调节心脏细胞中钙通道活性的方法及其试剂 【发明领域】
本发明总体上涉及可调节心脏细胞中钙通道活性的新肽。更具体地，本发明提供了调节心脏钙通道活性的方法，该方法包括：将心脏理阿诺碱受体(RyR2)接触一定量的足以调节所述RyR2活性的二氢吡啶受体(DHPR)多肽片段，并测定所述钙通道活性。本发明方法用于与心脏功能异常有关的一系列失调和疾病的治疗，特别是涉及心脏细胞中减少的心输出量和/或异常的兴奋-收缩偶联、钙超载或钙渗漏的疾病和失调的治疗。
【发明背景】
在本说明书末尾收集了本申请文件中参考的出版物目录细节。不应该将这里谈及的现有技术，包括任意一种或多种现有技术文献的参考文献视为所述现有技术是澳大利亚的常识或形成了澳大利亚常识的一部分的公知或暗示。
兴奋-收缩偶联对于横纹肌如心肌和骨骼肌发挥作用连结电兴奋和机械活性是必要地。兴奋-收缩偶联的关键成分是二氢吡啶受体(DHPR)--一种横小管(TT)的电压依赖性Ca2+通道以及肌浆网(SR)膜的Ca2+释放通道或理阿诺碱受体(RyR)，其打开以从SR释放钙到细胞质中。
在心肌细胞和骨骼肌细胞中存在RyRs和DHPRs的不同同工型。特别地，在骨骼肌中RyR1和DHPR-同工型3占优势，在心脏细胞中RyR2和DHPR-同工型1占优势。在RyR1和RyR2氨基酸序列间仅有约70％的同一性。
在骨骼肌中，已知DHPRα-1亚基的重复II和III间138个氨基酸胞质环的蛋白质-蛋白质间相互作用激活了理阿诺碱受体(RyR1)(Tanabe等，1990，Nature 346：567-568)。已经确定足以激活骨骼肌RyR1介导的钙释放的骨骼DHPR胞质环区域存在于Thr671到Leu690的20个氨基酸内(E1 Hayek等，1995，J.Biol.Chem.270：22116-22118；Dulhunty等，1999，Biophys.J.77：189-203；和Gurrola等，1999，J.Biol.Chem.274：7879-7886)。在骨骼肌，有4个DHPR分子位于DHPRs四联体构型中，在严格的几何匹配中，与每隔开一个的RyR1多肽相对应，认为这对于正常的兴奋-收缩偶联是重要的。在DHPR兴奋期间，如通过电刺激兴奋期间，该蛋白质-蛋白质相互作用可能引起导致通道打开的RyR1多肽构型转换，因此引起了从SR的钙流出。因此，骨骼肌中兴奋-收缩偶联实质上是不依赖于钙的过程。
相反，心肌中兴奋-收缩偶联涉及钙诱导的钙释放(CICR)机理(Niggli，1999，Annu Rev Physiol 61：311-335)。心脏DHPR钙通道兴奋后的打开，通过每个动作电位期间激活的依赖于电压的L-型钙通道(即心脏DHPRs)引起了小量细胞外钙流入到心肌细胞中。这个最初信号作为随后贮存在SR中细胞内钙的CICR的触发。通过心脏RyR2钙释放通道产生从SR的次级钙释放。在大多数哺乳动物中，CICR放大了最初信号触发若干倍，放大倍数与约16∶1的心脏RyR2分子比心脏DHPR的化学计算法一致。
尽管心脏CICR需要胞质Ca2+的最初升高以触发从SR的钙释放，但是它似乎没有变成自动维持。这是因为CICR可能仅在超载钙的心肌细胞间传导，而钙在单个细胞中是正常定位的。此外，在约3×10-7M[Ca2+]i和约10-6M[Ca2+]i之间，心肌收缩力随着[Ca2+]i的增加成比例地增强表明CICR不是全或无应答。
与骨骼肌细胞中兴奋-收缩偶联相比，尽管在体内心脏DHPR和心脏RyR2间是否存在任何直接的蛋白质-蛋白质相互作用是未知的，但是在双杂交测定中骨骼DHPRα-1亚基的胞质环确实结合心脏RyR2(Osterland等，1999，Biophys.J.76：A467-(摘要))，并且在表面胞质共振研究中骨骼DHPRα-1亚基胞质环的20-mer肽(即Thr671到Leu690)结合RyR2(O′Reilly和Ronjat，1999，Biophys.J：76：A466-(摘要))。
有力的使人信服的数据表明骨骼和心脏DHPRs和RyRs通道间的关系是不同的。例如，在缺乏骨骼RyR1但含有骨骼DHPRα-1亚基的dyspedic肌细胞中表达的心脏RyR2不能支持骨骼类型的兴奋-收缩偶联。此外，心脏或骨骼DHPRα-1亚基的重复II和III间全部的138个氨基酸胞质环没有激活分离的RyR2通道(Lu等，1994，J.Biol.Chem.269：6511-6516)。并且，尽管骨骼DHPRα-1亚基胞质环的20-mer肽(即Thr671到Leu690)是骨骼肌RyR1通道高亲和性激活剂的事实，但是已经表明其不诱导从心脏SR的Ca2+释放，或不增强结合心脏RyR2通道的[3H]理阿诺碱(E1Hayek等，1995，上文)。而且，这些可用的数据表明骨骼DHPRα-1亚基胞质环的20-mer肽(即Thr671到Leu690)不能激活心脏RyR2通道，例如延长它们的开放时间或开放频率。
Stern(1992，FASEB J.6：3092-3100)提出了心脏组织中Ca2+突触(即定位于进入和释放Ca2+位点附近非常高的Ca2+结构域)功能性地连结DHPRs和RyRs活性。借助于高的局部Ca2+浓度，每个Ca2+突触允许RyR2的局部控制以产生可观察的高信号放大，而在整个细胞和细胞间没有Ca2+释放信号的传播。结果，可以用触发钙释放定量分级每个信号期间收集的释放单元数。这个建议与心肌细胞刺激期间短期(约50ms)钙的激发和有限的空间传播(约1.5μm)观察结果相符(Cheng等，1993，Science 262：740-744)。
心肌收缩衰竭是患缺血性心脏病、充血性心力衰竭和系统炎性状态如脓毒病患者中发病和死亡的常见病因。累积的证据表明收缩衰竭与肌质钙流动的调节障碍有关。肌丝降低的Ca2+敏感性或例如由于钙突触的退化或破坏、RyR2退化或DHPR退化的钙信号传导的退化可以引起心脏收缩力的衰退。在心脏衰竭或心脏肥大期间不利地影响了几种Ca2+信号途径(具有在心脏衰竭末期观察到的钙超载)。已经观察到衰竭或肥大心脏组织中SR中升高的静止Ca2+浓度、降低的Ca2+瞬变幅度、减缓的张弛和改变的Ca2+泵。
更具体地，与正常心脏比较，肥大和衰竭的心脏显示了降低的兴奋-收缩偶联效力(Gomez等，1997，Science 276：755-756)。然而，衰竭或肥大心脏中单独的DHPRs和RyRs看似正常的，表明这两种钙信号蛋白质间的连结可能是缺陷的。通过应用β-肾上腺素能激动剂以延长心脏DHPRs开放时间，恢复肥大细胞或随后的充血性心力衰竭中正常的兴奋-收缩偶联支持了该观点。
此外，衰竭的人心脏中RyR2的超磷酸化引起了缺陷的通道功能。
此外，在急性情况下如心脏病发作后，通过增强兴奋-收缩偶联的“心肌变力剂”可以增加心输出量。在缺血性发病期间损害了心肌的离散区域，引起了降低的心输出量。通过要求保持健康的心肌以更有力的收缩可以维持主要器官如大脑的血液供应。目前这是通过模拟β-肾上腺素能刺激和增加cAMP水平以刺激DHPR活性和兴奋-收缩偶联的药物完成的。从长远的观点看，增加的cAMP水平可能变成有毒的，并且引起钙超载。
发明概述
本申请文件包含用程序PatentIn版本3.1做成的核苷酸和氨基酸序列信息，这里在参考书目后示出了该信息。通过数字标记<210>，随后通过序列标志符(例如，<210>1，<210>2等)确定了序列表中的每种核苷酸或氨基酸序列。分别通过数字标记字段<211>，<212>和<213>中提供的信息表示序列(DNA，蛋白质(PRT)等)的长度、类型和每种核苷酸或氨基酸序列的来源组织。用后面带有数字标记的描述符“SEQ ID NO”定义本申请文件中参照的核苷酸和氨基酸序列。例如，SEQ ID NO：1指标明为<400>1的数字标记字段中提供的信息等。
应该理解这里SEQ ID NO：1中所述共有序列的参考文献为包括SEQID Nos：2-7中所述任何一种或多种氨基酸序列的参考文献，其中所述SEQID Nos：2-7用于编辑共有序列。
在整个该申请文件中，除非上下文另外要求，将文字“包括”理解为意指包括规定的步骤或要素或整体，或者一组步骤或要素或整体，但不排除任何其它步骤或要素或整体，或者一组要素或整体。
应该理解这里所用术语“来源于”为表示可以从特定来源获得的特定整体，虽然该特定整体不必直接来自于该来源。
在进行本发明的工作中，发明人试图鉴定调节心脏组织中CICR的新方法，以提供心脏衰竭和/或心脏肥大的改进治疗方案。意外地，尽管确定了心脏DHPRs和心脏RyRs间没有物理关系，但是本发明提供了小片段的骨骼或心脏DHPR多肽，例如小的碱性电荷肽，其能激活心脏RyR2通道。
更具体地，本发明人已经证明骨骼DHPRα-1亚基的胞质环20-mer肽(即Thr671到Leu690)在-40mV(负电势诱导从SR的钙释放)产生了RyR2通道的显著激活，在+40mV产生了强抑制。在显著低于激活骨骼肌RyR1所需肽浓度的1nM低的肽浓度观察到了心脏RyR2的激活。此外，在3×10-7M胞质Ca2+时，心脏RyR2通道的抑制显著大于观察到的骨骼RyR1通道的抑制。
因此，本发明的一个方面提供了调节心脏理阿诺碱受体(RyR2)钙通道活性的方法，该方法包括用适量的足以调节所述RyR2活性的二氢吡啶受体(DHPR)多肽片段，例如碱性电荷片段接触心脏RyR2。
更优选地，本发明提供了调节心脏理阿诺碱受体(RyR2)钙通道活性的方法，该方法包括用适量的足以调节所述RyR2活性的二氢吡啶受体(DHPR)多肽片段，例如碱性电荷片段接触心脏RyR2，测定所述心脏RyR2钙通道的活性。
从前面讨论显而易见本发明的一种实施方案涉及增加心脏RyR2钙通道活性的方法，该方法包括用适量的足以增加所述RyR2活性的二氢吡啶受体(DHPR)多肽片段接触心脏RyR2，以及测定所述心脏RyR2钙通道的活性。如这里所示例的，并且本发明不限于任何理论或作用方式或有效的肽浓度，本发明人已经证明对于脂质双层中分离的心脏RyR2，通过应用达到约1nM肽到约10μM肽增加了通道打开的频率和每个通道打开的期间。在高的肽浓度时，最初打开的通道活性稍微下降，然而其它通道的活性更显著，可能反应了对肽敏感的RyR2通道中微不均一性。
从前面讨论显而易见本发明的另一种实施方案涉及抑制心脏RyR2钙通道活性的方法，该方法包括用适量的足以抑制所述RyR2活性的二氢吡啶受体(DHPR)多肽片段接触心脏RyR2，测定所述心脏RyR2钙通道缺少活性。如这里所示例的，并且本发明不限于任何理论或作用方式或有效的肽浓度，本发明人已经证明对于脂质双层中分离的心脏RyR2，通过高于约10μM肽的浓度降低了钙打开的频率，特别是在+40mV时钙打开的频率，这可能是在不同于通道激活期间肽结合位点的位点结合RyR2通道小孔内的肽的结果。
本发明第二方面提供了鉴定心脏RyR2钙通道肽调节剂的方法，该方法包括：
(i)在适于调节钙通道活性的条件下，于存在功能性心脏RyR2钙通道时，温育适量的调节心脏RyR2通道活性的二氢吡啶受体多肽或其同系物、类似物或衍生物，并测定通道活性；
(ii)在适于通过所述二氢吡啶受体多肽或其同系物、类似物或衍生物调节钙通道活性的条件下，于存在所述功能性心脏RyR2钙通道时，温育候选肽，并测定通道活性；
(iii)比较在(i)和(ii)时的活性；和
(iv)优选(ii)中相对于(i)具有可比较或增加的调节通道活性的肽。
在可替代的实施方案中，本发明的该方面提供了鉴定心脏RyR2
钙通道肽调节剂的方法，该方法包括：
(i)在适于调节钙通道活性的条件下，于存在功能性心脏RyR2钙通道时，温育适量的调节心脏RyR2通道活性的二氢吡啶受体多肽或其同系物、类似物或衍生物，并测定通道活性；
(ii)在适于通过所述二氢吡啶受体多肽或其同系物、类似物或衍生物调节钙通道活性的条件下，于功能性心脏RyR2钙通道存在时，温育候选肽和适量的调节心脏RyR2通道活性的所述二氢吡啶受体多肽或其同系物、类似物或衍生物，并测定通道活性；
(iii)比较在(i)和(ii)的活性；和
(iv)优选(ii)中相对于(i)具有可比较或增加的通道活性调节的肽。
本发明的第三个方面提供了测定心脏RyR2通道是否打开或具有高的通道打开概率的方法，所述方法包括用适量的二氢吡啶受体(DHPR)多肽片段或其同系物、类似物或衍生物接触心脏RyR2通道一段时间，并且在足以出现结合所述通道条件下进行，并测定所述肽与所述通道的结合，其中所述肽与所述通道的结合表示高的通道打开概率，并且其中非特异性肽的结合表示低的通道打开概率。
本发明的第四方面提供了人或动物受试者心脏功能障碍的治疗方法，该方法包括施用有效量的二氢吡啶受体(DHPR)多肽片段或其同系物、类似物或衍生物一段时间并且在足以出现增加的心脏收缩的条件下，因此矫正所述的心脏功能障碍。
本发明的第五个方面提供了包含二氢吡啶受体多肽片段或其同系物、类似物或衍生物，并包含一种或多种可药用稀释剂的药物组合物，其中所述肽包含在SEQ ID NOs：1-10中所示的任一肽的至少约5个邻接氨基酸残基。
表1中定义了整个申请文件中所用的单个和三个字母缩写。
表1单个和三个字母的氨基酸缩写 氨基酸 三个字母的缩写 一个字母的符号 丙氨酸 Ala A 精氨酸 Arg R 天冬酰胺 Asn N 天冬氨酸 Asp D 半胱氨酸 Cys C 谷氨酰胺 Gln Q 谷氨酸 Glu E 甘氨酸 Gly G 组氨酸 His H 异亮氨酸 Ile I 亮氨酸 Leu L 赖氨酸 Lys K 甲硫氨酸 Met M 苯丙氨酸 Phe F 脯氨酸 Pro P 丝氨酸 Ser S 苏氨酸 Thr T 色氨酸 Trp W 酪氨酸 Tyr Y 缬氨酸 Val V任何残基或另外所定义的 Xaa X
附图简述
图1是表示如下几种心脏和骨骼DHPR多肽胞质环对齐氨基酸序列的示意图：人骨骼肌DHPR-3(SEQ ID NO：2；Drouet等，1993)；鼠骨骼肌DHPR-3(SEQ ID NO：3；Chaudhari，1992)；兔骨骼肌DHPR-3(SEQID NO：4；Tanabe等，1987)；兔心脏DHPR-1(SEQ ID NO：5)；大鼠心脏DHPR-1(SEQ ID NO：6)；和牛蛙骨骼肌DHPR-3(SEQ ID NO：7；Zhou等，1998)。根据所得序列的比较，以粗体形式表示共有序列(SEQID NO：1)。也表示了称为NB(SEQ ID NO：8)和A1S(SEQ ID NO：9)的非特异性肽的氨基酸序列。
图2是表示当在-40mV测量时，于胞质(cis)10-7M Ca2+存在的情况下，加到脂质双层中分离的心脏RyR2胞质(cis)面的骨骼DHPR胞质环的20-mer肽(SEQ ID NO：2)增加了心脏RyR2的活性的示图。在添加的肽缺乏的情况下(小组A)或者在65nM肽(小组B)或6.5μM肽(小组C)存在的情况下，于-40mV测定了单通道活性。
在每个小组的左手侧，表示在-40mV的下降的通道打开，其中通过点线“C”表示零电流(封闭的)水平，通过连续线“O”表示最大的单通道电导。在肽添加后，双层中两个通道在-40mV是活性的。
在每个小组的右手侧是在30s记录期间的所有点的图示。X轴的数字表示通道打开的幅度，横坐标表示在每个幅度总的打开比例。负数表示在-40mV的负(内部的)电流。
图3是表示在+40mV时，于cis 10-7M Ca2+存在的情况下，加到胞质(cis)溶液的骨骼DHPR胞质环的20-mer肽(SEQ ID NO：2)增加和然后接着降低了心脏RyR2活性的示图。在添加的肽缺乏的情况下(小组A)或者在65nM肽(小组B)或32.5μM肽(小组C)存在的情况下，于+40mV时测定了单通道活性。
在每个小组的左手侧，表示在+40mV的上升的通道打开，其中通过点线“C”表示零电流(封闭的)水平，通过连续线“O”表示最大的单通道电导。在65nM浓度时，通道大多数是处于打开的构型。相反，在缺乏肽或在32.5μM肽时，通道大多数是处于关闭的构型。
在每个小组的右手侧是在30s记录期间的所有点的图示。X轴的数字表示通道打开的幅度，横坐标表示在每个幅度总的打开比例。数值表示在+40mV的通道打开。
图4是表示在-40mV(小组A)和在+40mV(小组B)时，胞质溶液中肽浓度(即，log10[肽nM])与平均标准化平均电流(横坐标)的函数示图。标准化平均电流(I’p/I’C)是肽存在情况下的平均电流(即I’p)与对照条件下肽缺乏情况的平均电流(即I’c)的比率。数据表示平均的平均电流±SEM。样品含有SEQ ID NO：2所述的骨骼DHPR胞质环的20-mer肽(n＝8，●)，或者SEQ ID NO：8所述的非特异性肽NB(n＝2，▲)，或者SEQ ID NO：9所述的非特异性肽A1S(n＝3，■)。大于1.0的标准化平均电流表示肽激活心脏RyR2通道。因此，数据表示在+40mV时，10μM肽(SEQ ID NO：2)，或者在-40mV时更高的浓度，显著活化心脏RyR2通道。
图5是增加Ca2+和咖啡因激活的Ca2+从心脏SR囊泡释放的的题述肽的图示。显示了在对照条件下或随后20μM Ca2+或2mM咖啡因添加至囊泡外溶液(在零肽浓度时)，和单独肽添加到囊泡溶液后(小符号)，或在横坐标所述浓度时，20μM Ca2+或2mM咖啡因加肽添加到囊泡溶液后(大符号)，最初的Ca2+释放的速率。给出Ca2+释放的速率为每分钟SR囊泡中每毫克蛋白质的微摩尔Ca2+。数据表示SEQ ID NO：2(填充的圆形)，SEQ ID NO：8(填充的方形)，SEQ ID NO：9(空心的圆形)和SEQ ID NO：10(空心的方形)。结果表示为平均值±sem，每个浓度至少有5个观测值。
图6是用100μM cis(胞质)Ca2+浓度，SEQ ID NO：9对流过掺入脂质双层的RyR通道平均电流影响的示图。数据获自在-40mV(上图)和+40mV(下图)双层电势的60s记录。数据点表示来自于6个试验的平均相对平均电流(有肽的平均电流除以对照条件下的平均电流)，并且垂直条表示±sem。肽以浓度依赖的方式明显地抑制通道活性，在100nM肽时有最大的影响。100nM肽在+40mV(星号)时抑制显著高于在-40mV时的抑制。
图7是用100nM cis(胞质)Ca2+浓度，SEQ ID NO：9对流过结合进入脂质双层的RyR通道平均电流影响的示图。数据获自在-40mV(上图)和+40mV(下图)双层电势的60s记录。数据点表示来自于7个试验的平均相对平均电流(有肽的平均电流除以对照条件下的平均电流)，并且垂直条表示±sem。肽以浓度依赖的方式明显地增加通道活性，在100nM肽时有最大的影响。在+40mV观察到了＞100nM肽时的抑制，该抑制表示一些小孔闭合。
图8是SEQ ID NO：9的肽浓度对单通道参数影响的函数关系示图。显示了在-40mV(左侧小组)和+40mV(右侧小组)时的数据。上图表示通道打开的概率，第二图表示平均打开时间，接着是平均关闭时间，最后是通道打开的频率。数据点表示七个试验的平均参数值，垂直条表示±1sem。通道关闭时间的减少和随后频率的增加极大地有助于打开概率的增加。
优选实施方案的详细描述
本发明的一个方面提供了调节心脏理阿诺碱受体(RyR2)钙通道活性的方法，该方法包括用适量的足以调节所述RyR2活性的二氢吡啶受体(DHPR)多肽片段接触心脏RyR2通道。
更具体地，本发明提供了调节心脏理阿诺碱受体(RyR2)钙通道活性的方法，该方法包括用适量的足以调节所述RyR2活性的二氢吡啶受体(DHPR)多肽片段接触心脏RyR2通道，并测定所述心脏RyR2钙通道的活性。
这里所用术语“理阿诺碱受体-2通道”或“RyR2通道”或“心脏RyR通道”应该理解为意指包含RyR2多肽亚基的钙通道。本领域技术人员知道这里提到的“RyR2通道”或“心脏RyR通道”的物理结构。
这里所用术语“调节”应该理解为意指增强或抑制RyR2钙通道的活性。因此，通过“修饰RyR2钙通道活性”或类似术语一般意指修饰CICR(即增强或降低)，例如通过修饰心脏RyR2的钙突触或钙敏感性、每个动作电位期间心脏RyR2通道打开的频率或者单独的心脏RyRs的打开时间。
如上文所述，本发明清楚地包括增强心脏RyR2钙通道活性的方法和抑制心脏RyR2钙通道活性的方法。
心脏RyR2通道可以原位存在于心脏细胞或在体内心肌，然而它也可以是例如插入在脂质双层中分离的RyR2通道，或者备选地，是例如在转染细胞(例如CHO细胞或dyspedic肌细胞)膜中表达的重组或重建的RyR2通道。可以用例如Bhat等(1997，Biophys.J 73：1329-1336)所述的标准方法在转染细胞中表达RyR2通道，这里并入该篇文献为参考文献。优选地，心脏RyR2通道在原位心脏细胞或在体内心脏组织。
这里所用术语“片段”意指肽在生理pH值时由于相对高比例的碱性氨基酸残基例如精氨酸或赖氨酸或半碱性氨基酸残基组氨酸的存在而具有总体上的正电荷。优选地，片段将有至少约25％的碱性氨基酸残基，更优选地至少约50％的碱性氨基酸残基。
用在进行这里所述本发明中的肽具有来源于心脏或骨骼二氢吡啶受体(DHPR)多肽片段的至少约5个氨基酸长度，所述多肽片段包含氨基酸序列TSAQKXXXEE(R/K)XR(R/K)K(M/L)(A/S)(R/K)XX(SEQ IDNO：1)，其中X是任何氨基酸残基。本发明清楚地延伸至使用任何来源的与SEQ ID NO：1有相似序列的肽，例如合成或天然存在的肽或任何来源于DHPR序列的肽。
为了进一步描述本发明的目的，SEQ ID NO：1中所述氨基酸序列对应于几种动物物种骨骼肌和心肌DHPRs胞质II-III环的20-mer肽共有序列，如图1所示。如这里所示例的，本发明人证明了人骨骼肌DHPR-3的一部分胞质II-III环调节绵羊RyR2通道活性。图1中列出的各种DHPRs间密切的序列关系表示具有SEQ ID NO：1序列或基本上与SEQ ID NO：1相同序列的肽将调节RyR2通道活性。
因此，本发明清楚地延伸至使用SEQ ID NO：1中所述氨基酸序列的任何或所有同系物、类似物和衍生物的用途。优选地，此类同系物、类似物或衍生物将是碱性电荷的肽，更优选地其保留有SEQ ID NO：1的保守碱性残基。
甚至更优选地，题述序列包含在SEQ ID NO：1氨基酸位置11直到15的基序RKRRK。
在本发明上下文中，SEQ ID NOs：1-7任何之一的“同系物”指直接来源于骨骼或心脏DHPR氨基酸序列或来自其它来源如其它物种相似序列的天然或合成的碱性电荷肽，或者备选地，通过筛选RyR2通道调节活性的模拟肽获得的天然或合成的碱性电荷肽，并且其包含基本对应于SEQ IDNO：1或SEQ ID NOs：2-7中列出的任何特定氨基酸序列之一的序列。
例如，只要保持肽的总体特性(例如碱性电荷或构象)，就可以用具有类似特性，例如疏水性、亲水性、疏水力矩、抗原性、电荷或形成α螺旋结构倾向的其它氨基酸置换SEQ ID NOs：1-7任何之一的氨基酸。
置换包含氨基酸的改变，其中用不同的天然存在或非常规的氨基酸残基置换氨基酸。用另一种类似特性的天然存在的氨基酸置换氨基酸残基情况的这种置换可以归类为“保守性的”，例如GlyAla，ValIleLeuMet，AspGlu，LysArg或者AsnGln。通常地，氨基酸置换是单个残基的置换，但是也可以是成簇或分散的多个残基的置换。
本发明特别考虑了通过本领域已知的任何方法，例如利用在自动肽合成仪中的Fmoc氨基酸的固相方法生产合成肽的同系物。可以通过常规方法进行环化和/或部分纯化这种肽，这样它们基本上不含同种的肽。
SEQ ID NOs：1-7任何之一的“类似物”包含与所述序列或其同系物基本相同的氨基酸序列，尽管其中存在一种或多种非天然存在的氨基酸类似物。特别优选的类似物包含SEQ ID NOs：1-7任何之一的任何肽或非肽模拟物，该肽或非肽模拟物保留所述序列特性，例如电荷分布或构象或其它结构特性。本发明特别考虑了Gurrola等(1999，J.Biol.Chem.274：7879-7886)描述的欧前胡素肽和任何合成的非肽模拟物。
与SEQ ID NOs：1-7任何之一相关的术语“衍生物”应该理解为意指所述序列或其同系物或类似物的任何部分、片段或多肽融合物。衍生物包含修饰的氨基酸序列或肽，其中配体与其中含有的一个或多个氨基酸残基连接，所述配体例如脂质、脂糖、脂多糖(LPS)、碳水化合物、酶、肽、放射性核素、荧光化合物、可光活化残基(例如，对苯甲酰-苯丙氨酸)或葡糖基部分。衍生肽的方法是本领域熟知的。
例如，优选的衍生物可以包含SEQ ID NOs：1-7任何之一的片段或SEQ ID NOs：1-7任何之一的同系物或类似物的片段。氨基酸缺失通常具有约1-15个氨基酸残基长度。优选地，对SEQ ID NO：1的N-末端或C-末端制造缺失。
备选地，SEQ ID NOs：1-7任何之一的衍生物可以有加到肽或其同系物或类似物N-未端或C-末端的附加氨基酸残基。一般地，插入要足够小，如，例如1-4氨基酸残基的插入以不阻碍进入RyR2通道。
优选的SEQ ID NOs：1-7任何之一的同系物、类似物和衍生物将包含SEQ ID NOs：1-7任何之一的至少约5个邻接氨基酸，更优选地至少约10个邻接氨基酸残基或更优选地至少约15-20个邻接氨基酸残基。因此，与SEQ ID NOs：2-7任何之一比较，这种同系物、类似物和衍生物可以是全长或小于全长的序列。
关于RyR2通道调节活性，除了与SEQ ID NO：1具有功能性等效外，优选的同系物、类似物或衍生物将包含与SEQ ID NO：1有至少约70％同一性的氨基酸序列。优选地，与SEQ ID NO：1的百分比同一性将是至少约80％，更优选地至少约90％，并且甚至更优选地至少约95％或至少约98％或99％。在确定是否两个氨基酸序列属于定义的百分比同一性或相似性限制方面，本领域技术人员知道进行氨基酸序列的并排比较。在这种比较或对齐中，根据用于进行该对齐的算法，在不相同氨基酸残基的定位中将出现不同。在本上下文中，涉及两个或多个氨基酸序列间百分比同一性或相似性应该分别理解为意指利用任何本领域已知标准算法所测定的所述序列间相同和相似残基数。特别地，利用Computer Genetics Group，Inc.，University Research Park，Mladison，Wisconsin，United States of America(Devereaux等，1984，Nucl.Acids Res.12：387-395)的GAP程序计算氨基酸同一性和相似性，该程序利用了Needleman和Wunsch的算法(1970，J.MolBiol.48：443-453)，或者可替代地，利用Thompson等(1994，Nucl Acids Res.22：4673-4680)用于多重对齐的CLUSTAL W算法以最大化相同/相似氨基酸数并以最小化对齐中的序列空位数和/或长度。
特别优选的SEQ ID NO：1的同系物、类似物或衍生物将成功地与SEQID NOs：2-7任何之一竞争对心脏RyR2通道活性的调节。在标准竞争研究中，在SEQ ID NO：2浓缩物存在的情况下，测定被试验肽的不同浓度的RyR2通道调节活性，例如，增强或抑制心脏RyR2通道活性的RyR2通道调节活性。例如，可以通过在约10-7M到约10-5M范围的胞质钙浓度时，心脏RyR2通道的高亲和激活物可通过其成功地增强脂质双层中的通道活性并竞争已知激活物肽(例如，约1nM SEQ ID NO：2到约100nM SEQ IDNO：2)诱导的通道活性增加的能力来确定。类似地，可以通过在约10-7M到约10-5M范围的胞质钙浓度时，心脏RyR2通道的高亲和抑制剂可通过其成功地抑制脂质双层中的通道活性并在胞质Ca2+浓度达到10-4M竞争已知抑制剂肽(例如，32.5μM SEQ ID NO：2)诱导的通道活性抑制的能力来确定。
不以任何方式限制本发明，本发明人产生了如这里所述的对应于SEQID NO：2中所述人骨骼DHPR 20-mer肽序列类似物和衍生物的三种肽。详述这些肽如下：
(i)SEQ ID NO：8对应于SEQ ID NO：2的20-mer肽，但是其中用丙氨酸残基置换丝氨酸687(SEQ ID NO：2的残基17)，如下：
TSAQKAKAEERKRRKMARGL(SEQ ID NO：8)
(ii)SEQ ID NO：9对应于SEQ ID NO：2的20-mer肽，但是其中用精氨酸的D-异构体置换精氨酸688(SEQ ID NO：2的残基18)，如下：
TSAQKAKAEERKRRKMSRDGL(SEQ ID NO：9)
(iii)SEQ ID NO：10对应于SEQ ID NO：2的20-mer肽，但是其中用丙氨酸残基置换丝氨酸687(SEQ ID NO：2的残基17)，用精氨酸的D-异构体置换精氨酸688(SEQ ID NO：2的残基18)，如下：
TSAQKAKAEERKRRKMARDGL(SEQ ID NO：10)
在本上下文中，例如，术语“接触”可以意指将具有DHPR多肽的碱性肽片段与心脏RyR2通道接触，使该肽与通道有密切的物理连接，而不必需要肽与通道的实际结合。尽管在实施本发明中DHPR肽可以结合RyR2通道，但是这种结合不是本发明的必要特征，因为所需要的只是修饰通道活性。在这方面，本发明的目的不是实现与心脏RyR2多肽的结合，而是调节RyR2通道的活性。本领域技术人员知道结合和活性不必是等价的，因为DHPR肽可以结合RyR2多肽上任何大量不同位点之一，而不必修饰RyR2通道的活性。
优选地，该肽与RyR2通道的胞质面接触。
优选地，在实施本发明方法期间，SEQ ID NOs：1-7任何之一或SEQ IDNOs：1-7任何之一的同系物、类似物或衍生物，如SEQ ID NOs：8-10任何之一结合RyR2通道中RyR2多肽的一部分。不受任何理论或作用方式限制，在实施本发明中所用的肽(或其同系物、类似物或衍生物)可通过结合通道中RyR2多肽的一个或多个负电荷残基，例如氨基酸序列：
FRAEKTYAVKAGRWYFEFEAVTSGDMRVGWSRPGCQP (SEQ IDNO：13)中的酸性残基，可以呈现获得进入RyR2通道的构象。
在前述讨论之后是测定心脏RyR2钙通道的活性，仅仅测定肽或理阿诺碱与通道或RyR2多肽的结合是不充分的，尽管其一定可以形成用于确定修饰通道活性的附属物。确定通道活性的优选方法选自：
(i)利用本领域公知的方法，例如Ahern等(1994，FEBS Lett.352：369-374)，Lu等(1994，J.Biol.Chem.269：6511-6516)，Laver等(1995，J.Membr.Biol 147：7-22)或Dulhunty等(1999)于上文中所述的方法，记录脂质双层中单个或多个RyR2通道打开；
(ii)利用本领域公知的方法，例如El-Hayek等(1995，上文)，Gurrola等(1999，上文)或Dulhunty等(1999，见上文)所述的方法，测定从SR囊泡的钙释放；
(iii)例如根据Zaloga等(1997)，通过测定心脏的收缩性来测定心脏功能；以及
(iv)利用本领域公知的任一测定血管紧张度的方法，在肽施用后，测定分离的胸主动脉环的血管紧张度。
本领域技术人员知道可通过测定肽施用对一个或多个参数的浓度相关性易于测定心脏的功能，所述一个或多个参数选自：通过dP/dtmax或dP/dtmax值、左心室收缩压和心率估测的收缩率。也可以测定心室颤动和或其它的心脏心率失常以定量肽的无益副作用。
在测定增强的心脏RyR2通道活性中，检测增加的通道打开概率(Po)。较高的通道打开概率引起了增加的钙流出或从SR包括从SR囊泡的释放，以及增加的心脏收缩性和减少的张驰。也可以增加血管紧张度。
相反，心脏RyR2通道活性的抑制剂将减少通道打开概率，降低从SR的钙释放和减少心脏的收缩性。也可以降低血管紧张度。
不排除测定修饰心脏RyR2通道活性的其它方法。
SEQ ID NOs：1-7任何之一或其同系物、类似物或衍生物(如SEQ IDNOs：8-10)，特别是SEQ ID NO：2在调节心脏RYR通道活性的效力证实了这种序列作为用于筛选具有结构和功能相似性化合物的试剂的用途。这种试剂能进行高通量的筛选测定，其中可以快速筛选数千种化合物。在脂质双层或在另一合适的分析体系中用分离的心脏RyR2受体可以测定这里所述的潜在地具有调节活性的肽模拟物调节心脏RyR2通道活性的能力。
因此，本发明第二方面提供了鉴定心脏RyR2钙通道的肽或非肽调节剂的方法，该方法包括：
(i)在适于调节钙通道活性的条件下，于存在功能性心脏RyR2钙通道时，温育适量的调节心脏RyR2通道活性的二氢吡啶受体多肽或其同系物、类似物或衍生物，并测定通道活性；
(ii)在适于通过所述二氢吡啶受体多肽或其同系物、类似物或衍生物调节钙通道活性的条件下，于存在功能性心脏RyR2钙通道时，温育候选的肽或非肽化合物，并测定通道活性；
(iii)比较在(i)和(ii)时的活性。
优选地，所述片段包含SEQ ID NO：1肽序列的至少5个邻接氨基酸。
优选地，选择对SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：1同系物、类似物或衍生物具有可比较或增强的通道活性调节的肽。通过上文(ii)中相对于(i)检测到的可比较或增加的通道活性调节，这种肽是可检测的。
例如，可以向功能性受体添加调节心脏RyR2通道活性的固定量的SEQ ID NO：1或其同系物类似物或衍生物。然后在适于待调节活性的条件下温育反应混合物，并测定通道的活性。在平行试验中，在SEQ ID NO：1存在时，于允许活性调节的条件下温育候选肽或非肽化合物与心脏通道，并且测定该试验样品相对于SEQ ID NO：1或其同系物、类似物或衍生物活性的通道活性。可以选择与SEQ ID NO：1或其同系物、类似物或衍生物比较，具有可比较或增强的调节活性的肽或非肽化合物。
在备选实施方案中，本发明的该方面提供了鉴定心脏RyR2钙通道肽或非肽调节剂的方法，包括：
(i)在适于调节钙通道活性的条件下，于存在功能性心脏RyR2钙通道时，温育适量的调节心脏RyR2通道活性的二氢吡啶受体多肽或其同系物、类似物或衍生物，并测定通道活性；
(ii)在适于通过所述二氢吡啶受体多肽或其同系物、类似物或衍生物调节钙通道活性的条件下，于存在功能性心脏RyR2钙通道时，温育候选的肽或非肽化合物和适量的调节心脏RyR2通道活性的所述二氢吡啶受体多肽或其同系物、类似物或衍生物，并测定通道活性；
(iii)比较在(i)和(ii)时的活性。
优选地，所述片段包含SEQ ID NO：1肽序列的至少5个邻接氨基酸。
在本发明这些方面的最优选实施方案中，所述SEQ ID NO：1肽或其同系物或衍生物选自SEQ ID NOs：2-10的任何一种或多种。
优选地，选择对SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：1同系物、类似物或衍生物具有可比较或增强的通道活性调节的肽或非肽模拟物等。通过上文在(ii)和(i)比较时检测到的可比较或增加的通道活性调节，这些肽或非肽化合物是可检测的。
例如，在允许出现调节的条件下，可以向功能性受体添加固定量的调节心脏RyR2通道活性的SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：1同系物、类似物或衍生物。在候选肽存在或缺乏的情况下，测定通道的活性，并比较样品的通道活性。可以选择调节SEQ ID NO：1或其同系物、类似物或衍生物作用的肽或非肽化合物。
任何依赖于调节心脏RyR2通道活性的常规测定方法适于该目的。在一个优选的测定方法中，待测样品是在平面脂质双层中的重建RyR2通道或具有功能性心脏RyR2钙通道的SR囊泡或dyspedic肌细胞。仅仅利用常规的实验法，本领域技术人员可以测定是否特定的候选肽、或非肽化合物调节心脏钙通道的活性。
本发明清楚地考虑了利用具有一些耐受非特异性的快速，高通量筛选的方法，和/或具有较高特异性的较小规模功能性筛选，和/或定量的动力学研究以阐述心脏RyR2通道的化学结构/功能关系，例如心脏RyR2钙通道功能激动剂或拮抗剂的肽或非肽化合物的确定，或者阐释通道中所述化合物锚定位点。
优选地，本发明考虑了一种方法，其包括：
(i)鉴定心脏RyR2钙通道候选激动剂和拮抗剂；
(ii)鉴定(i)中实际上激活或抑制心脏RyR2通道活性的那些化合物；
(iii)确定(ii)中对所述心脏RyR2钙通道比SEQ ID NOs：1-10任何之一具有更高结合亲和性的化合物；和
(iv)任选地，确定(iii)中那些化合物和所述心脏RyR2钙通道间相互作用的位点。
优选地利用心肌微粒体制备物中，或者可替代地，利用在CHO细胞中或其它适合的细胞测定系统中表达的心脏RyR2钙通道进行鉴定心脏RyR2钙通道候选激动剂和拮抗剂的快速、高通量的筛选。这种高通量的筛选有利于与微粒体制备物温育的，或注射入表达RyR2通道的转染细胞中或与表达RyR2通道的转染细胞温育的大量化合物的筛选。高通量的筛选也有利于文库中表达的大量肽的筛选，其中所述文库已经转染入表达RyR2通道的细胞。
可替代地，或者此外，通过将心脏RyR2蛋白质与载体如大量聚合物针结合鉴定候选激动剂和拮抗剂分子，并且使得大量针上的多肽与候选激动剂和/或拮抗剂分子接触用于筛选。可以同位素标记被筛选分子使得结合的简便迅速检测。可替代地，用于筛选的化合物可以与固相载体，如大量的针结合，所述用于筛选的化合物与RyR2多肽反应。例如，通过同位素标记或通过抗体检测或另一种报道试剂的应用可以再一次检测结合。
可以通过本领域已知的用于测定蛋白质-配体相互作用的动力学参数的任何本领域技术人员公知的测定方法测定特定化学化合物对心脏RyR2钙通道的结合亲和性。优选地，利用例如表面胞质共振的结合测定法。例如，利用BiacoreTM分析仪可以测定蛋白质的表面胞质共振。如本领域技术人员所知的，该方法提供了配体与目的蛋白质结合的开和关的速率测定的数据。
为了筛选多个候选化合物，化合物可以与大量聚合针或载体连接。
为了测定候选化合物和心脏RyR2钙通道间相互作用的位点，可以测定候选化合物与多种突变体RyR2多肽的结合，其中所述突变体RyR2多肽的一个或多个位点是对天然蛋白质用不同的氨基酸序列缺失或置换，并且比较所述化合物与野生型或非突变体RyR2蛋白质的结合。而且，可以用表面胞质共振促进结合亲和性的比较。利用提供更强激活剂/拮抗剂活性的相互作用位点的数据有利于与此类位点结合的药物的合理设计，但是药物具有增强的结合亲和性。
利用这种筛选方法检测的化合物最终可以用于例如心脏功能障碍的治疗中。
在可替代实施方案中，通过鉴定与心脏RyR2钙通道立体结构结合或连接的化合物，利用合理的药物设计来确定激动剂和/或拮抗剂化合物。本发明清楚地考虑了来源于心脏RyR2钙通道立体结构的任何化合物，该化合物结合所述通道，并且激活或抑制心脏RyR2钙通道活性。
通过与SEQ ID NO：1或其同系物、类似物或衍生物温育来观察对心脏RyR2通道打开概率的调节证实此类序列在确定或测定体外和体内心脏RyR2通道的小孔结构和调节机制的用途。更具体地，一方面肽与RyR2结合间的相关性和通道高的打开概率，以及在通道小孔内负电荷残基的肽间非特异性结合的相关性和低的打开概率使得根据肽结合研究的打开概率预测成为可能。
因此，本发明的第三方面提供了测定心脏RyR2通道是否打开或有高的通道打开概率的方法，所述方法包括用适量的二氢吡啶受体(DHPR)多肽片段或其同系物、类似物或衍生物接触心脏RyR2通道一段时间，并且在足以出现对RyR2结合的条件下进行，并测定所述肽与RyR2的结合，其中所述肽与RyR2的结合表示高的通道打开概率，并且其中非特异性肽与通道小孔的结合表示低的通道打开概率。
优选地，所述片段基本上是SEQ ID NOs：1-10的任何一种或多种所定义的肽。
可以通过本领域技术人员已知的任何方法，例如，通过利用放射性标记或荧光标记的肽或用报道分子标记的肽，并且测定在任何特定肽浓度下与通道结合的标记物或报道分子的量来测定肽结合。用于该目的的优选的报道分子是不妨碍肽结合通道能力的小分子，例如可光活化化合物。
可替代地，可以通过测定经通道释放钙测定该通道活性从而间接地确定肽结合。如这里所示例的，在约1nM和约10μM间的肽浓度时肽产生了高的通道开放概率，而在更高浓度的肽时产生了低的通道打开概率，特别是对脂质双层中的通道产生低的通道打开概率。
本发明的第四方面提供了人或动物受试者心脏功能障碍的治疗方法，该方法包括施与有效量的二氢吡啶受体(DHPR)多肽片段或其衍生物、同系物或类似物一段时间，并在足以出现增加的心脏收缩的条件下进行，因此矫正所述的心脏功能障碍。
优选地，所述片段包含基本上如SEQ ID NOs：1-10任何一种或多种所定义肽的至少5个邻接氨基酸。
“心脏功能障碍”是指涉及损害的心肌收缩的情况，例如其中的肌丝Ca2+敏感性降低或存在钙信号传导的退化，例如由于钙突触的退化或破坏，RyR2的退化或DHPR的退化。这里考虑的根据本发明可以治疗的心脏功能障碍疾病包括但不限于心肌收缩衰竭、局部缺血性心脏病、系统炎性状态如脓毒病、心脏肥大(钙超载)、心肌病如致心律失常性右心室发育异常类型-2(ARVD2)以及药物(例如，可卡因)诱导的心肌病、梗塞、节律障碍、充血性心力衰竭或心脏病。
“有效量”指足以减轻或逆转功能障碍发展的肽量。
对于本发明该方面的目的，有益或期望的临床结果包括但不限于可检测到的或不可检测到的症状的缓解、疾病程度的减轻、疾病状态的稳定、疾病发展的延迟或减缓、疾病状态的好转或减轻和症状缓解(无论部分还是全部)。“治疗”也包括与不接受治疗受试者的期望存活比较时存活的延长。这里所用的术语“治疗”包括预防。
“减轻”疾病指减少了疾病状态的程度和/或不期望的临床表现和/或通过治疗减缓或延长了进展的时间过程。
在预防的上下文中，“受试者”包括但不限于约40岁或以上普通人群中的个体；并且特别是具有进行性心脏肥大、心肌病、心脏病、高血压、肾衰竭、血管高血压、呼吸疾病如肺气肿或囊性纤维化、慢性哮喘和肺结核的历史和体质的个体。适合的个体也包括器官移植患者。
本发明的第五个方面提供了二氢吡啶受体多肽片段或其同系物、类似物或衍生物修饰心脏理阿诺碱钙通道活性的用途，因此修饰缺陷性钙信号传导，其中所述二氢吡啶受体多肽片段包含任一个SEQ ID NOs：1-10所述肽的至少约5个邻接氨基酸残基。
优选地，所述缺陷的钙信号传导诱导慢性肥大、扩张的心肌病或心脏衰竭。
本发明的第六方面提供了二氢吡啶受体多肽片段或其同系物、类似物或衍生物在制造用于人或动物受试者心脏功能障碍治疗的药物的用途，该二氢吡啶受体多肽片段包含任一个SEQ ID NOs：1-10所述肽的至少约5个邻接氨基酸残基。
本发明涉及任一个SEQ ID NOs：1-10或其同系物、类似物或衍生物所述肽修饰心脏RyR2钙通道活性的用途，因此修饰慢性未接受治疗的动物或人受试者中诱导慢性肥大或扩张心肌病或者甚至心脏衰竭的缺陷性钙信号传导。
优选地，以可以增强收缩力，并进一步可以增加心缩期细胞内钙浓度(即[Ca2+]i)，进一步可以降低心舒期[Ca2+]i的剂量施用肽或其同系物、类似物或衍生物。优选地，根据标准的体外钙敏化测定，与肽缺乏情况下测定的心缩期[Ca2+]i比较，肽或其同系物、类似物或衍生物诱导至少约3％或5％心缩期[Ca2+]i的增加。优选地，根据标准的体外钙敏化测定，与肽缺乏情况下测定的心舒期[Ca2+]i比较，肽或其同系物、类似物或衍生物诱导至少约3％或5％心舒期[Ca2+]i的降低。更优选地，在这种标准的体外钙敏化测定中，与肽缺乏情况下分别测定的心缩期[Ca2+]i或心舒期[Ca2+]i比较，增加心缩期[Ca2+]i或降低心舒期[Ca2+]i至少约10％或15％，并且甚至更优选地至少约20％，25％，30％，40％或50％。
甚至更优选地，施用的肽或其同系物、类似物或衍生物改进了心脏收缩的效力。优选地，通过在给药后0.5-1.0小时内诱导至少约5％或10％前负荷-补充搏功(PRSW)的增加而增强心脏的收缩。更优选地，与健康个体比较，心脏衰竭患者中通过所测定的PRSW增加而使心脏收缩增强了约15％，20％，30％，40％，50％，55％，60％或70％。
例如，可以立即施与(例如i.p或i.v)已经患有或正在患有充血性心力衰竭或心源性休克的患者肽或其同系物、类似物或衍生物。优选地，这种立即施用将需要施用合适剂量肽，以在患者已经患有心力衰竭如充血性心力衰竭或心源性休克后约1，2，4，8，12或24小时内，或一天以上到约2或3周之间增加RyR2钙通道活性。
患者已经患有慢性心力衰竭后，以适于活化RyR2钙通道活性的剂量的肽，或其同系物、类似物或衍生物的相对长期给药对于提供增加的运动耐力和功能性能力也是有益的。例如，在已经患有心力衰竭后，可以有规律地给患者施用肽至少2，4，6，8，12，16，18，20或24周或者更长，例如6个月，1年，2年，3年或更多年以促进增加的功能性能力。对于这种长期给药，将优选口服剂量的剂型。
不排除以抑制人或动物患者中心脏RyR2钙通道活性的剂量施用肽或其同系物、类似物或衍生物，并且可以适于如需要心脏组织瞬时张驰的情况下。
可以通过细胞培养或实验动物中标准的药物方法测定肽、同系物、类似物或衍生物的毒性和治疗效力，例如测定LD50(群体中50％的致死剂量)和ED50(群体中50％治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果间的剂量比率是治疗指数，并且该指数可以表达为比率LD50/ED50。优选SEQ ID NOs：1-7中任何之一或其同系物、类似物或衍生物中具有高治疗指数的氨基酸序列。
虽然显示毒副作用或有高LD50值的肽、同系物、类似物或衍生物是不太期望的，但这种肽可以与将化合物靶向到受侵袭组织位点的递送系统一起使用，因此最小化对健康组织的潜在损害。
可以利用获自细胞测定和动物研究的数据来计算用于人类的目标肽的剂量范围。Grant等(USSN 6,201,165，于2001年3月13日出版)所述的心脏肥大动物模型对于该目的特别有用。肽、同系物、类似物或衍生物的剂量优选位于这样的浓度范围内，即通过特定途径给药后，产生了与ED50一致的循环浓度并且几乎没有或没有毒性。剂量范围可以根据剂型和给药途径在该范围内变化。剂量也可以根据如个体的疾病，疾病的严重性，年龄，性别和体重因素而变化。
对于任何用在本发明方法中的肽、同系物、类似物或衍生物，可以从基于细胞的测定和动物模型中最初估测治疗有效的剂量。例如，可以通过动物模型中计算的有效的剂量获得循环血浆浓度范围，包括从基于细胞的测定和/或整体动物测定的IC50(即，达到对症状的半数最大抑制的肽或非肽化合物的浓度)。这种信息可以用于更精确地测定人的有用剂量。
也可以通过诱导动物模型中的心力衰竭来测定肽或其同系物、类似物或衍生物的适合剂量，方法为长期的快速心室起搏，然后以约3.3mL/min的速率灌注不同浓度的肽进入右心房，然后记录压力-面积的关系以及对肽应答的动脉压力。也可以利用已知的钙敏化剂，如Marban等(USSN 6,191,136，2001年2月20日出版)所述敏化剂进行对照试验。也可以测定心脏养气消耗。
本发明的另一方面涉及药物组合物，其包含二氢吡啶受体多肽片段，其肽包含任一个SEQ ID NOs：1-10或其同系物、类似物或衍生物的至少约5个邻接氨基酸残基和一种或多种药学上可接受的载体和/或稀释剂。
本领域技术人员可利用诊断和治疗的已知原理获得本发明方法检测到的物质在心脏功能障碍治疗方面的治疗效力。
治疗组合物在制造和贮藏条件下必需是无菌和稳定的。肽可以制成溶液、微乳状液、脂质体或其它适于高药物浓度的有序结构。载体可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)的溶剂或分散介质和其合适混合物。例如，通过包衣如卵磷脂的应用，在分散情况下通过所需颗粒大小的维持和通过表面活性剂的应用可以维持适当的流动性。在许多情况下，优选组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化钠。
通过将肽或其同系物、类似物或衍生物与脂质或脂糖部分的连接可以实现吸附增强。
通过在组合物中包含延缓吸收的试剂例如单硬脂酸盐或明胶可以引起可注射组合物的吸收延长。而且，可以通过时间释放制剂的形式施用化合物，例如在包含缓释或控释聚合体的组合物中优选包含疏水和/或两亲化合物。可以用保护化合物免遭快速释放的载体制备肽，如可控的释放剂型，包括植入和微囊化的递送系统。可以使用可生物降解的、可生物相容的聚合物如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯、聚乳酸和聚乳、聚乙二醇共聚体(PLG)。一般地，此类剂型的制备方法是本领域技术人员已知的。
例如，如果在有玻璃转变稳定的玻璃状基质相中分散肽或蛋白质药物，其中所述玻璃转变温度高于聚(ε-己内酯)聚合物的熔点温度，例如如Wang等(USSN6,187,330)所述，通过冷冻干燥肽的水溶液和适合的热防护剂(例如，海藻糖，松三糖，乳糖，麦芽糖，纤维二糖，蜜二糖或棉子糖)产生玻璃状的基质相时，在融化阶段通过在可生物侵蚀、可生物降解的聚(ε-己内酯)聚合物基质中分散肽、同系物、类似物或衍生物以制备适合的控释递送安瓿。
可以通过在适合溶剂中混合所需量的肽、同系物、类似物或衍生物和所需的上述例举的一种组分或组分组合，随后通过无菌过滤制备无菌注射溶液。一般地，通过在含有碱性分散介质和所需的上述列举的其它组分的无菌媒介物中掺入活性肽或非肽化合物来制备分散体。在制备无菌注射溶液的无菌粉末时，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，该干燥方法产生了来源于其前面无菌过滤溶液的活性组分及任何额外的所需组分的粉末。
优选地，本发明的肽、或其同系物、类似物或衍生物制剂为在施用后延长其半衰期的剂型，特别是将其制成用于慢性疾病治疗的剂型。延长活性肽化合物半衰期的方法包括直接修饰以降低其蛋白水解作用，例如通过交联或氨基酸置换以除去已知的蛋白酶位点。备选地，通过将活性成分包封入合适的剂型，例如缓释剂型可以延长任何活性组分的半衰期。根据给药途径，可以用保护肽、同系物、类似物或衍生物免受导致其失活的酶、酸和其它自然条件作用的材料包被肽、同系物、类似物或衍生物。
例如，肽，同系物、类似物或衍生物可以在合适载体或稀释剂中与酶抑制剂，或合适的载体如脂质体共施用而施与受试者。可药用稀释剂包括盐水和水缓冲溶液。酶抑制剂包括胰腺胰蛋白酶抑制剂、二异丙基氟磷酸(DEP)和抑肽酶(trasylol)。脂质体包括水包油包水乳剂及常规的脂质体。
也可以在甘油、液体聚乙二醇和其混合物以及在油中制备分散体。在贮藏和使用的普通条件下，这些制品可以含有防腐剂以防止微生物的生长。
也参考下面非限制性实施例描述本发明。
实施例1
调节心脏RYR2钙通道活性的20-mer肽
材料和方法
材料
化学试剂和生物试剂购自Sigma-Aldrich(Castle Hill，澳大利亚)。利用Applied Biosystems 430A肽合成仪合成DHPR II-III环肽(SEQ IDNos：1-7)，利用HPLC和质谱法和NMR纯化，其纯度≥98％。在水中以～2mM母液制备肽，以20μl等份冷冻。利用酸水解，随后通过标准PTC(苯基硫代甲酰氨基)方法，通过Auspep Pty Ltd测定精确的母液浓度，并且通过反相HPLC分析。
肽
用于研究的特定肽是：
1.DHPR II-II胞质环的20-mer肽(SEQ ID NO：2)：
Thr Ser Ala Gln Lys Ala Lys Ala Glu Glu Arg Lys Arg Arg Lys Met Ser Lys Gly Lea
2.肽NB(II-III环B片断的N-末端部分；Hamilton和lanuzzo，1991；
SEQ ID NO：11)：
Gly Leu Pro Asp Lys Thr Glu Glu Glu Lys Ser Val Met Ala Lys Lys Leu Glu Gln Lys
3.肽A1S(混杂的20-mer肽；SEQ ID NO：12)：
Thr Arg Lys Ser Arg Leu Ala Arg Gly Gln Lys Ala Lys Ala Lys Ser Glu Met Arg Glu
SR囊泡制备
如Laver等(1995，J.Membr.Biol.147：7-22)所述从绵羊心脏分离SR囊泡。
脂质双层
基本上根据Ahern等(1994，FEBS Lett.352：369-374)和Laver等(1995，J.Membr.Biol.147：7-22)在20℃到25℃进行试验。通过1.0ml Delrin杯壁具有约100μm直径的孔径(Cadillac Plastics，澳大利亚)，由磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱(5∶3∶2w/w/w)形成双层(Avanti PolarLipids，Alabaster，Alabama)。向胞质(即cis)室添加终池(TC)囊泡(终浓度，10μg/ml)和药物。利用Axopatch 200A放大器(Axon Instruments，Foster City，CA)控制双层电势，并记录单通道活性。为了试验目的，cis室保持在底面上，并控制腔(即，trans)的电压。双层电势以常规的方式表达为Vcis-Vtrans(即V胞质-V腔)。
双层溶液
如上所述形成双层，利用含有230mM Cs甲烷磺酸盐(MS)，20mMCsCl，1mM CaCl2和10mM N-tris(羟甲基)甲基-2-氨基乙烷磺酸(TES，pH7.4，有CsOH)的cis溶液和含有30mM Cs MS，20mM CsCl，lmMCaCl2和10mM TES(pH7.4)的trans溶液，将囊泡掺进双层中。为了防止多通道掺进双层，当观察通道活性时，通过cis室的灌注置换cis溶液。除了用1mM BAPTA缓冲的[Ca2+]是3×10-7M外，cis灌注溶液与最初的cis溶液是相同的。在通道掺入后向trans室添加CsMS(200mM)，以产生对称的溶液。
记录单通道活性和数据分析
向cis室每次添加肽后每30s改变双层电势，进行2分钟以上，。向trans室添加200mM CsMS后，记录对照活性2分钟。每等份肽(每个通道中检测6种不同的肽浓度)的cis添加后，记录活性2分钟。将肽灌注出cis室，记录恢复。最后将通道暴露于30μM钌红。
在1kHz过滤电流(8-电极低通Bessel，-3dB)，并且在5kHz数字化。对单通道记录的分析(利用PW Gage和M Smith研究的通道2)产生了通道打开概率(P0)，事件频率(F0)，打开时间，关闭时间和平均打开或关闭时间(T0或TC)及平均电流(I’)。在约20％最大电流，而不是通常的50％时，事件鉴频器设定在基线噪音以上，这样在分析中包括这种对次级传导和最大传导水平的打开。分析在+40mV和-40mV时的通道活性，分析连续活性的多于两个30s期间。
统计分析
平均数据表示为平均值±SEM。根据需要对单独或成对的数据，用单边或两边学生T试验(one sided or two sided Students T-test)测定对照和试验数值间差异的显著性。
实施例2
调节心脏RyR2钙通道活性的20-mer肽
结果
当浓度为10-7M cis Ca2+，向通道的胞质(cis)侧添加20-mer肽(SEQID NO：2)观察心肌RyRs活性的增加。在+40mV或-40mV双层电势时约450pS的Cs+传导和在试验最后30μM钌红阻断通道的能力确定单通道为RyRs。
图2所示是在-40mV和图3所述是在+40mV时心脏RyRs强烈地被20-mer肽(SEQ ID NO：2)激活的一个试验的记录。肽添加前，通道活性由短暂的间歇性打开组成(图2，小组A；图3，小组A)。在添加65nM肽(SEQ ID NO：2)的10s内，在-40mV时，通道打开增加。
双层中第二通道的打开伴随着事件频率的增加，非常长打开的出现(图2，小组B)。当肽浓度增加到6.5μM SEQ ID NO：2，在-40mV时，RyR2通道活性稍微下降，尽管第二通道活性更显著。如图2小组C所示，通道特别是在65nM肽时显示了高的打开概率(Po)(如果通道充分打开，所期望的主要的电流水平，O)。
记录表明单通道活性的增加与单通道传导中任何变化无关。
当双层电势是+40mV时，在65nM 20-mer肽(SEQ ID NO：2)时通道活性也增加了(图3，小组B)。然而，通道活性的增加小于-40mV时观察到的相同通道活性的增加(图2，小组B)。
虽然在-40mV双层电势的通道活性在较高肽浓度时增加，但是在+40mV时由于低的传导水平，在约100nM肽浓度以上时通道打开开始下降，并且在10μM肽时观察到仅仅几个短暂的通道打开(图3，小组C)。不以任何一种理论或作用方式限制本发明，认为其中通道打开大多数由于次最大传导的40mV时活性的降低是由于肽(SEQ ID NO：2)与低亲和性位点的结合，所述低亲和性位点不同于通道激活期间肽结合的位点。这些低亲和性位点可能在通道孔内。
在8个双层样品的8个中获得了脂质双层中心脏RyR2通道的相似激活和抑制。没有进行单通道分析，因为大多数双层含有一个以上通道。肽(SEQ ID NO：2)添加到cis室后，所有样品在+40mV和在-40mV有较高的打开频率。此外，与在10-7M cis Ca2+时肽缺乏的情况下检测到的相比，在肽存在的情况下，在-40mV电势时出现了延长的通道打开。
平均电流(即，在每个电势和每个肽浓度时，将两个30s期间的所有数据的平均值除以记录中观察到的通道数)提供了通道活性的测定。图4中平均标准化平均电流表示为肽浓度的函数。整数I’p/I’c是肽存在情况下的平均电流与向室添加肽之前平均电流的比率。在-40mV或+40mV的双层电势时，在10nM肽(SEQ ID NO：2)中检测到了平均电流的显著增加(约2倍)。在-40mV时，50μM肽(SEQ ID NO：2)中平均电流的增加进一步达到4倍。相反，+40mV时10nM肽(SEQ ID NO：2)加倍的标准化平均电流保持升高一直到约10μM肽，然后在更高肽浓度(即，约10μM肽和50μM肽之间)时急剧下降。
也测定了20-mer肽(SEQ ID NO：2)的心脏RyR2通道活化的特异性。在1μM cis肽NB(SEQ ID NO：8)或10μM cis肽NB时，在+40mV或-40mV双层电势时没有观察到修饰的通道活性(n＝3；图4)。在其它2个双层的2个中(图4)，为非同源序列、与试验的20-mer肽具有相同等电点的混杂序列(即，肽A1S；SEQ ID NO：9)以较高浓度(即，1μM cis肽或10μM cis肽)存在时降低了心脏RyR2通道活性。
数据提供了20-mer肽(SEQ ID NO：2)的活化反映了对心脏RyR2通道的结合的强有力的支持。
不以任何方式限制本发明，并非意料之外的是，在+40mV时，较高浓度的20-mer肽(SEQ ID NO：2)和肽AlS抑制心脏RyR活性的能力表明心脏和骨骼RyRs中的孔和其孔腔含有大量的可以与肽中正电荷残基相互作用的负电荷位点。在缺乏激活的情况下，肽A1S持续抑制的事实进一步提供了激活和抑制取决于结合RyR2通道上两个分离位点的20-mer肽(SEQ ID NO：2)的证据。
实施例3
DHPR 20-MER片段衍生物和类似物的功能分析
材料和方法
肽
在该系列试验中检测了4种肽，它们是：
(i)天然DHPR 20-mer肽(SEQ ID NO：2)；
(ii)SEQ ID NO：2肽中将Ser687(残基17)置换为丙氨酸残基以产生SEQ ID NO：8；
(iii)SEQ ID NO：2肽中将Arg688(残基18)置换为D异构体以产生SEQ ID NO：9；和
(iv)SEQ ID NO：2肽中Ser687突变为丙氨酸，Arg688置换为D异构体以产生SEQ ID NO：10。
从心脏SR Ca2+释放的测定
向比色杯加入心脏SR囊泡(50μg蛋白质)，至2ml溶液的终体积，含有(以mM为单位)：100，KH2PO4(pH＝7)；4，MgCl2；1，Na2ATP；0.5，antipyrylazo III。利用Cray50或者Cray100分光光度计在710nm监测囊泡外[Ca2+]。在790nm的相同试验表明不依赖于[Ca2+]改变的OD没有改变，该[Ca2+]改变将改变710nm测定的Ca2+释放速率。用4个3μl等份的5mM CaCl2将Ca2+加载囊泡，到7.5μM Ca2+的最终浓度。然后添加毒胡萝卜素(200nM)以阻断SR Ca2+ATPase。最后单独添加肽，或者添加肽和20μM Ca2+或2mM咖啡因。在毒胡萝卜素存在的情况下，在激活剂添加前立即测定Ca2+释放速率，在激活剂添加后立即测定Ca2+最初速率。然后添加特异的RyR活性阻断剂5μM钌红以证实Ca2+释放是通过RyR通道进行的。在试验最后添加Ca2+离子载体A23187(3μg/ml)以测定保留在SR囊泡中Ca2+的量。当完成Ca2+释放时，离子载体添加后Ca2+的瞬态表明含有不能通过RyR通道释放的钙的囊泡部分(推定囊泡来源于缺乏RyR通道的纵向SR)。结果表明仅仅10-20％的心脏SR制备物含有RyR的可调型贮藏。在从3个不同绵羊心脏制备物分离的囊泡上重复试验。
单通道试验
在缺乏BAPTA的情况下，cis溶液中Ca2+的浓度通过向cis溶液添加CaCl2至100nM缓冲，或者调整Ca2+的浓度至100μM。
实施例4
DHPR 20-MER肽片段衍生物和类似物的功能分析
结果
概述
实施例4的试验包括测定所有化合物对心脏SR囊泡Ca2+释放。此外，单心脏RyR通道暴露于肽SEQ ID NO：9。所有的肽均显著地增加了Ca2+激活的Ca2+释放速率或咖啡因激活的Ca2+释放速率。在缺乏激活的Ca2+或咖啡因的情况下，肽SEQ ID NO：9和10在＞30μM的高浓度时勉强增加了Ca2+释放速率，并且也增强了Ca2+激活的Ca2+释放和咖啡因激活的Ca2+释放。在脂质双层试验中，肽SEQ ID NO：9在低浓度(1-10nM)时增加了心脏RyR的活性，但是在高浓度时，于+40mV下以电压-和Ca2+-依赖的方式阻断了通道孔。因此，在适合的生理条件下，二氢吡啶受体片段肽能结合并激活心脏Ca2+释放通道和心脏SR的Ca2+释放。
肽对心脏SR Ca2+释放的作用
在其它激活因子缺乏的情况下，测定SEQ ID Nos：2，8，9和10从心脏SR释放Ca2+的能力。向囊泡外溶液添加肽，并且在肽添加后立即测定最初的Ca2+释放速率。在图5中所示的是4种肽的平均数据(小符号)。在30μM和50μM浓度时观察到所有肽释放速率的少量增加。
检测了肽对Ca2+激活的Ca2+释放和咖啡因激活的Ca2+释放的作用。Ca2+激活是心脏收缩期间RyR激活的主要体内机理。Ca2+激活机理与从SR囊泡的Ca2+激活和咖啡因激活的Ca2+释放有关，因为咖啡因的主要作用是转换Ca2+激活曲线至更低的Ca2+浓度。在咖啡因存在的情况下，约100nM的静息Ca2+浓度激活Ca2+释放。20μM Ca2+和2mM咖啡因诱导的Ca2+释放的最初速率是相似的，在这些试验中每毫克SR蛋白质每分钟约释放10μmoles的Ca2+。肽对Ca2+诱导的Ca2+释放和咖啡因诱导的Ca2+释放作用也是相似的，在图5中示出了两种激活方法获得的数据以平均数据一起进行的分组。清楚地，当将4种肽的每一种肽加入到囊泡外溶液中时，它们都能增加从心脏SR囊泡的Ca2+/咖啡因激活的Ca2+释放。在所有试验中，通过添加钌红终止Ca2+释放，表示释放是通过RyR通道进行的。具有4种肽的每一种肽的Ca2+释放的最大速率比对照大2到2.5倍，在20-30μM肽时达到Ca2+释放的最大速率。四种肽存在双阶段作用，因为在较高肽浓度时，Ca2+释放的速率倾向于下降。
在从心脏SR释放Ca2+和增加Ca2+/咖啡因激活的Ca2+释放方面所有的肽都显示了相似的效力。可能是从非Ca2+/咖啡因激活通道的释放太小了而不能获得肽间的差异。不以任何方式限制本发明，肽对Ca2+/咖啡因激活的Ca2+释放作用间的这种相似性已经反映了在单独具有激活剂的情况下，RyR通道接近最大打开的事实，因此限制了肽进一步激活它们的能力。
肽SEQ ID NO：9对单心脏RyR通道活性的作用
检测了脂质双层中SEQ ID NO：9对单心脏RyR通道活性的作用。最初向具有100μM cis Ca2+的心脏RyR通道胞质(cis)侧添加肽。肽不能激活通道(图6)。
当向双层溶液添加肽SEQ ID NO：9时诱导的心脏RyR活性的降低在+40mV时比-40mV时要大，因此其与通过肽SEQ ID NO：2进行的骨骼RyR通道依赖电压(即，依赖电流方向)的阻断是相似的。活性的降低与进入离子通道并与孔内负电荷相作用的正电荷SEQ ID NO：9肽相符。当电流从cis到trans并且携带肽进入孔时，阻断增加，但是当电流从trans到cis并且倾向于从孔中带走肽时，阻断部分反转。
利用2mM BAPTA缓冲的100nM肽的cis Ca2+浓度。肽SEQ ID NO：9对心脏通道的强烈激活均引起了正和负电势时，相对平均电流的10-20倍的增加(图7)。仅仅用10nM肽就使活性显著增加，用100nM肽观察到了最大的激活。在+40mV、较高肽浓度(1和10μM)时相对平均电流的下降表明肽的残余阻断作用。
测定了该肽对心脏RyRs的平均单通道参数的作用，图8所示是平均数据。在-40mV时肽诱导了约50倍增加的打开概率，在+40mV时肽诱导了约10倍增加的打开概率。该活性的增加是由于在两个电势时平均打开时间增加了8倍以及在+40mV和-40mV时，平均关闭时间分别降低80或170倍和事件频率的相应增加。因此肽对通道门的主要作用是对平均关闭次数的作用。
因此，DHPR II-III环SEQ ID NO：2肽可以激活心脏RyR通道并从心脏SR囊泡释放Ca2+。不仅天然肽释放Ca2+，具有增加的螺旋结构，并且优选含有RKR RK序列的几种其它肽显示了对Ca2+释放的相同作用。
本领域技术人员将理解除了特别说明以外，这里描述的本发明是易于变化和修改的。也要理解本发明包括所有的此类变化和修改。本发明也包括本申请文件中单独或一起引用的或标明的所有步骤、特征、组合物和化合物，和所述步骤或特征的所有联合或任何两个或多个联合。
本发明不限于这里描述的特定实施方案的范围，实施方案仅仅用于示例性目的。功能性等同的产品、组合物和方法清楚地在这里所述本发明范围内。
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序列表
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<130>2533538/TDO
<160>12
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>21
<212>PRT
<213>合成的DHPR 20-mer肽共有序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(21)
<223>在第6位和第8位的Xaa为任一氨基酸，优选地为Ala或Glu；在第7位的Xaa为任一氨基酸，优选地为Glu或Lys；在第11、14和18位的Xaa为Arg或Lys；在第12位的Xaa为任一氨基酸，优选地为Arg或Glu；在第16位的Xaa为Met，Leu，Ile或Val；在第17位的Xaa为Ala或Ser；在第18位的Xaa为Lys或Arg；在第18位的Xaa为为任一氨基酸，优选地为Gly，Thr，Ala；在第19位的Xaa为为任一氨基酸，优选地为Leu，Ala或Asn。
<400>1
Thr Ser Ala Gln Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Glu Xaa Xaa Arg Ser Lys
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20
<210>2
<211>20
<212>PRT
<213>合成的鼠骨骼DHPR 20-mer肽
<400>2
Thr Ser Ala Gln Lys Ala Lys Ala Glu Glu Arg Lys Arg Arg Lys Met
1 5 10 15
Ser Lys Gly Leu
20
<210>3
<211>20
<212>PRT
<213>合成的鼠骨骼DHPR 20-mer肽
<400>3
Thr Ser Ala Gln Lys Ala Lys Ala Glu Glu Arg Lys Arg Arg Lys Met
1 5 10 15
Ser Lys Gly Leu
20
<210>4
<211>20
<212>PRT
<213>合成的兔骨骼DHPR 20-mer肽
<400>4
Thr Ser Ala Gln Lys Ala Lys Ala Glu Glu Arg Lys Arg Arg Lys Met
1 5 10 15
Ser Arg Gly Leu
20
<210>5
<211>20
<212>PRT
<213>合成的兔心脏DHPR 20-mer肽
<400>5
Thr Ser Ala Gln Lys Glu Glu Glu Glu Glu Lys Glu Arg Lys Lys Leu
1 5 10 15
Ala Arg Thr Ala
20
<210>6
<211>20
<212>PRT
<213>合成的大鼠心脏DHPR 20-mer肽
<400>6
Thr Ser Ala Gln Lys Glu Glu Glu Glu Glu Lys Glu Arg Lys Lys Leu
1 5 10 15
Ala Arg Thr Ala
20
<210>7
<211>20
<212>PRT
<213>合成的牛蛙骨骼DHPR 20-mer肽
<400>7
Thr Ser Ala Gln Lys Ala Lys Ala Glu Glu Arg Lys Arg Lys Lys Leu
1 5 10 15
Ala Arg Ala Asn
20
<210>8
<211>20
<212>PRT
<213>合成的人骨骼DHPR 20-mer肽衍生物
<400>8
Thr Ser Ala Gln Lys Ala Lys Ala Glu Glu Arg Lys Arg Arg Lys Met
1 5 10 15
Ala Arg Gly Leu
20
<210>9
<211>20
<212>PRT
<213>人骨骼DHPR 20-mer肽类似物
<220>
<221>MISC FEATURE
<222>(1)..(20)
<223>X为Arg的D异构体
<400>9
Thr Ser Ala Gln Lys Ala Lys Ala Glu Glu Arg Lys Arg Arg Lys Met
1 5 10 15
Ser Xaa Gly Leu
20
<210>10
<211>20
<212>PRT
<213>人骨骼DHPR 20-mer肽类似物
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(20)
<223>X为Arg的D异构体
<400>10
Thr Ser Ala Gln Lys Ala Lys Ala Glu Glu Arg Lys Arg Arg Lys Met
1 5 10 15
Ala Xaa Gly Leu
20
<210>11
<211>20
<212>PRT
<213>合成肽NB
<400>11
Gly Leu Pro Asp Lys Thr Glu Glu Glu Lys Ser Val Met Ala Lys Lys
1 5 10 15
Leu Glu Gln Lys
20
<210>12
<211>20
<212>PRT
<213>合成肽A1S
<400>12
Thr Arg Lys Ser Arg Leu Ala Arg Gly Gln LysAla Lys Ala Lys Ser
1 5 10 15
Glu Met Arg Glu
20
<210>13
<211>37
<212>PRT
<213>合成的RyR2肽
<400>13
Phe Arg Ala Glu Lys Thr Tyr Ala Val Lys Ala Gly Arg Trp Tyr Phe
1 5 10 15
Glu Phe Glu Ala Val Thr Ser Gly Asp Met Arg Val Gly Trp Ser Arg
20 25 30
Pro Gly Cys Gln Pro
35