGVEALKX39X40ILX43X44LP
其中彼此独立地
X3选自E、S、Q以及C；
X6选自E、S以及C；
X7选自A和S；
X10选自A、S以及R；
X14选自A、S、C以及K；
X26选自D和E；
X39选自D和E；
X40选自A和E；
X43选自A和K；
X44选自A、S以及E；
位置45处的L存在或不存在；并且
位置46处的P存在或不存在；
以及
ii)与i)中所定义的序列具有至少95%一致性的一个氨基酸序列。
根据权利要求1所述的白蛋白结合多肽，其中X6是E。
根据以上权利要求中任一项所述的白蛋白结合多肽，其中X3是S。
根据权利要求1至2中任一项所述的白蛋白结合多肽，其中X3是E。
根据以上权利要求中任一项所述的白蛋白结合多肽，其中X7是A。
根据以上权利要求中任一项所述的白蛋白结合多肽，其中X14是S。
根据权利要求1至5中任一项所述的白蛋白结合多肽，其中X14是C。
根据以上权利要求中任一项所述的白蛋白结合多肽，其中X10是A。
根据权利要求1至7中任一项所述的白蛋白结合多肽，其中X10为是S。
根据权利要求1至9中任一项所述的白蛋白结合多肽，其中X26是D。
根据权利要求1至9中任一项所述的白蛋白结合多肽，其中X26是E。
根据权利要求1至11中任一项所述的白蛋白结合多肽，其中X39是D。
根据权利要求1至11中任一项所述的白蛋白结合多肽，其中X39是E。
根据权利要求1至13中任一项所述的白蛋白结合多肽，其中X40是A。
根据权利要求1至14中任一项所述的白蛋白结合多肽，其中X43是A。
根据权利要求1至15中任一项所述的白蛋白结合多肽，其中X44是A。
根据权利要求1至15中任一项所述的白蛋白结合多肽，其中X44是S。
根据权利要求1至17中任一项所述的白蛋白结合多肽，其中位置45处的L存在。
根据权利要求1至18中任一项所述的白蛋白结合多肽，其中位置46处的P存在。
根据以上权利要求中任一项所述的白蛋白结合多肽，该白蛋白结合多肽与白蛋白结合，使得该相互作用的koff值为至多5×10‑5s‑1。
根据权利要求20所述的白蛋白结合多肽，该白蛋白结合多肽与白蛋白结合，使得该相互作用的koff值为至多5×10‑6s‑1。
根据权利要求1所述的白蛋白结合多肽，其氨基酸序列是选自SEQ ID NO:1‑144以及SEQ ID NO:164‑203中的任何一个。
根据权利要求22所述的白蛋白结合多肽，其氨基酸序列是选自SEQ ID NO:4‑5、SEQ ID NO:7‑8、SEQ ID NO:10‑11、SEQ ID NO:13‑14、SEQ ID NO:16‑17、SEQ ID NO:19‑20、SEQ ID NO:22‑23、SEQ ID NO:25‑26、SEQ ID NO:28‑29、SEQ ID NO:31‑32、SEQ ID NO:34‑35、SEQ ID NO:37‑38、SEQ ID NO:41‑42、SEQ ID NO:49‑50、SEQ ID NO:164‑170以及SEQ ID NO:192‑203中的任何一个。
根据权利要求22所述的白蛋白结合多肽，其氨基酸序列是选自SEQ ID NO:1‑144中的任何一个。
根据权利要求24所述的白蛋白结合多肽，其氨基酸序列是选自SEQ ID NO:4‑5、SEQ ID NO:7‑8、SEQ ID NO:10‑11、SEQ ID NO:13‑14、SEQ ID NO:16‑17、SEQ ID NO:19‑20、SEQ ID NO:22‑23、SEQ ID NO:25‑26、SEQ ID NO:28‑29、SEQ ID NO:31‑32、SEQ ID NO:34‑35、SEQ ID NO:37‑38、SEQ ID NO:41‑42以及SEQ ID NO:49‑50中的任何一个。
根据以上权利要求中任一项所述的白蛋白结合多肽，进一步包含位于i)中所定义的该序列的N末端和/或C末端处的一个或多个另外的氨基酸残基。
根据权利要求26所述的白蛋白结合多肽，其中这些另外的氨基酸包含在该多肽的N末端的至少一个丝氨酸残基。
根据权利要求26至27中任一项所述的白蛋白结合多肽，其中这些另外的氨基酸包含在该多肽的N末端的一个甘氨酸残基。
根据权利要求26至28中任一项所述的白蛋白结合多肽，其中这些另外的氨基酸包含在该多肽的N末端的一个半胱氨酸残基。
根据权利要求26至29中任一项所述的白蛋白结合多肽，其中这些另外的氨基酸包含在该多肽的C末端处的一个赖氨酸残基。
根据权利要求26至30中任一项所述的白蛋白结合多肽，其中这些另外的氨基酸包含在该多肽的C末端处的一个甘氨酸残基。
根据权利要求26至31中任一项所述的白蛋白结合多肽，其中这些另外的氨基酸包含在该多肽的C末端处的一个半胱氨酸残基。
根据权利要求26至32中任一项所述的白蛋白结合多肽，其氨基酸序列是选自SEQ ID NO:145‑150以及SEQ ID NO:162‑163中的任何一个。
根据以上权利要求中任一项所述的白蛋白结合多肽，包含不超过两个半胱氨酸残基。
根据权利要求34所述的白蛋白结合多肽，包含不超过一个半胱氨酸残基。
根据以上权利要求中任一项所述的白蛋白结合多肽，该白蛋白结合多肽与人血清白蛋白结合。
一种融合蛋白或结合物，包含：
i)一个第一部分，由根据以上权利要求中任一项所述的白蛋白结合多肽组成；以及
ii)一个第二部分，由具有一种所希望的生物活性的一种多肽组成。
根据权利要求37所述的融合蛋白或结合物，其中具有一种所希望的生物活性的该第二部分是一种治疗活性多肽。
根据权利要求38所述的融合蛋白或结合物，其中具有一种所希望的生物活性的该第二部分是选自下组，该组由以下各项组成：人内源酶、激素、生长因子、趋化因子、细胞因子以及淋巴因子。
根据权利要求39所述的融合蛋白或结合物，其中该第二部分是选自下组，该组由以下各项组成：IL‑2、GLP‑1、BNP、IL‑1‑RA、KGF、GH、G‑CSF、CTLA‑4、肌肉生成抑制素、因子VII、因子VIII以及因子IX。
根据权利要求38所述的融合蛋白或结合物，其中具有一种所希望的生物活性的该第二部分是一种非人类生物活性蛋白，其选自下组，该组由以下各项组成：细菌毒素类、酶类以及活化蛋白类。
根据权利要求37所述的融合蛋白或结合物，其中具有一种所希望的生物活性的该第二部分是能够与一个目标分子选择性相互作用的一种结合多肽。
根据权利要求42所述的融合蛋白或结合物，其中该结合多肽是选自下组，该组由以下各项组成：抗体以及其实质上保留抗体结合活性的片段和结构域；微体、maxybodies、高亲合性多聚体（avimer）以及其他小的二硫键结合的蛋白质；以及衍生自一种骨架的结合蛋白，其选自下组，该组由以下各项组成：葡萄球菌A蛋白及其结构域、其他三螺旋结构域、脂质运载蛋白、锚蛋白重复结构域、纤维素结合域、γ晶型、绿色荧光蛋白、人细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4、蛋白酶抑制剂（如库尼兹（Kunitz）结构域）、PDZ结构域、SH3结构域、肽适体、葡萄球菌核酸酶、淀粉酶抑肽、纤连蛋白III型结构域、转铁蛋白、锌指以及芋螺毒素。
根据权利要求43所述的融合蛋白或结合物，其中所述目标分子是选自下组，该组由以下各项组成：阿尔茨海默病的Aβ肽；其他疾病相关淀粉样肽；毒素，如细菌毒素和蛇毒；凝血因子，如血管性血友病因子；白细胞介素，如IL‑13；肌肉生成抑制素；促炎因子，如TNF‑α、TNF‑α受体、IL‑1、IL‑23以及IL‑8；补体因子，如C3和C5；超敏反应介质，如组胺和IgE；肿瘤相关抗原，如CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD40、CD52、CD70、cMet、HER1、HER2、HER3、HER4、CAIX、CEA、IL‑2受体、MUC1、PSMA、TAG‑72，以及其他生物学分子，如G‑CSF、GM‑CSF、GH、胰岛素以及生长抑素。
根据权利要求37至44中任一项所述的融合蛋白或结合物，包含一个另外的部分，该另外的部分由具有另外的、所希望的生物活性的一种多肽组成，该另外的所希望的生物活性可以与该第二部分的生物活性相同或不同。
根据权利要求45所述的融合蛋白或结合物，其中该第二部分如权利要求38至41中任一项所定义，并且该另外的部分如权利要求42至44中任一项所定义。
根据权利要求37至46中任一项所述的结合物，其中该第二部分是经由在该多肽的位置X14处存在的任何半胱氨酸残基的硫基与根据权利要求1至36中任一项所述的白蛋白结合多肽结合。
根据以上权利要求中任一项所述的白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物，进一步包含一种细胞毒性剂。
根据权利要求48所述的白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物，其中该细胞毒性剂是选自刺孢霉素、奥莉丝汀（auristatin）、多柔比星、美登醇、紫杉醇、海鞘素、格尔德霉素、氨甲喋呤以及它们的衍生物，以及其组合。
根据以上权利要求中任一项所述的白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物，进一步包含一种标记。
根据权利要求50所述的白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物，其中所述标记是选自下组，该组由以下各项组成：荧光染料和金属、发色染料、化学发光化合物和生物发光蛋白、酶、放射性核素以及颗粒。
根据权利要求51所述的白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物，包含由一种聚氨基聚羧酸酯螯合剂提供的一种螯合环境（chelating environment），这种聚氨基聚羧酸酯螯合剂经由一个半胱氨酸残基的一个硫基或一个赖氨酸残基的一个胺基与该白蛋白结合多肽结合。
根据权利要求52所述的白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物，其中该聚氨基聚羧酸酯螯合剂是1,4,7,10‑四氮杂环十二烷‑1,4,7,10‑四乙酸或其衍生物。
根据权利要求53所述的白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物，其中该1,4,7,10‑四氮杂环十二烷‑1,4,7,10‑四乙酸衍生物是1,4,7,10‑四氮杂环十二烷‑1,4,7‑三‑乙酸‑10‑马来酰亚胺乙基乙酰胺。
根据权利要求52所述的白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物，其中该聚氨基聚羧酸酯螯合剂是二乙烯三胺五乙酸或其衍生物。
一种编码根据权利要求1至46中任一项所述的白蛋白结合多肽或融合蛋白的多核苷酸。
一种生产根据权利要求1至45中任一项所述的多肽的方法，包括表达根据权利要求56所述的多核苷酸。
一种表达载体，包含根据权利要求56所述的多核苷酸。
一种宿主细胞，包含根据权利要求58所述的表达载体。
一种制造根据权利要求1至36中任一项所述的多肽的方法，该方法是使用具有受保护的反应性侧链的氨基酸和/或氨基酸衍生物通过非生物学肽合成来实现，该非生物学肽合成包括：
使这些氨基酸和/或这些氨基酸衍生物逐步偶联，形成具有受保护的反应性侧链的根据权利要求1至36中任一项所述的多肽，
从该多肽的这些反应性侧链去除保护基团，以及
使该多肽在水溶液中折叠。
一种生产根据权利要求37至48中任一项所述的结合物的方法，包括
通过根据权利要求60所述的方法生产一种白蛋白结合多肽，以及
使所生产的白蛋白结合多肽与如权利要求38至48中任一项所定义的第二部分和/或另外的部分结合。
根据权利要求37至55中任一项所述的融合蛋白或结合物，用作一种药剂。
根据权利要求62所述的融合蛋白或结合物，与向哺乳动物给予本身具有一种所希望的生物活性的该多肽后引出的免疫应答相比，在向该哺乳动物给予该融合蛋白或结合物后不引出或引出降低的免疫应答。
根据权利要求37至55中任一项所述的融合蛋白或结合物，用于诊断。
一种组合物，包含
一种化合物，这种化合物本身具有不超过100μg/ml的在水中的溶解度；与以下物质偶联：
根据权利要求1至47中任一项所述的白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物，其中该化合物与该白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物是共价偶联的。
根据权利要求65所述的组合物，其中所述溶解度不超过10μg/ml。
根据权利要求66所述的组合物，其中所述溶解度不超过1μg/ml。
根据权利要求65至67中任一项所述的组合物，其中所述化合物是一种药物活性化合物。
根据权利要求68所述的组合物，其中所述药物活性化合物是一种细胞毒性剂。
根据权利要求69所述的组合物，其中所述细胞毒性剂如权利要求49中所定义。
根据权利要求69所述的组合物，其中所述细胞毒性剂是一种合成化学毒素（chemotoxin），而不是衍生自一种天然存在的化合物。
根据权利要求65至71中任一项所述的组合物，进一步包含对于临床相关目标具有结合亲和力的一种结合多肽。
根据权利要求72所述的组合物，其中所述结合多肽如权利要求43中所定义。
根据权利要求65至73中任一项所述的组合物，进一步包含人血清白蛋白。
根据权利要求65至74中任一项所述的组合物，用作一种药剂。
根据权利要求65至74中任一项所述的组合物，用于诊断。
一种制备根据权利要求65至76中任一项所述的组合物的方法，包括
a)提供一种化合物，这种化合物本身具有不超过100μg/ml在水中的溶解度；以及
b)使该化合物与根据权利要求1至47中任一项所述的白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物共价偶联，从而形成一种组合物，该组合物包含化合物与一种白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物的一种共价复合物。
根据权利要求77所述的方法，进一步包括c)将化合物与白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物的所述复合物与白蛋白混合，从而形成一种组合物，该组合物包含i)化合物与白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物的共价复合物与ii)白蛋白的一种非共价复合物。
根据权利要求78所述的方法，进一步包括将包含该非共价复合物的所述组合物冻干，获得一种冻干组合物。
一种增加化合物的水溶性的方法，包括
提供一种化合物，这种化合物本身具有不超过100μg/ml的在水中的溶解度；
使该化合物与根据权利要求1至47中任一项所述的白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物共价偶联，从而形成化合物与白蛋白结合多肽的一种共价复合物；以及
将化合物与白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物的所述复合物与白蛋白在促进该白蛋白结合多肽与人血清白蛋白的非共价缔合的条件下混合；
由此在所述复合物中的该化合物在水中的溶解度比该化合物本身在水中的溶解度大。
根据权利要求80所述的方法，其中所述溶解度如权利要求66至67中任一项所定义。
根据权利要求80到81中任一项所述的方法，其中所述化合物如权利要求68至71中任一项所定义。
根据权利要求80至82中任一项所述的方法，其中所述复合物进一步包含对于临床相关目标具有结合亲和力的一种多肽。
根据权利要求83所述的方法，其中所述结合多肽如权利要求43中所定义。

说明书多肽 
技术领域
本披露涉及对白蛋白具有结合亲和力的一类工程化多肽。本披露还涉及利用这些和其他化合物与白蛋白在不背景下结合的新的方法和用途，其中一些对于治疗包括人类的哺乳动物中的疾病具有重要性。 
发明背景 
血清白蛋白 
血清白蛋白是哺乳动物血清中最丰富的蛋白质（40g/l；在人类中大约为0.7mM），并且它的功能之一是结合多种分子，如脂质和胆红素（彼得斯（Peters）,《蛋白质化学进展》（Advances in Protein Chemistry）37:161,1985）。血清白蛋白无任何酶或免疫功能。此外，人血清白蛋白（HSA）是在许多天然以及治疗性分子的内源性运输和递送中所涉及的一种天然载体（塞勒斯（Sellers）和科赫韦泽（Koch‑Weser）,《白蛋白结构、功能以及用途》（AlbuminSructure,Function and Uses）,编者罗森诺（Rosenoer）等人,培格曼（Pergamon）,牛津（Oxford）,第159页,1977）。血清白蛋白的半衰期与动物的大小成正比，其中例如人血清白蛋白具有19天的半衰期，而兔血清白蛋白具有大约5天的半衰期（麦柯迪（McCurdy）等人,《实验和临床医学杂志》（J Lab Clin Med）143:115,2004）。HSA广泛分布于身体各处，尤其在间质和血液隔室中，其中HSA主要与维持克分子渗透压浓度有关。在结构上，白蛋白是包含三个同源结构域以及总共584或585个氨基酸的单链蛋白质（Dugaiczyk等人,《美国国家科学院院刊》（ProcNatl Acad Sci USA）79:71,1982）。白蛋白包含17个二硫键以及单个反应性巯基、位置34上的半胱氨酸，但缺乏N连接以及O连接的碳水化合物部分（彼得斯,1985,同前文献；尼克尔森（Nicholson）等人,《英国麻醉 学杂志》（Br J Anaesth）85:599,2000）。 
与HSA融合或缔合导致蛋白质的体内半衰期增加 
已经报道了使蛋白质与血清白蛋白抑或将允许与血清白蛋白的体内缔合的肽或蛋白质直接共价偶联的若干策略。后一方法的实例已经描述于例如WO91/01743、WO01/45746以及丹尼斯（Dennis）等人（《生物化学杂志》（J Biol Chem）277:35035‑43,2002）中。第一个文献尤其描述了从链球菌蛋白G（SpG）衍生的白蛋白结合肽或蛋白质用于增加其他蛋白质的半衰期的用途。这种观念在于，使细菌衍生的白蛋白结合肽/蛋白质与一种治疗上感兴趣的肽/蛋白质融合，这种肽/蛋白质已经显示出具有从血液中的快速消除。因此产生的融合蛋白与血清白蛋白在体内结合，并且受益于其更长的半衰期，增加了融合的在治疗上感兴趣的肽/蛋白质的净半衰期。WO01/45746和丹尼斯等人涉及同一概念，但在此，诸位作者利用相对较短的肽来结合血清白蛋白。这些肽选自一个噬菌体展示肽库。在丹尼斯等人的文献中，提及了早期研究中发现对链球菌蛋白G的白蛋白结合域与人补体受体1型的重组融合物的免疫应答的增强。作为US2004/0001827公开的美国专利申请（丹尼斯）还披露了包含肽配体的构建体的用途，这些构建体同样通过噬菌体展示技术鉴定，其与血清白蛋白结合并且与生物活性化合物结合用于肿瘤靶向。 
细菌受体蛋白的白蛋白结合域 
链球菌蛋白G（SpG）是一种双功能受体，它存在于某些链球菌菌株的表面上，并且能够与IgG和血清白蛋白两者结合（布约克等人,《分子免疫学》（Mol Immunol）24:1113,1987）。其结构以若干结构上和功能上不同的结构域高度重复（格斯（Guss）等人,欧洲分子生物学杂志（EMBO J）5:1567,1986），更准确地说以三个Ig结合域和三个血清白蛋白结合域高度重复（奥尔松（Olsson）等人,《欧洲生物化学杂志》（EurJ Biochem）168:319,1987）。已经测定SpG中的三个血清白蛋白结合域之 一的结构，显示为一种三螺旋束折叠（Kraulis等人,《欧洲生物化学学会联盟通讯》（FEBS Lett）378:190,1996；约翰松（Johansson）等人,《生物化学杂志》（J.Biol.Chem.）277:8114‑20,2002）。一个含46个氨基酸的基序被定义为ABD（白蛋白结合域）并且后来也被命名为G148‑GA3（关于蛋白G相关性白蛋白结合的GA）。在例如WO09/016043中，披露了该含46个氨基酸的基序ABD的白蛋白结合变体。 
除了蛋白G中的白蛋白结合域之外也已经鉴定了其他细菌白蛋白结合域，其中一些在结构上与蛋白G的白蛋白结合域相似。含有这样的白蛋白结合域的蛋白质的实例是PAB、PPL、MAG以及ZAG蛋白（罗扎克（Rozak）等人,《生物化学》（Biochemistry）45:3263‑3271,2006）。已经例如由约翰松和同事进行了这样的白蛋白结合域的结构和功能的研究并且加以报道（约翰松等人,《分子生物学杂志》（J Mol Biol）266:859‑865,1997）。此外，罗扎克等人已经报道了G148‑GA3的人工变异体的产生，这些人工变异体是就不同的种特异性和稳定性而加以选择并且研究的（罗扎克等人,《生物化学》，45:3263‑3271,2006），而约翰松等人研发了对于人血清白蛋白的亲和力有很大提高的G148‑GA3的人工变异体（约翰松等人,《蛋白质工程设计与选择》（Prot Eng Des Sel）21:515‑27,2008）。对于一些变异体来说，获得一种更高的亲和力是以热稳定性降低为代价的。 
除了上述含有三螺旋结构的蛋白质之外，还存在着其他的结合白蛋白的无关细菌蛋白。 
ABD和免疫作用 
最近，以实验的方式鉴定出在链球菌蛋白G菌株148（G148）的白蛋白结合区内的少数T细胞和B细胞表位（戈奇（Goetsch）等人,《临床诊断实验室免疫学》（Clin Diagn Lab Immunol）10:125‑32,2003）。这项研究背后的诸位作者的兴趣在于，利用在疫苗中的G148的T细胞表位，即，利用白蛋白结合区的固有免疫刺激特性。另外，戈奇等人在G148的序列中发现一个B细胞表位，即，被在免疫之后的抗体结合的一个区域。 
在用于人类给药的药物组合物中，免疫应答是所不希望的。因此，由于其上述免疫刺激特性，白蛋白结合域G148本身不适合用于这样的组合物中。 
说明书
在一个第一个方面，通过一种白蛋白结合多肽克服或减轻了现有技术的以上缺点和不足，这种白蛋白结合多肽包含选自以下的一个氨基酸序列： 
i)LAX3AKX6X7ANX10   ELDX14YGVSDF    YKRLIX26KAKTVEGVEALKX39X40ILX43X44LP， 
其中彼此独立地， 
X3选自E、S、Q以及C； 
X6选自E、S以及C； 
X7选自A和S； 
X10选自A、S以及R； 
X14选自A、S、C以及K； 
X26选自D和E； 
X39选自D和E； 
X40选自A和E； 
X43选自A和K； 
X44选自A、S以及E； 
位置45处的L存在或不存在；并且 
位置46处的P存在或不存在； 
以及 
ii)与i)中所定义的序列具有至少95%一致性的一个氨基酸序列。 
以上所定义的对于白蛋白具有结合亲和力的序列相关多肽的类别是衍生自一种共同亲本多肽序列，这种共同亲本多肽序列折叠成一个三α螺旋束结构域。更确切地说，如上文所描述的这些多肽衍生自一种模型建立，这种模型建立是基于血清白蛋白与白蛋白结合域G148‑GA3之间的一种复合物的结构（莱永（Lejon）等人,《生物化学杂志》279:42924‑8,2004），以及对共同亲本多肽序列的许多突变变异体的结合和结构特性的分析。以上所定义的氨基酸序列i)与亲本多肽序列相比包含氨基酸置换，这导致预期折叠成一种几乎完全相同的三螺旋束结构域的一类多肽。同时该亲本多肽序列已经包含用于与白蛋白相互作用的一个结合表面，该结合表面是通过根据以上定义的一些置换而被修饰的。根据以上定义的置换提供了相比于亲本多肽序列的改进的白蛋白结合能力。 
根据本披露的第一个方面的白蛋白结合多肽展现出一组特征，这组特征例如，使这些白蛋白结合多肽适合用作用于人类给药的治疗性分子的融合或结合伴侣。例如，与相关白蛋白结合多肽（如白蛋白结合域G148‑GA3以及披露于WO09/016043中的白蛋白结合多肽）相比较，根据本披露的白蛋白结合多肽展示以下六个特征中的至少五个： 
与例如G148‑GA3和其他细菌衍生的白蛋白结合域比较，这些多肽展示不同的表面。该差异可以降低或消除已经暴露于这样的细菌蛋白的受试者（如一个人）体内的抗体反应的任何风险。 
这些多肽与例如G148‑GA3和多种其他相关但不同的常见亲本多肽序列的突变变异体相比包含更少的潜在T细胞表位，并且因此当向一个受试者（如一个人）给予时展示低免疫原性。 
当给予受试者（如一个人）时，这些多肽展示出更低的与循环抗体的反应性。因此，如在人类血清的一个试验装置中所测量的，通过在暴露于循环抗体的这些多肽的表面中（即，在不涉及与白蛋白的结合相互作用的多肽表面中）的氨基酸置换，相比于例如由G148‑GA3引起的抗体交叉反应性，抗体交叉反应性被降低了。 
与例如已知天然存在的白蛋白结合多肽（如衍生自细菌蛋白的白蛋 白结合域）相比，就更高的结合亲和力（如通过KD值所定义的）来说，以及就更慢的解离率（如通过koff值所定义的）来说，这些多肽具有高的白蛋白结合能力。 
与例如已知天然存在的白蛋白结合多肽（如衍生自细菌蛋白的白蛋白结合域）相比，这些多肽包含更少的与多肽的稳定性问题相关的氨基酸残基。因此，这些多肽不包含例如易于氧化的甲硫氨酸或色氨酸并且仅包含一个天冬酰胺。 
与前述白蛋白结合多肽（如在WO09/016043中所披露的）相比，这些多肽具有更高的结构稳定性（如通过55°C以上的熔点所定义的）。 
在一个实施方案中，根据第一个方面的白蛋白结合多肽展示所有以上列出的六个特征。在另一个实施方案中，当与白蛋白结合时，与例如前述白蛋白结合多肽（如在WO09/016043中所披露的）比较，根据第一个方面的白蛋白结合多肽展示更亲水的特征。当白蛋白结合多肽与白蛋白相互作用时，该多肽暴露于环境的表面包含更少的赋予表面疏水性的氨基酸残基。 
如熟练的人员将认识到的，任何多肽的功能（如根据第一个方面的多肽的白蛋白结合容量）取决于该多肽的三级结构。然而，有可能在不影响α螺旋多肽的结构的情况下改变其氨基酸序列（达维娜（Taverna）和戈德斯坦（Goldstein）,《分子生物学杂志》315(3):479‑84,2002；何（He）等人,《美国国家科学院院刊》105(38):14412‑17,2008）。因此，i)的修饰变异体（这些变异体使得产生的序列与属于由i)所定义的类别的一个序列至少95%一致）也被该第一个方面所涵盖。例如，有可能的是，属于氨基酸残基的某一官能团（例如疏水性、亲水性、极性官能团，等等）的一个氨基酸残基可以取代为来自相同官能团的另一个氨基酸残基。 
如在本说明书和权利要求书中所使用的，术语“一致性百分比（%identitical或%identity）”是如下计算的。使用CLUSTAL W算法将查询序列与目标序列进行比对（汤普森,J.D.（Thompson,J.D.）,希金斯,D.G.（Higgins,D.G.）以及吉布森,T.J.（Gibson,T.J.）,《核酸研究》（Nucleic Acids Research）,22:4673‑4680(1994)）。在与比对序列中的最短序列相应的窗口上进行比较。比对序列中的最短序列在一些情况下可以是目标序列，如在此所披露的白蛋白结合多肽。在其他情况下，查询序列可以构成比对序列中的最短序列。查询序列可以例如由至少10个氨基酸残基，如至少20个氨基酸残基，如至少30个氨基酸残基，如至少40个氨基酸残基，例如45个氨基酸残基组成。比较在各位置的氨基酸残基，并且将查询序列中具有目标序列中的相同一致性的位置的百分比报告为一致性百分比。 
在根据第一个方面的白蛋白结合多肽的一个实施方案中，X6是E。 
在根据这个方面的白蛋白结合多肽的另一个实施方案中，X3是S。 
在根据这个方面的白蛋白结合多肽的另一个实施方案中，X3是E。 
在根据这个方面的白蛋白结合多肽的另一个实施方案中，X7是A。 
在根据这个方面的白蛋白结合多肽的另一个实施方案中，X14是S。 
在根据这个方面的白蛋白结合多肽的另一个实施方案中，X14是C。 
在根据这个方面的白蛋白结合多肽的另一个实施方案中，X10是A。 
在根据这个方面的白蛋白结合多肽的另一个实施方案中，X10是S。 
在根据这个方面的白蛋白结合多肽的另一个实施方案中，X26是D。 
在根据这个方面的白蛋白结合多肽的另一个实施方案中，X26是E。 
在根据这个方面的白蛋白结合多肽的另一个实施方案中，X39是D。 
在根据这个方面的白蛋白结合多肽的另一个实施方案中，X39是E。 
在根据这个方面的白蛋白结合多肽的另一个实施方案中，X40是A。 
在根据这个方面的白蛋白结合多肽的另一个实施方案中，X43是A。 
在根据这个方面的白蛋白结合多肽的另一个实施方案中，X44是A。 
在根据这个方面的白蛋白结合多肽的另一个实施方案中，X44是S。 
在根据这个方面的白蛋白结合多肽的另一个实施方案中，在位置45处存在L残基。 
在根据这个方面的白蛋白结合多肽的另一个实施方案中，在位置46处存在P残基。 
在根据这个方面的白蛋白结合多肽的另一个实施方案中，在位置46处不存在P残基。 
在另一个实施方案中，根据这个方面的白蛋白结合多肽的限制条件为X7既不是L、E，也不是D。 
可以制备根据第一个方面的白蛋白结合多肽，以便通过用例如一个半胱氨酸或一个赖氨酸置换表面暴露的氨基酸残基而与一种适合的结合伴侣相结合。这些置换可以引入到该多肽的N末端螺旋（即螺旋一）中，螺旋一为当白蛋白结合多肽与血清白蛋白结合时位于离该血清白蛋白最远的螺旋。因此，可以使用i)中所定义的序列的位置X14处的一个赖氨酸残基来实现定点结合。此外，当通过化学肽合成来制造该分子时，这可能是有利的，因为可以利用所述赖氨酸的ε‑氨基的正交保护。此外，可以将一个半胱氨酸残基引入到氨基酸序列中以实现定点结合。例如，可以将半胱氨酸残基引入到符合以上定义的位置X3、X6和/或X14中的任何一处。 
一个结合伴侣与一个赖氨酸的ε胺或一个半胱氨酸的硫基偶联代表两种化学上不同的替代方案，从而使用氨基酸序列i)内的一个氨基酸残基获得定点结合。如熟练的人员所理解的，存在着制备用于结合的一个氨基酸序列的其他化学替代方案，并且这些方案本身也在本披露的范围内。这样的化学方法的一个实例是点击样化学反应（click‑like chemistry），如由班（Ban）等人提出的通过引入一个酪氨酸来实现的（《美国化学会志》（J AmChem Soc）132:1523‑5,2009）。 
如在本说明书中所使用的，术语“白蛋白结合”和“对白蛋白的结合亲和力”是指一个多肽的一种特性，这种特性可以例如通过使用表面等离子共振技术（如在Biacore仪器中）来测试。例如，如在以下实例中所述的，可以在一个实验中测试白蛋白结合亲和力，其中白蛋白或其一个片段被固定在该仪器的一个传感器芯片上，并且使含有将要被测试的多肽的样品在该芯片上方经过。可替代地，将要被测试的多肽被固定在该仪器的一个传感 器芯片上，并且使含有白蛋白或其一个片段的一个样品在该芯片上方经过。在这点上，白蛋白可以是来自一个哺乳动物的血清白蛋白，如人血清白蛋白。然后，熟练的人员可以解释通过这样的实验所获得的结果来建立该多肽对于白蛋白的结合亲和力的至少一个定性量度。如果一个定量量度是所希望的，例如用来确定针对相互作用的一个KD值，还可以使用表面等离子共振法。例如，可以在Biacore2000仪器（通用电气医疗集团（GEHealthcare））中确定结合值。将白蛋白适当地固定在该测量仪器的一个传感器芯片上，并且通过连续稀释来制备有待测定亲和力的多肽的样品并且将其注入。然后，可以根据由使用例如由仪器制造商（通用电气医疗集团）提供的BIA评估4.1软件的1:1兰米尔结合模型（Langmuirbinding model）的结果来计算KD值。 
在一个实施方案中，根据这个方面的白蛋白结合多肽与白蛋白结合，使得该相互作用的koff值为至多5×10‑5s‑1，如至多5×10‑6s‑1。 
如上文所描述的，如由氨基酸序列i)所定义的白蛋白结合多肽衍生自折叠成一个三α螺旋束结构域的一种共同亲本多肽序列。在一个实施方案中，这种亲本多肽序列的三螺旋结构域形成来自链球菌（Streptococcus）菌株G148的蛋白G的一部分，尤其结构域GA3。 
在另一个实施方案中，白蛋白结合多肽的氨基酸序列是选自SEQ IDNO:1‑144以及SEQ ID NO:164‑203中的任何一个，如选自SEQ IDNO:1‑144中的任何一个。更确切地说，该氨基酸序列是选自SEQ IDNO:4‑5、SEQ ID NO:7‑8、SEQ ID NO:10‑11、SEQ ID NO:13‑14、SEQ IDNO:16‑17、SEQ ID NO:19‑20、SEQ ID NO:22‑23、SEQ ID NO:25‑26、SEQID NO:28‑29、SEQ ID NO:31‑32、SEQ ID NO:34‑35、SEQ ID NO:37‑38、SEQ ID NO:41‑42、SEQ ID NO:49‑50、SEQ ID NO:164‑170以及SEQ IDNO:192‑203。因此，该氨基酸序列可以选自SEQ ID NO:4‑5、SEQ IDNO:7‑8、SEQ ID NO:10‑11、SEQ ID NO:13‑14、SEQ ID NO:16‑17、SEQ IDNO:19‑20、SEQ ID NO:22‑23、SEQ ID NO:25‑26、SEQ ID NO:28‑29、SEQID NO:31‑32、SEQ ID NO:34‑35、SEQ ID NO:37‑38、SEQ ID NO:41‑42以及SEQ ID NO:49‑50。 
在一个实施方案中，根据这个方面的白蛋白结合多肽进一步包含位于i)中所定义的序列的N末端和/或C末端的一个或多个另外的氨基酸残基。这些另外的氨基酸残基可以在增强多肽对白蛋白的结合以及改进折叠的白蛋白结合域的构象稳定性方面发挥作用，但同样可以良好地用于其他目的，例如有关于该多肽的生产、纯化、体内或体外稳定化、偶联、标记或检测中的一者或多者，以及其任何组合。这样的另外的氨基酸残基可以包含为化学偶联目的而添加的一个或多个氨基酸残基，例如添加到色谱树脂中以获得一种亲和基质，或添加到一个螯合部分中以便与一种射电金属络合。 
因此，在一个实施方案中，直接在氨基酸序列i)的N末端或C末端的α螺旋之前或之后的氨基酸可能影响构象稳定性。可以促使改进构象稳定性的一个氨基酸残基的一个实例为位于如上文所定义的氨基酸序列i)的N末端的一个丝氨酸残基。在一些情况下，该N末端丝氨酸残基可以通过涉及在丝氨酸侧链的γ氧与谷氨酸残基的多肽主链NH之间的氢键键合来形成一种标准S‑X‑X‑E封端盒。这种N末端封端可以促进构成根据本披露第一个方面的白蛋白结合多肽的三螺旋结构域的第一α螺旋的稳定化。 
因此，在一个实施方案中，这些另外的氨基酸包含在多肽的N末端的至少一个丝氨酸残基。换句话说，该氨基酸序列前面是一个或多个丝氨酸残基。在白蛋白结合多肽的另一个实施方案中，这些另外的氨基酸包含在该多肽的N末端的一个甘氨酸残基。应当理解的是，氨基酸序列i)前面可以是一个、两个、三个、四个或任何适合数目的氨基酸残基。因此，该氨基酸序列的前面可以是单个丝氨酸残基、单个甘氨酸残基或这两者的组合（如一个甘氨酸‑丝氨酸（GS）组合或一个甘氨酸‑丝氨酸‑丝氨酸（GSS）组合）。包含在N末端的另外的氨基残基的白蛋白结合多肽的实例展示于SEQ ID NO:145‑163（如SEQ ID NO:145‑148以及SEQ ID NO:162‑163）中。在又另一个实施方案中，这些另外的氨基酸残基在如由序列i)所定义的多肽的N末端包含一个谷氨酸。 
同样，可以利用C末端封端来改进构成白蛋白结合多肽的三螺旋结构域的第三α螺旋的稳定性。当存在于i)中所定义的氨基酸序列的C末端 时，一个脯氨酸残基可以至少部分地作为一个封端残基起作用。在这种情况下，在C末端的脯氨酸残基之后的一个赖氨酸残基可以促使白蛋白结合多肽的第三螺旋进一步稳定化，这是通过赖氨酸残基的ε氨基与位于多肽主链中的赖氨酸之前两个和三个残基处的氨基酸的羰基（例如当L45与P46两者都存在时，在i)中所定义的氨基酸序列的亮氨酸和丙氨酸残基的羰基）之间的氢键键合来实现的。因此，在一个实施方案中，这些另外的氨基酸包含在该多肽的C末端的一个赖氨酸残基。 
如上文所论述的，这些另外的氨基酸可能与该白蛋白结合多肽的生产有关。具体来说，当根据其中存在P46的一个实施方案的白蛋白结合多肽是通过化学肽合成来生产时，在C末端脯氨酸之后的一个或多个任选的氨基酸残基可以提供多种优点。这样的另外的氨基酸残基可以例如防止形成所不希望的物质，如在合成的二肽阶段的二酮哌嗪。这样的氨基酸残基的一个实例是甘氨酸。因此，在一个实施方案中，这些另外的氨基酸包含在该多肽的C末端的一个甘氨酸残基，如上文所考虑的，这个甘氨酸残基直接在脯氨酸残基之后，或在一个另外的赖氨酸和/或甘氨酸残基之后。可替代地，多肽生产可以受益于氨基酸序列i)的C末端脯氨酸残基（当存在时）的酰胺化。在这种情况下，C末端脯氨酸包含在羧基碳处的一个另外的胺基。在此处所述的多肽（特别是那些在C末端处以脯氨酸或已知在肽合成过程中用来外消旋的其他氨基酸终止的多肽）的一个实施方案中，以上提及的向C末端添加一个甘氨酸或使脯氨酸（当存在时）酰胺化也可以对抗C末端氨基酸残基的外消旋化的潜在问题。如果以此方式酰胺化的多肽预期通过重组手段而不是通过化学合成来生产，可以通过本领域中已知的若干方法（例如通过使用酰胺化PAM酶）来进行C末端氨基酸的酰胺化。 
在C末端包含多个另外的氨基酸残基的多种白蛋白结合多肽的多项实例展示于SEQ ID NO:145‑152，如SEQ ID NO:148‑150中。熟练的人员知晓用于完成C末端修饰的多种方法，例如通过不同类型的用于肽合成的预制基质。 
在另一个实施方案中，这些另外的氨基酸残基包含在该多肽的N末端 和/或C末端的一个半胱氨酸残基。这样的半胱氨酸残基可以直接在如i)中所定义的氨基酸序列之前和/或之后或可以在如上文所描述的任何其他另外的氨基酸残基之前和/或之后。包含在该多肽链的N末端和/或C末端的一个半胱氨酸残基的白蛋白结合多肽的实例展示于SEQ ID NO:149‑150（C末端）和SEQ ID NO:151‑152（N末端）中。通过向该多肽链中添加半胱氨酸残基，可以获得用于定点结合白蛋白结合多肽的硫基。可替代地，可以用与引入一个半胱氨酸残基类似的一种方式将一个硒半胱氨酸残基引入到该多肽链的C末端，以有助于位点特异性结合（程（Cheng）等人,《自然实验手册》（Nat Prot）1:2,2006）。 
在一个实施方案中，该白蛋白结合多肽包含不超过两个半胱氨酸残基。在另一个实施方案中，该白蛋白结合多肽包含不超过一个半胱氨酸残基。 
在另一个实施方案中，该白蛋白结合多肽的另外的氨基酸残基包含用于该多肽的纯化或检测的一个“标签”，如一个六聚组氨酰基（His6）标签，或一个“myc”（“c‑Myc”）标签或一个“FLAG”标签，这种标签可以与对该标签具有特异性的抗体相互作用和/或待用于纯化。熟练的人员知晓其他的替代方案。 
在又另一个实施方案中，根据这个方面的白蛋白结合多肽与人血清白蛋白结合。在其他实施方案中，白蛋白结合多肽与来自除了人类之外的其他种类的白蛋白（如来自小鼠、大鼠、狗以及食蟹猴的白蛋白）结合。 
上文所论述的“另外的氨基酸残基”也可以构成具有任何所希望的功能（如与第一白蛋白结合域相同的结合功能，或另外的结合功能，或治疗功能，或酶促功能，或荧光功能，或其功能的混合）的一个或多个多肽结构域。 
因此，在另一个相关方面中提供了一种融合蛋白或结合物，该融合蛋白或结合物包含： 
i)一个第一部分，该第一部分由一个如在此所述的根据第一个方面的白蛋白结合多肽组成；以及 
ii)一个第二部分，该第二部分由具有一种所希望的生物活性的一个多肽组成。 
包含一个根据本披露第一个方面的白蛋白结合多肽以及一个第二部分的一种融合蛋白或结合物与该第二部分本身的体内半衰期相比可以增加该第二部分的体外和/或体内半衰期。结果，当向受试者（如人类受试者）给予一种根据这个方面的融合蛋白或结合物时，体内暴露于该第二部分可以增加，这可以导致该第二部分的生物活性效能与在单独给予该第二部分时的体内暴露的效能相比有所改进。 
所希望的生物活性可以例如是一种治疗活性、一种结合活性或一种酶促活性。当所希望的生物活性是一种治疗活性时，显示这种活性的第二部分可以是一种治疗活性多肽。治疗活性多肽的非限制性实例是生物分子，如选自下组的分子，该组由以下各项组成：人内源酶、激素、生长因子、趋化因子、细胞因子以及淋巴因子、以及非人类生物活性蛋白，如选自下组的蛋白质，该组由以下各项组成：细菌毒素（例如假单胞菌外毒素以及葡萄球菌和链球菌超抗原）、酶（例如核糖核酸酶和β‑内酰胺酶）以及活化蛋白（例如链激酶）。可以证明对与白蛋白结合多肽融合或结合有用的治疗活性生物分子的非限制性实例选自下组，该组由以下各项组成：IL‑2、GLP‑1、BNP（Alb‑β‑钠尿肽）、IL‑1‑RA（白细胞介素‑1受体拮抗剂）、KGF（角质细胞生长因子）、生长激素（GH）、G‑CSF、CTLA‑4、肌肉生成抑制素、因子VII、因子VIII以及因子IX。 
肿瘤组织的有泄漏缺陷的（leaky defective）血管使其血管结构（内皮屏障）能透过大分子，而在健康组织的血管中仅仅小分子可以通过该内皮屏障。同样，在类风湿性关节炎患者的发炎的关节中，血‑关节屏障对白蛋白的渗透性显著增加。因此，根据这个方面的融合蛋白或结合物有可能渗透在肿瘤组织中的血管以及在发炎的关节中的血‑关节屏障。 
当该第二部分的所述所希望的生物活性是一种结合活性时，所述第二部分可以是能够与目标分子选择性相互作用的一种结合多肽。这样的结合多肽可以例如选自下组，该组由以下各项组成：抗体以及其实质上保留抗体结合活性的片段和结构域；微体、maxybody、高亲合性多聚体以及其他 小的二硫键结合的蛋白质；以及衍生自一种骨架的结合蛋白，其选自下组，该组由以下各项组成：葡萄球菌A蛋白及其结构域、其他三螺旋结构域、脂质运载蛋白、锚蛋白重复结构域、纤维素结合域、γ晶型、绿色荧光蛋白、人细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4、蛋白酶抑制剂（如库尼兹结构域）、PDZ结构域、SH3结构域、肽适体、葡萄球菌核酸酶、淀粉酶抑肽、纤连蛋白III型结构域、转铁蛋白、锌指以及芋螺毒素。 
在一些实施方案中，用于结合所述目标结合多肽的目标分子可以选自下组，该组由以下各项组成：阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease）的淀粉样β（Aβ）肽；其他疾病相关淀粉样肽；毒素，如细菌毒素和蛇毒；凝血因子，如血管性血友病因子；白细胞介素，如IL‑13；肌肉生成抑制素；促炎因子，如TNF‑α、TNF‑α受体、IL‑1、IL‑8以及IL‑23；补体因子，如C3和C5；超敏反应介质，如组胺和IgE；肿瘤相关抗原，如CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD40、CD52、CD70、cMet、HER1、HER2、HER3、HER4、CAIX（碳酸酐酶IX）、CEA、IL‑2受体、MUC1、PSMA、TAG‑72；以及其他生物分子，如G‑CSF、GM‑CSF、生长激素（GH）、胰岛素以及生长抑素。 
如熟练的人员所理解的，根据第一个方面的白蛋白结合多肽可以在融合蛋白中或作为任何其他部分的结合伴侣是有用的。因此，以上治疗活性多肽、结合多肽以及目标分子的清单不应当理解为以任何方式的限制。 
在根据本披露的融合蛋白或结合物一个实施方案中，该第二部分经由添加到该白蛋白结合多肽的N末端或C末端的一个赖氨酸或半胱氨酸残基或经由在该白蛋白结合多肽内的一个位置处（如选自X3、X6以及X14的一个位置处）的一个赖氨酸或半胱氨酸残基而与该白蛋白结合多肽结合。如果该结合位点是在该白蛋白结合多肽的氨基酸序列i)内的一个位点（如在位置X14处的一个半胱氨酸），为了实现与该第二部分结合的目的，不需要将另外的氨基酸添加到该白蛋白结合多肽中。而且如由i)所定义的在该多肽链内的一个结合位点可以保护该多肽（尤其是接近于该结合位点的多肽部分）不受交叉反应抗体的影响。在不希望受理论约束的情况下，当该结合物经由该白蛋白结合多肽与体内（即位于血清白蛋白的结合口袋中）血 清白蛋白结合时，结合在例如构成该白蛋白结合多肽的三螺旋结构域的螺旋一之内的一个位置的第二部分可能远离该白蛋白结合多肽结合到其上的血清白蛋白。另外，在该白蛋白结合多肽内的一个结合位点可以损害以别的方式衍生自该多肽的这个部分的肽部分到T细胞的呈递，这是由于例如对抗原呈递细胞的加工的作用、潜在肽在MCH II类分子的肽结合槽中的配合的损害、以及可供T细胞受体使用的肽表面的重塑（由于结合部分伸出）。因此，在该结合位点附近的结合物部分的免疫原性预期在结合之后会变得进一步降低。 
由于本披露的白蛋白结合多肽与血清白蛋白之间的高亲和力，包含这样一种白蛋白结合多肽的一种结合物或融合蛋白可以被视为与血清白蛋白的一种间接复合物。因此，根据本披露的结合物或融合蛋白为时常使用的利用具有血清白蛋白的直接结合物或融合物的方法提供了一种替代方案。这样的具有血清白蛋白的直接结合物时常是不均匀的，无论使用何种方法进行偶联。当一个特定分子经由一个赖氨酸残基的一个氨基与血清白蛋白偶联时，可以靶向血清白蛋白分子表面上的大量赖氨酸中的任何一个，这个赖氨酸提供一个随机结合位点和一种随机产物。虽然经由人血清白蛋白中的单一不成对的半胱氨酸偶联（在34位置处，彼得斯,1985,同前文献）的巯基似乎提供了一种获得直接结合物的替代方法，但是这样的方法时常产生一种不均匀的产物。在可商购的（人类）血清白蛋白中，仅20%‑60%的分子展示游离硫基，而其余部分被硫基化合物（如半胱氨酸、高半胱氨酸或谷胱甘肽）封闭。相比之下，可以用位点特异性方式来进行与根据本披露的白蛋白结合多肽的三螺旋结构域的结合。如上文所论述的，这可以通过偶联到一个或多个半胱氨酸、一个硒半胱氨酸或一个指定赖氨酸上（在合成期间受正交保护）来完成。 
根据本披露的这个方面，具有所希望的生物活性的该第二部分可以与该白蛋白结合多肽的三螺旋结构域结合或作为一种具有该第二部分的融合蛋白而生产。以下给出根据本披露的结合物的一个非限制性实例。胰高血糖素样肽1（GLP‑1）或其衍生物是一种小的多肽，这种多肽可以适合地作为具有该白蛋白结合多肽的结合物中的一个第二部分而存在。可以在如 上文所描述的多肽序列的任一位置中进行GLP‑1与该白蛋白结合多肽的结合。像这样，可以在一种非生物过程中生产该结合物，并且与GLP‑1本身的效能相比，该结合物预期展示出显著提高的效能。结合可以采用小的多肽或蛋白质，如GLP‑1，或用更大的多肽或蛋白质。根据本披露的结合物可以典型地包含一种非氨基酸间隔部分，如聚乙二醇（PEG）。 
其他多肽或蛋白质可以与处于融合蛋白形式的白蛋白结合多肽的氨基酸序列相组合。此外，这样一种融合蛋白可以在第一与第二部分之间包含一个或多个间隔氨基酸残基。 
如上文所描述的，根据第一个方面的白蛋白结合多肽结合来自若干种类（包括小鼠、大鼠、狗以及食蟹猴）的血清白蛋白。因此，根据本披露的融合蛋白或结合物可以有助于增强不仅在人类受试者而且动物模型中的第二部分的生物效应。已经生产了作为具有人血清白蛋白的直接融合物的许多内源性蛋白质，这样的蛋白质的实例包括G‑CSF、GH、干扰素、CD4、IL‑2、胰岛素、胰高血糖素、GLP‑1、抗体Fab片段以及蛋白酶抑制剂（像库尼兹结构域衍生蛋白）。然而，可以在动物模型中不完全评估这样的直接融合物。这是由于以下事实：人血清白蛋白例如在通常使用的动物模型（小鼠和大鼠）中不适当地与内源性Fc新生受体（FcRn）相互作用，并且这种相互作用是促成血清白蛋白的长循环时间的重要因素。如上文所描述的，根据本披露的结合物或融合蛋白可以在血清白蛋白存在下与白蛋白组合并且作为一种具有白蛋白的间接融合物起作用。这使得包含根据第一个方面的白蛋白结合多肽的结合物或融合蛋白在临床前模型种类中是有用的，条件是在所选择的种类中该第二部分是生物学活性的。 
在一个实施方案中，在此提供了包含由具有一种另外的所希望的生物活性的多肽组成的一个另外的部分的融合蛋白或结合物，这种另外的所希望的生物活性可以与该第二部分的所希望的生物活性相同或不同。这样的融合蛋白或结合物的一个特定实例包含如上文定义为第二部分的治疗活性多肽以及如上文定义为一个另外的部分的结合多肽。 
关于以上对与根据第一个方面的白蛋白结合多肽结合的融合蛋白或结合物的描述，应当注意的是，作出第一、第二以及另外的部分的指定是 为了清楚的原因，以便在一方面区分根据本披露的白蛋白结合多肽或多肽，而在另一方面区分展示其他功能的部分。这些指定并不旨在是指在融合蛋白或结合物的多肽链中的不同结构域的实际顺序。因此，例如，所述第一部分可以未加限制地出现在融合蛋白或结合物的N末端、中间或C末端。 
在一个相关方面，提供了进一步包含有机分子（如一种细胞毒性剂）的如在本披露中所定义的白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物。与根据第一个方面的白蛋白结合多肽融合或结合或与根据第二个方面的融合蛋白或结合物组合的细胞毒性剂的非限制性实例选自刺孢霉素、奥莉丝汀（auristatin）、多柔比星、美登醇、紫杉醇、海鞘素（ecteinascidin）、格尔德霉素（geldanamycin）、氨甲喋呤以及其衍生物以及其组合。先前已经作出用直接白蛋白结合物治疗不同的失调的尝试。这样的直接白蛋白结合物已经例如与多柔比星一起用于癌症中（克拉兹（Kratz）等人,《药物化学杂志》（J Med Chem）45:5523‑33,2002），并且与氨甲喋呤一起用于类风湿性关节炎中（温德尔（Wunder）等人，《免疫学杂志》（J Immunol）170:4793‑4801,2003）。应当理解的是，白蛋白结合多肽，其自身或作为融合蛋白或结合物中的一个部分，通过其高白蛋白结合能力提供了分析白蛋白复合物的间接手段，并且因此可以提供与以上提及的这些尝试相比的一种替代治疗方法。 
此外，以上方面涵盖了多种多肽，其中根据第一个方面的白蛋白结合多肽或如根据第二个方面的融合蛋白或结合物中所包含的白蛋白结合多肽已经具备一种标记基团，如一种选自下组的标记物，该组由以下各项组成：荧光染料和金属、发色染料、化学发光化合物以及生物发光蛋白、酶、放射性核素以及颗粒，例如用于检测多肽的目的。具体来说，本披露涵盖了由如在此所述的白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物与一种放射性核素（如一种放射性金属）的放射性螯合物组成的一种放射性标记多肽。 
在标记白蛋白结合多肽包含根据本披露第一个方面的一种白蛋白结合多肽以及一个标记的实施方案中，该标记多肽可以例如用于间接标记血清白蛋白。由于标记多肽与血清白蛋白之间的强缔合作用，该标记多肽可 以用于例如研究血管渗透性和血池（blood pool）。 
在其他实施方案中，该标记白蛋白结合多肽是作为同样包含具有所希望的生物活性的一个第二部分的融合蛋白或结合物中的一个部分而存在。该标记在一些情况下可以仅仅与该白蛋白结合多肽偶联，而在一些情况下与该白蛋白结合多肽和该结合物或融合蛋白的第二部分偶联。当参考一种标记多肽时，这应当理解为参考如在此所述的多肽的所有方面，包括包含一种白蛋白结合多肽和一个第二部分以及任选地另外的部分的融合蛋白和结合物。因此，一种标记多肽可以仅含有该白蛋白结合多肽和例如一种治疗性放射性核素，这种治疗性放射性核素可以与该白蛋白结合多肽螯合或共价偶联，或含有该白蛋白结合多肽、一种治疗性放射性核素以及具有所希望的生物活性（如治疗效果）的一个第二部分（如一个小分子）。 
在白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物经放射性标记的实施方案中，这样的放射性标记多肽可以包含一种放射性核素。大多数放射性核素具有金属性质并且多种金属典型地不能与蛋白质和肽中存在的元素形成稳定的共价键。由于这个原因，用放射性金属标记蛋白质和肽是在使用多种螯合剂（即多齿配体）的情况下进行的，这些螯合剂与金属离子形成非共价化合物，称为螯合物。在白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物的一种实施方案中，与一种放射性核素结合是通过提供一种螯合环境来实现的，通过这种螯合环境该放射性核素可以与多肽配合、螯合或复合。 
螯合剂的一个实例是聚氨基聚羧酸酯型螯合剂。这样的聚氨基聚羧酸酯螯合剂中的两类是著名的：大环和非环螯合剂。在一个实施方案中，该白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物包含由通过半胱氨酸残基的一个硫基或赖氨酸残基的一个ε胺基与白蛋白结合多肽结合的一种聚氨基聚羧酸酯螯合剂提供的螯合环境。 
对于铟、镓、钇、铋、放射性锕系元素（radioactinide）以及放射性镧系元素（radiolanthanide）的放射性同位素来说，最常使用的大环螯合剂为DOTA（1,4,7,10‑四氮杂环十二烷‑1,4,7,10‑四乙酸）的不同衍生物。在一个实施方案中，白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物的螯合环境是由DOTA或其衍生物提供的。更确切地说，例如如实例5中所述，通过使DOTA衍 生物1,4,7,10‑四氮杂环十二烷‑1,4,7‑三‑乙酸‑10‑马来酰亚胺乙基乙酰胺（马来酰亚胺单酰胺‑DOTA）与例如白蛋白结合多肽的一个硫基反应而产生由本披露所涵盖的一组螯合多肽。 
高动力学惰性（即金属从DOTA的缓慢解离速率）有利于放射性核素的稳定连接。然而，由于缔合速率缓慢，对于标记需要高温。由于这个原因，DOTA衍生物广泛用于标记短肽，如本披露的白蛋白结合多肽，这种短肽在标记反应所需的温度下孵育后展示出结合功能性。 
最常使用的非环聚氨基聚羧酸酯螯合剂是DTPA（二乙烯三胺五乙酸）的不同衍生物。因此，具有由二乙烯三胺五乙酸或其衍生物提供的螯合环境的多肽也被本披露所涵盖。 
已经发现DTPA的主链修饰的半刚性变异体（semi‑rigid variant）由于用例如的90Y标记提供了充分的稳定性。虽然非环螯合剂与大环螯合剂相比惰性更小，并且因此稳定性更低，但是其标记甚至在环境温度下也是足够快的。为了这个原因，非环螯合剂可以用于标记根据本披露的融合蛋白或结合物。用于使聚氨基聚羧酸酯螯合剂与目标蛋白和肽偶联的详细方案已经由库柏（Cooper）等人（《自然实验手册》1:314‑7,2006）以及索松伯斯基（Sosabowski）和马瑟（Mather）（《自然实验手册》1:972‑6,2006）公开。 
与一种聚氨基聚羧酸酯螯合剂偶联的根据在此所述的这些方面的白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物可以用于提供一种放射性标记多肽，这种放射性标记多肽由与螯合剂偶联的白蛋白结合多肽融合蛋白或结合物与一种放射性核素的放射螯合物组成，这种放射性核素适合用于医学显像，其选自下组，该组由以下各项组成：61Cu、64Cu、66Ga、67Ga、68Ga、 110mIn、111In、44Sc以及86Y，或这种放射性核素适合用于治疗，这种放射性核素选自下组，该组由以下各项组成：225Ac、212Bi、213Bi、67Cu、166Ho、 177Lu、212Pb、149Pm、153Sm、227Th以及90Y，其中该放射性核素与白蛋白结合多肽经由一种螯合剂而复合。 
在其实施方案中，该多肽也可以用非金属放射性同位素使用所谓的间 接标记进行放射性标记。因此，用例如18F、76Br、不同的碘同位素以及211At标记时，使用中间“连接分子”进行标记。这样的连接子分子应当含有两个功能部分，一个提供快速并且有效的放射性标记，而另一个实现与蛋白质的快速并且有效的偶联，例如与一个独特半胱氨酸（如在白蛋白结合多肽的位置X14处）的胺基或优选地硫基偶联。例如，一个马来酰亚胺基与硫基反应形成一个稳定的硫醚键。“连接分子”可以首先与放射性标记反应，并且随后与蛋白质的巯基或硒代巯基（selenothiol group）反应。 
在另一个方面，提供了编码如在此所述的白蛋白结合多肽或融合蛋白的一种多核苷酸。同样，涵盖了生产如上文所描述的白蛋白结合多肽或融合蛋白的一种方法，包括表达多核苷酸、包含这种多核苷酸的表达载体以及包含这种表达载体的宿主细胞。 
本披露的白蛋白结合多肽可以可替代地使用具有受保护的反应性侧链的氨基酸和/或氨基酸衍生物通过非生物肽合成来生产，这种非生物肽合成包括： 
使氨基酸和/或氨基酸衍生物逐步偶联，形成具有受保护的反应性侧链的根据第一个方面的一种多肽， 
从该多肽的反应性侧链中去除保护基团，并且 
使该多肽在水溶液中折叠。 
因此，使用生理氨基酸（例如甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸以及缬氨酸）和预保护的氨基酸衍生物在溶液中或在一种有机溶剂中的固体载体上顺序地构建多肽序列。在固体载体上的肽合成的一个特定实例描述于实例5中。当构建好一个完整的多肽序列时，去除保护基团并且允许该多肽在水溶液中折叠。根据本披露的每种多肽在不添加因子并且因此自发地折叠的情况下可逆地折叠成一种三螺旋束结构域。 
可以通过一种方法来生产根据第二个方面的结合物，这种方法包括根据以上所描述的任何方法（如通过非生物肽合成）生产一种白蛋白结合多肽，并且使所生产的白蛋白结合多肽与如结合第二个方面所定义的一个第二和/或另外的部分相结合。 
而且，在融合蛋白或结合物的一个实施方案中，提供了如在此所定义的融合蛋白或结合物用于治疗，例如用作一种药剂。这样一种融合蛋白或结合物可以展示比本身具有所希望的生物活性的多肽的体内半衰期更长的体内半衰期。而且，与向哺乳动物给予本身具有所希望的生物活性的多肽后引出的免疫应答相比，向哺乳动物（如人类）给予该融合蛋白或结合物后可能不引出免疫应答或引出较低的免疫应答。可替代地讲，这提供了用于降低具有所希望的生物活性的多肽的免疫原性的一种方法，这种方法是通过使这样的多肽与根据在此所披露的方面的白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物融合或结合。另外，这可能增强第二部分的生物活性。 
在另一个实施方案中，提供了根据本披露的融合蛋白或结合物，用于诊断，例如用作一种诊断剂。 
同样，本披露涉及使用上述白蛋白结合多肽的不同方面，以及用于治疗、诊断以及检测的不同方法，其中该多肽由于其结合特征和其他特征是有用的。当在以下对这些用途和方法的说明中提及“白蛋白结合多肽”时，这一术语旨在涵盖单独的白蛋白结合多肽，以及所有基于上文所描述的这种多肽的那些分子，这些分子例如与作为融合蛋白或结合物中的一个部分的白蛋白结合多肽结合，和/或与一种标记物、一种螯合剂、一种治疗剂和/或诊断剂结合，和/或具备另外的氨基酸残基作为一个标签或用于其他目的。如上文所解释的，这样的融合蛋白、衍生物等等形成本披露的一部分。 
另一组方面涉及提供多种新的手段，用于通过使一种难溶的化合物与白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物结合使其在水溶液中的溶解度增加。难溶的化合物与白蛋白结合多肽（单独地或作为融合蛋白或结合物中的一个部分而结合）的作为结果产生的复合物能够与白蛋白体内或体外缔合，这种缔合使其在水溶液中的溶解度增加。因此，在这个另外的方面的一个实施方案中，提供了一种组合物，这种组合物包含 
一种化合物，这种化合物本身具有不超过100μg/ml的在水中的溶解度；与以下物质偶联 
如在此所述的白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物，其中这种化合物 与这种白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物是共价偶联的。 
在一个实施方案中，该化合物本身具有不超过10μg/ml的溶解度。在又另一个实施方案中，所述溶解度不超过1μg/ml。 
在一些实施方案中，该化合物可以是一种药物活性的化合物，例如一种细胞毒性剂。细胞毒性剂的非限制性实例为选自以下的那些细胞毒性剂：刺孢霉素、奥莉丝汀、多柔比星、美登醇、紫杉醇、海鞘素、格尔德霉素以及其衍生物以及其组合。可替代地，细胞毒性剂可以为通过有机合成制成而不是衍生自天然存在的化合物的一种合成化学毒素。 
除了难溶的化合物以及白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物之外，根据本披露的这个方面的组合物在一些实施方案中还可以包含对于临床相关目标具有亲和力的一种结合多肽。这种结合多肽适当地不同于白蛋白结合多肽，并且可以与发明的组合物的其他组分非共价或共价偶联。作为非限制性实例，对于临床相关目标具有亲和力的结合多肽可以选自下组，该组由以下各项组成：抗体以及其实质上保留抗体结合活性的片段和结构域；微体、maxybodies、高亲合性多聚体以及其他小的二硫键结合的蛋白质；以及衍生自选自下组的一种骨架的结合蛋白，该组由以下各项组成：葡萄球菌A蛋白以及其结构域、其他三螺旋结构域、脂质运载蛋白、锚蛋白重复结构域、纤维素结合域、γ晶型、绿色荧光蛋白、人细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4、蛋白酶抑制剂（如库尼兹结构域）、PDZ结构域、SH3结构域、肽适体、葡萄球菌核酸酶、淀粉酶抑肽、纤连蛋白III型结构域、转铁蛋白、锌指以及芋螺毒素。 
根据本披露以上方面的组合物具有通过提供于白蛋白结合多肽（单独地或以存在于融合蛋白或结合物中的形式）的组合物中而与白蛋白体内或体外缔合的能力。在某些情况下，形成组合物与一个活有机体外部的白蛋白的一种复合物（即将外源性白蛋白添加到组合物中）可能是有益的。可以将这样的组合物冻干，从而提供适合于在环境温度下储存的一种制剂。因此，本披露还提供了如上文所定义的一种组合物，这种组合物进一步包含白蛋白，如人血清白蛋白。 
在该化合物为一种治疗活性化合物的情况下，本披露还提供了根据以上方面的组合物以便用作一种药剂，即，用于治疗。适当地，提供了一种白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物并且任选地白蛋白不会有害地影响活性化合物的治疗效果，因此发明的组合物在指定化合物本身的那些治疗性或预防性背景下将是有用的。 
在另一个实施方案中，提供了根据以上方面的组合物，以便用作一种诊断剂，即，用于诊断。 
本披露的一个相关方面提供了制备如上文刚刚描述的组合物的一种方法。该方法包括： 
提供一种化合物，这种化合物本身具有不超过100μg/ml的在水中的溶解度；以及 
使该化合物与根据如在此所述的方面的白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物共价偶联，从而形成包含该化合物与白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物的共价复合物的一种组合物。 
在白蛋白包括于该组合物中的本披露的实施方案中，该方法可以包括使该化合物与白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物的所述复合物与白蛋白混合的另外的步骤，从而形成一种组合物，这种组合物包含i)化合物与白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物的共价复合物与ii)白蛋白的非共价复合物。这种非共价复合物中的两种组分的相对比例可以例如是1:1，使得难溶的化合物与白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物的一个复合物单元与一个白蛋白分子缔合。在一个实施方案中，该方法另外包括将该非共价复合物冻干，从而获得一种冻干组合物。 
在另一个紧密相关的方面，本披露提供了增加一化合物的水溶性的方法，该方法包括： 
提供一种化合物，这种化合物本身具有不超过100μg/ml的在水中的溶解度； 
使该化合物与根据如在此所述的方面的白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物共价偶联，从而形成化合物与白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物 的一种共价复合物；以及 
将化合物与白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物的所述复合物与白蛋白在促进白蛋白结合多肽与白蛋白非共价缔合的条件下混合； 
从而所述复合物中的该化合物在水中的溶解度比这种化合物本身在水中的溶解度更大。 
在有关一种难溶的化合物的溶解度的这些方法方面中，不同组分的任选特征如结合刚刚在之前的组合物方面所描述。 
虽然已经参考不同的示例性实施方案描述了本发明，本领域的普通技术人员应当理解的是，在不脱离本发明范围的情况下可以作出不同的改变并且多种要素可以由多种等效物代替。另外，在不脱离本发明的基本范围的情况下，可以做出许多修改以使特定的情况或分子适应本发明的传授内容。因此，预期本发明不受限于为进行本发明而考虑的任何具体实施方案，而是本发明将包括落入所附权利要求书范围内的所有实施方案。 
附图
图1是以下实例的氨基酸序列表：本披露的多种白蛋白结合多肽（SEQID NO:1‑152、SEQ ID NO:155‑203），由一个N末端甘氨酸残基扩展的来自链球菌菌株G148的蛋白G的GA3结构域（SEQ ID NO:153），以及先前由约翰松等人所描述的衍生自G148‑GA3的一种白蛋白结合多肽（同前文献，SEQ ID NO:154）。 
图2显示了在Biacore仪器中进行的结合分析的结果，用于研究白蛋白结合多肽PEP07912（SEQ ID NO:157）与人血清白蛋白的结合。在具有955个RU的固定人血清白蛋白的一个表面上注射三种不同浓度的纯化蛋白（40nM，粗灰色线；10nM，黑色线；以及2.5nM，灰色线）。 
图3A‑C显示了通过ELISA进行结合分析的结果，用于研究白蛋白结合多肽PEP07913（SEQ ID NO:153）、PEP06923（SEQ ID NO:154）、PEP07271（SEQ ID NO:155）、PEP07912（SEQ ID NO:157）、PEP07554（SEQ ID NO:156）、PEP07914（SEQ ID NO:158）、PEP07968（DOTA结合的PEP07911，SEQ ID NO:159）以及PEP07844（SEQ ID NO:161）与存在于126位个体的正常人血清中的IgG分子的结合，其中A)显示了平均OD值，B)显示了阴性血清（定义为OD<0.15）的百分比，并且C)显示了阳性血清（定义为OD>1.0）的百分比。 
图4A‑B是显示了对纯化的以化学方式生产的白蛋白结合多肽PEP07834（SEQ ID NO:160）的分析的色谱图，其中A)显示了220nm处的吸收信号，已扣除空白，并且B)显示了280nm处的吸收信号，已扣除空白。在两种波长处均出现两个峰。 
图5A‑B是显示对在图4A)和B)中所鉴定的两个峰的质谱分析的光谱图。A)是第一峰，即PEP07834（SEQ ID NO:160）的单体的光谱图，而B)是PEP07834的二聚体的光谱图。 
图6A‑C是显示在CD3+CD4+T细胞增殖分析中的白蛋白结合多肽PEP07913（SEQ ID NO:153）、PEP07912（SEQ ID NO:157）、PEP07914（SEQID NO:158）以及PEP07968（DOTA结合的PEP07911，SEQ ID NO:159）的免疫原性评定的图。A)显示了在一个具有52位白种人供体的同期组群中与重组人白蛋白相比对白蛋白结合多肽作出反应的个体的数目。B)显示了与含有重组人白蛋白的阴性对照相比的PEP07913、PEP07912、PEP07914以及PEP07968的平均刺激指数（SI）。C)显示了与缓冲剂对照相比的对研究中的所有蛋白质作出反应的个体的数目。 
图7A‑C显示了在Biacore仪器中进行的结合分析的结果，用于研究白蛋白结合多肽A)PEP07986（SEQ ID NO:163）、B)PEP08296（DOTA结合的PEP08185，SEQ ID NO:148）以及C)PEP06923（SEQ ID NO:154）与来自不同种类的白蛋白的结合。所示的传感图相应于在固定有来自以下种类的白蛋白的表面上以40nM的浓度注射的蛋白质：人类（1130RU），细灰色线；食蟹猴（1046RU），粗灰色线；大鼠（831RU），粗浅灰色线；狗（1053RU），细黑色线；以及小鼠（858RU），粗黑色线。 
图8显示了ZX‑PP013（空心圆）、ZY‑PP013（空心正方形）以及 Zneg‑PP013（实心三角形）在五倍摩尔过量的HSA存在下对细胞因子诱导的TF‑1细胞增殖的抑制作用。 
图9显示了通过PEP07986（SEQ ID NO:163）的Biacore分析获得的最大结合反应，PEP07986在2mg/ml的浓度下按指示储存在4°C、25°C或40°C下持续一周、两周、一个月以及三个月，以10nM的浓度注射于固定的HSA（704RU）上。显示了时间为0时的未处理样品作为参考。 
图10显示了在Biacore仪器中进行的结合分析的结果，用于研究白蛋白结合多肽PEP08296（DOTA结合的PEP08185，SEQ ID NO:148）在热处理之前和之后与人血清白蛋白的结合。在具有724RU的固定人血清白蛋白的一个表面上注射两种浓度的PEP08296（0.8nM，灰色线；4nM，黑色线）。实线表示热处理之前而阴影线表示在90°C下热处理10分钟之后。 
图11A‑B显示了PEP08296（DOTA结合的PEP08185，SEQ ID NO:148）在热处理之前和在90°C下热处理12min之后的两种CD光谱的叠加。A)在PBS（pH 7.2）中孵育样品。B)在PBS（pH 4.0）中孵育样品。 
图12显示了68Ga‑PEP08296在一个健康大鼠中的全身分布的最大强度投影（MIP）图像，在静脉内注射（尾静脉）后立即采集数据，持续1.5h后求和。容易地描绘出在主要血管（例如颈静脉（长箭头）和股动脉（短箭头））、心脏（H）、肝脏（L）、脾脏（S）、肾脏（K）以及膀胱（B）中的循环放射性。 
图13显示了以42mg/ml的浓度注射的PEP07986（SEQ ID NO:163）的凝胶过滤色谱图，黑色实线。包括以5mg/ml的浓度注射的卵白蛋白（Mw43kDa）的色谱图用于比较，灰色虚线，证实了PEP07986的峰不是一种聚集体，将预期聚集体在与卵白蛋白相比更早的一个时间点洗脱的空隙体积中。 
现在，将进一步通过对据此所进行的实验的非限制性说明来展示本发明。除非另有规定，自始至终使用了常规的化学和分子生物学方法。 
实例
实例1：
白蛋白结合多肽的克隆、表达、纯化以及表征
在这个实例中，将以下十种不同的白蛋白结合多肽克隆、纯化以及特征化：PEP07913（SEQ ID NO:153）、PEP07912（SEQ ID NO:156）、PEP07914（SEQ ID NO:158）、PEP07968（DOTA结合的PEP07911，SEQ ID NO:159）、PEP06923（SEQ ID NO:154）、PEP07271（SEQ ID NO:155）、PEP07554（SEQID NO:156）、PEP07844（SEQ ID NO:161）、PEP07986（SEQ ID NO:163）以及PEP08296（DOTA结合的PEP08185，SEQ ID NO:148），其氨基酸序列在图1和所附的序列表中列出。 
材料和方法 
白蛋白结合多肽变异体的克隆 
用适当的寡核苷酸使用定点突变诱变在G148‑GA3中产生突变，从而获得所希望的白蛋白结合多肽变异体。用引物通过PCR扩增基因片段，在白蛋白结合多肽变异体之前添加特异性核酸内切酶位点以及一个N末端MGSS序列。将这些片段用NdeI和NotI切割、纯化，然后连接到受相同的酶的限制的一种克隆载体上，该克隆载体为质粒pAY02556（含有来自pBR322的复制起点、卡那霉素抗性基因以及T7启动子，用于表达感兴趣的基因））。将连接体转化到多个电感受态的大肠杆菌TOP10细胞中。将转化的细胞涂布在补充有50μg/ml卡那霉素的TBAB板（30g/l胰蛋白示血琼脂基质）上，随后在37°C下孵育过夜。根据制造商的方案进行使用，使用PCR筛选集落，并且使用生物素化寡核苷酸和    Terminatorv3.1循环测序试剂盒（应用生物系统（Applied Biosystems））对扩增片段进行测序。使用Magnatrix 8000（NorDiag AB）通过与包被有磁性链霉亲和素的珠粒结合来纯化测序反应物，并且在ABI3100基因分析仪 （PE应用生物系统（PE Applied Biosystems））上分析。将所有白蛋白结合多肽变异体亚克隆为单体，并且由表达载体编码的多种结构为MGSS‑[PP###]，其中PP###相应于构成白蛋白结合多肽序列的氨基酸残基。 
另外，用多引物通过PCR将G148‑GA3、PP007（SEQ ID NO:7）、PP013（SEQ ID NO:13）以及PP037（SEQ ID NO:37）的基因片段扩增，在构成白蛋白结合多肽序列的氨基酸残基之前添加特异性核酸内切酶位点以及一个六聚组氨酸（hexahistidin）序列、一个TEV蛋白酶位点以及一个甘氨酸残基。多肽PEP07913（SEQ ID NO:153）、PEP07912（SEQ ID NO:157）、PEP07914（SEQ ID NO:158）以及PEP07968（SEQ ID NO:159）相应于添加了甘氨酸残基的白蛋白结合多肽G148‑GA3、PP007（SEQ ID NO:7）、PP013（SEQ ID NO:13）以及PP037（SEQ ID NO:37）。将这些片段用XbaI和NotI切割、纯化，然后与受相同的酶的限制的一种克隆载体连接，该克隆载体为质体pAY02512（含有来自pBR322的复制起点、卡那霉素抗性基因以及T7启动子，用于表达感兴趣的基因。克隆位点的前面是编码一种含有一个六聚组氨酸标签的肽的序列，随后为TEV蛋白酶的切割位点），其受相同的酶的限制。如上文所描述进行连接、转化以及序列测定。将四个白蛋白结合多肽变异体G148‑GA3、PP007、PP013以及PP037亚克隆为单体，并且由表达载体编码的构建体为MGSSHHHHHHLQSSGVDLGTENLYFQG‑[PP###]。 
通过使用寡核苷酸的定点诱变将编码MGSSHHHHHHLQSSGVDLGTENLYFQG‑[PP013]的表达载体进一步修饰，导致在构成白蛋白结合多肽序列的氨基酸残基之前插入一个丝氨酸残基，从而获得构建体MGSSHHHHHHLQSSGVDLGTENLYFQGS‑[PP013]。将这个构建体通过如下方式进一步修饰：1)定点诱变以用一个半胱氨酸残基替换位置14（PP013内）处的丝氨酸残基，产生MGS SHHHHHHLQS SGVDLGTENLYFQGS‑[PP049]，以及2)在C末端添加一个甘氨酸残基，产生MGSSHHHHHHLQSSGVDLGTENLYFQGS‑[PP049]‑G。通过使用引物的 PCR扩增完成在C末端添加甘氨酸，这些引物包括编码甘氨酸残基和多个特异性核酸内切酶位点的核苷酸。将该片段用XbaI和NotI切割、纯化，然后与受相同的酶的限制的一种克隆载体连接，该克隆载体为质体pAY02641（含有来自pBR322的复制起点、卡那霉素抗性基因以及T7启动子，用于表达感兴趣的基因。如上文所描述进行连接、转化以及序列测定。 
蛋白表达 
在大肠杆菌BL21（DE3）中表达白蛋白结合多肽变异体，这种大肠杆菌具有一个N末端MGSS延伸或一个N末端His6标签，随后为一个TEV蛋白酶识别位点和一个甘氨酸残基。使用每个白蛋白结合多肽变异体的一个集落在4ml TSB+YE介质中接种，TSB+YE介质补充有达到浓度为50μg/ml的卡那霉素。使培养物在37°C下生长大约5小时。在多个并联的生物反应器（格里塔系统（Greta system），Belach Bioteknik AB），使用3ml的每种培养物，接种在800ml的补充有达到浓度为50μg/ml的卡那霉素的TSB+YE中。在37°C下进行培养，具有每分钟800ml的通气以及以保持溶解氧含量水平大于30%的搅拌曲线（agitation profile），直到2个达到OD600，随后添加IPTG，达到最终浓度为0.5mM。培养持续五小时，其后将培养物冷却到10°C，停止通气并且使搅拌速度降低到300rpm。通过离心（15600×g，4°C，20分钟）收获细胞沉淀物并且在‑20°C下储存直到进行纯化。 
具有一个His6‑tag和一个TEV‑蛋白酶位点的白蛋白结合多肽变异体的纯化 
将含有带可溶性六聚组氨酸标签的多肽PEP07913（SEQ ID NO:153）、PEP07912（SEQ ID NO:156）、PEP07914（SEQ ID NO:158）、PEP07968（SEQID NO:159）、PEP07986（SEQ ID NO:163）以及PEP08185（SEQ ID NO:148）的冷冻细胞沉淀在添加1000U（1.01654.001，默克公司（Merck））的情况下悬浮于35ml结合缓冲液（20mM磷酸钠，0.5M NaCl， 20mM咪唑，pH 7.4）中，并且通过超声作用进行破碎。对于每种多肽，通过离心（1h，37000×g，4°C）使超声处理的悬浮液变澄清，并且将上清液加载到His GraviTrapTM柱（11‑0033‑99，通用电气医疗集团）上。将该柱子用10ml洗涤缓冲液（20mM磷酸钠，0.5M NaCl，60mM咪唑，pH 7.4）洗涤，然后用3ml洗脱缓冲液（20mM磷酸钠，0.5M NaCl，0.5M咪唑，pH 7.4）洗脱多肽。使用PD‑10脱盐柱（17‑0851‑01，通用电气医疗集团），将缓冲液换成一种切割缓冲液（50mM Tris‑HCl，150mMNaCl，pH 8）。通过测量280nm下的吸光度测定多肽产物的量，然后添加DTT，达到最终浓度为5mM。将带His6标签的TEV蛋白酶以相对于多肽产物1:10的质量比添加到切割缓冲液中。在4°C下，在缓慢混合下进行切割过夜。将咪唑添加到切割混合物中，直到浓度为20mM，然后将混合物加载到His GraviTrapTM柱（11‑0033‑99，通用电气医疗集团）上，以便去除切割的His6标签、带His6标签的TEV蛋白酶以及带His6标签的未切割产物。 
对于每种变异体，使流过的含有白蛋白结合多肽变异体的物质如下通过反相色谱（RPC）进一步纯化。将流过的部分加载到事先用RPCA缓冲液（0.1%TFA水溶液）平衡的1ml Resource 15RPC柱（通用电气医疗集团）上。在用10个柱体积（CV）RPC A缓冲液洗涤柱子后，将结合的多肽用10个CV以内的RPC B缓冲液（0.1%TFA乙腈溶液）以0%‑50%的线性梯度进行洗脱。流速为2ml/min并且监测在280nm下的吸光度。将含有白蛋白结合多肽变异体的部分通过SDS‑PAGE分析来鉴定并且汇集。 
将RPC纯化白蛋白结合多肽变异体通过在填充在一个XK16柱（通用电气医疗集团）中的120ml Superdex 75（通用电气医疗集团）上凝胶过滤而进一步纯化。运行缓冲液为1xPBS，并且流速为2ml/min。将含有纯白蛋白结合多肽变异体的部分汇集并且浓缩到大约1.3mg/ml。最后，根据制造商的建议，通过使用1ml的AffinityPak Detoxi‑Gel内毒素去除凝胶柱（Pierce，产品号20344）将浓缩物从痕量的剩余内毒素中纯化。 
使白蛋白结合多肽变异体PEP07911和PEP08185与Mal‑DOTA结合，然后如下进行RPC纯化步骤。使用一次性PD‑10脱盐柱（通用电气医疗 集团）将来自IMAC‑FT纯化步骤的流过的部分的缓冲液换成0.2M NaAc（pH 5.5）。以5倍摩尔过量添加马来酰亚胺基‑单‑酰胺‑DOTA（大环，目录号：B‑272），并且在30°C下在连续振荡下孵育60分钟。产生的多肽对应地表示PEP07968和PEP08296。 
不含His6标签的白蛋白结合多肽变异体的纯化 
将含有可溶性白蛋白结合多肽变异体PEP06923（SEQ ID NO:154）、PEP07271（SEQ ID NO:155）、PEP07554（SEQ ID NO:156）以及PEP07844（SEQ ID NO:161）的冷冻细胞沉淀悬浮在20mM Tris‑HCl（pH 8）中，并且用超声作用破碎。对于每种多肽变异体，通过离心（30min，32000×g，4°C）将超声处理的悬浮液变澄清，并且将上清液加载到HSA‑Sepharose柱（通用电气医疗集团）上。在用TST缓冲液（25mM Tris‑HCl，1mMEDTA，200mM NaCl，0.05%吐温（Tween）20，pH 8.0）之后，用5mM NH4Ac（pH 5.5）洗涤，将结合的白蛋白结合多肽变异体用0.5M HAc（pH 3.2）洗脱。 
将白蛋白结合多肽变异体如下通过反相色谱（RPC）进一步纯化。对于每种变异体，将来自HSA亲和力纯化步骤的洗脱物加载到事先用RPC A缓冲液（0.1%TFA水溶液）平衡的1ml Resource 15RPC柱（通用电气医疗集团）上。在用10个CV的RPC A缓冲液洗涤柱子后，将结合的多肽用10个CV以内的RPC B缓冲液（0.1%TFA乙腈溶液）以0%‑50%的线性梯度进行洗脱。流速为2ml/min并且监测在280nm下的吸光度。将含有纯白蛋白结合多肽变异体的部分通过SDS‑PAGE分析鉴定并且汇集。最后，使用一次性PD‑10脱盐柱（通用电气医疗集团）将缓冲液换成1xPBS（2.68mM KCl，137mM NaCl，1.47mM KH2PO4，8.1mM Na2HPO4，pH7.4）。 
纯化的白蛋白结合多肽变异体的表征 
通过使用一台ND‑1000分光光度计测量在280nm下的吸 光度来评估浓度。用SDS‑PAGE和LC‑MS进一步分析这些蛋白质。 
为了SDS‑PAGE分析，将大约10μg的每种白蛋白结合多肽变异体与NuPAGE LDS样品缓冲液（茵维特罗根（Invitrogen））混合，在70°C下孵育15min，并且加载到NuPAGE 4%‑12%Bis‑Tris凝胶（茵维特罗根）上。使这些凝胶在一个XCell II SureLock电泳槽（诺维克斯（Novex））中用NuPAGE MES SDS运行缓冲液（茵维特罗根）进行电泳，使用Sharp预染色标准品（茵维特罗根）作为分子量标记并且使用PhastGel BlueR（通用电气医疗集团）进行染色。 
为了鉴定白蛋白结合多肽变异体的一致性，使用装备有API‑ESI和单个四组分质量分析仪的一个Agilent 1100LC/MSD系统进行LC/MS分析。将大约10μg的每种纯化白蛋白结合多肽变异体加载到Zorbax 300SB‑C8窄孔柱（2.1×150mm，3.5μm，安捷伦技术公司（Agilent Technologies））上，流速为0.5ml/min。在0.5ml/min下使用溶液B以10%‑70%的线性梯度将多肽洗脱15min。在30°C下进行分离。监测离子信号以及280nm和220nm下的吸光度。通过MS确定纯化的白蛋白结合多肽变异体的分子量。 
结果 
如由SDS‑PAGE分析评估的，白蛋白结合多肽变异体的表达水平是每克细胞沉淀10‑30mg产物。 
对于所有变异体，如通过SDS‑PAGE分析所测定，纯度超过95%，并且LC/MS分析验证了正确的分子量。在纯化之后，针对十种白蛋白结合多肽变异体中每一个获得了1mg与8mg之间的纯多肽。 
实例2：
白蛋白结合多肽的亲和力测定
在这个实例中，使用Biacore仪器表征在实例1中合成或表达并且纯 化的PEP06923（SEQ ID NO:154）、PEP07271（SEQ ID NO:155）、PEP07844（SEQ ID NO:161）、PEP07912（SEQ ID NO:157）、PEP07913（SEQ IDNO:153）、PEP07914（SEQ ID NO:158）以及PEP07968（DOTA结合的PEP07911，SEQ ID NO:159）对人血清白蛋白（HSA）的亲和力。PEP07913相应于添加了一个N末端甘氨酸残基的G148‑GA3的氨基酸序列，而PEP07271、PEP07844、PEP07912、PEP07914以及PEP07968相应于添加有不同的N末端氨基酸的白蛋白结合多肽PP001（SEQ ID NO:1）、PP043（SEQ ID NO:43）、PP007（SEQ ID NO:7）、PP013（SEQ ID NO:13）以及PP037（SEQ ID NO:37）。 
材料和方法 
根据制造商的建议，用HSA（诺维信（Novozymes））在Biacore2000仪器（通用电气医疗集团）上进行生物传感器分析，HSA是通过胺偶联到CM‑5芯片（研究级；通用电气医疗集团）表面的羧化右旋糖酐层上而固定。将芯片的表面1活化和去活化，并且用作多次注射之间的一个参比池（空白表面），而表面2包含被固定到731个共振单位（RU）上的HSA，并且表面4包含被固定到955个RU上的HSA。将纯化白蛋白结合多肽变异体在运行缓冲液HBS‑EP（通用电气医疗集团）中稀释到2.5nM、10nM以及40nM，并且以50μl/min的恒定流速注射5分钟，随后注射HBS‑EP 60分钟。用25μl HCl（10mM）注射一次使这些表面再生。在两组中进行亲和力测量；在第一组中，注射HBS‑EP、PEP06923、PEP07271、PEP07912、PEP07913、PEP07914以及PEP07968（芯片表面2），而在第二组中，注射HBS‑EP、PEP06923、PEP07844、PEP07912以及PEP07914（芯片表面4）。在每组中注射PEP06923两次作为对照。用BIA评估软件（通用电气医疗集团）分析结果。将空白表面的曲线从配体表面的曲线上扣除。 
结果 
Biacore 2000仪器具有技术限制，妨碍很高亲和力的测量。因此，Biacore研究的目的不是测定白蛋白结合多肽变异体对HAS的亲和力的精确动力学参数。然而，这些结果提供了对这些多肽对于白蛋白的相对亲和力的定量估计。在扣除参考表面和缓冲液注射之后，使用BIA评估软件在对质量转移进行校正并且以RUmax组作为局部参数的情况下，将多条曲线与1:1（兰米尔）结合模型拟合。在图2中显示了多条曲线。评估相对KD、ka（kon）以及kd（koff）值并且呈现于下表中。 
表1： 
白蛋白结合多肽对HSA的动力学参数（ka、kd以及KD），第1组 
  ka（Ms‑1） kd（s‑1） KD（M） PEP07913 5.7x1059.3x10‑41.6x10‑9PEP06923(1) 2.9x1072.9x10‑59.9x10‑13PEP06923(2) 2.6x1072.8x10‑51.1x10‑12PEP07271 3.9x1062.9x10‑57.5x10‑12PEP07912 4.6x1062.8x10‑56.2x10‑12PEP07914 3.5x1062.5x10‑57.2x10‑12PEP07968 3.0x1062.7x10‑59.0x10‑12
表2： 
白蛋白结合多肽对HSA的动力学参数（ka、kd以及KD），第2组 
  ka（Ms‑1） kd（s‑1） KD（M） PEP06923(1) 2.0x1072.6x10‑51.3x10‑12PEP06923(2) 2.1x1072.5x10‑51.2x10‑12PEP07912 5.4x1062.8x10‑55.2x10‑12PEP07914 3.8x1062.6x10‑56.9x10‑12PEP07844 5.4x1062.3x10‑54.4x10‑12
如在表1和表2中所示，PEP07271（SEQ ID NO:155）、PEP07844（SEQID NO:161）、PEP07912（SEQ ID NO:157）、PEP07914（SEQ ID NO:158）以及PEP07968（DOTA结合的PEP07911，SEQ ID NO:159）全部似乎都对HSA具有大致相同的亲和力，大大超过亲本G148‑GA3（PEP07913；SEQ ID NO:153）的亲和力。这些多肽的HSA亲和力与PEP06923（SEQ ID NO:154）相比稍微更低，尽管解离率相似。 
实例3：
白蛋白结合多肽的熔融温度（Tm）的测定
在这个实例中，通过CD分析来分析如在实例1中所述经表达和纯化的白蛋白结合多肽变异体PEP07913（SEQ ID NO:153）、PEP06923（SEQ IDNO:154）、PEP07271（SEQ ID NO:155）、PEP07554（SEQ ID NO:156）、PEP07912（SEQ ID NO:157）、PEP07914（SEQ ID NO:158）、PEP07968（DOTA结合的PEP07911，SEQ ID NO:159）、PEP07844（SEQ ID NO:161）以及PEP07986（SEQ ID NO:163），以及如在实例5中所述生产的白蛋白多肽变异体PEP07975（DOTA结合的PEP07834，SEQ ID NO:160）。PEP07913相应于具有一个N末端甘氨酸残基的G148‑GA3的序列，PEP06923为先前由约翰松等人（同前文献）中所描述的一种工程化高亲和力衍生物，而PEP07271、PEP07554、PEP07912、PEP07914、PEP07968、PEP07844以及PEP07975是根据本披露添加有不同N末端氨基酸的白蛋白结合多肽PP001（SEQ ID NO:1）、PP007（SEQ ID NO:7）、PP013（SEQ IDNO:13）、PP037（SEQ ID NO:37）以及PP043（SEQ ID NO:43）的实例。 
材料和方法 
将纯化白蛋白结合多肽变异体在1xPBS中稀释，直到最终浓度在0.4mg/ml与0.5mg/ml之间。在Jasco J‑810分光偏振计上在光学路径长度为1mm的一个小池中进行圆二色谱（CD）分析。在变温测量中，在221nm下从20°C到90°C测量吸光度，其中温度斜率为5°C/min。 
结果 
通过确定CD对温度曲线图中转变的中点来计算不同白蛋白结合多肽 变异体的熔融温度（Tm）。结果汇总于下表3中。 
表3.测试的白蛋白结合多肽变异体的Tm测定值 

1)肽与马来酰亚胺‑DOTA在半胱氨酸处结合 
2)肽在C末端处酰胺化 
3)亮氨酸（带下划线的）是如本披露第一个方面中所定义的白蛋白结合多肽的氨基酸序列的位置1处的残基 
多肽PEP07968与PEP07912相同，除了前者在与马来酰亚胺DOTA结合的位置14处具有一个半胱氨酸残基之外，而后者具有一个丝氨酸残基。因此，DOTA修饰不应影响熔融温度。同样使用C14使PEP07975与DOTA结合，并且与PEP07968相同，除了C末端酰胺（因实例5中的肽合成而产生）以及具有一个N末端丙氨酸而不是一个甘氨酸之外。此外，将PEP07912与PEP07554比较显示一个N末端丝氨酸与同一位置处的一个甘氨酸相比提供了更高的熔融温度（Tm相差5°C）。因此，根据本披露的所有白蛋白结合多肽变异体都显示Tm超过55°C，除了PEP07912和DOTA结合的变异体之外。考虑到N末端部分的重要性，所有测试的白蛋白结合多肽都优于约翰松等人的现有技术衍生物，即PEP06923。 
实例4：
血清反应分析
通过ELISA分析能够与在此所披露的一组白蛋白结合多肽结合的含有IgG的人血清的百分比。一共筛选了相应于127例个体的149个血清样品。 
材料和方法 
用在涂布缓冲液（西格玛（Sigma），目录号：3041）中稀释到8μg/ml的（诺维信）以每孔50μl涂布ELISA板（96孔，半边板（科斯塔（Costar），目录号：3690））。在4°C下将这些板涂布过夜，持续三天。在分析当天，将各板用自来水洗涤两次，并且用含有0.05%酪蛋白（PBSC）的100μl的磷酸盐缓冲盐水（PBS）封闭2小时。清空各板并且根据预制板布局添加在PBSC中稀释到2μg/ml的每孔50μl的白蛋白结合多肽PEP07913（SEQ ID NO:153）、PEP06923（SEQ ID NO:154）、PEP07271（SEQID NO:155）、PEP07912（SEQ ID NO:157）、PEP07554（SEQ ID NO:156）、PEP07914（SEQ ID NO:158）、PEP07968（DOTA结合的PEP07911，SEQ IDNO:159）以及PEP07844（SEQ ID NO:161）。在室温（RT）下孵育两小时后，使用自动ELISA洗板机将这些板在PBSC中洗涤四次。通过将24μl血清添加到1174μl PBSC中将来自129例个体的149个血清样品在PBSC中稀释50倍。根据预制板布局每孔添加50μl稀释血清。每个血清样品经测试为单峰。在每个板上以及对于每种白蛋白结合多肽都包括有阳性以及阴性对照。添加白蛋白结合抗体（50μl，0.5μl/ml免疫球蛋白溶液，由用PEP06923免疫的灵长类动物的血清内部制备）作为阳性对照，并且使用50μl PBSC作为阴性对照。在RT下孵育这些板一小时，并且随后使用自动ELISA洗板机在PBSC中洗涤四次。用每孔50μl的在PBSC中稀释10000倍的抗人IgG（南方生物技术公司（Southern Biotech），目录号2040‑05）检测结合的IgG。在使用自动ELISA洗板机在PBSC中洗涤四次后，每孔添加50μl的基质（Pierce，目录号：34021）。在10‑15分钟之后，通过向 每孔中添加50μl H2SO4使反应停止，然后使用一个多孔板读取器（Victor3，珀金埃尔默（Perkin Elmer））测量吸光度。 
结果 
在所筛选的用于使IgG与白蛋白结合多肽结合的149份血清中，23份对所有八种多肽是阴性的（OD值<0.1），即显示IgG不与这些多肽结合。用对于一种或多种白蛋白结合多肽呈阳性的126份血清进行分析。计算平均吸光度（图3A）以及具有OD值<0.15（图3B）或>1.0（图3C）的血清的百分比。对于PEP07913（SEQ ID NO:153）、PEP06923（SEQ IDNO:154）以及PEP07844（SEQ ID NO:161）获得具有IgG结合的血清的最高平均OD值和最高百分比，而针对PEP07968（DOTA结合的PEP07911，SEQ ID NO:159）、PEP07914（SEQ ID NO:158）以及PEP07954（SEQ IDNO:156）则发现最小的反应性。 
因此，最大反应性白蛋白结合多肽是亲本G148‑GA3（PEP07913，SEQID NO:153）以及先前改进亲和力的衍生物（PEP06923，SEQ ID NO:154），这种衍生物具有保留自G148‑GA3的螺旋1。第三较大反应性的多肽（PEP07844，SEQ ID NO:161）在螺旋1中的位置14处含有初始赖氨酸。这个残基旨在用于结合，并且因此在最终环境中将不被暴露。除了在位置14处具有一个丙氨酸之外的相同白蛋白结合多肽变异体（PEP07554，SEQID NO:156）为反应性最小者之一。 
实例5：
DOTA结合的白蛋白结合多肽的化学合成
材料和方法 
在433A肽合成反应器（应用生物系统（Applied Biosystems），福斯特市（Foster City），加利福尼亚州（CA））中，在0.1mmol规模上，即以 0.1mmol肽的理论可能产量，使用标准Fmoc化学，通过固相肽合成（SPPS，如由奎贝尔,M.（Quibell,M.）和约翰松（Johnson,T）在Fmoc固相肽合成—一种实用方法（Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis‑A Practical Approach）,W.C.陈（W.C.Chan）,P.D.怀特（P.D.White）编,牛津大学出版社（OxfordUniversity Press）2000,115‑135中所描述）来合成白蛋白结合多肽PEP07834（SEQ ID NO:160）。在整个合成中，使用一种酸不稳定的Fmoc酰胺树脂（Rink酰胺MBHA树脂LL（100‑200目），每克树脂（Novabiochem）负载0.39mmol酰胺）作为固体载体。 
通过在反应器中在室温（RT）下酰化反应10分钟并且混合，将根据以下序列的47个氨基酸残基与酰胺树脂偶联。用NMP（N‑甲基吡咯烷酮，默克公司）中的十倍克分子过量的Fmoc保护氨基酸进行酰化反应，用1当量的六氟磷酸2‑(1H‑苯并三唑‑1‑基)‑1,1,3,3‑四甲基铵（HBTU，IRIS生物技术公司（IRIS Biotech））、1当量的1‑羟基苯并三唑（HOBt，IRIS生物技术公司）以及2当量的二异丙基乙胺（DIEA，应用生物系统）活化。另外，在活化和偶联之前，用标准侧链保护基团（对于Asp、Glu、Ser、Thr以及Tyr为叔丁基（tBu），对于Lys为叔丁氧基羰基（Boc），对于Arg为2,2,4,6,7‑五甲基二氢苯并呋喃‑5‑磺酰基（Pbf)，并且对于Asn和Cys为三苯甲基（Trt））保护所有反应性氨基酸侧链。为减少导致截短肽的不完全偶联的量，在第一与第二偶联之间不进行如下文所描述的Fmoc脱保护的情况下，使少量的所选氨基酸残基通过酰化两次而经受偶联。所合成的白蛋白结合多肽PEP07834的氨基酸序列为ALASAKEAAN AELDCYGVSD FYKRLIDKAK TVEGVEALKDAILAALP‑NH2（SEQ ID NO:160‑NH2）。 
带下划线的氨基酸残基已经被双偶联。用乙酸酐（0.5M乙酸酐（阿法埃莎（AlfaAesar）），0.125M DIEA，0.015M HOBt的NMP溶液）对树脂结合肽上的任何剩余的未反应氨基封端5min。在每次偶联后，通过用 20%哌啶的NMP溶液（西格玛‑奥德里奇（Sigma‑Aldrich））处理10min来进行树脂结合肽上的N末端Fmoc基团的脱保护。 
在完成合成之后，通过在偶尔混合下用TFA/EDT/H2O/TIS（94:2.5:2.5:1）（TFA：三氟乙酸（阿波罗（Apollo）），EDT：1,2‑乙二硫醇（奥德里奇），TIS：三异丙基硅烷（奥德里奇））在RT下处理2h将肽从固体载体上切割并且同时切割掉侧链保护基团。在TFA处理之后，使用20%乙腈（默克公司）水溶液和叔丁基甲醚（默克公司）将肽萃取三次。将水相合并、过滤并且冻干。 
通过半制备型RP‑HPLC（Reprosil GOLD C18300，250*10mm，5μm粒径）和32%‑55%B（A：0.1%TFA‑H2O；B：0.1%TFA‑CH3CN）的梯度，在25min内，以2.5ml min‑1的流速分析粗肽并且纯化，随后冻干。 
通过计算来自RP‑HPLC上的粗分析的220nm信号的峰下积分面积来测定合成产率。使用液相色谱电喷雾电离质谱法（LC‑ESI‑MS），在6520Accurate Mass Q‑TOF LC/MS（安捷伦技术公司）上证实正确的分子量。使用RP‑HPLC（Reprosil GOLD C18300，250*4.6mm，3μm粒径），使用35%‑55%B的梯度，历时25min，以1.0ml min‑1的流速验证产物的纯度。 
DOTA结合 
用20mM DTT将3mg的PEP07834‑酰胺（SEQ ID NO:160‑酰胺）在40°C下还原30分钟。通过在一个PD‑10柱（通用电气医疗集团）上将缓冲液换成0.2M乙酸铵（pH 5.5）来去除过量DTT。用5倍摩尔过量的螯合剂马来酰亚胺基‑单‑酰胺‑DOTA（大环，目录号：B‑272）水溶液（1mg/ml）进行偶联。将混合物在30°C下在连续振荡下孵育1小时。在一个半制备型RPC柱（Zorbax 300SB C18，9.4x250mm，5μm）上从非结合螯合剂进行纯化。在Zorbax 300SB C8150x 2.1mm，3.5μm分析柱上通过HPLC‑MS分析纯化材料的偶联度。通过这种方法仅检测到表示为PEP07975的马来酰亚胺‑DOTA‑结合的PEP07834。 
结果 
基于粗材料的洗脱图，白蛋白结合多肽PEP07834‑酰胺（SEQ IDNO:160‑酰胺）的合成产率经测定为8%。发现的分子量为4952.9Da，这与计算为4952.6Da的理论分子量的一致性良好。当分析纯化产物时，发现大约10%‑15%的蛋白质为一种二硫键连接的同型二聚体（图4和5）。如在实例2证实了DOTA结合的肽（PEP07975）的结合活性（数据未显示），并且如在实例3中所述测定了熔融温度。 
实例6：
白蛋白结合多肽的免疫原性测试
按照其诱导外周血单核细胞（PBMC）中的T细胞增殖的能力从52个人类白种人个体（从比利时根特医学分析CRI实验室（CRI‑LaboMedische Analyse,Gent,Belgium）获得）中筛选PEP07913（SEQ IDNO:153）、PEP07912（SEQ ID NO:157）、PEP07914（SEQ ID NO:158）、以及PEP07968（DOTA‑结合的PEP07911，SEQ ID NO:159）。PEP07913相应于具有一个N末端甘氨酸残基的G148‑GA3的序列，而PEP07912、PEP07914以及PEP07968是根据本披露的添加有不同N末端氨基酸的白蛋白结合多肽PP007（SEQ ID NO:7）、PP013（SEQ ID NO:13）以及PP037（SEQ ID NO:37）的实例。 
材料和方法 
将根据标准细胞生物学方法制备的PBMC以每孔300000个PBMC的量添加到经组织培养（TC）处理的96孔圆底板（福尔肯（Falcon））中。通过每孔添加在AIMV培养基（茵维特罗根）中的100μl白蛋白结合多肽PEP07913、PEP07912、PEP07914以及PEP07968来刺激细胞，这种AIMV培养基另外含有900μg/ml（3倍摩尔过量）的重组人白蛋白（ 诺维信）。这相应于30μg/ml的白蛋白结合多肽的最终浓度。以八次重复（eight‑plicates）完成刺激，即，将相同的白蛋白结合多肽以完全相同的量并且在相同的条件下添加到八个孔中。在阳性对照孔中，用30μg/ml钥孔虫戚血蓝蛋白（Keyhole Limpet Hemocyanin）（KLH，卡尔生物化学公司（Calbiochem））或30μg/ml破伤风类毒素（TT，国家血清研究所（StatensSerum Institut））刺激细胞。在阴性对照孔中，仅添加含有或不含900μg/ml白蛋白的AIMV培养基。 
在培养七天后使用Alexa Fluor 488Click‑iTEdU流式细胞术测定试剂盒（茵维特罗根）评定细胞增殖。在第六天每孔添加1μM的EdU结合标记。在第七天，将细胞洗涤，从板上解离，再次洗涤并且用抗CD3‑PerCP试剂（百克顿‑迪金森（Becton Dickinson））和抗CD4‑Alexa647试剂（百克顿‑迪金森）染色30分钟。染色后，将细胞洗涤、固定（BD细胞固定剂（BD cellfix），BD生物科学公司（BD biosciences））、渗透处理（使用皂苷）并且通过添加Click‑iT试剂根据制造商的方案（茵维特罗根）来染色以便进行EdU。在完成染色之后，再次将细胞洗涤并且使用流式细胞术（FACSCantoII，BD生物科学公司）进行分析。为了评定增殖细胞的数目，在分析之前将固定数目的荧光球（fluosphere）（茵维特罗根）添加到每个孔中。所有染色程序和洗涤是直接在96孔板中进行的。 
原始FACSCantoII数据是对CD3+CD4+T细胞分级分类的（gatedhierarchically），并且记录了分类的细胞数目以及其EdU‑Alexa Flour 488结合标记的荧光强度。将蛋白质处理孔中的增殖细胞/八次重复的数目的平均值与阳性和阴性对照相比较，并且计算被描述为刺激指数（SI）的由此产生的比率。基于SI与多次重复之间的变化，将针对刺激和抑制的临限SI值对应地设定为2.0和0.5。 
结果 
在一个目标人群中，使用体外PBMC增殖测定在3倍过量的重组人白蛋白存在下针对白蛋白结合多肽PEP07913、PEP07912、PEP07914以及 PEP07968的免疫原性潜力进行了评定。与白蛋白对照相比，在52个供体中有6个出现PEP07913诱导的CD3+CD4+T细胞增殖，在52个供体中有5个出现PEP07912诱导的CD3+CD4+T细胞增殖，并且在52个供体中有1个出现PEP07914和PEP07968诱导的CD3+CD4+T细胞增殖（图6A）。 
与含有重组人白蛋白的阴性对照相比，PEP07914和PEP07968对所有52个供体的平均刺激指数（SI）没有显著不同（p对应地为0.79和0.48，图6B）。PEP07913的SI是显著更高的（p=0.002），而PEP07912的SI更高但不显著（p=0.03，图6B）。 
与仅缓冲液相比，对于PEP07912作出反应的个体的数目为10，对于PEP07912为7，对于PEP07914为2，对于PEP07968为1，对于重组人白蛋白为2，而对于两组阳性对照TT和KLH对应地为49和51（图6C）。根据白蛋白结合多肽的免疫原性它们按以下顺序排列：PEP07913>PEP07912>PEP07914>PEP07968。PEP07914和PEP07968两者被定义为非免疫原性的。因此，以上结果表明，与阳性对照相比，本披露的白蛋白结合多肽的免疫原性潜力为是低的。 
实例7：
白蛋白结合多肽对来自不同种类的白蛋白的亲和力
在这个实例中，使用Biacore仪器表征如在实例1中所述的表达且纯化的PEP06923（SEQ ID NO:154）、PEP07986（SEQ ID NO:163）以及PEP08296（DOTA结合的PEP08185，SEQ ID NO:148）对来自人（HSA）、食蟹猴（CSA）、大鼠（RSA）、小鼠（MSA）以及狗（DSA）的白蛋白的亲和力。 
材料和方法 
在Biacore2000仪器（通用电气医疗集团）上，根据制造商的建议， 用通过胺偶联到CM‑5芯片（研究级；通用电气医疗集团）表面的羧化右旋糖酐层上而固定的HSA（诺维信）、CSA（来自猕猴血清的内部纯化产品）、RSA（西格玛‑奥德里奇，目录号：A6272）、MSA（西格玛‑奥德里奇，目录号：A3559）以及DSA（MP生物医学公司（MPBiomedicals），目录号：55925）进行生物传感器分析。 
在芯片1上，将表面1活化和去活化并且用作在多个注射之间的一个参比池（空白表面），而表面2包含被固定到1130个共振单位（RU）上的HSA，表面3包含被固定到1046个RU上的CSA，表面4包含被固定到831个RU上的RSA。在芯片2上，使用表面1作为空白表面，而表面3包含被固定到858个RU上的MSA。在芯片3上，使用表面1作为空白表面，而表面2包含被固定到1053个RU上的DSA。 
为了分析对HSA、CSA以及RSA（芯片1）的亲和力，将纯化白蛋白结合多肽变异体在运行缓冲液HBS‑EP（通用电气医疗集团）中稀释到40nM、10nM以及2.5nM；为了分析对MSA（芯片2）的亲和力，将白蛋白结合多肽变异体稀释到1280nM、640nM、160nM以及40nM，而为了分析对DSA（芯片3）的亲和力，将白蛋白结合多肽变异体稀释到1280nM、640nM、160nM、40nM以及10nM。以50μl/min的恒定流速注射白蛋白结合多肽5分钟，随后注射HBS‑EP 60分钟。用25μl HCl（10mM）注射一次使表面再生。所有样品按一式二份运行。 
用BIA评估软件（通用电气医疗集团）分析结果。将空白表面的曲线从配体表面的曲线上扣除。 
结果 
Biacore 2000仪器具有技术限制性，妨碍了很高亲和力的测量。因此，Biacore研究的目的不是测定白蛋白结合多肽变异体对应地对HSA、CSA、RSA、MSA以及DSA的亲和力的精确动力学参数。然而，这些结果提供了对于包封多肽对来自这些不同种类的白蛋白的相对亲和力的定量估计。在扣除参考表面和缓冲液注射之后，使用BIA评估软件在对质量转移进行 校正并且以RUmax组作为局部参数的情况下，将曲线与1:1（兰米尔）结合模型拟合。在图7中显示了代表性的结合曲线。 
PEP07986和PEP08296（DOTA结合的PEP08185）以高亲和力（KD在从低于皮摩尔到低于纳摩尔范围内）与人血清白蛋白以及来自常见的临床前模型种类大鼠、食蟹猴、小鼠以及狗的白蛋白结合。对于不同的种类，相对亲和力可以排列为RSA≥HSA/CSA>MSA/DSA，即KD值排列为KD‑RSA≤KD‑HSA/KD‑CSA<KD‑MSA/KD‑DSA。就KD值来说，亲和力相同或稍微比对于PEP06923（非发明的多肽）所获得的亲和力更低（但在相同的数量级下）。 
实例8：
与白蛋白结合多肽融合的蛋白Z变异体的体外活性
在这个实例中，对于包含与白蛋白结合多肽变异体PP013（SEQ IDNO:13）基因融合的细胞因子特异性蛋白Z（葡萄球菌A蛋白的结构域B的衍生物）变异体的多肽，测试了它们的功能性，这种功能性为在人血清白蛋白存在下阻断细胞因子诱导的TF‑1细胞增殖。TF‑1细胞的增殖依赖于若干不同类型的细胞因子中任一者的存在，并且可以通过阻断剂（如相应的细胞因子特异性蛋白Z变异体）抑制该增殖反应。使用与针对无关蛋白具有特异性的蛋白Z变异体融合的PP013作为阴性对照。 
材料和方法 
Z‑PP013融合蛋白的克隆 
使用引物通过PCR将对应地对细胞因子X或Y或对一种无关蛋白（阴性对照）具有特异性的蛋白Z变异体的基因片段扩增，添加PstI和AccI特异性核酸内切酶位点。将这些片段用PstI和AccI切割，纯化并且连接到受相同的酶的限制的一种表达载体（质粒pAY02747）中。pAY02747含有 来自pBR322的复制起点、卡那霉素抗性基因以及T7启动子，用于表达感兴趣的基因。克隆位点的前面是编码氨基酸MGSSLQ的序列，并且随后为编码VDSS‑PP013的序列，其中PP013为所披露的具有SEQ ID NO:13的白蛋白结合多肽。如上文所描述进行连接、转化以及序列测定。所编码的蛋白质为： 
1)MGSSLQ‑ZX‑VDSS‑PP013（表示ZX‑PP013） 
2)MGSSLQ‑ZY‑VDSS‑PP013（表示ZY‑PP013） 
3)MGSSLQ‑Zneg‑VDSS‑PP013（表示Zneg‑PP013） 
蛋白表达 
在大肠杆菌BL21（DE3)细胞中表达ZX‑PP013、ZY‑PP013以及Zneg‑PP013。使用来自每种融合变异体的转化的集落接种50ml TSB+YE培养基的起子培养物，TSB+YE培养基补充有卡那霉素，达到浓度为50μg/ml。使培养物在37°C下生长过夜并且在100rpm下搅拌。然后，使用起子培养物接种900ml TSB+YE培养基，TSB+YE培养基补充有有卡那霉素达到浓度为50μg/ml。使培养物大约生长1.5h，直到OD600>1.1，其后添加IPTG，直到最终浓度为0.2mM。继续培养五小时。通过离心（15600g，4°C，20分钟）收获细胞沉淀并且在‑20°C下储存直到进行纯化。 
蛋白纯化 
将含有可溶性融合蛋白变异体ZX‑PP013、ZY‑PP013以及Zneg‑PP013的冷冻细胞沉淀再悬浮于50mM Tris‑HCl中，并且添加150mM NaCl（pH8）和1000U（默克公司，目录号：1.01654.0001）。通过超声作用将这些细胞破碎，并且对于每种融合蛋白变异体，通过离心（15min，37000g，4°C）使超声处理的悬浮液变澄清。以一定体积添加20x TST‑缓冲液（20x[25mM Tris‑HCl，1mM EDTA，200mM NaCl，0.05%吐温20， pH8.0]），在澄清悬浮液中产生1×TST缓冲液。将融合蛋白变异体的每个样品加载到HSA‑Sepharose柱（通用电气医疗集团）上。在用TST‑缓冲液洗涤之后，用5mM NH4Ac（pH 5.5）洗涤，将结合的融合蛋白变异体用0.5M HAc（pH 2.5）洗脱。 
通过反相色谱法（RPC）如下进一步纯化融合蛋白变异体。对于每种变异体，将来自HSA亲和力纯化步骤的洗脱物加载到事先用RPC A缓冲液（0.1%TFA水溶液）平衡的1ml Resource 15RPC柱（通用电气医疗集团）上。在用10CV RPC A缓冲液和5CV RPC B缓冲液（0.1%TFA乙腈溶液）洗涤柱子之后，将结合的融合蛋白用超过20CV的10%‑50%RPC B缓冲液的线性梯度进行洗脱。流速为2ml/min并且监测在280nm下的吸光度。通过SDS‑PAGE分析来鉴定含有纯融合蛋白变异体的部分并且将其汇集。最后，使用一次性PD‑10脱盐柱（通用电气医疗集团）将缓冲液换成1xPBS（2.68mM KCl，137mM NaCl，1.47mM KH2PO4，8.1mMNa2HPO4，pH 7.4）。为了验证融合蛋白变异体的一致性，如在实例1中所描述进行SDS‑PAGE和LC/MS分析。 
Z‑PP013融合蛋白的体外细胞测定 
如提供商所建议，使细胞系TF‑1（CLS，目录号：300434）在添加有2ng/ml rhGM‑CSF（美天旎（Miltenyi））的RPMI 1640培养基+10%胎牛血清（吉诺（Gibco））中繁殖。在实验当天，将细胞在RPMI 1640培养基+10%胎牛血清中洗涤以去除GM‑CSF。 
通过将分子ZX‑PP013、ZY‑PP013以及Zneg‑PP013对应地与细胞因子X和Y并且与五倍摩尔过量的HSA（诺维信）混合来分析ZX‑PP013和ZY‑PP013阻断细胞因子诱导的增殖的能力。将这些分子在具有固定浓度的细胞因子（4.9pM）和五倍摩尔过量的HSA的2倍稀释系列中滴定。以100μl的体积在96孔板中进行滴定。每孔（100μl）添加25000个细胞，并且将多个板在37°C，5%CO2下培养三天。为了测量增殖，每孔添加19μl的在RPMI 1640培养基+10%胎牛血清中稀释两倍的CCK‑8 细胞增殖试剂（西格玛）。4小时后使用96孔板读取器（Victor3；珀金埃尔默）监测颜色反应。 
结果 
如在图8中所示，在HSA存在下ZX‑PP013和ZY‑PP013两者都抑制了对应的细胞因子诱导的增殖，而Zneg‑PP013（阴性对照）并不影响TF‑1的增殖。因此，实验显示，当结合到含有白蛋白结合多肽的融合蛋白中时，Z分子的功能被保留，并且当这些融合蛋白与白蛋白结合时同样如此。 
实例9：
白蛋白结合多肽的长期稳定性
在这个实例中，研究了如在实例1中所描述的表达和纯化的PEP07986（SEQ ID NO:163）在4°C、25°C以及40°C下储存长达三个月之后的稳定性。通过使用Biacore仪器测量多肽在储存之后与HSA的结合来研究其状态。 
材料和方法 
将冻干的PEP07986以2mg/ml的浓度溶解在无菌NaPi缓冲液（20mM磷酸钠，150mM氯化钠，pH 7.2）中。移出参考样品（时间为0）并且在‑80°C下储存。将105μl的等分试样在4°C、25°C以及40°C下储存在用石蜡膜密封的无菌螺旋帽艾本德管（eppendorftube）中。将储存在每一温度下的样品在一周、两周、一个月以及三个月之后冷却到4°C，在13000rpm下离心5min，并且然后在‑80°C下储存，等待进行生物传感器分析。 
基本上如在实例2中所描述进行生物传感器分析，但是用固定到704个共振单位（RU）的HSA（诺维信），并且将白蛋白结合多肽变异体稀释到10nM并且以20μl/min的恒定流速注射10分钟，随后注射 HBS‑EP 10分钟。 
0＞Results<}100{＞结果 
PEP07986（SEQ ID NO:163）在4°C、25°C以及40°C下储存至少三个月之后保留与HSA的结合。储存在不同条件下的PEP07986所获得的对HSA的最大结合反应显示于图9中。 
实例10：
白蛋白结合多肽在极端条件下的稳定性
在这个实例中，描述了白蛋白结合多肽PEP08296（DOTA结合的PEP08185，SEQ ID NO:148）在低pH（约4.0）缓冲液中热处理（90°C）之后的生物传感器和圆二色谱（CD）分析。因为例如对于DOTA修饰的蛋白质的68Ga标记必须使用这样的极端反应条件，通过测量熔融温度（Tm）、再折叠特性以及与HSA的结合研究了高热量和低pH处理对多肽的结构一致性和其对HSA的结合容量的影响。 
材料和方法 
热稳定性的生物传感器分析 
根据制造商的建议，用通过胺偶联固定到CM‑5芯片（研究级；通用电气医疗集团）表面的羧化右旋糖酐层上的HSA（诺维信）在Biacore 2000仪器（通用电气医疗集团）上进行生物传感器分析。将芯片的表面1活化和去活化并且用作注射之间的一个参比池（空白表面），而表面2包含被固定到724个共振单位（RU）上的HSA。将在15ml福尔肯管（Falcon tube）中的PEP08296（50μl，100μg）用450μl 0.2M乙酸钠（NaAc）（pH 5.5）稀释到最终肽浓度为0.2mg/mL。在添加1.5ml 0.05M HCl（与洗脱68Ge/68Ga发生器时所用的条件和体积类似）之后，将样品在90°C 或RT（对照）下孵育10分钟，并且然后转换到RT。添加6ml 0.1M柠檬酸钠以中和pH。将热处理的PEP08296（0.8和4nM）以50μl/min的恒定流速注射5分钟，随后在HBS‑EP中解离15分钟。用25μl 10mM HCl注射一次使这些表面再生。用BIA评估软件（通用电气医疗集团）分析结果。将空白表面的曲线从配体表面的曲线上扣除。 
熔融温度(Tm）的测定 
将PEP08296溶解到PBS中，直到最终浓度为0.5mg/ml。通过将9.5μl100mM HCl添加到100μl PBS中来制备pH为大约为4.0的PBS。如在实例3中所描述进行圆二色谱（CD）分析。 
热稳定性的CD分析 
为了研究PEP08296在热处理之后的结构可逆性，在20°C下记录每一样品在195与250之间的两个CD光谱。在第一光谱之后，如上文所描述在加热到90°C的情况下进行一个VTM循环，随后在20°C下采集在195与250nm之间的第二CD光谱。另外，在一个热混合器（500rpm，间隔混合：打开10s，关闭30s）中将PEP08296在90°C下在PBS（pH 4.0）缓冲液或PBS（pH 7.2）缓冲液中孵育12分钟。在孵育之后，将样品在冰上冷却，随后在13000rpm下离心1分钟，并且在20°C下记录在195与250nm之间的一个CD光谱。 
结果 
使用生物传感器分析来研究是否热处理与低pH值组合（即多肽的68Ga标记所需的共同条件）会影响PEP08296对HSA的结合容量。图10显示了用Biacore 2000仪器进行的这一结合分析的结果。将两种不同浓度的PEP08296（0.8nM和4nM）注射到具有724个RU的固定人血清白蛋白的表面上。在90°C，pH 4.0下热处理10分钟轻微降低了PEP08296对HSA 的结合容量，表明该分子的潜在结构改变。 
使用CD进一步研究该分子的潜在结构改变。在加热之前和之后的相似CD光谱将证明一个样品是结构上可逆的。在第一个实验中，以从20°C到90°C的温度梯度加热这些样品。在Tm测定实验中，热处理之前和之后的CD光谱是相似的，其中在207和221nm处的典型最小值指示了α‑螺旋性，即在pH4或pH7.2的缓冲液中短时间加热到90°C对PEP08296的结构没有影响。 
然而，将PEP08296在90°C下预处理12分钟显示：如果在pH 4.0下培养，PEP08296的α螺旋含量稍有降低，但如果在pH 7.2下培养，α螺旋含量没有变化。在加热之前和之后的两个CD光谱的典型叠加显示于图11中。 
熔融温度（Tm）测定结果汇总于表4中。 
表4.PEP08296的Tm 
命名 Tm（°C） PEP08296，pH7.2 59 PEP08296，pH4.0 62
实例11：
使用68Ga标记的白蛋白结合多肽的血池显像
在进行这个实例的实验中，将68Ga标记的PEP08296（DOTA结合的PEP08185，SEQ ID NO:148）在大鼠中进行全身分布，随后进行历时1.5小时的动态显像。由于在标记多肽与血清白蛋白之间的强缔合作用，该标记多肽可以用于例如研究血池和组织渗透性。 
材料和方法 
PEP08296的68Ga标记 
如先前所描述，用0.1M HCl将68Ga从68Ge/68Ga发生器（俄罗斯奥布宁斯克（Obninsk,Russia））中以68GaCl3形式洗脱，用浓HCl转化成 68GaCl4，截留到阴离子交换柱（Chromafix‑HCO3）上，并且随后用18MΩ水洗脱（Velikyan等人(2008),《核医学与生物学》（Nucl Med Biol）35:529‑536）。 
基本上如托马契夫（Tolmachev）等人在（EJNMMI 37:1356‑1367,2010）中所描述进行标记。将浓的68Ga洗脱物（150‑200μl）添加到PEP08296（≥100μg，在0.2M乙酸钠缓冲液（pH 5.5）中）中，并且使用乙酸钠（1.25M）或HCl（0.1M）将pH值调节到3.5‑4。将标记混合物在90°C下培养15分钟，然后冷却，并且在用生理学缓冲盐水洗脱的NAP‑5柱上通过尺寸排阻纯化将标记的蛋白质分离。 
使用UV（210nm）和串联的多个放射性检测器以及用生理学缓冲盐水洗脱的Superdex Peptide 10/300GL柱（通用电气医疗集团），通过放射‑HPLC评定68Ga标记蛋白的放射化学纯度和一致性。 
小动物PET 
用异氟烷（最初5%，然后与7:3空气/O2混合为2%）将一只大鼠（277g）麻醉，使用来自Euthanex公司的Microflex非再呼吸面罩通过一个E‑Z蒸发器进行控制，并且保持在一个加热垫（37°C）上，同时放置在一个microPET Focus120系统（西门子，CTI康恩得微系统（Siemens,CTIConcorde Microsystems）内。将68Ga‑PEP08296（33MBq）分配到一个注射器中，用盐水稀释到0.5ml并且经由尾静脉注射。通过以一个恒定床运动方案使床移动1.5h而从全身获得数据。用MicroPET Manager处理数据，并且进行随机、死时间以及衰减校正。使用一个斜变滤波器（ramp filter）通过标准2D滤过反投影来重建图像，并且使用Inveon研究工作平台（西门子医学解决方案（Siemens Medical Solutions））软件来评估。 
结果 
PEP08296的基本分布型式（图12）与标记有放射性同位素（如 68Ga‑DOTA、64Cu‑DOTA以及11C）的白蛋白的基本分布型式很相似（参见例如（Hoffend）等人(2005),《核医学与生物学》32:287‑292以及卢（Lu）等人(2008),“用于血流和血池显像的[1‑11C]丁醇和[甲基‑11C]白蛋白（[1‑11C]Butanol and[Methyl‑11C]Albumin for Blood Flow and Blood PoolImaging）”,张贴（poster）于XIth Turku PET论文集中,24‑27,2008年五月）。简言之，在整个扫描中的主要血管中观测到高放射性浓度。如同心脏血池放射性那样，还清楚地描绘了具有大的血容量的器官（肝脏、脾脏以及肾脏）。在观测时段期间，膀胱中的放射性增加，这个肾脏消除观察结果与用基于标记的白蛋白的示踪剂进行的先前观察结果以及用白蛋白本身的代谢的观察结果一致。 
在静脉内注射68Ga‑PEP08296之后，放射性的整体分布型式和极缓慢的血浆清除与其所预期的与白蛋白极快并且极强地结合相一致。因此，这些结果支持该放射性示踪剂作为一种体内血池显像剂的其他应用，在疾病发展过程中以及在治疗性干预过程中这种体内血池显像剂用于与组织渗透性的正电子发射断层摄影研究一起使用。 
实例12：
白蛋白结合多肽的溶解度
通过使用超滤连续浓缩样品，随后测量浓度，并且研究聚集状态来研究PEP07986（SEQ ID NO:163）在生理缓冲液中的溶解度。在280nm下通过直接吸光度读取而测定的浓度与通过凝胶过滤测定的浓度是一致的，显示了超过42mg/ml的溶解度，并且未检测到聚集体。 
材料和方法 
将冻干的PEP07986以3mg/ml的一个浓度溶解在NaPi缓冲液（20mM磷酸钠，150mM氯化钠，pH 7.2）中。将Amicon超离心过滤单元（截止值：3kDa）（密理博（Millipore），目录号：UFC800324）通过在吊桶式转头离心机（Multifuge，贺利氏（Heraeus））中在4000g下离心20min而用2ml NaPi缓冲液进行预清洗。将1620μl的3mg/ml PEP07986施加到一个第一离心过滤单元中，并且在4000g、20°C下离心7min。移出一个25μl样品（UF样品1）用于进一步分析，并且将样品的其余部分转移到一个第二离心过滤单元中。将离心和样品移出重复三次，并且旋转时间对应地为8、9以及20min（对应地为UF样品2、3以及4）。使用ND‑1000分光光度计，并且通过将UF样品1‑4在NaPi缓冲液中分别稀释2、4、6以及12倍来进行吸光度读取。使用消光系数1Abs 280=1.955mg/ml来计算浓度。在一个1100HPLC系统（安捷伦技术公司）上使用已经在NaPi缓冲液中平衡的Superdex7510/300GL柱（通用电气医疗集团）来进行凝胶过滤。将10μl的每个UF样品施加到柱子上；使用NaPi缓冲液作为运行缓冲液并且流速为0.5ml/min。还收集了以5mg/ml的浓度注射的分子量标准卵白蛋白（通用电气医疗集团）的色谱图。通过对曲线下面积求积分来确定浓度。 
结果 
通过在280nm下直接吸光度读取所测定的浓度以及通过凝胶过滤测定的浓度显示于表5中。PEP07986（SEQ ID NO:163）在生理缓冲液（20mM磷酸钠，150mM氯化钠，pH 7.2）中的溶解度为至少42mg/ml。如由图13所示，通过凝胶过滤未检测到聚集体。 
表5.在连续浓缩PEP07986（SEQ ID NO:163）之后测定的浓度