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1、(10)申请公布号 CN 102864235 A (43)申请公布日 2013.01.09 CN 102864235 A *CN102864235A* (21)申请号 201210376593.2 (22)申请日 2012.09.29 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 山东大学齐鲁医院 地址 250012 山东省济南市历下区文化西路 107 号 (72)发明人 苑存忠 孔北华 杨其峰 闫实 刘晓燕 杨宁 (74)专利代理机构 济南圣达知识产权代理有限 公司 37221 代理人 彭成 (54) 发明名称 一种用于检测卵巢癌易感性的分子标。
2、记、 试 剂盒及其检测方法 (57) 摘要 本发明公开了一种用于检测卵巢癌易感性的 分子标记， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 1 所示， 第 1098位存在一个单核苷酸多态性 ： GT。 一种用于 检测卵巢癌易感性的试剂盒， 包括特异性引物， 该 引物为一对， 具有SEQ ID NO ： 2和SEQ ID NO ： 3的 序列。一种体外检测样品是否存在 GADD45A 基因 的单核苷酸多态性的方法， 步骤如下 ：（1） 用特异 性引物扩增样品的 GADD45A 基因， 得到扩增产物 ； （2） 对扩增产物进行序列测定， 检测扩增产物中是 否存在以下单核苷酸多态性 ： 1098GT。本。
3、发明的 方法， 检测简单、 准确、 快速， 特异性强， 对于高危 人群或易感个体及卵巢癌患者实施有效的早诊、 早治和个体化防治具有重要意义。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 5 页 序列表 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 5 页 序列表 3 页 1/2 页 2 1. 一种用于检测卵巢癌易感性的分子标记， 其特征在于 ： 其核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 1 所示， 第 1098 位存在一个单核苷酸多态性 ： GT， 即第 1098 位的碱基包括碱基 G 和碱基 T 两种情形 ： cagtggctgg ta。
4、ggcagtgg ctgggaggca gcggcccaat tagtgtcgtg cggcccgtgg 60 cgaggcgagg tccggggagc gagcgagcaa gcaaggcggg aggggtggcc ggagctgcgg 120 cggctggcac aggaggagga gcccgggcgg gcgaggggcg gccggagagc gccagggcct 180 gagctgccgg agcggcgcct gtgagtgagt gcagaaagca ggcgcccgcg cgctagccgt 240 ggcaggagca gcccgcacgc cgcgctctct c。
5、cctgggcga cctgcagttt gcaatatgac 300 tttggaggaa ttctcggctg gagagcagaa gaccgaaagg tgagtcggcc tgcggactct 360 tccggcccga acttctctta cctaccccgc gctccccggt gcagccgggc tgtggaaggc 420 ttgcagggga ggaagctaaa aagtttgcac agggcaactc ccgcccttgc tccctcggga 480 ctctccgtgg agctcccacg gactgaaaga gcgtgccccc caacccgaac。
6、 gagccccgcc 540 ggggcctttg caaagggcag cagtggccgt cgctgcccgt gcggctcccg tggctggcag 600 cctgtggcag gggcactctc gggacttctc acgggacgcc cggtccttgg gcgtgcaggg 660 gtcatggggg gtgacggggc cgcgggagcg ccgggttttc gtagagccca ggtgcgcggt 720 ggtgcttgca ttcgagaggg aggggcgtgg taccggacga ggggggcggc gatggccccg 780 aggg。
7、caccgg ggctgacggg acccctcgcc cttgcccgcg tgtaggatgg ataaggtggg 840 ggatgccctg gaggaagtgc tcagcaaagc cctgagtcag cgcacgatca ctgtcggggt 900 gtacgaagcg gccaagctgc tcaacgtgta agtggggccc ttgcgcgtcc cccatggcac 960 cccttcccgc cccagcccgg gaggtcgcct tggctgggcg cccctcgccc ggccgcgcca 1020 cttcctgtcg cttttctgcc t。
8、gtctcggaa gggagggggc gagcgggccg ggcggcgacc 1080 cccagggacc cgggcagrgg ttgagggcgc ccgcgcttct gcgctcactg gccccgcccg 1140 1098 ctgcccccag cgaccccgat aacgtggtgt tgtgcctgct ggcggcggac gaggacgacg 1200 acagagatgt ggctctgcag atccacttca ccctgatcca ggcgttttgc tgcgagaacg 1260 acatcaacat cctgcgcgtc agcaacccgg g。
9、ccggctggc ggagctcctg ctcttggaga 1320 ccgacgctgg ccccgcggcg agcgagggcg ccgagcagcc cccggacctg cactgcgtgc 1380 tggtgacggt aagggactgg gggactgcag cctgcagggt agagccccgg aaggacggga 1440 gtcagggctg ggttgcctga ttgtggatct gtggtaggtg ggggtcagga gggtggctgc 1500 ctttgtccga ctagagtgtg gctggacttt cagccgagat gtgcta。
10、gttt catcaccagg 1560 attttctgtg gtacagaaca tgtctaagca tgctggggac tgccagcagc ggaagagatc 1620 cctgtgagtc agcagtcagc ccagctactc cctacctaca tctgcactgc ctcccgtgac 1680 taattccttt agcagggcag attagataaa gccaaatgaa ttcctggctc acccctcatt 1740 aaggagtcag cttcattctc tgccagtcag agctaaaaat agaaattgtg taggagacaa 。
11、1800 accttgttaa ttccctagaa atacattaag aggatagagt ggaatttttt ttctctgcaa 1860 tcttgcattt ttttaatggc tctttttttt tttcctgata aaaacctttg gtaggtaggg 1920 aagttatgtt ttcaggggta aatgtgctac ttttgtcttc taaattttgc tcttttttga 1980 ctggtctagt caagtgacag cccgattatt ttgctactcc ttaaaagtac tattctgtct 2040 cttggagtat 。
12、ggttgatggc aattccagtt aactgctgtg cagctctcat ctcattgtgc 2100 权 利 要 求 书 CN 102864235 A 2 2/2 页 3 acacagcatg gaaatctttc tcaaaactgt ttcactcagg tcagggtaac aagtttggta 2160 gagcaaaccg gtgaatgata ctctcatgca aaactgaaca gatatgcaaa catatgtatg 2220 tggttcagct tgggttgcat gggttcagac tttgcaatgt gtagtttaat aggtaatt。
13、ac 2280 ccttaacgct tttgcaggga acccaactac cttgaagaaa ctttaatttt tttgtgcttc 2340 taatttgtct ccatgtcaca tagccaaaat atagaatgtt caagtgtttt ctcctcaaaa 2400 gtataattac tagaatatac tggtttttaa aataagttta tttttataaa tttgtttcca 2460 g 2461。 2. 一种用于检测卵巢癌易感性的试剂盒， 其特征在于 ： 包括特异性引物， 该引物为一 对， 具有 SEQ ID NO ： 2 和 SEQ I。
14、D NO ： 3 的序列。 3. 根据权利要求 1 所述的用于检测卵巢癌易感性的试剂盒， 其特征在于 ： 还包括 PCR 反应液， PCR 反应液由 dNTP、 Mg2+、 Taq 酶和 Buffer 组成。 4. 一种体外检测样品是否存在 GADD45A 基因的单核苷酸多态性的方法， 其特征在于 ： 步骤如下 ： （1） 用 GADD45A 基因特异性引物扩增样品的 GADD45A 基因， 得到扩增产物 ； 所述引物为 一对， 具有 SEQ ID NO ： 2 和 SEQ ID NO ： 3 的序列 ； （2）对扩增产物进行序列测定， 检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性 ： 1098G。
15、T ； 1098GT 突变位置编号基于 SEQ ID NO:1 的序列。 权 利 要 求 书 CN 102864235 A 3 1/5 页 4 一种用于检测卵巢癌易感性的分子标记、 试剂盒及其检测 方法 技术领域 0001 本发明涉及一种用于检测卵巢癌易感性的分子标记、 试剂盒及其检测方法， 具体 地涉及 GADD45A 基因的单核苷酸多态性 （single nucleotide polymorphism， SNP） 及其与 卵巢癌的相关性， 及检测这些 SNP 的方法和试剂盒， 属于分子生物学和医学领域。 背景技术 0002 卵巢癌是致死率最高的女性生殖系统肿瘤， 2008 年全球新发病例 。
16、225500 人， 死亡 140200 人。由于起病隐匿， 症状不明显， 多数患者发现时已届晚期， 晚期卵巢癌患者 5 年生 存率仅为 30 45左右， 预后差， 而早期卵巢癌患者 5 年生存率高达 90， 这提示我们提 高卵巢癌患者预后和生存的关键是早诊、 早治， 因此探讨卵巢癌发生发展的生物学机制， 寻 找鉴定卵巢癌易感人群的分子标记， 卵巢癌患者分子分型和预后预测的分子标记， 对于高 危人群或易感个体及卵巢癌患者实施有效的早诊、 早治和个体化防治具有重要意义。 0003 现有技术中， 虽然已经有超过 200 个候选基因和 20 个遗传区域的 1100 个遗传变 异与卵巢癌易感性相关， 但。
17、是与卵巢癌相关性很强的遗传变异却很少。并且没有 GADD45A 基因与卵巢癌相关性的报道， 更没有 GADD45A 基因 SNP 与卵巢癌相关性的报道。因此， 本领 域急需进一步寻找卵巢癌易感基因， 开发检测卵巢癌高危人群和易感个体的方法、 试剂盒， 以及相关的治疗药物。 发明内容 0004 针对上述现有技术， 本申请的发明人经过深入而广泛的研究， 对大量候选基因的 SNP 进行了测定和分析， 首次发现 GADD45A 和卵巢癌易感性密切相关， 可作为卵巢癌易感性 检测或者早期诊断的分子标记， 因此， 本发明提供了一种用于检测卵巢癌易感性的试剂盒 及其方法， 以及体外检测样品是否存在 GADD。
18、45A 基因的单核苷酸多态性的方法。 0005 本发明是通过以下技术方案实现的 ： 0006 一种用于检测卵巢癌易感性的分子标记， 其核苷酸序列如SEQ ID NO ： 1所示， 其与 正常的 GADD45A 基因相比， 区别在于 ： 第 1098 位存在一个单核苷酸多态性 ： GT， 即第 1098 位的碱基包括碱基 G 和碱基 T 两种情形， 当为碱基 G 时， 为正常的 GADD45A 基因， 当为碱基 T 时， 为突变的 GADD45A 基因 ： 0007 cagtggctgg taggcagtgg ctgggaggca gcggcccaat tagtgtcgtg cggcccgtgg。
19、 60 0008 cgaggcgagg tccggggagc gagcgagcaa gcaaggcggg aggggtggcc ggagctgcgg 120 0009 cggctggcac aggaggagga gcccgggcgg gcgaggggcg gccggagagc gccagggcct 180 0010 gagctgccgg agcggcgcct gtgagtgagt gcagaaagca ggcgcccgcg cgctagccgt 240 0011 ggcaggagca gcccgcacgc cgcgctctct ccctgggcga cctgcagttt gcaatatgac 。
20、300 0012 tttggaggaa ttctcggctg gagagcagaa gaccgaaagg tgagtcggcc tgcggactct 360 0013 tccggcccga acttctctta cctaccccgc gctccccggt gcagccgggc tgtggaaggc 420 说 明 书 CN 102864235 A 4 2/5 页 5 0014 ttgcagggga ggaagctaaa aagtttgcac agggcaactc ccgcccttgc tccctcggga 480 0015 ctctccgtgg agctcccacg gactgaaaga gc。
21、gtgccccc caacccgaac gagccccgcc 540 0016 ggggcctttg caaagggcag cagtggccgt cgctgcccgt gcggctcccg tggctggcag 600 0017 cctgtggcag gggcactctc gggacttctc acgggacgcc cggtccttgg gcgtgcaggg 660 0018 gtcatggggg gtgacggggc cgcgggagcg ccgggttttc gtagagccca ggtgcgcggt 720 0019 ggtgcttgca ttcgagaggg aggggcgtgg ta。
22、ccggacga ggggggcggc gatggccccg 780 0020 agggcaccgg ggctgacggg acccctcgcc cttgcccgcg tgtaggatgg ataaggtggg 840 0021 ggatgccctg gaggaagtgc tcagcaaagc cctgagtcag cgcacgatca ctgtcggggt 900 0022 gtacgaagcg gccaagctgc tcaacgtgta agtggggccc ttgcgcgtcc cccatggcac 960 0023 cccttcccgc cccagcccgg gaggtcgcct tg。
23、gctgggcg cccctcgccc ggccgcgcca 1020 0024 cttcctgtcg cttttctgcc tgtctcggaa gggagggggc gagcgggccg ggcggcgacc 1080 0025 cccagggacc cgggcagrgg ttgagggcgc ccgcgcttct gcgctcactg gccccgcccg 1140 0026 1098 0027 ctgcccccag cgaccccgat aacgtggtgt tgtgcctgct ggcggcggac gaggacgacg 1200 0028 acagagatgt ggctctgcag。
24、 atccacttca ccctgatcca ggcgttttgc tgcgagaacg 1260 0029 acatcaacat cctgcgcgtc agcaacccgg gccggctggc ggagctcctg ctcttggaga 1320 0030 ccgacgctgg ccccgcggcg agcgagggcg ccgagcagcc cccggacctg cactgcgtgc 1380 0031 tggtgacggt aagggactgg gggactgcag cctgcagggt agagccccgg aaggacggga 1440 0032 gtcagggctg ggttgc。
25、ctga ttgtggatct gtggtaggtg ggggtcagga gggtggctgc 1500 0033 ctttgtccga ctagagtgtg gctggacttt cagccgagat gtgctagttt catcaccagg 1560 0034 attttctgtg gtacagaaca tgtctaagca tgctggggac tgccagcagc ggaagagatc 1620 0035 cctgtgagtc agcagtcagc ccagctactc cctacctaca tctgcactgc ctcccgtgac 1680 0036 taattccttt ag。
26、cagggcag attagataaa gccaaatgaa ttcctggctc acccctcatt 1740 0037 aaggagtcag cttcattctc tgccagtcag agctaaaaat agaaattgtg taggagacaa 1800 0038 accttgttaa ttccctagaa atacattaag aggatagagt ggaatttttt ttctctgcaa 1860 0039 tcttgcattt ttttaatggc tctttttttt tttcctgata aaaacctttg gtaggtaggg 1920 0040 aagttatgt。
27、t ttcaggggta aatgtgctac ttttgtcttc taaattttgc tcttttttga 1980 0041 ctggtctagt caagtgacag cccgattatt ttgctactcc ttaaaagtac tattctgtct 2040 0042 cttggagtat ggttgatggc aattccagtt aactgctgtg cagctctcat ctcattgtgc 2100 0043 acacagcatg gaaatctttc tcaaaactgt ttcactcagg tcagggtaac aagtttggta 2160 0044 gagca。
28、aaccg gtgaatgata ctctcatgca aaactgaaca gatatgcaaa catatgtatg 2220 0045 tggttcagct tgggttgcat gggttcagac tttgcaatgt gtagtttaat aggtaattac 2280 0046 ccttaacgct tttgcaggga acccaactac cttgaagaaa ctttaatttt tttgtgcttc 2340 0047 taatttgtct ccatgtcaca tagccaaaat atagaatgtt caagtgtttt ctcctcaaaa 2400 0048 g。
29、tataattac tagaatatac tggtttttaa aataagttta tttttataaa tttgtttcca 2460 0049 g 2461 0050 一种用于检测卵巢癌易感性的试剂盒， 包括特异性引物， 该引物为一对， 具有 SEQ ID NO ： 2和SEQ ID NO ： 3的序列， 能够特异性的扩增GADD45A基因的引物， 能特异性地扩增 出长度 200 2700bp。 说 明 书 CN 102864235 A 5 3/5 页 6 0051 进一步地， 试剂盒还包括 PCR 反应液， PCR 反应液由 dNTP、 Mg2+、 Taq 酶和 Buffer 组 成。。
30、PCR 反应液中各组分的用量关系为常规的， 对所属领域技术人员而言是公知常识。 0052 一种体外检测样品是否存在 GADD45A 基因的单核苷酸多态性的方法， 步骤如下 ： 0053 （1） 用 GADD45A 基因特异性引物扩增样品的 GADD45A 基因， 得到扩增产物 ； 所述引 物为一对， 具有 SEQ ID NO ： 2 和 SEQ ID NO ： 3 的序列 ； 0054 （2） 对扩增产物进行序列测定， 检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性 ： 1098GT ； 1098GT 突变位置编号基于 SEQ ID NO:1 的序列。 0055 一种对个体的卵巢癌易感性或患病风险进。
31、行检测或诊断的方法， 步骤如下 ： 0056 检测该个体的 GADD45A 基因、 转录本和 / 或蛋白， 并与正常的 GADD45A 基因、 转录 本和 / 或蛋白进行比较， 存在差异就表明该个体患卵巢癌的可能性低于正常人群。所述差 异是指是否存在单核苷酸多态性 ： 1098GT ； 1098GT 突变位置编号基于 SEQ ID NO:1 的序 列。 0057 本发明的用于检测卵巢癌易感性的分子标记、 试剂盒及其方法， 以及体外检测样 品是否存在 GADD45A 基因的单核苷酸多态性的方法， 检测简单、 准确、 快速， 特异性强， 对于 高危人群或易感个体及卵巢癌患者实施有效的早诊、 早治和。
32、个体化防治具有重要意义。 具体实施方式 0058 下面结合实施例对本发明作进一步的说明。 0059 实施例 1 GADD45A 基因突变的检测及与卵巢癌的关联分析 0060 1.1 研究对象 0061 选取卵巢癌患者 139 例， 2008 年 9 月 2011 年 4 月于山东大学齐鲁医院确诊治 疗， 临床资料从病历获得。年龄匹配的对照病人 189 例， 为齐鲁医院健康体检中心健康查体 妇女。 大部分受试者均为山东省内汉族居民。 取受试人员外周血1.5ml， 于-80冷藏保存。 所有受试人员均按照山东大学齐鲁医院伦理委员会要求征得同意。 0062 1.2DNA 提取 0063 用常规酚氯仿法。
33、提取受试者外周血 DNA， 具体如下 ： 0064 （1） 取 400ul 血加于 1.5ml 离心管中。 0065 （2） 加入 800ul PBS, 混匀， 3500g， 15min， 弃上清 ； 重复一遍。 0066 （3） 加入 400ul 裂解液， 37， 1h。 0067 （4） 加入蛋白酶 K 4ul， 浓度 200ug/ml。 0068 （5） 55水浴消化过夜 （4-12h） 。 0069 （6） 加入 400ul 的 Tris 饱和酚， 混合摇动 10min。 0070 （7） 5000g， 15min， 取水相。 0071 （8） 加入 100ul NaAc， 800ul。
34、 无水乙醇， -20， 20min。 0072 （9） 12000g， 5min， 弃上清。 0073 （10） 600ul 70% 冰乙醇， 12000g， 5min， 弃上清， 重复一次。 0074 （11） 12000rpm 离心， 10 分钟。弃上清， 晾干。溶于 100l TE。 0075 （12） 测定浓度和纯度， 分装， 冻存于 -80。 0076 1.3 引物、 PCR 扩增和测序 说 明 书 CN 102864235 A 6 4/5 页 7 0077 从GenBank下载GADD45A基因组序列 （GenBank序列 ； AY135686.1 ； GI:22122007） ，。
35、 用 primer premier5.0 设计引物。具体引物详细信息见表 1。 0078 表 1 引物序列表 0079 引物名称 序列 SEQ ID NO ： 上游引物 5AGTTTGCACAGGGCAACTCC3 2 下游引物 5CCTGCTAAAGGAATTAGTCACG3 3 0080 PCR 扩增条件 ： 94 3 分钟，（94 30 秒， 60 30 秒， 72 40 秒） 35， 72 7 分 钟， 10保温。PCR 扩增产物为 1255bp。 0081 PCR 扩增产物送交上海博尚生物技术公司测序， 测序结果应用软件 Meglign 7.0 和 Chromas 2.33 进行检验。
36、和分析， 本实施采用了反向测序， 经分析， 发现存在以下 SNP ： 1098GT。 0082 1.4SNP 分型和关联分析 0083 应用卡方 （X2） 检验对受试人员位点的分布进行统计分析 ； 当一个单元格的期望 个数少于 5 个时应用 Fisher 精确检验进行分析。所有 P 值均为双侧概率， 当 PT)位点与卵巢癌发病显著相关， 其 中加性遗传模型 （G/G vs.G/T vs T/T） 的 P 值为 0.0028。显性遗传模型 （G/G+G/T vs T/T） 的 P 值为 0.048（OR=0.545， 95%CI0.297 1.000） 。隐性遗传模型 （G/G vs G/T+T。
37、/T） 的 P 值为 0.000839 （OR=0.470,95%CI0.301 0.734） ， T 等位基因为保护性基因 （P=0.0005， OR=0.569， 95%CI0.412 0.784） 。详细结果见表 2。 0085 表 2 1098GT 位点基因型及等位基因在卵巢癌组和健康对照组中的分布 说 明 书 CN 102864235 A 7 5/5 页 8 0086 0087 0088 实施例 2 卵巢癌易感性检测试剂盒 0089 由于 SEQ ID NO ： 1 中 1098GT 的突变与卵巢癌发表高度相关， 因此可基于这个突 变设计 GADD45A 基因特异性引物再以病人的 D。
38、NA 为模板进行扩展检测。 0090 制备一试剂盒 （100 人次） ， 它含有如表 3 所示的物质 ： 0091 表 3 0092 0093 抽取受试者外周血 2ml， 常规方法提取 DNA。利用卵巢癌易感性检测试剂盒进行 PCR反应， 将反应产物进行测序， 将测序结果利用Meglign 7.0和Chromas 2.33软件进行检 验和分析。检测结果含有 rs2759219(1098GT) 的受试者卵巢癌易感性低于正常人群。 0094 应理解， 在阅读了本发明的上述内容之后， 本领域的技术人员可以对本发明做各 种修改或改动， 但这些改动或修改的等价形式同样落在本发明所限定的范围内。 说 明 书 CN 102864235 A 8 1/3 页 9 0001 0002 序 列 表 CN 102864235 A 9 2/3 页 10 0003 序 列 表 CN 102864235 A 10 3/3 页 11 序 列 表 CN 102864235 A 11 。