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测定脊柱侧凸风险的方法
相关申请的交叉引用
按照35 U.S.C.§119(e)，本申请要求2007年3月30日提交的美国临时申请序列号60/909,408和2008年2月1日提交的美国临时申请序列号61/025,571的优先权。以上文件通过引用全文纳入本文。
联邦资助的研究或开发的声明
不适用
发明领域
发明涉及测定发生脊柱侧凸风险的方法，对具有脊柱侧凸的对象分类的方法，评估支具(brace)对具有脊柱侧凸的对象的效力的方法以及用于这些方法的试剂盒。
发明背景
脊柱畸形，特别是脊柱侧凸代表了儿童和青少年中最常见的整形外科畸形(人群的0.2-6％)，而青少年特发性脊柱侧凸(AIS)代表了脊柱侧凸的最常见形式。
青少年特发性脊柱侧凸(AIS)的原因尚不清楚，因此传统认为AIS是具有某种遗传倾向的多因子疾病^(1-7)。有报道称源自手术期间从患AIS患者获得的活检样品的细胞中发生褪黑激素信号传导功能障碍⁸。
不幸的是，没有经证实的方法或检验可用于鉴定具有发生AIS风险的儿童或青少年或鉴定哪位受影响的个体因(疾病)进展的风险而需要治疗。因此，目前治疗方法，例如支具疗法或外科手术矫正的应用迟滞，除非检测到明显畸形或明确显示显著进展，从而导致治疗延迟和治疗不佳。²⁹
本说明书参考许多文件，它们的内容通过引用全文纳入本文。
发明概述
更具体地说，本发明提供测定发生脊柱侧凸风险的方法，包括在一段时期中监测对象样品的骨桥蛋白(OPN)表达，其中一段时期中该对象样品中的OPN表达增加表明该对象具有发生脊柱侧凸的风险。
在一具体实施方式中，所述监测始于当该对象约3岁时。在另一具体实施方式中，通过以每月至少约一次的频率检测OPN表达来实施所述监测。在另一具体实施方式中，通过以每6个月至少约一次的频率检测OPN表达来实施所述监测。在另一具体实施方式中，所述方法还包括检测该对象的样品中的sCD44表达。在另一具体实施方式中，采用酶联免疫吸附测定(ELISA)或放射免疫测定(RIA)实施所述监测OPN表达。
本发明提供测定发生脊柱侧凸风险的方法，包括检测对象的样品中的骨桥蛋白(OPN)表达，其中该对象样品中的OPN表达高于对照样品中的表明该对象具有发生脊柱侧凸风险。
在另一具体实施方式中，所述对象是发生脊柱侧凸的可能候选对象。在另一实施方式中，所述对象是发生青少年特发性脊柱侧凸的可能候选对象。在另一具体实施方式中，所述对象是预先诊断为具有脊柱侧凸。
在另一具体实施方式中，所述对象预先诊断为具有青少年特发性脊柱侧凸。
本发明另一方面提供对具有脊柱侧凸的对象分类的方法，包括检测该对象的样品中的骨桥蛋白(OPN)表达，从而该检测步骤能将该对象分入脊柱侧凸亚组。
本发明的另一方面提供评估支具对具有脊柱侧凸的对象的效力的方法，包括在支具治疗该对象之前和之后至少一次检测该对象的样品中骨桥蛋白(OPN)表达，其中与支具治疗该对象之前相比，随后OPN表达增加表明该支具无效。
在具体实施方式中，在支具治疗后测定OPN表达在支具治疗后至少一个月时进行。在另一具体实施方式中，在支具治疗后测定OPN表达在支具治疗后至少两个月时进行。在另一具体实施方式中，在支具治疗后测定OPN表达在支具治疗后至少三个月时进行。在另一具体实施方式中，在支具治疗后测定OPN表达在支具治疗后至少六个月时进行。
在另一具体实施方式中，该方法还包括检测该对象的样品中可溶性CD44受体(sCD44)表达。
在另一具体实施方式中，该对象的样品是该对象的生物学液体。在另一具体实施方式中，所述生物学液体选自下组：血液、尿液、泪液和唾液。在另一具体实施方式中，所述生物学液体是血浆。
在另一具体实施方式中，所述OPN表达是OPN蛋白。在另一具体实施方式中，用特异性结合OPN的抗体测定OPN表达。在另一具体实施方式中，采用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测OPN表达。在另一具体实施方式中，所述样品是血浆样品，OPN表达高于每毫升血浆700纳克表明该对象具有发生脊柱侧凸的风险。在另一具体实施方式中，所述样品是血浆样品，OPN表达高于每毫升血浆800纳克表明该对象具有发生脊柱侧凸的风险。
在另一具体实施方式中，所述OPN表达是OPN RNA。在另一具体实施方式中，所述对象的样品是脊柱旁肌肉活检样品，而所述OPN表达是OPN RNA。
本发明的另一方面提供选择用于减轻或预防脊柱侧凸的可能候选药剂的方法，包括将候选药剂与表达骨桥蛋白(OPN)的细胞接触，检测OPN的表达，其中与没有候选药剂存在下相比，当有其存在下OPN的表达降低，则选择该候选药剂。
本发明的另一方面提供选择用于减轻或预防脊柱侧凸的可能候选药剂的方法，包括将候选药剂与表达sCD44的细胞接触，检测sCD44的表达，其中与没有候选药剂存在下相比，当有其存在下OPN的表达增加，则选择该候选药剂。
在另一具体实施方式中，所述细胞是源自脊柱侧凸患者的细胞。
本发明的另一方面提供选择用于预防或减轻脊柱侧凸的可能候选药剂的方法，包括在脊柱侧凸模型动物发生脊柱侧凸之前将候选药剂给予该动物，从而与未给予候选药剂的对照动物相比，当该模型动物的脊柱侧凸得到预防或减轻时，选择该候选药剂。
本发明的另一方面提供预防或减轻脊柱侧凸的方法，包括将治疗有效量的骨桥蛋白抑制剂(OPN)或富硒饮食给予具有脊柱侧凸的对象，从而预防或治疗脊柱侧凸。
本发明的另一方面提供预防或减轻脊柱侧凸的方法，包括将治疗有效量的CD44抑制剂给予具有脊柱侧凸的对象，从而预防或治疗脊柱侧凸。
本发明的另一方面提供预防或减轻脊柱侧凸的方法，包括将治疗有效量的sCD44刺激剂给予具有脊柱侧凸的对象，从而预防或治疗脊柱侧凸。
在本发明方法的某具体实施方式中，所述对象是人。在本发明方法的另一具体实施方式中，所述对象是女性。在本发明方法的另一具体实施方式中，所述对象是男性。
本发明的另一方面提供用于治疗或预防脊柱侧凸的骨桥蛋白抑制剂。
本发明的另一方面提供用于治疗或预防脊柱侧凸的CD44抑制剂。
本发明的另一方面提供用于治疗或预防脊柱侧凸的sCD44刺激剂。
本发明的另一方面提供骨桥蛋白抑制剂在制备预防或治疗脊柱侧凸的药物中的应用。
本发明的另一方面提供骨桥蛋白抑制剂在预防或治疗脊柱侧凸中的应用。
本发明的另一方面提供CD44抑制剂在制备预防或治疗脊柱侧凸的药物中的应用。
发明的另一方面提供CD44抑制剂在预防或治疗脊柱侧凸中的应用。
本发明的另一方面提供sCD44刺激剂在制备预防或治疗脊柱侧凸的药物中的应用。
发明的另一方面提供sCD44刺激剂在预防或治疗脊柱侧凸中的应用。
在本发明应用的某具体实施方式中，所述脊柱侧凸是青少年特发性脊柱侧凸。
本发明的另一方面提供预测发生脊柱侧凸风险的试剂盒，其装有骨桥蛋白(OPN)的特异性配体和使用该试剂盒预测发生脊柱侧凸风险的使用说明书。在一具体实施方式中，所述试剂盒还装有可溶性CD44(sCD44)的特异性配体。
参考附图阅读下文对具体实施方式(只是举例)的非限制性描述后可更明白本发明的其它目的、优点和特征。

附图简述
在附图中：
图1显示了在松果体切除的鸡中的OPN检测情况和相应的脊柱侧凸。上图和下图分别描述了与未受影响(NS)的相比，在发生脊柱侧凸(S)的松果体切除鸡中脊柱旁肌肉中检测到的OPN表达在mRNA和蛋白质水平均上调；
图2在左图中示出了外科手术后脊柱侧凸的两足C57Bl/6j小鼠的循环OPN水平的动态变化，右图示出在两足C57Bl/6j小鼠中观察到脊柱侧凸畸形的典型x-射线照片，其中雌性(708)比雄性(907)受影响更严重；
图3显示了不同小鼠品系中血浆褪黑激素浓度的变化。S＝脊柱侧凸的；NS＝非-脊柱侧凸的；
图4显示药理学抑制OPN转录对脊柱侧凸的松果体切除鸡的作用；
图5图示了健康对照对象、AIS患者和具有风险的无症状对象中血浆骨桥蛋白的灵敏度和特异性。在图A中，包括33位健康对照对象和具有严重科布角(≥45°)的32位AIS患者的分析显示曲线下面积(AUC)为0.94，标准偏差为0.03(95％置信区间[CI]，0.88-1.000)。在图B中，应用每毫升700纳克/毫升骨桥蛋白的截断值显示对于早期检测AIS和检测脊柱侧凸进展风险的灵敏度高(90.6％)并且特异性非常好(81.8％)。在图C中，应用800纳克/毫升骨桥蛋白的截断值显示对于早期检测AIS和检测脊柱侧凸进展风险的灵敏度高(84.9％)而特异性更高(90.9％)。在图D中，利用所有AIS患者显示血浆骨桥蛋白水平和科布角之间有明确的相关性，产生的p-值0.001，r²＝0.26；
图6图示了男性和女性混合的(对照，具有风险，AIS＜45和AIS≥45)(图A)以及按性别分开的女性(图B)和男性(图C)的不同组中的年龄分布；
图7显示了基线访问(baseline visit)时，12岁(红色)、14岁(绿色和蓝色)和17岁(黄色)的4位选择的AIS女性患者(未经支具治疗)在随访期间的OPN水平、sCD44水平和科布角的变化情况；
图8显示了弯曲畸形加重(科布角的总增值超过3°；n＝14)的AIS患者和弯曲没有明显改变(科布角没变化，减小或增值小于3°；n＝36)的那些AIS患者在随访期间OPN(左图)和sCD44(左图)水平的总体改变的分布；
图9显示AIS患者中OPN进展与科布角进展相关；
图10显示AIS患者中OPN消退或稳定与科布角消退或稳定相关；
图11显示基线访问时，没有脊柱侧凸但具有风险的4位选择对象在随访期间OPN和sCD44水平的改变情况：13岁男性1名(绿色)，5岁(金色)、11岁(蓝色)和9岁(红色)女性3名；
图12比较了非AIS脊柱侧凸患者(NAIS)(OPN(n＝28)、sCD44(n＝18)、HA(n＝24))、健康对照(n＝35)和AIS患者(n＝252)中的OPN、sCD44和HA水平；
图13是比较手术前AIS患者(n＝79)与手术后AIS患者(n＝28)中，OPN循环水平的改变与脊柱生物力学性能的关系的柱状图；
图14是比较手术前AIS女性(OPN(n＝10)；sCD44(n＝15))与手术后AIS女性(OPN(n＝10)；sCD44(n＝12))中OPN和sCD44循环水平的柱状图；
图15是手术前(图A)和手术后(图B)，AIS患者在预定截断区(cut-offzone)上的分布图；
图16是用支具治疗前(图A)和支具治疗后(图B)，AIS患者在预定截断区上的分布图；
图17说明了AIS中脊柱畸形进展可能的假定分子概念；
图18将AIS患者中的硒水平与OPN水平相关联；
图19是比较以下三类对象中硒水平的柱状图：对照、低OPN产生对象和高OPN产生对象；
图20是3种人OPN同种型的核苷酸序列(转录物变体1，mRNANM_001040058(SEQ ID NO：1)；转录物变体2，mRNA NM_000582(SEQ IDNO：2)；转录物变体3，mRNA NM_001040060(SEQ ID NO：3)和3种人OPN同种型的氨基酸序列(同种型a NP_001035147(SEQ ID NO：4)；同种型bNP_000573(SEQ ID NO：5)；和同种型c NP_001035149(SEQ ID NO：6))；
图21是6种人CD44同种型的核苷酸序列(mRNA)(NM_000610转录物变体1(SEQ ID NO：7)；NM_001001389转录物变体2(SEQ ID NO：8)；NM_001001390转录物变体3(SEQ ID NO：9)；NM_001001391转录物变体4(SEQ ID NO：10)；NM_001001392转录物变体5(SEQ ID NO：11)；肿瘤细胞中鉴定的X62739同种型(SEQ ID NO：12))和6种人sCD44同种型的氨基酸序列(NP_000601同种型1前体(SEQ ID NO：13)；NP_001001389同种型2前体(SEQ ID NO：14)；NP_001001390同种型3前体(SEQ ID NO：15)；NP_001001391同种型4前体(SEQ ID NO：16)；NP_001001392同种型5前体(SEQ ID NO：17)；和在肿瘤细胞中鉴定的CAA44602同种型(SEQ IDNO：18))；和
图22显示了sCD44的结构(图A)、各种CD44同种型的起源(图B)和一种sCD44同种型(SEQ ID NO：23)的切割位点。
说明性实施方式的描述
观察到一种多功能细胞因子——骨桥蛋白(OPN)(也称为分泌型磷蛋白1、骨唾液蛋白I、早期T-淋巴细胞活化1)参与青少年特发性脊柱侧凸(AIS)，测定了三种人群的血浆OPN浓度：AIS患者、没有任何脊柱侧凸家族先例的健康对照和双亲中至少一位是脊柱侧凸患者，视作有风险的无症状后代(“风险儿童”)。
比较一组252位连续的AIS患者与35位无任何脊柱侧凸家族病史的健康对照对象和70位无症状有风险的对象。所有的对象是高加索人，人口统计学特征见下表2。通过酶联免疫吸附测定检测血浆OPN、可溶性CD44受体(sCD44)和乙酰透明质酸(HA)水平。还研究了松果体切除的鸡和经遗传修饰缺乏OPN或CD44受体(一种已知的OPN受体)的两足C57Bl/6j小鼠。
科布角＞45°(965±414纳克/毫升)的AIS患者中平均血浆OPN浓度明显高于(p-值＜0.001)健康对照(570±156纳克/毫升)和科布角＜45°(799±284纳克/毫升)的AIS患者。OPN对AIS的诊断灵敏度和特异性分别是84.4％和90.6％(截断值≥800纳克/毫升)。亚组分析显示47.9％有风险的儿童的OPN值高于800ng/ml，而对照只有8.6％，表明血浆OPN水平先于脊柱侧凸形成之前升高。所有组之间的平均血浆sCD44水平和HA水平没有显著差异。对于脊柱侧凸的病理生理学研究，两足C57Bl/6j小鼠模型显示脊柱侧凸的发生需要OPN与CD44受体相互作用，因为遗传修饰的两足小鼠无一发生脊柱侧凸。利用IBL的商品化人OPN特异性ELISA试剂盒计算本文公开的OPN截断值。当有差别地检测OPN表达(mRNA或蛋白质)时(例如，通过OPN RNA或OPN蛋白质，但利用不同的抗体检测不同生物学样品中的OPN表达)，它们可能不同。
OPN(也称为分泌型磷蛋白1，米诺蛋白(minopontin)，Eta-1)是存在于矿化组织，例如胞外基质中的含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列的磷酸化糖蛋白。该多功能细胞因子参与许多病理学状况^9，10。感兴趣的是OPN转录物和蛋白质是否存在于控制平衡的体位控制中心，例如小脑、骨骼肌本体感受感觉器官和内耳结构中⁽¹¹⁾，因为AIS患者也显示体位控制、本体感受和平衡有缺陷^(12，13)。现已在不同的成人癌症和炎性病症中发现血浆OPN水平高^30-33。
OPN信号传导作用：OPN信号传导途径不十分了解，虽然已知除与整联蛋白相互作用外，OPN还能与细胞表面的CD44受体相互作用^14，15。虽然CD44是乙酰透明质酸(HA)的主要受体，它还用作OPN的受体并具有多个RGD结合位点。粘着分子的CD44家族的所有人同种型由一种基因编码。人CD44基因的19个外显子中12个的另路剪接产生了多个变体同种型^16，17，这种结构异质性产生了CD44的配体库，包括纤连蛋白¹⁸、硫酸软骨素¹⁹、骨桥蛋白²⁰、至少两种肝素结合生长激素和乙酰透明质酸^21，22。sCD44的可溶性变体同种型(sCD44var)与几种病理学状况有关^{16，18，23，24}。有人提出sCD44同种型通过细胞表面CD44的蛋白水解切割或因另路剪接导致的从头合成而产生。观察到当CD44H，或任何具体剪接变体在某些细胞类型中表达时有乙酰透明质酸(HA)结合活性但在其它细胞类型中无活性，证明CD44分子之间有功能差异，与变体外显子利用无关。许多CD44同种型是组织特异性的，但sCD44的全部可溶性变体同种型与一些病理学状况有关。实际上，总sCD44和具体的可溶性CD44同种型显示在包括非霍奇金淋巴瘤和乳腺癌、胃癌及结肠癌在内的一些恶性肿瘤中与肿瘤转移有关。还知道可溶性CD44的水平在具有特定炎性病症，例如类风湿性关节炎、肠粘膜极性炎症(pouchitis)和结肠炎及支气管炎的对象的体液中较高。乙酰透明质酸(HA)也称为透明质酸盐或透明质酸，其是广泛分布于身体的粘多糖，由包括成纤维细胞和其它专门化结缔组织细胞在内的各种细胞产生。
本文所用的术语“对象”表示任何哺乳动物，包括人、小鼠、大鼠、狗、猫、猪、猴、马，等等。在一具体实施方式中，其指人。
本文所用的术语“支具”表示包括牙科和矫型支具，因此“支具治疗”指将支具置于对象中的行为。在一具体实施方式中，其表示用于脊柱侧凸对象的支具。
本文所用的术语“脊柱疾病和导致脊柱侧凸的疾病”指可能参与脊柱侧凸发生的疾病。其包括但不限于AIS、先天性脊柱侧凸、先天性脊柱后凸(congenital cyphose scoliosis)、神经性脊柱侧凸(neurological scoliosis)、发育不良性脊柱侧凸(dysplasic scoliosis)、多发性神经纤维瘤、大脑性瘫痪、肌营养不良、神经肌肉性脊柱侧凸(neuromuscular scoliosis)、脊椎前移和努南综合征(Noonan syndrome)。可分类或预测的脊柱侧凸不包括事故和某些先天畸形导致的那些。
本文所用的术语“发生青少年特发性脊柱侧凸的可能候选对象”包括至少双亲之一具有青少年特发性脊柱侧凸的儿童。相对于其它因素，已知年龄(青少年)、性别和遗传特征(即，母亲或父亲具有脊柱侧凸)是发生脊柱侧凸的风险的因素，在一定程度上可用它们来评估发生AIS的风险。在某些对象中，脊柱侧凸在很短时期内快速发展到需要接受矫型外科手术的地步。目前从诊断到AIS之时(脊柱侧凸明显时)可用的做法包括目测观察(科布角约为10-25°时)、整形外科装置(科布角约为25-30°时)和外科手术(超过45°)。按照本发明测定进展的风险并监测治疗效率的更可靠方法有助于1)选择合适的饮食以除去鉴定为导致脊柱侧凸的某些食品；2)选择最佳治疗剂；或3)选择介入性最低的预防措施和/或可用的治疗方法，例如体位锻炼、整形外科装置，或介入性较低的外科手术或不融合的外科手术(不融合脊椎且保留脊柱运动性的外科手术)。
本文所用的术语“严重的AIS”指特征在于科布角为45°或以上的脊柱侧凸。
本文所用的术语“发生脊柱侧凸的风险”指某对象发生脊柱侧凸(即，脊柱畸形)和/或在将来发生更严重的脊柱侧凸的遗传或新陈代谢倾向性。例如，对象的科布角增加(如，从40°增加到50°。或从18°增加到25°)即为发生脊柱侧凸。
本文所用的术语“生物学样品”指从生物分离的任何固体或液体样品。在一具体实施方式中，其指从人分离的任何固体或液体样品。其包括生物活检材料、血液、泪(48)、唾液、母乳、滑膜液、尿液、耳液(ear fluid)、羊水和脑脊液，但不局限于此。在一具体实施方式中，其指血液样品。
本文所用的术语“血液样品”表示血液、血浆或血清。某一优选实施方式采用血浆。在一更具体的实施方式中，其指血浆样品。
本文所用的术语“对照样品”指并非来自已知具有脊柱侧凸的对象或来自已知可能发生脊柱侧凸的候选者的样品。然而，在测定预诊断为脊柱侧凸的对象发生脊柱侧凸风险的方法中，样品还可来自经研究处于该疾病或病症的早期阶段的对象。
本文所用的术语“治疗的”或“治疗”述及脊柱侧凸时指至少一种以下情况：已存在的脊柱畸形的科布角减小、脊柱运动性改善、脊柱运动性保留/维持、某一特定计划(plan)中均衡和平衡的改善；某一特定计划中均衡和平衡的保留/维持；某一特定计划中功能的改善、某一特定计划中功能的保留/维持、美容学改善和以上任一种的组合。
本文所用的术语“预防的”或“预防”述及脊柱侧凸时指至少一种以下情况：具有脊柱侧凸的患者或无症状患者中科布角进展减缓，完全防止出现脊柱畸形，包括在三维上影响肋架和骨盆的改变，和以上任一种的组合。
本文所用的术语“骨桥蛋白抑制剂”指能减少或阻断OPN(称为sspil的基因)表达(转录或翻译)的药剂，能减少或阻断OPN分泌的药剂或能减少或阻断OPN与其受体CD44结合的药剂。所述药剂可以是天然或合成的，可以是蛋白质，例如但不限于特异性结合OPN的抗体、肽、小分子、核苷酸，例如但不限于OPN的特异性反义或siRNA，但不限于此。
本文所用的术语“CD44抑制剂”指能减少CD44表达(转录或翻译)的药剂，或能减少CD44定位于细胞膜的药剂。所述药剂可以是天然或合成的，可以是蛋白质，例如但不限于特异性结合CD44的抗体、肽、小分子、核苷酸，例如但不限于CD44的特异性反义或siRNA，但不限于此。
本文所用的术语“sCD44刺激剂”指能增加sCD44表达(转录或翻译)的药剂，能增加sCD44分泌的药剂或能增加sCD44与OPN亲和力的药剂。所述药剂可以是蛋白质、肽、小分子或核苷酸，但不限于此。
本文利用冠词“一”、“一个”和“该”指一个或更多个(即，至少一个)该冠词在语法上的对象。
本文利用术语“包括”和“包含”表示短语“包括但不限于”和“包含但不限于”，并可与上述短语互换使用。
本文利用术语“例如”表示短语“例如但不限于”，并可与该短语互换使用。
本发明还涉及测定OPN、HA或sCD44的表达水平(即，转录或翻译)的方法。因此，本发明包括用于这种测定的任何已知方法，包括ELISA(酶联免疫吸附测定)、RIA(放射免疫测定)、实时PCR和竞争性PCR、Northern印迹、核酶保护、噬菌斑杂交和槽印迹。
本发明还涉及分离的核酸分子，包括检测OPN、sCD44或CD44的探针和引物。在具体的实施方式中，分离的核酸分子具有不超过300、或不超过200、或不超过100、或不超过90、或不超过80、或不超过70、或不超过60、或不超过50、或不超过40或不超过30个核苷酸。在具体的实施方式中，所述分离的核酸分子具有至少17、或至少18、或至少19、或至少20、或至少30、或至少40个核苷酸。在其它具体的实施方式中，所述分离的核酸分子具有至少20且不超过300个核苷酸。在其它具体实施方式中，所述分离的核酸分子具有至少20且不超过200个核苷酸。在其它具体实施方式中，所述分离的核酸分子具有至少20且不超过100个核苷酸。在其它具体实施方式中，所述分离的核酸分子具有至少20且不超过90个核苷酸。在其它具体实施方式中，所述分离的核酸分子具有至少20且不超过80个核苷酸。在其它具体实施方式中，所述分离的核酸分子具有至少20且不超过70个核苷酸。在其它具体实施方式中，所述分离的核酸分子具有至少20且不超过60个核苷酸。在其它具体实施方式中，所述分离的核酸分子具有至少20且不超过50个核苷酸。在其它具体实施方式中，所述分离的核酸分子具有至少20且不超过40个核苷酸。在其它具体实施方式中，所述分离的核酸分子具有至少17且不超过40个核苷酸。在其它具体实施方式中，所述分离的核酸分子具有至少20且不超过30个核苷酸。在其它具体实施方式中，所述分离的核酸分子具有至少17且不超过30个核苷酸。在其它具体实施方式中，所述分离的核酸分子具有至少30且不超过300个核苷酸。在其它具体实施方式中，所述分离的核酸分子具有至少30且不超过200个核苷酸。在其它具体实施方式中，所述分离的核酸分子具有至少30且不超过100个核苷酸。在其它具体实施方式中，所述分离的核酸分子具有至少30且不超过90个核苷酸。在其它具体实施方式中，所述分离的核酸分子具有至少30且不超过80个核苷酸。在其它具体实施方式中，所述分离的核酸分子具有至少30且不超过70个核苷酸。在其它具体实施方式中，所述分离的核酸分子具有至少30且不超过60个核苷酸。在其它具体实施方式中，所述分离的核酸分子具有至少30且不超过50个核苷酸。在其它具体实施方式中，所述分离的核酸分子具有至少30且不超过40个核苷酸。应该知道在实时PCR中，引物还构成探针，而不是该术语的传统含义。可采用已知的方法，利用分布在它们各自的核苷酸序列中的序列设计适合在本发明方法中检测OPN、sCD44和CD44的引物或探针(49)。
可用的本发明探针含天然产生的糖-磷酸主链以及修饰的主链，包含硫代磷酸酯、连二硫酸酯、膦酸烷酯和α-核苷酸等。修饰的糖-磷酸主链是公知的。本发明的探针可由核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)，优选DNA构成。
可用探针的检测方法的类型包括Southern印迹(DNA检测)、斑点或槽印迹(DNA、RNA)和Northern印迹(RNA检测)。虽然不是最优选，但标记的蛋白质也可用于检测与其结合的特定核酸序列。其它检测方法包括含有在浸渍片装置上的探针的试剂盒，等等。
本文所用的术语“可检测标记的”指标记本发明的探针或抗体，从而能按照本发明检测OPN、HA和/或sCD44。虽然本发明并不特别依赖于利用标记物来检测特定的核酸序列，但这种标记物因提高检测的灵敏度而可能有益。此外，它能实现自动化。可按照许多熟知的方法标记探针。标记物的非限制性例子包括3H、14C、32P和35S。可检测标记的非限制性例子包括配体、荧光团、化学发光剂、酶和抗体。可与探针联用并能提高本发明方法的灵敏度的其它可检测标记包括生物素和放射性核苷酸。本领域普通技术人员应明白特定标记物的选择决定了其与探针的结合方式。
公知可通过几种方法将放射性核苷酸掺入本发明探针。它们的非限制性例子包括利用γ32P ATP和多核苷酸激酶激活(kinasing)探针的5’端，有放射性dNTP存在下利用大肠杆菌Pol I的Klenow片段(例如，在低熔点凝胶中利用随机寡核苷酸引物均匀标记的DNA探针)，有一种或多种放射性NTP存在下利用SP6/T7系统转录DNA区段，等等。
本发明还涉及选择化合物的方法。本文所用的术语“化合物”表示包括天然、合成或半合成的化合物，包括但不限于化学物质、大分子、细胞或组织提取物(取自植物或动物)、核酸分子、肽、抗体和蛋白质。
本发明还涉及阵列。本文所用的“阵列”是有意产生的分子集合，其可经合成或生物合成制备。阵列中的分子可以彼此相同或不同。阵列可采取各种形式，例如可溶性分子文库；系于树脂珠、二氧化硅芯片或其它固体支持物上的化合物文库。
本文所用的“核酸分子阵列”是有意产生的核酸分子集合，其可经合成或生物合成制备成各种不同形式(例如可溶性分子文库；系于树脂珠、二氧化硅芯片或其它固体支持物上的寡核苷酸文库)。此外，该术语“阵列”包括可通过在基板上点样基本上任意长度(例如，长度为1-约1000个核苷酸单体)的核酸来制备的那些核酸文库。本文所用的术语“核酸”指含有嘌呤和嘧啶碱基，或其它天然的、化学或生物化学修饰的，非天然或衍生的核苷酸碱基的任何长度的核苷酸，即核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸的聚合物形式或肽核酸(PNA)。多核苷酸的主链可包含RNA或DNA中常见的糖和磷酸基团，或修饰或取代的糖或磷酸基团。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。核苷酸序列可间插以非核苷酸组分。因此核苷、核苷酸、脱氧核苷和脱氧核苷酸这些术语通常包括类似物，例如本文所述的那些。这些类似物是某些结构特征与天然产生的核苷或核苷酸相同的那些分子，从而在掺入核酸或寡核苷酸序列时能与溶液中天然产生的核酸序列杂交。这些类似物一般通过替代和/或修饰碱基、核糖或磷酸二酯部分而衍生自天然产生的核苷和核苷酸。可视需要特制这些改变以使杂交稳定或去稳定或提高与互补核酸序列杂交的特异性。
本文所用的“固体支持物”、“支持物”和“基板”可互换使用，指具有刚性或半刚性表面的材料或一组材料。在许多实施方式中，固体支持物的至少一个表面应基本上是平的，虽然在一些实施方式中优选为不同的化合物而用例如孔、凸出的区域、针、蚀刻槽等来物理分隔合成区域。按照其它实施方式，固体支持物可采取珠、树脂、凝胶、微球的形式或其它几何构型。
本发明可利用任何已知的核酸阵列。例如，这些阵列包括基于短或较长寡核苷酸探针或引物以及cDNA或聚合酶链式反应(PCR)产物的那些阵列。其它方法包括基因表达系列分析(SAGE)、差异展示以及消减杂交法、差异筛选(DS)、RNA任意引物(RAP)-PCR、差异表达序列的限制性内切核苷酸分析(READS)、扩增限制性片段-长度多态性(AFLP)。
抗体
本发明包括利用检测或测定例如，对象样品中的OPN、sCD44或CD44水平的抗体，或装在本发明试剂盒中的抗体。可采用下文进一步描述的方法常规制备特异性结合那些生物学标记的抗体，本发明还包括利用可商品化购得的抗体。特异性结合OPN的抗体包括下表1所列的那些，但不限于此。
表1.可商品化购得的人OPN ELISA试剂盒

  公司  试剂盒名称  目录号  灵敏度  汉堡IBL公司  (IBL Hambourg)  人骨桥蛋白ELISA  JP 171 58  3.33ng/ml  美国IBL公司  (IBL America)  人骨桥蛋白N-半测  定试剂盒-IBL  27258  3.90ng/ml  IBL公司-美国  (IBL-America)  人骨桥蛋白测定试  剂盒-IBL  27158  3.33ng/ml  试验设计公司  (Assay designs)  骨桥蛋白(人)EIA试  剂盒  900-142  0.11ng/ml  美国研究产品有限  公司  (American Research  Products，Inc.)  骨桥蛋白，人试剂盒  17158  ？  研发系统公司  (R & D Systems)  人骨桥蛋白  (OPN)ELISA试剂盒  DOST00  0.024ng/ml  普罗卡因公司  (Promokine)  人骨桥蛋白ELISA  PK-EL-KA4231  3.6ng/ml
  Uscn生命公司  (Uscnlife) 人骨桥蛋白，OPN ELISA试剂盒  E0899h  ？
针对OPN的单克隆和多克隆抗体均属于本发明的范围内，因为可通过本领域技术人员熟知的方法产生它们。此外，针对第一抗体的任何第二抗体(单克隆或多克隆)也包括在本发明的范围内。
本文所用的术语“抗-OPN抗体”和“免疫特异性抗-OPN抗体”指与OPN蛋白质特异性结合(与其相互作用)，并且除与OPN蛋白质共有相同抗原决定簇的蛋白质外，与其它天然产生的蛋白质基本上不结合的抗体。术语抗体或免疫球蛋白以最宽泛的含义使用，涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体和抗体片段，只要它们显示所需生物学活性。抗体片段包含全长抗体的一部分，通常是其抗原结合或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)₂和Fv片段，双抗体(diabody)、线性抗体、单链抗体分子、单域抗体(例如，来自骆驼)、鲨鱼NAR单域抗体和由抗体片段构成的多特异性抗体。抗体片段还指包含CDR或抗原结合结构域的结合部分，包括但不限于VH区(V_H、V_H-V_H)、抗运载蛋白(anticalin)、PepBodies^TM、抗体-T-细胞表位融合体(Troybodies)或肽抗体。此外，针对第一抗体的任何第二抗体(单克隆或多克隆)也包括在本发明范围内。
总之，制备抗体(包括单克隆抗体和杂交瘤)和利用抗体检测抗原的技术是本领域熟知的(Campbell，1984，刊于《单克隆抗体技术：生物化学和分子生物学的实验室技术》(Monoclonal Antibody Technology：LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology)，埃尔赛维科学出版公司(Elsevier Science Publisher)，阿姆斯特丹，荷兰)和Harlow等，1988(刊于：《抗体实验室手册》(Antibody A Laboratory Manual)，CSH实验室(CSHLaboratories))。术语抗体在本文包括多克隆、单克隆抗体和抗体变体，例如单链抗体、人源化抗体、嵌合型抗体和抑制或中和其对映体(Hyphen)中的各相互作用结构域和/或对其有特异性的抗体的免疫活性片段(例如，Fab和Fab’片段)。
优选通过多次皮下(sc)、静脉内(iv)或腹膜内(ip)注射相关抗原(用或不用佐剂)在动物中产生多克隆抗体。利用双功能或衍生剂，例如马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(maleimidobenzoyl sulfosuccinimide ester)(通过半胱氨酸残基偶联)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl₂或R¹N＝C＝NR(其中R和R¹是不同的烷基)，将相关抗原与在待免疫的物种中有免疫原性的蛋白质，例如匙孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂偶联可能是有用的。
可利用抗原、免疫原性偶联物或衍生物，通过将抗原或偶联物(例如，对于家兔是100μg，对于小鼠是5μg)与3体积的完全弗氏佐剂混合并在多个部位真皮内注射该溶液来免疫动物。一个月后，通过在多个部位皮下注射用完全弗氏佐剂配制的该抗原或偶联物(例如，用于免疫的原始剂量的1/5-1/10)来加强免疫动物。7-14天后，对动物采血，分析血清的抗体滴度。加强免疫动物直至滴度达到平台期。对于偶联物免疫，优选用抗原相同但偶联于不同蛋白质和/或通过不同交联剂的偶联物加强免疫动物。还可在重组细胞培养物中将偶联物制备成蛋白质融合体。聚集剂，例如明矾也适用于增强免疫应答。
可采用Kohler等在Nature，256：495(1975)中首次描述的杂交瘤方法，或可通过重组DNA方法(例如，美国专利号6,204,023)制备单克隆抗体。还可采用美国专利号6,025,155和6,077,677以及美国专利申请公布号2002/0160970和2003/0083293所述的技术制备单克隆抗体(也可参见，例如Lindenbaum等，2004)。
在杂交瘤方法中，免疫(如上所述)小鼠或其它合适的宿主动物，例如大鼠、仓鼠或猴以引发产生或能产生特异性结合免疫所用抗原的抗体的淋巴细胞。或者，可体外免疫淋巴细胞。然后利用合适的融合剂，例如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞。
在合适培养基中接种和培养如此制备的杂交瘤细胞，所述培养基中最好含有一种或多种抑制未融合亲代骨髓瘤细胞的物质。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，杂交瘤的培养基通常包含次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质防止HGPRT-缺陷型细胞生长。
本文在“纯化抗体”这一表述中所用的术语“纯化”只是意味着区分人造抗体与动物针对其自己的抗原而天然产生的抗体。因此，含有抗-OPN抗体的原始血清和杂交瘤培养基是本发明含义内的“纯化抗体”。
本发明还包括检测和/或定量测定OPN、HA或sCD44的翻译产物的阵列。所述阵列包括蛋白质微阵列或大阵列，包括高分辨2D-凝胶方法在内的凝胶技术，可能在细胞水平与质谱成像系统联用，例如显微镜与荧光标记系统组合。
本发明还包括鉴定直接或间接影响OPN的转录、翻译、翻译后修饰或活性的具体突变的方法。感兴趣的突变包括影响OPN与CD44的任何可溶性或非可溶性同种型之间相互作用或影响HA与CD44的任何可溶性或非可溶性同种型结合的任何突变，但不限于此。
本发明还包括监测本文公开的生物标记以评估预防脊柱侧凸和弯曲进展的许多方法，例如任何物理治疗(如体位锻炼、理疗、通过操控或利用特定装置，如震动板进行的生物化学刺激)的效力；监测支具疗法效力或开发新型支具；监测融合或不融合脊椎的新外科手术装置，和监测具体饮食、营养品和/或药物治疗的效力。应用支具后的首次检测可在确定，例如支具是否良好调整并确定患者是否顺从于该治疗后1个月时进行，但不限于此。随后，可依据是否检测到高OPN水平，每3-6个月进行所述监测。本发明的这种方法有利地降低了对x-射线照相的需求。例如，可只在就诊时检测到OPN水平太高时实施x-射线照相。
本发明还包括监测本文公开的生物标记，从而为早期支具疗法或为利用新型无融合装置(fusionless device)的低介入性外科手术，为药理学治疗鉴定具有进展风险的患者，并监测AIS患者对治疗的反应。众所周知，无融合装置对仍具有生长可能性的患者尤其有用，因此，在对象的一生中尽可能早地鉴定发生脊柱侧凸的风险是有益的。在一具体实施方式中，在对象约5岁时，或者在具有脊柱侧凸家族先例/病史的对象中更小的年龄开始监测。检验的频率通常是每6个月一次。如果OPN值超过截断值(即，利用代号为27158的OPN IBL ELISA试剂盒时，＞800ng/ml)，优选显著增加该频率(例如，每月一次、每两月一次、每三个月一次...)。
对于可能有用的治疗剂，本发明还包括利用全细胞测定筛选/选择能阻遏OPN(ssp1基因编码)转录和/或合成，和/或能增加可以螯合循环OPN的sCD44产生，和/或能干扰OPN与CD44受体联络，和/或能阻断CD44受体的治疗性化合物的方法。用于这些方法中的细胞包括任何来源(包括内部或可商品化购得的细胞系)和类型(任何组织)的细胞。可通过，例如无限增殖AIS对象的细胞来制备内部细胞系。在具体的实施方式中，本发明的筛选方法想要鉴定抑制OPN表达(转录和/或翻译)的药剂和增加sCD44表达(转录和/或翻译)的药剂。对于这些实施方式，有用的细胞系包括产生高水平OPN和/或低水平sCD44的那些细胞系。参考文献43-56描述了这些有用的细胞系。
在一特定实施方式中，其包括源自脊柱侧凸患者的任何细胞类型的细胞(全细胞测定)。在具体的实施方式中，其包括成骨细胞、软骨细胞、成肌细胞或血细胞，包括淋巴细胞。本文所用的术语“源自脊柱侧凸患者的细胞”指从脊柱侧凸患者直接分离的细胞，或源自从脊柱侧凸患者直接分离的细胞的无限增殖细胞系。在具体的实施方式中，所述细胞是脊柱旁肌肉细胞。这些细胞可通过，例如穿刺活检从对象分离。
还可通过例如经鼻、静脉内、肌肉内、皮下、舌下、鞘内或真皮内等途径给予药物组合物。给药途径可取决于例如环境和治疗目的等因素。
剂量
可将任何用量的药物和/或营养品和/或饮食补充剂组合物给予对象。剂量取决于包括给药方式在内的许多因素。单次剂量所含的抗-脊柱侧凸组合物(例如，骨桥蛋白抑制剂或含硒化合物)的用量通常是有效防止、延迟或减轻脊柱侧凸而不会诱导明显毒性的用量，即“治疗有效量”。
在一些实施方式中，可以调节营养品抗-脊柱侧凸组合物(例如，硒补充剂)的治疗有效量。有用的有效量浓度包括以下用量：以重量计，总饮食的约0.01％到约10％，总饮食的约0.01％到约6％，或总饮食的约0.2％到约6％。
还可直接检测骨桥蛋白抑制剂或含硒化合物的有效量。可以每日或每周给予所述有效量或它们的几分之一。本发明的药物和/或营养品和/或饮食补充剂组合物的给予量通常是每日每公斤体重约0.001mg到最多约500mg(例如，10mg、50mg、100mg或250mg)。可以单次或多次剂量方案提供剂量。例如，在一些实施方式中，有效量是以下剂量：每天约1mg到约25克抗-脊柱侧凸制品，每天约50mg到约10克抗-脊柱侧凸制品，每天约100mg到约5克抗-脊柱侧凸制品，每天约1克抗-脊柱侧凸制品，每周约1mg到约25克抗-脊柱侧凸制品，每周约50mg到约10克抗-脊柱侧凸制品，每隔一天约100mg到约5克抗-脊柱侧凸制品，和每周一次约1克抗脊柱侧凸制品。
例如，本发明的药物(例如，含有骨桥蛋白抑制剂)和/或营养品(例如，含有硒)和/或饮食补充剂(例如，含有硒)组合物可以是以下形式：液体、溶液、混悬液、丸剂、胶囊、片剂、软胶囊、粉末、凝胶、软膏、乳膏、喷雾剂、轻雾、雾化气体、气溶胶或植物复合体(phytosome)。对于口服给药，可通过常规方法，利用至少一种药学上可接受的赋形剂，例如粘合剂、填充剂、润滑剂、崩解剂或润湿剂制备片剂或胶囊。可通过本领域已知的方法包衣片剂。口服给予的液体制品可采取，例如溶液、糖浆或混悬液等形式，或者它们可以是在使用前以盐水或其它合适的液体载体构建的干产品。本发明的饮食补充剂还可视需要含有药学上可接受的添加剂，例如悬浮剂、乳化剂、非水性载体、防腐剂、缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。还可适当配制口服给予的制品以控释活性成分。
此外，本发明的药物(例如，含有骨桥蛋白抑制剂)和/或营养品(例如，含有硒)和/或饮食补充剂(例如，含有硒)组合物可含有用于给予哺乳动物的药学上可接受的运载体，包括但不限于：无菌水性或非水性溶液、混悬液和乳液。非水性溶剂的例子包括但不限于：丙二醇、聚乙二醇、植物油和可注射有机酯。水性运载体包括但不限于：水、醇、盐水和缓冲溶液。药学上可接受的运载体还可包括生理学上可接受的载体(例如，生理盐水)或对于特定给药途径合适的其它已知运载体。
可将骨桥蛋白抑制剂或硒与药学制品中通常使用的任何载体，例如滑石粉、阿拉伯胶、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、可可脂、水性或非水性溶剂、油、石蜡衍生物或乙二醇一起掺入剂型。还可利用乳液，例如美国专利号5,434,183所述那些，其中混合了植物油(例如，大豆油或红花油)、乳化剂(例如，卵黄磷脂)和水与甘油。制备合适制剂的方法是本领域熟知的(参见，例如，《雷明顿药物科学》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，第16版，1980，A.Oslo编，伊斯顿，宾夕法尼亚州)。
如果选择胃肠外给药作为给药途径，可将含有骨桥蛋白抑制剂或硒的制品与药学上可接受的无菌水性或非水性溶剂、混悬液或乳液混合提供给患者。非水性溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油、鱼油和可注射有机酯。水性运载体包括水、水-醇溶液、乳液或混悬液，包括盐水或经缓冲的医学胃肠外载体，包括氯化钠溶液、林格葡萄糖溶液、葡萄糖加氯化钠溶液、含乳糖的林格溶液或不挥发的油。静脉内载体可包括液体和营养补充物、电解质补充物，例如基于林格葡萄糖的那些载体，等等。
这些只是简单的指导，因为实际剂量必须由主治医师根据每位患者独特的临床因素或由营养学家仔细选择和测定。最佳每日剂量通过本领域已知的方法测定，其受例如患者的年龄等因素以及其它临床相关因素的影响。此外，患者可服用用于其它疾病或病症的药物。在骨桥蛋白抑制剂或含硒化合物给予患者期间可继续其它药物治疗，但在这种情况下特别建议以低剂量开始来测定是否经历不利的副作用。
本发明还涉及试剂盒。本发明涉及将脊柱侧凸对象分类和/或预测某对象是否具有发生脊柱侧凸风险的试剂盒，但不限于此，所述试剂盒装有上述本发明分离核酸、蛋白质或配体，例如抗体。例如，本发明的分区试剂盒(compartmentalized kit)包括试剂包含在不同容器中的任何试剂盒。这些容器包括小玻璃容器、塑料容器或塑料或纸条带。这些容器能将试剂自一个隔室有效地转移至另一隔室，因而样品和试剂不会交叉污染，还能将各容器中的试剂或溶液以定量方式自一个隔室加入另一个。这些容器包括接受对象样品(DNA基因组核酸、细胞样品或血液样品)的容器，含有(在本发明的一些试剂盒中)本发明方法所用探针的容器，含有酶的容器，含有洗涤试剂的容器和含有用于检测延伸产物的试剂的容器。本发明试剂盒还装有利用这些探针或抗体对脊柱侧凸患者分类或预测某对象是否具有发生脊柱侧凸风险的使用说明书。
以下非限制性实施例更详细地描述了本发明。
实施例1
材料与方法
产生两足C57BL/6J OPN-缺乏和CD44-缺乏小鼠.按照圣贾斯汀医院动物健康照料审查委员会(The Ste-Justine Hospital’s Animal Health CareReview Committee)批准的方案进行小鼠实验。在C57Bl/6j小鼠中回交10代以上的无OPN(OPN-缺乏小鼠)或CD44受体(CD44-缺乏小鼠)的C57Bl/6的繁殖对(Breeding pair)分别由美国新泽西州拉吉尔大学(RutgerUniversity，NJ，USA)的Susan Rittling博士和加拿大安大略省多伦多大学(University of Toronto，ON，Canada)的Tak Mak博士馈赠以建立新的群体，而C57Bl/6j小鼠用作野生型对照小鼠(查尔斯河公司(Charles-River)，威尔明顿，马萨诸塞州，美国)。使用C57Bl6/6j小鼠品系是因为其天然缺乏褪黑激素⁽²⁶⁾，表现出高循环OPN水平⁽²⁷⁾并在维持于两足阶段时发生脊柱侧凸⁽²⁸⁾。其是熟知的脊柱侧凸动物模型。如以前报道的⁽²⁸⁾，断奶后通过在麻醉下截去前肢和尾部进行两足外科手术。所有小鼠自6周龄起在麻醉下利用Faxitron^TM X-射线设备(FX公司(Faxitron X-rays Corp.)，惠灵，伊利诺依州，美国)每两周进行完全X-射线照相检查。获得前后位X-射线照片(Anteroposterior X-ray)，随后评估每幅数字图看是否存在脊柱侧凸。科布角阈值为10°或更高依旧作为显著的脊柱侧凸状况。
免疫检测小鼠OPN.将外周血收集在含硅胶的血清分离器试管中(BD微容器公司(BD Microtainer)，BD，新泽西州，美国)，然后离心，从而获得小鼠血清来测定OPN的血清水平。将获得的血清样品等分并在-80℃冷冻，直至被解冻并分析。根据生产商(IBL公司，汉堡，德国)提供的方案，通过捕获酶联免疫吸附测定(ELISA)检测OPN的血清浓度。OPN ELISA试剂盒检测血清中OPN的所有磷酸化和非磷酸化同种型的总浓度。ELISA检验一式两份进行，利用英国剑桥拜尔克罗姆公司的AsysHiTech^TM专家-96微板读数计(AsysHiTech^TM Expert-96 microplate reader，Biochrom，Cambridge，UK)检测450nm的光密度。虽然本文使用的是小鼠血清，但本发明也包括检测小鼠血浆中的OPN。
产生松果体切除的鸡.一定百分比的松果体切除鸡发生脊柱侧凸，因此它们用作脊柱侧凸模型。对于本研究，在本地孵化站购买145只新孵出的鸡(哈伯德山(Mountain Hubbard))，如前所述切除松果体⁽²⁵⁾。
鸡OPN的表达分析和免疫检测.通过苯酚/氯仿提取从松果体切除鸡的脊柱旁肌肉制备总细胞RNA。对于RT-PCR，利用英杰公司(Invitrogen)的ThermoScript^TM逆转录酶逆转录1微克总RNA，等量的0.1微克逆转录RNA用于PCR反应。这些反应在含有200微摩尔dNTP、1.5微摩尔MgCl₂、10皮摩尔的各引物和1U Pfu DNA-聚合酶(美国加利福尼亚州拉霍亚斯特拉塔基因公司(Stratagene，LaJolla，CA，USA))的50微升终体积中进行。利用以下引物和条件进行PCR反应：鸡OPN(420bp PCR产物)：5’-ACACTTTCACTCCAATCGTCC-3’(SEQ ID NO：19)(正向)，5’-TGCCCTTTCCGTTGTTGTCC-3’(SEQ ID NO：20)(反向)35轮：95℃/45秒，66℃/45秒，72℃/1分钟。对于定量分析，所有扩增根据持家基因β-肌动蛋白标准化；鸡β-肌动蛋白(460bp PCR产物)5’-GGAAATCGTGCGTGACAT-3’(SEQ ID NO：21)(正向)，5’-TCATGATGGAGTTGAATGTAGTT-3’(SEQ ID NO：22)(反向)32轮：94℃/45秒，55℃/45秒，72℃/1分钟。用含溴化乙锭的1.5％琼脂糖凝胶分析PCR扩增产物。利用与鸡OPN交叉反应的抗-人OPN抗体(克隆8E5，凯美亚生物医学公司(Kamiya Biomedial)，华盛顿州，美国)，通过蛋白质印迹检测脊柱旁肌肉的总蛋白提取物中的鸡OPN。
人群.位于的圣贾斯汀医院(Ste-Justine Hospital)、蒙特利尔儿童医院(Montreal’s Children Hospital)和蒙特利尔麦吉尔大学兄弟会儿童医院(TheShriners Hospital for Children，McGill University，Montreal)的机构伦理委员会(Institutional Review Board)和爱福仑特学校董事会(The Affluent SchoolBoard)批准该项研究。所有参与者的父母和法定监护人给予书面知情同意，少数表示同意。
所有AIS患者由6位矫形外科医生之一检查。如果某人的病史和体检与特发性脊柱侧凸的诊断一致并且在脊柱的直立X-射线照片上发现额平面(coronal plane)有最低10度曲率伴有脊椎扭转，则认为该人受(脊柱侧凸)侵袭。在蒙特利尔小学中募集健康对照。采用亚当前弯检验(Adam’s forwardbending-test)，由同一矫形外科医生用脊柱侧凸测量器检查各对象。
检查了三群人：AIS患者，无脊柱侧凸的任何家族先例/病史的健康对照和双亲中至少一位是脊柱侧凸患者，视作有发生脊柱侧凸风险的无症状后代。募集一组252位连续的AIS患者、35位健康对照对象和70位无症状有发生脊柱侧凸风险的儿童。所有的对象是高加索人，人口统计学特征见下表2。

^*加-减值是平均值±标准偏差。胸部和腰部水平的曲率分别表示双重脊柱侧凸的平均科布角。
三重脊柱侧凸的平均科布角表示两个胸部曲率和一个腰部曲率。
骨桥蛋白、sCD44和HA酶联免疫吸附测定.在含EDTA的试管中收集AIS患者、无症状儿童和对照组的外周血样品，然后离心。将获得的血清样品等分并在-80℃冷冻，直至被解冻并分析。根据生产商(IBL公司，汉堡，德国)提供的方案，通过捕获酶联免疫吸附测定(ELISA)检测OPN和sCD44的血浆浓度。sCD44 Elisa试剂盒(sCD44std)检测所有循环(可溶性)CD44同种型，所述同种型包含标准蛋白质序列，但不是与外显子V2和V10(50)之间的另路剪接相关的罕有同种型(也参见图22)。OPN IBL ELISA试剂盒(代号27158)检测血浆中OPN的所有磷酸化和非磷酸化同种型的总浓度。利用ELISA试剂盒(HA-Elisa(K-1200)，阶梯生物科学公司(EchelonBiosciences)，盐湖城，犹他州)检测所有血浆样品中HA的循环水平。所有ELISA检验一式两份进行，利用英国剑桥拜尔克罗姆公司的AsysHiTech^TM专家-96^TM微板读数计(AsysHiTech Expert-96^TM microplate reader)检测450nm(对于OPN和sCD44)和405nm(对于HA)的光密度。其它可商品化购得或内部制备的Elisa试剂盒可用于本发明的方法。在统计学上区分非脊柱侧凸对象与脊柱侧凸对象的截断值有助于预测脊柱侧凸进展的风险，如这些其它试剂盒所测定的截断值可能不同于本文所用试剂盒计算的。然而，可计算如本文所述使用的各新抗体的截断值。
统计学分析.利用皮尔逊κ²和斯氏t检验分别评估不同AIS和对照组的年龄和性别差异。利用多元线性回归模型检验各组和OPN、sCD44及HA水平之间的关联性。当这些可能的混淆对象(confounder)与生物标记水平在p＜0.1相关时，根据年龄、性别和年龄-性别相互作用调整数值。还检查了组与性别之间的相互作用。利用比较具有和不具有组效应(group effect)的模型的全局F检验(global F test)首次检验了整体组效应。然后，如果检测到诸组之间有特定差异，则应用多元检验的布氏校正(Bonferroni correction formultiple testing)。利用接收器-操作特征(Receiver-operating characteristics)(ROC)曲线评估OPN的诊断值，鉴定最佳阈值。曲线描绘了OPN的灵敏度(当试验应用于已知具有AIS的患者时，真阳性结果的比例)和特异性(当试验应用于健康对照时，真阴性结果的比例)。计算ROC曲线下面积(AUC)和相关95％的置信区间。对理论AUC为0.5的假设的检验基于该置信区间。除ROC曲线分析由用于R的ROCR软件包进行外(www.r-project.org)^(51，52)，利用SAS软件9.1版进行统计学分析。除另有指出的，所有分析中，认为p-值＜0.05是统计学显著的。
实施例2
松果体切除鸡中OPN的mRNA和蛋白质水平
如以上实施例1所述对松果体切除鸡的OPN进行表达分析和免疫检测分析。在mRNA和蛋白质水平检测松果体切除鸡中产生的OPN。图1显示只有在发生脊柱侧凸的松果体切除鸡中OPN在mRNA和蛋白质水平强烈增加。
实施例3
C57Bl/6j小鼠的OPN蛋白质水平
产生两足C57Bl/6j小鼠，如以上实施例1所述测定它们的OPN水平。C57Bl/6j小鼠中两足离床活动8周在46％的雌性和24％的雄性中诱导了脊柱侧凸，这与在雌性中发现血浆OPN水平较高良好相关(下表3)。当与两足雄性(24％)比较时，在两足C57Bl/6j雌性(46％)中观察到脊柱侧凸的数量更多和严重性更高这一事实加强了该动物模型的关联性，在人中也观察到这一情况。
表3.天然褪黑激素缺陷小鼠品系C57Bl/6j小鼠和缺乏OPN或CD44的遗传修饰C57Bl小鼠中的脊柱侧凸频率

图2显示脊柱侧凸C57Bl/6j小鼠中，两足外科手术后(即，发生脊柱侧凸期间)OPN蛋白质水平强烈增加。
实施例4
观察缺乏OPN或CD44对两足C57Bl/6j小鼠脊柱侧凸的作用
还通过研究遗传修饰的两足C57Bl/6j小鼠检查了OPN和CD44受体作为病理生理学级联反应的组成部分在脊柱侧凸形成和弯曲进展中的作用，所述研究进行了如以上实施例1所述的实验。如上表3所示，发现两足C57Bl/6j OPN-缺乏小鼠(n＝54)和C57Bl/6j CD44-缺乏小鼠(n＝60)中无一发生脊柱侧凸，即使将它们的分析延长至52周以上。外科手术后8周检测脊柱侧凸发生。进行较长的随访以证明OPN-缺乏和CD44-缺乏小鼠中脊柱侧凸发生不是简单的延迟。
同时在野生型和OPN-KO小鼠中检测褪黑激素循环水平以排除两足C57Bl/6 OPN-KO小鼠中不存在脊柱侧凸是因为褪黑激素产量增加的可能性。
图3显示与野生型(C57Bl/6j、C57Bl/6j和FVB)相比，两足C57Bl/6j OPNKO小鼠的循环褪黑激素水平降低两倍。
如上所述，与产生高褪黑激素水平的FVB品系相反，C57Bl/6j小鼠是褪黑激素缺陷型并可能发生脊柱侧凸。OPN-敲除小鼠不发生脊柱侧凸(NS)，即使它们具有相同的遗传学背景(C57Bl6/j)，虽然褪黑激素显著减少，这提示褪黑激素在体内负调节OPN表达和合成。这还提示在遗传修饰的小鼠中，没有OPN存在下褪黑激素水平会作为适应性生理学反应而随之进一步降低，以提高OPN表达和合成，但不限于该假设。
实施例5
OPN抑制剂对脊柱侧凸预防的作用
在松果体切除24-48小时前，将怀疑对OPN转录或合成有影响的两种化合物以500μg/kg体重/天的剂量腹膜内注射入鸡。
如图4所示，与未治疗的松果体切除鸡相比，用药物预先治疗的松果体切除鸡中较少发生脊柱侧凸(减少约50％)。
实施例6
比较分成两组的AIS患者和健康对照的循环OPN水平
如以上实施例1所述测试一组252位AIS患者和35位健康对照对象。根据脊椎弯曲严重性(10°-44°与≥45°)，将AIS患者分成两个亚组。在受影响最严重的AIS亚组中，患者在测试时无一经历矫形外科手术。与对照组相比(在健康和有风险对照组中分别是54％和64％，与对照组相比时p≤0.0001)，观察到AIS组中女孩的比例更高(10°-44°亚组和≥45°亚组中分别是86％和84％)，这与就中等弯曲而言，年轻女孩的AIS患病率比男孩高(对于科布角≥30°的弯曲，比例为10∶1)的文献报道相一致。两个AIS亚组(p＝0.76)或两个对照组(p＝0.32)之间没有明显的性别差异。与科布角为10-44°的AIS患者相比，科布角≥45°的AIS患者的平均年龄显著较高(15.2±1.8与13.8±2.1，p＜0.0001)。与对照组相比，两个AIS组的平均年龄较高(健康组为10.7±0.6，风险组为9.9±3.4，与任一AIS组相比时p＜0.0001)。
按照各种临床参数将显示严重畸形(科布角≥45°)、低至中等弯曲(科布角介于10°和44°之间)的AIS患者与健康对照的血浆OPN水平总结在下表4中。与健康对照组相比，两个AIS组中平均血浆OPN水平显著较高，但在畸形最严重(科布角≥45°)的患者中更高(根据年龄、性别和年龄-性别相互作用调整后，布氏校正的p＜0.001)。女孩和男孩AIS患者中血浆OPN水平与弯曲畸形的严重性相关(图5)(根据年龄调整的部分皮尔逊校正系数分别是0.29，p＜0.001，和0.33，p＝0.04)。有发生脊柱侧凸风险的组的平均血浆OPN水平(846±402ng/ml)明显不同于(布氏校正的p＜0.001)健康对照(570±156ng/ml)。


^*SD是标准偏差
P-值来自按照年龄、性别和年龄-性别相互作用(OPN和HA)或年龄(sCD44)作布氏校正和调整后，所有对象中与健康对照组的比较。作相同调整后，组与生物标记水平相关性的全局F检验p-值是＜0.001(OPN)、0.035(sCD44)和0.163(HA)。
比较AIS影响最严重的患者(科布角≥45°)与健康对照的血浆OPN的接收器-操作特征(ROC)曲线分析显示AUC为0.94，标准偏差为0.03(95％置信区间0.88到0.99)(见图5A)。截断值为＞700纳克/毫升获得90.6％的灵敏度和81.8％的特异性(见图5B)。对于证实脊柱侧凸，截断值为＞800纳克/毫升获得最高精确度，其中灵敏度为84.4％，特异性为90.6％(假阴性和假阳性结果最低)(见图5C)。
虽然如上所述，在其他成人疾病中发现高水平的OPN，但在脊柱侧凸患者中发现血浆OPN水平高是儿科人群中的独特现象。因此，检测OPN水平可用于在无症状儿童中鉴定具有发生脊柱侧凸风险的那些(AIS或其他脊椎疾病和导致脊柱侧凸的疾病)，在脊柱侧凸对象中鉴定具有发生脊柱侧凸进展的风险的那些对象。此外，AIS患者中发现的血浆OPN水平常高于在成人疾病中检测到的水平。OPN水平还可用于预测成人中的风险(例如，在成年期进展的变性脊柱侧凸(degenerative scoliosis)和特发性脊柱侧凸)。早已将某些突变与可导致脊柱侧凸的其它疾病相联系。在一具体实施方式中，可组合使用OPN水平与对这些突变的检测。
实施例7
比较有风险的无症状儿童与健康对照的循环OPN水平
如以上实施例1所述测试一组70位无症状但有风险的儿童和35位健康对照对象。发生脊柱侧凸的组中平均血浆OPN水平(846.30±402纳克/毫升)明显不同(p＝0.001)于健康对照(570±156纳克/毫升)，两组是年龄和性别匹配的。未观察到明显的性别差异(见上表4)。
采用800纳克/毫升的截断值，观察到该组中47.9％的无症状儿童高于该血浆OPN值，而健康对照中只有8.6％高于该值。这些结果与显示相比于双亲未受影响的后代，至少双亲之一受影响的后代更易发生脊柱侧凸的以前报道相一致(34，35)。
因此，例如用于OPN的酶联免疫吸附测定(ELISA)或RIA可用于为预后目的早期鉴定有发生脊柱侧凸风险的对象，和/或用于为进行早期支具疗法和利用新型无融合装置的低介入性外科手术、为药理学治疗对脊柱侧凸患者分类，还可用于监测AIS患者对治疗的反应。
实施例8
比较分成两组的AIS患者和健康对照的循环sCD44水平
如以上实施例1所述进行实验。健康对照、两个AIS组和无症状但有风险儿童的血浆sCD44和HA水平显示于上表4。在所有组中的比较显示平均血浆sCD44和HA值没有明显差别。然而，显示与其它三组相比时，脊椎畸形最严重的AIS患者(≥45°)的平均血浆sCD44水平最低(p＝0.066)。
CD44和sCD44可分别用作OPN的受体和诱饵受体(decoy receptor)。虽然在所有测试组中未观察到明显差异，但受影响最严重的AIS患者(≥45°)在所有测试组中的sCD44值最低。令人感兴趣的是，在免疫缺陷和自身免疫疾病中发现血浆sCD44水平降低^(35-37)，但在没有高血浆OPN水平存在下这些病症通常无一导致脊柱侧凸，提示sCD44可能通过干扰OPN的作用而在AIS中作为疾病-调节因素起作用(见图17)。
实施例9
AIS患者的OPN水平、sCD44水平和科布角随时间的改变情况
在随访期间检测AIS患者的生物标记(OPN和sCD44水平)和科布角的进展。图7表示在基线访问(baseline visit)时，12岁(红色)、14岁(绿色和蓝色)和17岁(黄色)的4位选择的AIS女性患者(未经支具治疗)的这些进展情况。
图8显示了弯曲畸形加重(科布角的总增值超过3°)的AIS患者和弯曲没有明显改变(科布角没变化，减小或增值小于3°；也显示了所有的)的那些AIS患者在随访期间OPN(左图)和sCD44(右图)水平的总体改变分布。弯曲畸形加重的组中OPN水平的平均改变明显较高(威氏秩和检验(Wilcoxon rank sumtest)p＜0.01)。未检测到sCD44有明显差异(p＞0.5)。2组之间的随访时间长度相似(p＞0.5)。
图9显示AIS患者组中，OPN进展与科布角进展相关，而图10显示在其它AIS患者中，OPN减退或稳定与科布角减退或稳定相关。
OPN水平可用于鉴定预诊断患者中脊柱侧凸会进展的那些患者。
实施例10
无症状但有风险的患者的OPN水平、sCD44水平和科布角随时间的改变情况
图11显示基线访问时，没有脊柱侧凸但有风险的4位选择对象的OPN和sCD44水平的改变情况：13岁男性1名(绿色)，5岁(金色)、11岁(蓝色)和9岁(红色)女性3名。在生物标记的基线水平观察到显著的对象间差异，并在有风险对象中随时间改变(尤其是OPN)，表明此生物标记可能用作工具来监测有风险对象中脊柱侧凸的发生。
下表5-8详细显示健康对照对象(表5)、科布角小于45度的AIS患者(表6)、科布角为45度或更高的AIS患者(表7)和无症状但有风险儿童(表8)各自的临床和生化概况。





















实施例11
非AIS脊柱侧凸患者的OPN、sCD44和HA水平
检测非AIS脊柱侧凸患者(NAIS患者)的OPN水平。结果总结于下表9。健康、AIS和NAIS患者的OPN、sCD44和HA水平的比较见图12。

加-减值是平均值±标准偏差.
^*其它脊柱侧凸类型包括一种神经肌肉性脊柱侧凸(neuromuscular scoliosis)和一种发育不良性脊柱侧凸.
下表10详细显示了非AIS脊柱侧凸患者的生物标记水平。


实施例12
手术前后AIS患者的OPN和sCD44水平
检测手术前(n＝79)和手术后(n＝28)AIS患者的OPN水平。有趣的是，比较手术前后的AIS患者显示循环OPN水平降低，这进一步支持了OPN在细胞水平作为机械感受器(mechanosensor)的作用(图13)。
检测用支具治疗前(n＝10)和治疗后(N＝10)，AIS女性患者的OPN。在手术前(n＝15)和手术后(N＝12)类似地检测AIS女性患者的sCD44水平。结果示于图14。
还检测了12位AIS患者在手术前和手术后的预定截断区域分布情况。图15显示92％的外科手术治疗患者的手术前OPN水平在红色区域(血浆OPN水平＞800ng/mL)，而其余8％在黄色区域(700-800ng/mL)。表示血浆OPN水平＜700ng/mL的绿色区域中没有患者。这也显示高浓度OPN与脊柱侧凸弯曲进展之间有强烈的相关性。
图15的B图显示外科手术治疗的红色区域患者经历血液OPN浓度降低。75％的外科手术治疗患者落入绿色和黄色区域(800ng/mL或低一些)。
实施例13
利用各种类型支具的AIS患者的OPN水平
还检测了用支具治疗前(n＝79)和治疗后(N＝28)AIS患者的OPN水平。下表11还显示了支具疗法对生物标记的影响。


^*加-减值是平均值±标准偏差.
通过具有相等方差的双侧不配对斯氏T检验(bilateral unpaired Student’s T-test)进行统计学分析，以比较使用或不使用支具的患者。p-值＜0.05时认为差异是统计学显著的。
还检测了AIS患者在支具治疗前后的预定截断区域分布情况。支具治疗数月后测试了8位患者，即，分别是支具治疗后7、7、8、22、22、22和26个月的患者1号到8号中每一位。图16显示用支具治疗前(图A)，63％的这些患者处于红色和黄色区域。观察到朝着绿色区域(＜700ng/mL)的明显位移，这与外科手术治疗患者中观察到的趋势一致，如图13-15所示。
实施例14
比较AIS患者与健康对象的硒水平
据报道AIS患者的血浆中硒浓度显著降低(42)。硒，更具体是Se-甲基硒代半胱氨酸(饮食中的天然有机硒)因为靶向OPN转录而作为预防性化疗(chemopreventive therapy)用于预防乳腺癌转移(43-45)。
因此，检测儿科人群(AIS与健康对照)的血浆硒浓度以测定AIS中硒水平低是否OPN浓度与较高相关。利用2，3-二氨基萘(DAN)，通过荧光法测定血浆硒浓度(46，47)。图18和19所示结果显示脊柱侧凸和无症状但有风险儿童中OPN水平高与硒水平低相关。
虽然上文借助具体的实施方式描述了本发明，但可在不脱离由所附权利要求书所限定的本发明构思和性质的情况下对其作出改进。
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