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1、(10)申请公布号 CN 102851298 A (43)申请公布日 2013.01.02 CN 102851298 A *CN102851298A* (21)申请号 201210310236.6 (22)申请日 2012.08.29 C12N 15/12(2006.01) C12N 15/10(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 南京市第二医院 地址 210003 江苏省南京市鼓楼区钟阜路 1 号 1 (72)发明人 常家宝 (74)专利代理机构 南京经纬专利商标代理有限 公司 32200 代理人 李纪昌 (54) 发明名称 评判 - 干扰素治疗慢性乙肝疗。
2、效的基因位 点及应用 (57) 摘要 评判 - 干扰素治疗慢性乙肝疗效的基因 位点及其应用， 该基因由以下方法制得 ： 基因组 DNA 提取样本处理 ； 引物设计与合成 ； 设计 PCR 引物 ： 正义引物如 SEQIDNO.1 所示， 反义引物如 SEQIDNO.1 所示 ； PCR 反应 ； 扩增产物的分析 ： PCR 产物经 1.5琼脂糖电泳， 观察结果， 扩增产 物长 246bp。本方案已经找到相关的基因位点用 来预先评判干扰素治疗乙肝的疗效， 这样只要预 先对想要采用干扰素治疗慢性乙肝的患者进行采 血检测， 就可以判断治疗方案的可行性， 减少因盲 目进行干扰素治疗中出现的经济和时间损。
3、失， 未 来我们将会制作出相关的试剂盒， 这样就可以快 速、 有效的给出检测结果， 费用上也可减少， 市场 前景可观。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 2 页 序列表 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 2 页 序列表 1 页 1/1 页 2 1. 评判 - 干扰素治疗慢性乙肝疗效的基因位点， 其特征在于该基因由以下方法制 得 ： 基因组 DNA 提取样本处理 ： 抽取静脉全血 5mL， 由实验室提取纯化 DNA ； 引物设计与合 成 ： 以 NCBI 上序列为模板， 运用 Primer premier5.0 引物。
4、设计软件 ； 设计 PCR 引物 ： 正义 引物如 SEQ ID NO.1 所示， 反义引物如 SEQ ID NO.1 所示 ； PCR 反应条件 ： 50L 反应体积 中， 含 10 倍反应缓冲液 5L， 氯化镁溶液 (25mmol/L) 4.5L， 4 种三磷酸脱氧核糖核酸 (dNTP) (200mmol/L)4L， 两种引物各 10pmol， Taq DNA 多聚酶 （5 U/mL） 0.5L， 加入纯化 好的DNA模板10L， 加水至50L， 混匀上机， 94预变性3 min， 94变性30 sec， 54 退 火 30sec， 72延伸 30 sec ； 35 个循环， 最后 72延。
5、伸 10 min ； 扩增产物的分析 ： PCR 产 物经 1.5琼脂糖电泳， 观察结果， 扩增产物长 246 bp。 2. 权利要求 1 所述基因位点在制备评判 - 干扰素治疗慢性乙肝疗效药物中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102851298 A 2 1/2 页 3 评判 - 干扰素治疗慢性乙肝疗效的基因位点及应用 0001 技术领域 本发明属于评估治疗慢性乙肝药物的有效性的基因位点及应用技术领域， 具体涉及一 种评判 - 干扰素治疗慢性乙肝疗效的基因位点及应用。 0002 背景技术 0003 乙肝病毒检测为阳性， 病程超过半年或发病日期不明确而临床有慢性肝炎表现者 均可诊断为慢性乙肝。
6、。临床表现为 ： 乏力、 畏食、 恶心、 腹胀、 肝区疼痛等症状。肝大， 质地呈 中度硬度， 有轻压痛。病情较重者可伴有慢性肝病面容、 蜘蛛痣、 肝掌、 脾大， 肝功能可时有 异常或持续异常。 0004 慢性化因素有 ：（1） 免疫功能低下者。如肾移植、 肿瘤、 白血病、 艾滋病、 血液透析 患者感染乙肝病毒后常易演变为慢性肝炎。乙型肝炎发病的急性期使用肾上腺糖皮质激 素等免疫抑制剂治疗者， 常能破坏患者体内的免疫平衡， 也容易使急性肝炎转变为慢性肝 炎。 （2） 既往有其它肝炎或肝病史者， 或有并发病症者， 再感染乙型肝炎病毒时不仅容易急 转慢， 而且预后较差。 如原有酒精中毒性肝硬变或并发。
7、血吸虫病、 华支星吸虫病、 疟疾、 结核 病、 溃疡病、 糖尿病等。 （3） 急性或隐匿起病的无黄疸型肝炎患者比急性黄疸型肝炎患者容 易发展为慢性。这与不能得到及时休息和治疗有一定关系。 （4） 最初感染乙肝病毒时的患 者年龄。资料表明 ： 新生儿感染乙肝病毒， 约 90% 95% 要成为慢性携带者 ； 儿童期感染乙 肝病毒后约 20% ； 成人约 10% 发展为带毒状态。 （5） 其它因素。如急性期的肝炎患者过度劳 累、 酗酒、 性生活过度、 吸毒、 应用损害肝脏的药物、 营养不良、 有其它病原微生物的严重感 染或滥用药品等均可由急性转为慢性。 0005 目前国内外公认有效的抗 HBV 药物。
8、主要包括干扰素类和核苷 ( 酸 ) 类似物， 并 各有其优缺点。前者的优点是疗程相对固定， HBeAg 血清学转换率较高， 疗效相对持久， 耐 药变异较少， 其缺点是需要注射给药， 不良反应较明显， 不适于肝功能失代偿者。后者的优 点是口服给药， 抑制病毒作用强， 不良反应少而轻微， 可用于肝功能失代偿者， 其缺点是疗 程相对不固定， HBeAg 血清学转换率低， 疗效不够持久， 长期应用可产生耐药变异， 停药后 可出现病情恶化等。临床医生应根据自己的专业知识和临床经验， 在综合考虑患者具体病 情及其个人意愿的基础上， 在本 指南 的原则框架下确定个体化的治疗方案 。 0006 治疗慢性乙肝的。
9、方法主要有口服核苷类药物抗病毒和注射干扰素抗病毒， 其中注 射干扰素治疗地位很重要， 但是目前没有相关手段预先评判注射干扰素的疗效。 0007 发明内容 0008 解决的技术问题 ： 本发明提供一种评判 - 干扰素治疗慢性乙肝疗效的基因位点 及应用。通过测定目标基因位点的存在， 预先评判注射干扰素治疗慢乙肝的应答效果。 0009 技术方案 ： 评判 - 干扰素治疗慢性乙肝疗效的基因位点， 该基因由以下方法制 说 明 书 CN 102851298 A 3 2/2 页 4 得 ： 基因组 DNA 提取样本处理 ： 抽取静脉全血 5mL， 由实验室提取纯化 DNA ； 引物设计与合 成 ： 以 NC。
10、BI 上序列为模板， 运用 Primer premier5.0 引物设计软件 ； 设计 PCR 引物 ： 正义 引物如 SEQ ID NO.1 所示， 反义引物如 SEQ ID NO.1 所示 ； PCR 反应条件 ： 50L 反应体积 中， 含 10 倍反应缓冲液 5L， 氯化镁溶液 (25mmol/L) 4.5L， 4 种三磷酸脱氧核糖核酸 (dNTP) (200mmol/L)4L， 两种引物各 10pmol， Taq DNA 多聚酶 （5 U/mL） 0.5L， 加入纯化 好的DNA模板10L， 加水至50L， 混匀上机， 94预变性3 min， 94变性30 sec， 54 退 火 3。
11、0sec， 72延伸 30 sec ； 35 个循环， 最后 72延伸 10 min ； 扩增产物的分析 ： PCR 产 物经 1.5琼脂糖电泳， 观察结果， 扩增产物长 246 bp。 0010 所述基因位点在制备评判 - 干扰素治疗慢性乙肝疗效药物中的应用。 0011 有益效果 ： 本方案已经找到相关的基因位点用来预先评判干扰素治疗乙肝的疗 效， 这样只要预先对想要采用干扰素治疗慢性乙肝的患者进行采血检测， 就可以判断治疗 方案的可行性， 减少因盲目进行干扰素治疗中出现的经济和时间损失， 未来我们将会制作 出相关的试剂盒， 这样就可以快速、 有效的给出检测结果， 费用上也可大大减少， 市场。
12、前景 可观。 具体实施方式 0012 以下通过实施例形式， 对本发明的上述内容再作进一步的详细说明， 但不应将此 理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例， 凡基于本发明上述内容所实现的技术均 属于本发明的范围。 0013 实施例 1 ： 1. 基因组 DNA 提取样本处理 ： 抽取静脉全血 5mL， 由实验室提取纯化 DNA ； 2. 引物设计与合成 ： 以 NCBI 上序列为模板， 运用 Primer premier5.0 引物设计软件 ； 3. 设计 PCR 引物 ： 正义引物 （P1） 5 -CACGTTTCTTGGAGTACTCTAC-3 ， 反义引物 （P2） 5 -CACCAA。
13、CCCCGTAGTTGTGTC-3 ； 4.PCR 反应条件 ： 50L 反应体积中， 含 10 倍反应缓冲液 5L， 氯化镁溶液 (25mmol/ L) 4.5L， 4 种三磷酸脱氧核糖核酸 (dNTP) (200mmol/L)4L， 两种引物各 10pmol， Taq DNA 多聚酶 （5 U/mL） 0.5L， 加入纯化好的 DNA 模板 10L， 加水至 50L， 混匀上机， 94 预变性3 min， 94变性30 sec， 54 退火30sec， 72延伸30 sec ； 35个循环， 最后72 延伸 10 min ； 5. 扩增产物的分析 ： PCR 产物经 1.5琼脂糖电泳， 观。
14、察结果， 扩增产物长 246 bp。 0014 本方案已经找到相关的基因位点用来预先评判干扰素治疗乙肝的疗效， 这样只要 预先对想要采用干扰素治疗慢性乙肝的患者进行采血检测， 就可以判断治疗方案的可行 性， 减少因盲目进行干扰素治疗中出现的经济和时间损失， 未来我们将会制作出相关的试 剂盒， 这样就可以快速、 有效的给出检测结果， 费用上也可大大减少， 市场前景可观。 说 明 书 CN 102851298 A 4 1/1 页 5 序列表 南京市第二医院 评判 - 干扰素治疗慢性乙肝疗效的基因位点及应用 2 PatentIn version 3.3 1 22 DNA 人工序列 1 cacgtttctt ggagtactct ac 22 2 21 DNA 人工序列 2 caccaacccc gtagttgtgt c 21 序 列 表 CN 102851298 A 5 。