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1、(10)申请公布号 CN 102851404 A (43)申请公布日 2013.01.02 CN 102851404 A *CN102851404A* (21)申请号 201210399819.0 (22)申请日 2012.10.19 C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (71)申请人 天津朝海科技有限公司 地址 300384 天津市南开区华苑产业区华天 道 2 号国际创业中心 6010 (72)发明人 不公告发明人 (54) 发明名称 一种检测 H3N8 型禽流感病毒的试剂盒 (57) 摘要 本发明涉及一种用纳米金。
2、颗粒检测 H3N8 型 禽流感病毒 DNA 经环介导等温核酸扩增技术扩增 后产物 DNA 的试剂盒， 属于生物检测技术领域。 本发明结合环介导等温核酸扩增技术和生物纳米 技术， 提高生物分子检测的灵敏度， 是一种操作简 单、 快速、 准确、 不需要专业仪器设备的方法， 可以 广泛应用于家庭诊断、 临床诊断、 传染病控制、 环 境监测、 检验检疫， 生物技术等领域的高灵敏度的 H3N8 型禽流感病毒检测。本发明试剂盒包括两部 分 ： (1) 标记有可以识别 H3N8 型禽流感病毒特定 序列的分子探针的纳米金颗粒 ； (2) 可以扩增待 检测样品中的H3N8型禽流感病毒DNA或先经过逆 转录过程后。
3、再扩增待检测样品中的 H3N8 型禽流 感病毒 RNA 的环介导等温核酸扩增体系。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 序列表 2 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 序列表 2 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种用纳米金颗粒检测 H3N8 型禽流感病毒经环介导等温核酸扩增技术扩增后产物 DNA的试剂盒， 其特征在于该试剂盒包括以下部分 ： (1)标记有可以识别H3N8型禽流感病毒 特定序列的分子探针的纳米金颗粒 ； (2) 可以扩增待检测样品中的 H3N8 型禽流感病毒 DNA 或。
4、先经过逆转录过程后再扩增待检测样品中的 H3N8 型禽流感病毒 RNA 的环介导等温核酸 扩增体系。 2. 根据权利要求 1， 该试剂盒的工作原理为 (1) 用环介导等温核酸扩增技术扩增待检 测样品中的 H3N8 型禽流感病毒 DNA 或先经过逆转录过程后用环介导等温核酸扩增技术扩 增待检测样品中的 H3N8 型禽流感病毒 RNA ； (2) 纳米金颗粒探针与环介导等温核酸扩增技 术产物 DNA 杂交 ； (3) 杂交引发纳米金颗粒聚集， 导致纳米金颗粒聚集处颜色改变， 以此判 断待检测样品是否含有 H3N8 型禽流感病毒 DNA 或 RNA。 3. 根据权利要求 1， 纳米金颗粒探针包括两个。
5、部分， 一是纳米尺度的金颗粒， 另一部分 是固定在纳米金颗粒表面的分子探针， 该探针可以识别 H3N8 型禽流感病毒的特定序列。 4.根据权利要求2， 待检测样品中环介导等温核酸扩增技术的扩增对象可以是H3N8型 禽流感病毒 DNA、 RNA 或 DNA 和 RNA 的混合物。 5. 根据权利要求 2， 纳米金颗粒探针和 H3N8 型禽流感病毒环介导等温核酸扩增技术 产物 DNA 杂交可以和环介导等温核酸扩增反应在相同反应条件下、 相同反应容器中同时进 行。 6.根据权利要求2， 纳米金颗粒探针和H3N8型禽流感病毒环介导等温核酸扩增技术产 物 DNA 杂交可以发生在溶液中或者固体表面。 7.。
6、根据权利要求2， 纳米金颗粒探针与H3N8型禽流感病毒环介导等温核酸扩增技术产 物 DNA 杂交引发溶液或固体表面颜色改变， 这种变化可由肉眼直接判断， 也可利用分光光 度计等光学仪器检测。 8.根据权利要求3， 分子探针是指可以识别H3N8型禽流感病毒环介导等温核酸扩增技 术产物 DNA 的功能分子， 这些分子包括 DNA， RNA， PNA， 蛋白质， 化学分子。 9. 根据权利要求 4， 相同反应条件包括但不限于 ： 溶液组成， 成分浓度， PH 值， 温度， 反 应时间等。 权 利 要 求 书 CN 102851404 A 2 1/3 页 3 一种检测 H3N8 型禽流感病毒的试剂盒 。
7、技术领域 0001 本发明涉及一种用纳米金颗粒检测 H3N8 型禽流感病毒 DNA 或 RNA 经环介导等温 核酸扩增技术扩增后产物 DNA 的试剂盒， 属于生物检测技术领域。 背景技术 0002 对基因 （DNA） 及其转录产物 （RNA） 的高灵敏性、 高特异性、 简单、 快速的检测， 对于 疾病的早期诊断和治疗以及在在卫生防疫、 环境监测、 检验检疫等领域都具有十分重要的 意义。 以往在这方面较为准确灵敏的检测方法有荧光标记法、 放射性标记等方法， 这些方法 都需要复杂的操作和特殊的设备， 应用范围很窄。1993 年 PE 公司的 Dr. Kary B. Mullis 发明了聚合酶链式反。
8、应 (Polymerase Chain Reaction)， 简称 PCR。随后 PCR 技术大规模的 应用于生物科研和临床治疗中， 对 DNA 的检测进入了新的时代， Dr. Mullis 为此还获得了 1993年的诺贝尔化学奖。 虽然PCR方法具有快速、 灵敏、 准确性高、 操作较简单等优点， 但由 于其反应进行和产品 DNA 的检测需要特殊的仪器， PCR 技术的使用一直被限定在专业的实 验室和医院里。 0003 2001 年日本荣研化学株式会社研制出了一种新型 DNA 扩增方式， 环介导等温核酸 扩增技术 （LAMP） 可以在恒温条件下实现 DNA 的高效快速扩增， 该方法反应条件简单。
9、， DNA 扩 增效率高， 因此在核酸检测方面具有明显优势。但是对 LAMP 扩增制备的 DNA 产物使用常规 的检测方法， 如电泳法， 荧光染料法等， 均无法排除 LAMP 扩增所带来的假阳性问题， 而且需 要特殊的仪器， 因此限制了 LAMP 技术的实际应用。 0004 禽流感， 全名鸟禽类流行性感冒， 是由病毒引起的动物传染病， 通常只感染鸟类， 少见情况会感染猪。禽流感病毒高度针对特定物种， 但在罕有情况下会跨越物种障碍感染 人。自从 1997 年在香港发现人类也会感染禽流感之后， 此病症引起全世界卫生组织的高度 关注。其后， 本病一直在亚洲区零星爆发， 但在 2003 年 12 月开。
10、始， 禽流感在东亚多国 主要在越南、 韩国、 泰国严重爆发， 并造成越南多名病人丧生。直到 2005 年中， 疫症不 但未有平息的迹象， 而且还不断扩散。现时远至东欧多个国家亦有案例。 0005 根据核蛋白的抗原性分类， 禽流感病毒则属甲型流感病毒， 甲型流感病毒是根据 位于其套膜上的血凝素及神经氨酸酶的抗原性分为若干亚型， 血凝素 （H） 有 16 个亚型 ； 神 经氨酸酶 （N） 有 9 个亚型。所有的这些亚型都可以感染鸟， 在禽类中高致病性的属于 H5、 H7 亚型。典型的鸡禽流感病毒是 H3N8， 造成 1983 年、 1984 年在美国东部大流行的是 H5N2。目 前东南亚地区出现的。
11、人类感染是H5N1型。 1997年发现的H5N1型毒株被认定是当时流行性 感冒的病源。1999 年， 香港出现过 H9N2 型禽流感的人类感染， 2003 年， 荷兰出现过 H7N7 型 禽流感的人类感染 ； 2006 年 1 月， 美国出现 H3N2。 0006 H3N8 型禽流感病毒的对人类的生活影响很大， 但是目前针对 H3N8 型禽流感病毒 缺乏简单、 快速、 便于使用和成本低廉的检测方法。 发明内容 说 明 书 CN 102851404 A 3 2/3 页 4 0007 本发明的目的是提出一种用纳米金颗粒检测 H3N8 型禽流感病毒专有的基因片段 经环介导等温核酸扩增技术扩增后产物D。
12、NA的试剂盒， 从而判定H3N8型禽流感病毒的存在 与否。 0008 本发明采用如下采用下述技术方案来解决上述问题 ： 本发明试剂盒包括两部分 ： （1） 标记有可以识别 H3N8 型禽流感病毒特定序列的分子探针的纳米金颗粒 ；（2） 可以扩 增待检测样品中的 H3N8 型禽流感病毒 DNA 或先经过逆转录过程后再扩增待检测样品中的 H3N8 型禽流感病毒 RNA 的环介导等温核酸扩增体系。 0009 本发明中， 试剂盒的工作原理为 ： 1 纳米金颗粒标记有能识别H3N8型禽流感病毒 特定序列的分子探针， 分子探针被固定在纳米金颗粒的表面。 0010 2待检测样品中的 H3N8 型禽流感病毒 。
13、DNA 分子或 H3N8 型禽流感病毒 RNA 经环 介导等温核酸扩增技术大量复制或先经逆转录过程后大量复制， H3N8 型禽流感病毒的目标 片段被放大 109 倍， 产生的扩增产物 DNA 具有多重重复序列。 0011 3混合纳米金颗粒和环介导等温核酸扩增体系， H3N8 型禽流感病毒经环介导等 温核酸扩增技术以后的产物 DNA 与纳米金颗粒上能识别 H3N8 型禽流感病毒特定序列的分 子探针杂交。 0012 4纳米金颗粒沿环介导等温核酸扩增技术产物 DNA 分子链形成聚集体 （如附图所 示） ， 进而引发纳米金颗粒聚集处 （例如溶液中、 固体表面等） 的颜色变化， 依据颜色变化可 以判断待。
14、测样品是否具有 H3N8 型禽流感病毒 DNA 或 RNA。 0013 本发明中， 纳米金颗粒探针包括两个部分， 一是纳米尺度的金颗粒， 另一部分是固 定在纳米金颗粒表面的分子探针， 该探针可以识别 H3N8 型禽流感病毒的特定序列。 0014 本发明中， 待检测样品中环介导等温核酸扩增技术的扩增对象可以是 H3N8 型禽 流感病毒 DNA、 RNA 或 DNA 和 RNA 的混合物。 0015 本发明中， 纳米金颗粒探针和 H3N8 型禽流感病毒环介导等温核酸扩增技术产物 DNA 杂交可以和环介导等温核酸扩增反应在相同反应条件下、 相同反应容器中同时进行。 0016 本发明中， 纳米金颗粒探。
15、针和 H3N8 型禽流感病毒环介导等温核酸扩增技术产物 DNA 杂交可以发生在溶液中或者固体表面。 0017 本发明中， 纳米金颗粒探针与 H3N8 型禽流感病毒环介导等温核酸扩增技术产物 DNA 杂交引发溶液或固体表面颜色改变， 这种变化可由肉眼直接判断， 也可利用分光光度计 等光学仪器检测。 0018 本发明中， 分子探针是指可以识别 H3N8 型禽流感病毒环介导等温核酸扩增技术 产物 DNA 的功能分子， 这些分子包括 DNA， RNA， PNA， 蛋白质， 化学分子。 0019 本发明中， 相同反应条件包括但不限于 ： 溶液组成， 成分浓度， PH 值， 温度， 反应时 间等。 002。
16、0 本发明的优势 ： 本发明试剂盒结合环介导等温核酸扩增技术和生物纳米技术， 提 高生物分子检测的灵敏度， 是一种操作简单、 快速、 准确、 成本低廉、 不需要专业仪器设备的 方法， 可以广泛应用于家庭诊断、 临床诊断、 传染病控制、 环境监测、 检验检疫， 生物技术等 领域的高灵敏度的 H3N8 型禽流感病毒检测。 附图说明 说 明 书 CN 102851404 A 4 3/3 页 5 0021 图 1 为标记有分子探针的纳米金颗粒与 H3N8 型禽流感病毒经环介导等温核酸扩 增技术以后的产物DNA杂交示意图， 纳米金颗粒沿柯H3N8型禽流感病毒环介导等温核酸扩 增技术产物 DNA 分子链形。
17、成聚集体。 具体实施例 0022 本发明试剂盒包括2管溶液， 一管中是标记有可以识别H3N8型禽流感病毒特定序 列的分子探针的纳米金颗粒溶液50 l， 一管中是250 l可以扩增待检测样品中的H3N8 型禽流感病毒 DNA 或先经过逆转录过程后再扩增待检测样品中的 H3N8 型禽流感病毒 RNA 的环介导等温核酸扩增体系。 0023 纳米金颗粒溶液中含有直径为20 nm的纳米金颗粒， 浓度为1.2 nM， 纳米金颗粒表 面标记有巯基修饰的 DNA 探针。 0024 环介导等温核酸扩增体系成分如下 ： 0.2 M F3和B3 引物, 1.6 M FIP和BIP 引物, 0.4 M betaine。
18、 (SigmaAldrich, St. Louis, MO), 10 mM MgSO4, 1.4 mM dNTPs, 1 ThermoPol reaction buffer (New England Biolabs, Ipswich, MA), 80 U Bst DNA polymerase (New England Biolabs), 6.25 U AMV 逆转录酶 (Invitrogen, Carlsbad, CA)。 0025 巯基修饰的 DNA 探针序列 ： 5-ATGACTCAAATGTCAAGAACAAAAAAAAAAA-SH-3。 0026 H3N8 型禽流感病毒的 F3 引物序。
19、列 ： 5-CTTTACGATAAGGTCAGACT-3。 0027 H3N8 型禽流感病毒的 B3 引物序列 ： 5-TACAGCTTAAGGATAATGCAA-3。 0028 H3N8 型禽流感病毒的 FIP 引物序列 ： 5-AAGAGTTGGGTAACGGTTGTTTCGAGTTCTATCACAAATGT-3。 0029 H3N8 型禽流感病毒的 BIP 引物序列 ： 5-AATAATGAATGTATGGAAAGTGTAAGAAACGGAACGTA-3。 0030 操作过程如下 ： 1. 向装有环介导等温核酸扩增体系的管中加入 10 l 提取的核 酸或者混合样品。 0031 2. 将装。
20、有混合物的管放入 60 C 的水浴中 30 分钟。 0032 3. 再向步骤 2 中的管中加入纳米金颗粒溶液， 此时混合后的溶液为红色。 0033 4.60 C 水浴反应 15 分钟。 0034 观察反应后管中溶液的颜色， 溶液保持红色不变则不含有 H3N8 型禽流感病毒感 染特异性 RNA 或 H3N8 型禽流感病毒 DNA ； 如果溶液变为浅紫色， 则判定样本中含有 H3N8 型 禽流感病毒感染特异性的 RNA 或 H3N8 型禽流感病毒 DNA。 说 明 书 CN 102851404 A 5 1/2 页 6 SEQUENCE LISTING 天津朝海科技有限公司 一种检测 H3N8 型禽。
21、流感病毒的试剂盒 Demo 5 PatentIn version 3.5 1 31 DNA Avian influenza virus 1 atgactcaaa tgtcaagaac aaaaaaaaaa a 31 2 20 DNA Avian influenza virus 2 ctttacgata aggtcagact 20 3 21 DNA Avian influenza virus 3 tacagcttaa ggataatgca a 21 序 列 表 CN 102851404 A 6 2/2 页 7 4 41 DNA Avian influenza virus 4 aagagttggg taacggttgt ttcgagttct atcacaaatg t 41 5 38 DNA Avian influenza virus 5 aataatgaat gtatggaaag tgtaagaaac ggaacgta 38 序 列 表 CN 102851404 A 7 1/1 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 102851404 A 8 。