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1、(10)申请公布号 CN 102864120 A (43)申请公布日 2013.01.09 CN 102864120 A *CN102864120A* (21)申请号 201210382974.1 (22)申请日 2012.10.11 C12N 5/04(2006.01) C12N 5/02(2006.01) (71)申请人 顾向华 地址 215126 江苏省苏州市工业园区胜浦镇 浪花苑 91 幢 302 室 (72)发明人 顾向华 (54) 发明名称 甘薯胚性细胞悬浮培养方法及通过该方法得 到的胚性细胞 (57) 摘要 本发明涉及一种甘薯胚性细胞的悬浮方 法， 其主要特征是将甘薯胚性愈伤组织。
2、按接种 密度 0.5 25-4.0 25(SCV ： total ml of suspension culture) 放入置于 100r/min 摇床 的、 含 2.0mg/L2， 4-D 的 MS 液体培养基的培养瓶 中培养。通过这种培养方法培养的胚性悬浮细 胞 7 天后即可增殖到原来的 1.6-3.96 倍左右， 且 胚性悬浮细胞质量非常好 ； 特别是当接种密度为 2.0 25 时， 其培养的效率最高， 7 天后可增殖到 原来的 3.96 倍。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书。
3、 6 页 1/1 页 2 1. 一种甘薯胚性细胞的悬浮培养方法， 其特征在于 ： 将甘薯胚性愈伤组织按接种密度 0.525-4.025放入含2.0mg/L2， 4-D的MS液体培养基的培养瓶中培养， 该培养瓶置于 100r/min 摇床上。 2. 根据权利要求 1 所述的甘薯胚性细胞悬浮培养方法， 其特征在于 ： 所述甘薯品种为 徐 55-2。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的甘薯胚性细胞悬浮培养方法， 其特征在于 ： 培养瓶为 100mL、 培养瓶中的 MS 液体培养基为 25mL。 4. 根据权利要求 1 或 2 所述的甘薯胚性细胞悬浮培养方法， 其特征在于 ： 接种密度为 2.0 。
4、25。 5. 根据权利要求 3 所述的甘薯胚性细胞悬浮培养方法， 其特征在于 ： 接种密度为 2.0 25。 6. 根据权利要求 1 或 2 培养方法培养所得的甘薯胚性细胞。 7. 根据权利要求 3 培养方法培养所得的甘薯胚性细胞。 8. 根据权利要求 4 培养方法培养所得甘薯胚性细胞。 9. 根据权利要求 5 培养方法培养所得甘薯胚性细胞。 权 利 要 求 书 CN 102864120 A 2 1/6 页 3 甘薯胚性细胞悬浮培养方法及通过该方法得到的胚性细胞 技术领域 0001 本发明涉及一种甘薯胚性细胞的悬浮培养方法及通过该方法得到的胚性细胞。 背景技术 0002 传统的甘薯转基因受体大。
5、多采用叶片、 叶柄等外植体， 但这些外植体再生率较低， 不适合做生物工程材料。在 2003 年出版的 中国农业科学 第 36 卷第 5 期第 487-491 页 披露了一种甘薯胚性细胞悬浮培养系， 是一种较理想的生物工程材料， 但是这种甘薯胚性 悬浮培养系培养效率还不高。 发明内容 0003 本发明要解决的技术问题是提供一种高效的甘薯胚性细胞悬浮培养方法。 0004 将在含 2.0mg/L2， 4-D 的 MS 培养基上诱导得到的甘薯胚性愈伤组织， 按接种密度 0.5 25-4.0 25， 放入置于 100r/min 摇床含 2， 4-D 浓度为 2.0mg/LMS 液体培养基的培 养瓶中培养。
6、。 0005 通过此种方法培养的胚性悬浮细胞在7天后即可增殖到原来的1.6-3.96倍， 且胚 性悬浮细胞质量较好， 并且， 这个接种密度可以作为甘薯细胞悬浮培养中试放大的重要参 考数据。 0006 优选方案是在接种密度 2.0 25(SCV ： total ml of suspension culture) 放入 置于 100r/min 摇床含 2， 4-D 浓度为 2.0mg/LMS 液体培养基的培养瓶中培养。 0007 通过此种方法培养的胚性悬浮细胞 7 天后可增殖到原来的 3.96 倍。 具体实施方式 0008 本发明的优点在于 ： 与其它悬浮细胞培养方法相比， 培养所得的胚性细胞质量。
7、相 当， 但培养的效率显著提高。 0009 下面以甘薯徐 55-2 为例， 详细介绍本发明的实施例。 0010 实施例 1 ： 0011 取苗床生长旺盛、 长 1cm 的徐 55-2 茎尖， 用 70的酒精表面杀毒 30s 后立即转入 0.1 HgCl23min， 而后勇无菌蒸馏水充分洗净。在解剖显微镜下剥取约 0.5-1.0mm 的茎尖 分省组织， 而后接种在含 2.0mg/L2， 4-D 的 MS 培养基上 (3蔗糖， 0.8琼脂， pH 5.8)， 在 282、 黑暗条件下进行培养， 诱导胚性愈伤组织。 0012 培养 8 周后， 将诱导得到的胚性愈伤组织破碎成小细胞团， 转入 100m。
8、L 三角瓶中， 加入 20mL 含 2， 4-D 的 MS 液体培养基， 该培养基的成分同上述胚性愈伤组织诱导培养基， 但是不加琼脂。将三角瓶放在水平摇床上进行振荡培养， 培养条件为 282， 每天 13h、 500lx 光照。悬浮培养 7-10 天继代一次。 0013 将 0.5mLSCV(SCV ： total ml of suspension culture) 胚性悬浮培养细胞接 入 25mL 含 2.0mg/L2， 4-D 的 MS 液体培养基中， 置于 100r/min 摇床上培养， 培养条件为 说 明 书 CN 102864120 A 3 2/6 页 4 282， 每天 13h、 。
9、500lx 光照。 0014 通过这种培养方法培养的胚性悬浮细胞7天后即可增殖到原来的1.67倍， 且胚性 悬浮细胞质量较好。 0015 实施例 2 ： 0016 取苗床生长旺盛、 长 1cm 的徐 55-2 茎尖， 用 70的酒精表面杀毒 30s 后立即转入 0.1 HgCl23min， 而后勇无菌蒸馏水充分洗净。在解剖显微镜下剥取约 0.5-1.0mm 的茎尖 分省组织， 而后接种在含 2.0mg/L2， 4-D 的 MS 培养基上 (3蔗糖， 0.8琼脂， pH 5.8)， 在 282、 黑暗条件下进行培养， 诱导胚性愈伤组织。 0017 培养 8 周后， 将诱导得到的胚性愈伤组织破碎成。
10、小细胞团， 转入 100mL 三角瓶中， 加入 20mL 含 2， 4-D 的 MS 液体培养基， 该培养基的成分同上述胚性愈伤组织诱导培养基， 但是不加琼脂。将三角瓶放在水平摇床上进行振荡培养， 培养条件为 282， 每天 13h、 500lx 光照。悬浮培养 7-10 天继代一次。 0018 将 0.6mLSCV(SCV ： total ml of suspension culture) 胚性悬浮培养细胞接 入 25mL 含 2.0mg/L2， 4-D 的 MS 液体培养基中， 置于 100r/min 摇床上培养， 培养条件为 282， 每天 13h、 500lx 光照。 0019 通过这。
11、种培养方法培养的胚性悬浮细胞7天后即可增殖到原来的1.95倍左右， 且 胚性悬浮细胞质量较好。 0020 实施例 3 ： 0021 取苗床生长旺盛、 长 1cm 的徐 55-2 茎尖， 用 70的酒精表面杀毒 30s 后立即转入 0.1 HgCl23min， 而后勇无菌蒸馏水充分洗净。在解剖显微镜下剥取约 0.5-1.0mm 的茎尖 分省组织， 而后接种在含 2.0mg/L2， 4-D 的 MS 培养基上 (3蔗糖， 0.8琼脂， pH 5.8)， 在 282实、 黑暗条件下进行培养， 诱导胚性愈伤组织。 0022 培养 8 周后， 将诱导得到的胚性愈伤组织破碎成小细胞团， 转入 100mL 。
12、三角瓶中， 加入 20mL 含 2， 4-D 的 MS 液体培养基， 该培养基的成分同上述胚性愈伤组织诱导培养基， 但是不加琼脂。将三角瓶放在水平摇床上进行振荡培养， 培养条件为 282， 每天 13h、 500lx 光照。悬浮培养 7-10 天继代一次。 0023 将 1.0mLSCV(SCV ： total ml of suspension culture) 胚性悬浮培养细胞接 入 25mL 含 2.0mg/L2， 4-D 的 MS 液体培养基中， 置于 100r/min 摇床上培养， 培养条件为 282， 每天 13h、 500lx 光照。 0024 通过这种培养方法培养的胚性悬浮细胞7。
13、天后即可增殖到原来的2.86倍， 且胚性 悬浮细胞质量非常好。 0025 实施例 4 ： 0026 取苗床生长旺盛、 长 1cm 的徐 55-2 茎尖， 用 70的酒精表面杀毒 30s 后立即转入 0.1 HgCl23min， 而后勇无菌蒸馏水充分洗净。在解剖显微镜下剥取约 0.5-1.0mm 的茎尖 分省组织， 而后接种在含 2.0mg/L2， 4-D 的 MS 培养基上 (3蔗糖， 0.8琼脂， pH 5.8)， 在 282实、 黑暗条件下进行培养， 诱导胚性愈伤组织。 0027 培养 8 周后， 将诱导得到的胚性愈伤组织破碎成小细胞团， 转入 100mL 三角瓶中， 加入 20mL 含 。
14、2， 4-D 的 MS 液体培养基， 该培养基的成分同上述胚性愈伤组织诱导培养基， 但是不加琼脂。将三角瓶放在水平摇床上进行振荡培养， 培养条件为 282， 每天 13h、 说 明 书 CN 102864120 A 4 3/6 页 5 500lx 光照。悬浮培养 7-10 天继代一次。 0028 将 2.0mLSCV(SCV ： total ml of suspension culture) 胚性悬浮培养细胞接 入 25mL 含 2.0mg/L2， 4-D 的 MS 液体培养基中， 置于 100r/min 摇床上培养， 培养条件为 282， 每天 13h、 500lx 光照。 0029 通过这。
15、种培养方法培养的胚性悬浮细胞7天后即可增殖到原来的3.96倍， 且胚性 悬浮细胞质量非常好。 0030 实施例 5 ： 0031 取苗床生长旺盛、 长 1cm 的徐 55-2 茎尖， 用 70的酒精表面杀毒 30s 后立即转入 0.1 HgCl23min， 而后勇无菌蒸馏水充分洗净。在解剖显微镜下剥取约 0.5-1.0mm 的茎尖 分省组织， 而后接种在含 2.0mg/L2， 4-D 的 MS 培养基上 (3蔗糖， 0.8琼脂， pH 5.8)， 在 282实、 黑暗条件下进行培养， 诱导胚性愈伤组织。 0032 培养 8 周后， 将诱导得到的胚性愈伤组织破碎成小细胞团， 转入 100mL 三。
16、角瓶中， 加入 20mL 含 2， 4-D 的 MS 液体培养基， 该培养基的成分同上述胚性愈伤组织诱导培养基， 但是不加琼脂。将三角瓶放在水平摇床上进行振荡培养， 培养条件为 282， 每天 13h、 500lx 光照。悬浮培养 7-10 天继代一次。 0033 将 3.9mLSCV(SCV ： total ml of suspension culture) 胚性悬浮培养细胞接 入 25mL 含 2.0mg/L2， 4-D 的 MS 液体培养基中， 置于 100r/min 摇床上培养， 培养条件为 282， 每天 13h、 500lx 光照。 0034 通过这种培养方法培养的胚性悬浮细胞7天。
17、后即可增殖到原来的1.95倍， 且胚性 悬浮细胞质量较好。 0035 实施例 6 ： 0036 取苗床生长旺盛、 长 1cm 的徐 55-2 茎尖， 用 70的酒精表面杀毒 30s 后立即转入 0.1 HgCl23min， 而后勇无菌蒸馏水充分洗净。在解剖显微镜下剥取约 0.5-1.0mm 的茎尖 分省组织， 而后接种在含 2.0mg/L2， 4-D 的 MS 培养基上 (3蔗糖， 0.8琼脂， pH 5.8)， 在 282实、 黑暗条件下进行培养， 诱导胚性愈伤组织。 0037 培养 8 周后， 将诱导得到的胚性愈伤组织破碎成小细胞团， 转入 100mL 三角瓶中， 加入 20mL 含 2，。
18、 4-D 的 MS 液体培养基， 该培养基的成分同上述胚性愈伤组织诱导培养基， 但是不加琼脂。将三角瓶放在水平摇床上进行振荡培养， 培养条件为 282， 每天 13h、 500lx 光照。悬浮培养 7-10 天继代一次。 0038 将 4.0mLSCV(SCV ： total ml of suspension culture) 胚性悬浮培养细胞接 入 25mL 含 2.0mg/L2， 4-D 的 MS 液体培养基中， 置于 100r/min 摇床上培养， 培养条件为 282， 每天 13h、 500lx 光照。 0039 通过这种培养方法培养的胚性悬浮细胞 7 天后即可增殖到原来的 1.7 倍。
19、， 且胚性 悬浮细胞质量较好。 0040 比较例 1 ： 0041 取苗床生长旺盛、 长 1cm 的徐 55-2 茎尖， 用 70的酒精表面杀毒 30s 后立即转入 0.1 HgCl23min， 而后勇无菌蒸馏水充分洗净。在解剖显微镜下剥取约 0.5-1.0mm 的茎尖 分省组织， 而后接种在含 2.0mg/L2， 4-D 的 MS 培养基上 (3蔗糖， 0.8琼脂， pH 5.8)， 在 282、 黑暗条件下进行培养， 诱导胚性愈伤组织。 说 明 书 CN 102864120 A 5 4/6 页 6 0042 培养 8 周后， 将诱导得到的胚性愈伤组织破碎成小细胞团， 转入 100mL 三角。
20、瓶中， 加入 20mL 含 2， 4-D 的 MS 液体培养基， 该培养基的成分同上述胚性愈伤组织诱导培养基， 但是不加琼脂。将三角瓶放在水平摇床上进行振荡培养， 培养条件为 282， 每天 13h、 500lx 光照。悬浮培养 7-10 天继代一次。 0043 将 0.2mLSCV(SCV ： total ml of suspension culture) 胚性悬浮培养细胞接 入 25mL 含 2.0mg/L2， 4-D 的 MS 液体培养基中， 置于 100r/min 摇床上培养， 培养条件为 282， 每天 13h、 500lx 光照。 0044 通过这种培养方法培养的胚性悬浮细胞7天后。
21、即可增殖到原来的1.25倍左右， 且 胚性悬浮细胞质量较差。 0045 比较例 2 ： 0046 取苗床生长旺盛、 长 1cm 的徐 55-2 茎尖， 用 70的酒精表面杀毒 30s 后立即转入 0.1 HgCl23min， 而后勇无菌蒸馏水充分洗净。在解剖显微镜下剥取约 0.5-1.0mm 的茎尖 分省组织， 而后接种在含 2.0mg/L2， 4-D 的 MS 培养基上 (3蔗糖， 0.8琼脂， pH 5.8)， 在 282、 黑暗条件下进行培养， 诱导胚性愈伤组织。 0047 培养 8 周后， 将诱导得到的胚性愈伤组织破碎成小细胞团， 转入 100mL 三角瓶中， 加入 20mL 含 2，。
22、 4-D 的 MS 液体培养基， 该培养基的成分同上述胚性愈伤组织诱导培养基， 但是不加琼脂。将三角瓶放在水平摇床上进行振荡培养， 培养条件为 282， 每天 13h、 500lx 光照。悬浮培养 7-10 天继代一次。 0048 将 0.3mLSCV(SCV ： total ml of suspension culture) 胚性悬浮培养细胞接 入 25mL 含 2.0mg/L2， 4-D 的 MS 液体培养基中， 置于 100r/min 摇床上培养， 培养条件为 282， 每天 13h、 500lx 光照。 0049 通过这种培养方法培养的胚性悬浮细胞7天后即可增殖到原来的1.34倍左右，。
23、 且 胚性悬浮细胞质量较差。 0050 比较例 3 ： 0051 取苗床生长旺盛、 长 1cm 的徐 55-2 茎尖， 用 70的酒精表面杀毒 30s 后立即转入 0.1 HgCl23min， 而后勇无菌蒸馏水充分洗净。在解剖显微镜下剥取约 0.5-1.0mm 的茎尖 分省组织， 而后接种在含 2.0mg/L2， 4-D 的 MS 培养基上 (3蔗糖， 0.8琼脂， pH 5.8)， 在 282、 黑暗条件下进行培养， 诱导胚性愈伤组织。 0052 培养 8 周后， 将诱导得到的胚性愈伤组织破碎成小细胞团， 转入 100mL 三角瓶中， 加入 20mL 含 2， 4-D 的 MS 液体培养基，。
24、 该培养基的成分同上述胚性愈伤组织诱导培养基， 但是不加琼脂。将三角瓶放在水平摇床上进行振荡培养， 培养条件为 282， 每天 13h、 500lx 光照。悬浮培养 7-10 天继代一次。 0053 将 0.4mLSCV(SCV ： total ml of suspension culture) 胚性悬浮培养细胞接 入 25mL 含 2.0mg/L2， 4-D 的 MS 液体培养基中， 置于 100r/min 摇床上培养， 培养条件为 282， 每天 13h、 500lx 光照。 0054 通过这种培养方法培养的胚性悬浮细胞7天后即可增殖到原来的1.46倍左右， 且 胚性悬浮细胞质量一般。 0。
25、055 比较例 4 ： 0056 取苗床生长旺盛、 长 1cm 的徐 55-2 茎尖， 用 70的酒精表面杀毒 30s 后立即转入 说 明 书 CN 102864120 A 6 5/6 页 7 0.1 HgCl23min， 而后勇无菌蒸馏水充分洗净。在解剖显微镜下剥取约 0.5-1.0mm 的茎尖 分省组织， 而后接种在含 2.0mg/L2， 4-D 的 MS 培养基上 (3蔗糖， 0.8琼脂， pH 5.8)， 在 282、 黑暗条件下进行培养， 诱导胚性愈伤组织。 0057 培养 8 周后， 将诱导得到的胚性愈伤组织破碎成小细胞团， 转入 100mL 三角瓶中， 加入 20mL 含 2， 。
26、4-D 的 MS 液体培养基， 该培养基的成分同上述胚性愈伤组织诱导培养基， 但是不加琼脂。将三角瓶放在水平摇床上进行振荡培养， 培养条件为 282， 每天 13h、 500lx 光照。悬浮培养 7-10 天继代一次。 0058 将 4.1mLSCV(SCV ： total ml of suspension culture) 胚性悬浮培养细胞接 入 25mL 含 2.0mg/L2， 4-D 的 MS 液体培养基中， 置于 100r/min 摇床上培养， 培养条件为 282， 每天 13h、 500lx 光照。 0059 通过这种培养方法培养的胚性悬浮细胞7天后即可增殖到原来的1.65倍， 且胚。
27、性 悬浮细胞质量一般。 0060 比较例 5 ： 0061 取苗床生长旺盛、 长 1cm 的徐 55-2 茎尖， 用 70的酒精表面杀毒 30s 后立即转入 0.1 HgCl23min， 而后勇无菌蒸馏水充分洗净。在解剖显微镜下剥取约 0.5-1.0mm 的茎尖 分省组织， 而后接种在含 2.0mg/L2， 4-D 的 MS 培养基上 (3蔗糖， 0.8琼脂， pH 5.8)， 在 282、 黑暗条件下进行培养， 诱导胚性愈伤组织。 0062 培养 8 周后， 将诱导得到的胚性愈伤组织破碎成小细胞团， 转入 100mL 三角瓶中， 加入 20mL 含 2， 4-D 的 MS 液体培养基， 该培。
28、养基的成分同上述胚性愈伤组织诱导培养基， 但是不加琼脂。将三角瓶放在水平摇床上进行振荡培养， 培养条件为 282， 每天 13h、 500lx 光照。悬浮培养 7-10 天继代一次。 0063 将 4.2mLSCV(SCV ： total ml of suspension culture) 胚性悬浮培养细胞接 入 25mL 含 2.0mg/L2， 4-D 的 MS 液体培养基中， 置于 100r/min 摇床上培养， 培养条件为 282， 每天 13h、 500lx 光照。 0064 通过这种培养方法培养的胚性悬浮细胞7天后即可增殖到原来的1.60倍左右， 且 胚性悬浮细胞质量较差。 0065。
29、 比较例 6 ： 0066 取苗床生长旺盛、 长 1cm 的徐 55-2 茎尖， 用 70的酒精表面杀毒 30s 后立即转入 0.1 HgCl23min， 而后勇无菌蒸馏水充分洗净。在解剖显微镜下剥取约 0.5-1.0mm 的茎尖 分省组织， 而后接种在含 2.0mg/L2， 4-D 的 MS 培养基上 (3蔗糖， 0.8琼脂， pH 5.8)， 在 282、 黑暗条件下进行培养， 诱导胚性愈伤组织。 0067 培养 8 周后， 将诱导得到的胚性愈伤组织破碎成小细胞团， 转入 100mL 三角瓶中， 加入 20mL 含 2， 4-D 的 MS 液体培养基， 该培养基的成分同上述胚性愈伤组织诱导。
30、培养基， 但是不加琼脂。将三角瓶放在水平摇床上进行振荡培养， 培养条件为 282， 每天 13h、 500lx 光照。悬浮培养 7-10 天继代一次。 0068 将 4.3mLSCV(SCV ： total ml of suspension culture) 胚性悬浮培养细胞接 入 25mL 含 2.0mg/L2， 4-D 的 MS 液体培养基中， 置于 100r/min 摇床上培养， 培养条件为 282， 每天 13h、 500lx 光照。 0069 通过这种培养方法培养的胚性悬浮细胞7天后即可增殖到原来的1.58倍左右， 且 说 明 书 CN 102864120 A 7 6/6 页 8 胚性悬浮细胞质量较差。 0070 上述的实施例对本发明优选方式作了详细说明， 但本发明不限于上述实施方式， 在本领域普通技术人员所具备的知识范围内， 还可以不脱离本发明宗旨的前提下作出各种 变化。 说 明 书 CN 102864120 A 8 。