可促进人肺腺癌细胞分化的cDNA及其真核表达载体及应用 本发明涉及一种能促进人肺腺癌细胞分化的cDNA，包含该cDNA的真核表达载体以及该cDNA在制备治疗肿瘤的制剂中的应用。所述的cDNA是从维甲酸处理的人肺腺癌细胞系中分离得到。
肺癌对人类生命、健康的威胁日趋严重，在工业发达国家和地区，男性肺癌发病率高居各类肿瘤之首，女性肺癌发病率仅次于乳腺癌而居第二位。在我国，肺癌发病率有超过胃癌而跃居第一位的趋势。肺癌患者预后很差。其五年生存率仅为10-15％，其中小细胞肺癌五年生存率低于5％。20余年来，尽管对某些肿瘤的治疗取得了成功或取得重大进展，但传统的手术、放疗和化疗三大疗法并未能改善大多数肺癌患者的预后，降低死亡率。近20年来，肿瘤分子生物学研究取得了重大进展。现已明确，癌的发生是细胞增殖失控和分化障碍的结果，细胞癌基因的激活和抑癌基因的失活是造成细胞生长与分化调控紊乱的根本原因。因此，应用各种方法分离肿瘤抑制基因或促分化基因，对于阐明肿瘤发生的内在机制和设计有效防治措施都具有重要意义。
维甲酸(Retinoic Acid.，RA)是维生素A的代谢产物，对人体的正常形态发生、发育和细胞分化起重要调节作用。近10多年地研究结果表明，RA对某些完全转化的、具有转移性的肿瘤细胞产生增生抑制或诱导终末分化作用，能够使某些肿瘤的恶性程度降低或去恶性化。尽管并不是各种肿瘤都对RA有这样的反应，然而，这些发现无疑对肿瘤治疗提供了一个新线索。在很多情况下，恶性肿瘤是一种细胞异常分化的疾病，对于那些具有侵袭性的细胞可以通过调节其细胞分化而不是应用细胞毒药物杀死细胞的方法得到控制。由此为RA的肿瘤分化治疗作用提供了理论依据。
由于RA对多种肿瘤的增殖抑制和/或分化诱导作用，使其成为某些恶性肿瘤的分化诱导剂和化学预防剂。中国医学科学院肿瘤研究所林培中等(中华肿瘤杂志10(3)：161-166，1988；中国医学科学院学报12(4)：235-245，1990)从80年代初即开始用我国新研制的维甲类化合物在食管癌高发区进行食管癌的阻断性研究，使有食管粘膜重度增生者的癌变率明显降低；黄萌茸等(Huang ME，Ye YuChen et al，Blood 73：567-572，1988)在国际上首次用全反式维甲酸治疗急性早幼粒白血病患者取得成功。但RA对细胞增殖分化调节的分子机制一直是个谜。近10年来，随着维甲酸受体基因的克隆，对这个问题的认识发生了质的飞跃。目前认为，维甲酸作用的机制是：维甲酸与细胞核内的维甲酸受体结合后作为转录因子与特异性顺式作用DNA序列结合，调节靶基因的转录活性。虽然受调控基因的具体数量和顺序尚未弄清，但一般认为维甲酸是启动了级联(Cascade)式的转录调节，导致一系列分化基因的激活和增殖基因的受抑。至今已有越来越多的RA靶基因得到认识，也分离、克隆出了一些引起细胞分化的新基因。这不仅使肿瘤细胞分化治疗的理论认识深化了一步，也有可能成为一类恶性肿瘤基因治疗的目的基因。80年代末，本室在发现RA可引起食管癌细胞系生长的抑制及终末分化的基础上，应用cDNA消减杂交技术，已从诱导分化的食管癌细胞系中分离出一个具有抑癌作用的cDNA片段(见中国专利申请95101293.2)。
因此，本发明的第一个目的在于提供一种可促进人肺腺癌细胞分化的cDNA，所述的cDNA是从维甲酸处理的人肺腺癌细胞系中分离得到，其对人肺腺癌细胞等肿瘤细胞具有明显的生长抑制作用。
本发明的第二个目的在于提供包含所述的cDNA的真核表达载体。
本发明的第三个目的在于该cDNA在制备治疗肿瘤的制剂中的应用。
相应地，根据本发明的一个方面，本发明涉及一种可促进人肺腺癌细胞分化的cDNA，其全长为1859bp，核苷酸序列见序列表(SEQ ID NO：1)。所述的cDNA是通过用全反式维甲酸诱导人肺腺癌细胞系GLC-82使其发生分化，从其cDNA文库中利用cDNA消减杂交分离得到。
cDNA消减杂交是在mRNA水平分离两种状态下特异表达或抑制表达基因的策略。在正常细胞或肿瘤细胞分化过程中，涉及一些分化相关基因的表达，本发明人所在科室已用该方法从RA诱导分化的食管癌细胞系中分离出具有抑癌活性的cDNA-RA538，开辟了一条从诱导分化的肿瘤细胞中分离促分化基因的新途径(中国专利申请95101293.2)。Steinman等(Steinman RA，et al，Oncogene，9：3389-3396)对黑色素瘤细胞进行诱导分化，用消减杂交方法也得到一些差异表达的cDNA，称为黑色素瘤分化相关基因(mda)，而其中的一个cDNA恰巧是p21，WAF/CIPI(野生型p53激活因子)，该基因在RA，DMSO诱导分化的HL-60细胞中呈即刻快速表达。Schraml等(Schraml P，et al，Cancer Res.，54：5236-5240，1994)用正常肺组织与非小细胞肺癌组织的cDNA作消减杂交，分离出17个差异表达的cDNA克隆，其中六个在非小细胞肺癌中表达缺失，表明它们可能与非小细胞肺癌的发生有关。
基于RA作用的分子机制，根据cDNA消减杂交原理，本发明人采用肺腺癌细胞诱导分化与cDNA-cDNA消减杂交相结合的策略，首先构建了未经RA诱导及RA诱导不同时间细胞的cDNA文库，通过cDNA文库消减杂交，获取分化启动阶段和分化早期细胞基因表达变化的信息。其次，采用cDNA文库间直接比较(cDNA文库消减杂交)的策略，通过按比例加大靶DNA、即RA诱导文库单链DNA的投入量，增加了获取由低丰度mRNA转录的cDNA的机率，因而可望发现在RA诱导不同时间，即细胞分化的不同阶段被激活而特异表达的基因。RA特异性cDNA消减文库的建立，使细胞分化过程中基因表达变化的信息得到富集，使反映细胞分化过程中基因表达的动态变化特征成为可能，这为进一步筛选分化相关基因提供了方便。
经一系列筛选，本发明人从RA诱导表达的cDNA消减文库中分离到一个在RA诱导后呈早期表达的cDNA克隆(命名为RA5)。经查询美国国家生物信息中心(NCBI)的最新(1995.8)核苷酸序列数据库(Nucleotide Sequence Database)，未见同源序列，表明RA5是新发现的cDNA序列。
根据本发明的另一方面，本发明还涉及包含所述的cDNA的真核表达载体，在本发明的实施例中采用的真核表达载体为pMSG(7.6kb，购自Pharmacia)，将RA5克隆cDNA两端各加衔接头(adaptor)，使其两端均为SalI位点，直接与经SalI酶切的pMSG连接，利用限制酶切反应鉴定插入片段的正反向，并将正向重组质粒命名为pMSG-RA5，即GLC-ada-RA5，根据布达佩斯条约，该质粒已于1996年4月5日在中国典型培养物中心保藏(CCTCC，中国武汉)，保藏号为CCTCC M96006。
根据本发明的再一方面，本发明还涉及所述的cDNA序列在制备基因治疗人肺腺癌的制剂中的应用。
附图的简要说明
图1为本发明采用的cDNA定向克隆技术的示意图。
图2示出用菌落原位杂交/加-减法差异筛选cDNA消减克隆，图中(a)为消减克隆与RA诱导文库总cDNA探针杂交的结果，(b)为消减克隆与未诱导文库总cDNA探针杂交的结果。
图3为Northern杂交分析，示出本发明的RA5克隆在RA诱导1天的GLC-82细胞中特异表达。图中M为0.24-9.5kb的RNA分子量标记
图4为pMSG-RA5与pDOR-neo共转染的GLC-82细胞用地米塞松(10-6M/L)处理后的RNA原位杂交的照片，图中细胞浆中的蓝色颗粒为RA5表达的mRNA产物。
以下结合附图和实施例对本发明进行进一步的描述。实施例1用全反式维甲酸处理人肺腺癌细胞系GLC-82
A.材料来源
人肺腺癌细胞系GLC-82得自昆明医学院，其是一株来自终末小支气管的肺腺癌细胞，1982年建株。供体为云南个旧一48岁女性，该细胞倍增时间为48小时，体外培养呈堆叠性生长，细胞在双层软琼脂中形成集落的能力强，接种裸鼠第8天便有形成，呈结节状浸润生长，是一株恶性程度很高的瘤细胞。
全反式维甲酸(RA)、二甲亚砜(DMSO)为Sigma公司产品。
RPMI1640培养基、异硫氰酸胍购自GIBCO-BRL公司。
克隆载体pSPORT1购自BRL公司。
B.方法
细胞培养及RA诱导：于80ml培养瓶中接种5×104细胞，加入8ml RPMI 1640培养液(含10％小牛血清，100u/ml青、链霉素)于37℃、5％CO2条件下培养传代。于使用前溶于少量DMSO，用小牛血清稀释至10-3mol/L，细胞培养液中RA终浓度为10-5mol/L，每日换液，未处理细胞培养液中仅含相应量(0.02％)的DMSO。实施例2 GLC-82细胞的cDNA文库的建立及消减杂交
在用10-5mol/L全反式维甲酸(RA)诱导人肺腺癌细胞系分化的基础上，应用定向克隆方法分别构建了未经RA诱导和RA诱导1天及4天细胞的3个cDNA文库。通过cDNA文库消减杂交，建立了RA特异性cDNA消减文库，进而筛选到细胞分化过程中由RA激活而特异表达的cDNA序列。
cDNA定向克隆和细菌转化：
用异硫氰酸胍-盐酸胍分级沉淀法(Instructio n manual：mRNAisolation system，BRL life technologies Inc.USA，1990)提取细胞RNA，进而用Oligo-dT纤维素柱分离mRNA。以未经RA诱导及RA诱导1天和4天的GLC-82细胞mRNA为模版，采用衔接头-引物(adaptor-primer)法合成具有不同粘末端的cDNA，定向克隆进噬菌粒载体psPORT1(GIBCO-BRL，美国)，TFB法制备高转化率的DH5αF′IQ感受态菌并进行转化和作cDNA插入片段的限制性内切酶分析。
cDNA文库消减杂交：
用M13K07辅助噬菌体(Pharmacia，瑞士)感染RA诱导文库提取单链重组DNA(Shweinfst CW，et al，Genet.Annal.Tech.Appl.7：64-70，1990)，经羟基磷灰石柱层析(Sambrook J.etal，Molecular Cloning，A LaboratoryManual，2nd Edition，Cold Spring Harbor Laboratory，19 89，ColdSpring Harbor，New York，USA)和限制性内切酶消化纯化后，取10μg与经Southern转印共价结合于APT膜(Sigma，美国)上的80μg未诱导文库cDNA进行杂交。回收经6轮杂交后仍未被结合的RA诱导文库的单链DNA，纯化后将25μl模板/引物反应液(10μl消减杂交富集的单链DNA，5μl 5×Taq DNA聚合酶缓冲液和25ng经Not1/Sal1酶切的线性载体pSPORT1 DNA)于92℃变性7min，55℃退火40分钟，加入5μl预热的5×Taq DNA聚合酶缓冲液，5μl(2mmol/L)dNTP混合液，0.5μl(2u/ml)Taq DNA聚合酶，14.5μl去离子灭菌水，55℃继续反应2分钟后，于70℃延伸40分钟。反应产物纯化后作细菌转化，用含X-gal/IPTG/AMP的LB培养基筛选阳性克隆。
菌落原位杂交-加/减法差异筛选：
取RA诱导前后细胞的mRNA各10μg，随机引物法合成[α-32P]-dCTP标记的总cDNA探针，分别与消减杂交后得到的克隆作菌落原位杂交。
应用cDNA定向克隆技术(图1)，分别构建了未经RA诱导及RA诱导1天和4天细胞的3个cDNA文库，主要技术参数如下表。
3个cDNA文库的主要技术参数 Lib.GLC-82 Lib.GLC-82.RA1 Lib.GLC-82.RA4RA浓度诱导天数克隆载体重组子数重组效率cDNA分布 0 0 pSPORT1 5.8×105 97％ 0.5-9kb 10-5mol/L 1 pSPORT1 5.43×105 98％ 0.5-9kb 10-5mol/L 4 pSPORT1 5.8×105 98％ 0.5-9kb
RA特异性cDNA消减文库的建立和鉴定
将经消减杂交富集的RA特异性单链DNA回复为双链后转化感受态菌，得到143个克隆。与RA诱导前后细胞的总cDNA探针作加/减(plus-minus)法杂交差异筛选，见143个克隆全都与RA诱导后细胞的总cDNA探针结合，出现很强的杂交信号(图2a)，而与未诱导细胞的总cDNA探针杂交，也有19个克隆出现较强的杂交信号(图2b)，说明这19个克隆为RA诱导前后文库共有，而其余124个克隆应为RA特异性cDNA消减克隆。
根据同源性分析结果并按cDNA大小对消减克隆分组后，依次与文库总cDNA作Southern印迹杂交，以判断消减克隆的存在状态，去除共存于RA诱导前后三个文库中的非特异性序列，选取仅存在于RA诱导文库中的克隆作进一步分析。
经过文库总cDNA的Southern印迹杂交筛选，选取仅存在于RA诱导文库中的cDNA克隆作RNA Northern印迹杂交，见5号克隆cDNA在RA诱导1天的细胞中特异表达(图3)，而在未诱导细胞中无表达，将该克隆命名为RA5克隆。酶切RA5克隆的质粒DNA，分出1.8kb的cDNA插入片段，对该片段(序列1)进行进一步的分析。实施例3序列1的核苷酸序列测定
按T7测序试剂盒(Pharmacia)说明用双脱氧终止法测序，序列1的核苷酸序列如序列表所述。实验例1cDNA序列1的生物学功能鉴定材料和方法细胞系
肺腺癌细胞系GLC-82由昆明医学院梁明达教授惠赠。培养条件为：RPMI1640培养基，15％小牛血清，37℃，5％CO2。真核表达载体的构建
用SalI及NotI双酶切从克隆载体中得到RA5的全长cDNA 1.8kb，选择的表达载体为pMSG(7.6kb，Pharmacia)，其适于表达插入鼠乳腺瘤病毒LTR启动子下游多克隆位点的cDNA序列。在激素效应细胞中可以用糖皮质激素对上述启动子进行诱导。将RA5克隆cDNA两端各加衔接头(adaptor)，使其两端均为SalI位点，直接与经SalI酶切的pMSG连接，利用限制酶切反应鉴定插入片段的正反向，并将正向重组质粒命名为pMSG-RA5，根据布达佩斯条约，该质粒已于1996年4月5日在中国典型培养物中心保藏(CCTCC，中国武汉)，保藏号为CCTCCM96006。Lipofectin介导的DNA转染
GLC-82细胞接种于50ml培养瓶中(约5×104个细胞)，37℃培养至50％的覆盖率。将10μg pMSG、pMSG-RA5分别与40μg Lipofectin混合，加入3ml培养基中，37℃、5％CO2孵育12小时后，换等体积含20％胎牛血清的培养基，继续培养48小时，1∶5传代，加入筛选培养基(含霉酚酸25μg/ml，次黄嘌呤5μg/ml，黄嘌呤5μg/ml，胸腺嘧啶10μg/ml，氨基喋呤2μg/ml，谷氨酰胺29.2μg/ml)。一般在筛选14-20天出现明显的转化集落。RNA原位杂交检测外源cDNA片段的表达
用地塞米松(DM，1mg/ml，华北制药厂出品，作用终浓度为10-6M/L)处理转染后细胞，将胰酶消化的细胞悬液滴于载玻片上，使细胞贴附于玻片，用生物素标记的RA5探针进行细胞原位杂交，亲和素偶联碱性磷酸酶，NBT/BCIP为底物显色，细胞内出现蓝色颗粒为表达的mRNA产物。RT-PCR反应检测转染细胞中谷氨酰胺转移酶(TGase)基因的表达变化
提取经DM处理的转染细胞的总RNA，取1μgRNA，在20μl反应体积内，用M-MLV H-RT(Gibco，BRL)合成第一链cDNA。TGase引物为跨第6、7外显子片段，长度为180bp；用于内对照的管蛋白(α-tubulin)引物跨第1、2外显子，扩增长度410bp。 PCR反应为：50μl体积内，取逆转录产物5μl，引物各50pmol，2.5mM dNTP 2μl，10x缓冲液5μl，Taq酶(中科院遗传所)1单位。94℃40秒，50℃40秒，72℃2分钟，循环35次，1.8％琼脂糖凝胶电泳检测。结果GLC-82细胞的形态学变化
转染pMSG-RA5的GLC-82细胞，经筛选培养基筛选出抗性集落后，用DM诱导RA5的表达。结果表明，DM诱导后细胞生长速度明显减慢，5-6天后，集落周边细胞体积增大，细胞扁平，形状不规则。这些变化逐渐累及集落内部细胞，至2周左右，大多数细胞的细胞连接被破坏，细胞成片脱落、死亡，只见一些残留的网络状支架。而空载体pMSG的转化集落经DM作用后无明显变化，培养8周以后，集落从内部细胞开始自然死亡脱落。
用细胞原位杂交检测RA5在GLC-82细胞中的表达，在DM处理后的转化细胞的胞浆内发现了RA5的mRNA转录产物(图4)，说明RA5的确整合进入GLC-82细胞并表达。RA5对GLC-82细胞中TGase基因表达的影响
RA5在GLC-82细胞中表达1天后，即出现TGase基因的表达并持续至第6天。
因此，由上述实验可以看出RA5克隆是肺腺癌细胞分化过程中由维甲酸激活而特异表达的基因。将其亚克隆进真核表达载体pMSG，转导进亲本细胞诱导表达后，在分化标志基因-TGase被激活并持续表达的同时，细胞生长受到明显抑制，表明这个克隆是人肺腺癌细胞分化相关基因的cDNA序列。这个基因的cDNA可用于肺癌的分化治疗和基因治疗研究，并有可能作为肺癌基因治疗的目的基因在肺癌的临床治疗研究中加以应用。
序列表序列1序列长度：1859bp链型：单链分子型：cDNA特征：没有明显的阅读框，含终止密码子多来源：人性质：具有促进人肺腺癌细胞分化功能的cDNATCGACCCACC CGTCCGCATG AATGTGTTAC TGTATACAAA ACTCTTAATG CTTTATTCTC 60AAATGCTGGG TTGAAAAATG TTTTGAAAGC CTTTTAAAAT ATATATCTTG ATAAAGTAAT 120ATTCAGGATG ATGATAAAAA TTGTTTATAT TGTTATGATA AAAATGACAG GATAATGGTG 180CCCAGTGTAT TTAATGATTT ATTTGAAGAG GGATTGGGAA GGAACGTCTT CATACCACTT 240GCTCCTTTGA AAATTTTCAG TTATTGACTT TTAAAAAATG AATACCTCAG GCAGTAGACA 300TTTTTTTTCT AGTATCATTT AATTGATACC CTGTGCGCTA AATAGTGTGT GGTGCCTGAT 360TAATTTGGTC TGAATATTTG ATTCTTTCTG TTCCTTTCAA CTTGACATTC AGATTATTGA 420CTCAAGGAGA GAGGCTCAGA GTGGAATGGT TGGCGCTGTG GGTAAGGTGG GATCGCCCTT 480AAAACTGCCT TTTGGATTCA GTGTTTGTGC TTGAGTTCC TTTCAAATAT GACCATAATC 540GTGTGGGTGC AAGACTGTAC AGTGATACAT ATGTAGAGGT AAAGCATTCA TTTTAATACT 600TAAAGTTATA TAAATCTTTT CAAAAAGTGT TTTGTTATAA AATACGCTGT TTGTACCCAT 660ACCAGCCCAC CTCTTCTGAG GCCCTGTATT CAAATAGATG ATAGTGATCT ATCTTTCCTG 720CATGAAGTGT AGGTGGCGAG TGGGCGAGGG GCGCAGACTT CTTTGAAATC GAAGGGTACA 780GTCAAATCTA CTGCTGATTT GGTTGTTTTG TTGCTGTGGG CAGAATATGC CATGAAACAC 840ATACAGACTT CTCCGAACGT GCACCCGCAT CAGCCACCTC CTCCCCTCTT TCCCTGAGTG 900CTGGGAACAC AGCAGACCTG CACACTTGTG CAGATCCAGC TCCTACAGCT TGGGGCACTA 960GGCTGCCTTT GCTAGTCCTG TCAACAACCA TACAGTGCGA ATTGCTGAAT TAGCTGCTAT 1020TGTATGTGGA GTCACATTAA GCTTTTTCTT ATCTTTTTCT ATGGGGAAGC TATAGGGTGG 1080GTAAGGAAAA AATGTTGAAT CCTTTTACTT TGCTGAAAAT ATTAGAACTC TCTGGTGACA 1140GGATACAGCA AATTATAATT AAATATAAAT TACCAGAACC AGAGCTACCT CTAAGTCATA 1200CTTCCTCAAG CACAAAGCTC TCAGGCATAT GAGACCCACC TTAATGAAGG GTCTCTGATT 1260TCTTGAGCAT CAGCGAGTTT CAGAAGTGAC TATTTTTTTG TACTCTTCTA GTTTCCTTGT 1320AACTATACAC TTTTTCCCAT TCCACACTGT GCTTAAATGA CAAAGACTCT TGTGAGAAGC 1380CAAATTCTGT CCAAGTATTA ACTAGAGATA TTGTTGATTA AATAAAATCT AGAACTGAAG 1440TGAAAGAAGA GAGTTCCAGT TCTAATAGTC TTTTGATTAA CAATTCTTTT CTGAGAAATG 1500ATTTTTATAA GAAATGGGGT GATTCTTTAA ATGCTTTCT TAAGTTGAAG CCACAACAGT 1560TAATGGCTGT ATTGTTGCTA TTCCGTTGCT GACATGTTTT TGATAAAGCT TTAACATTCC 1620TGCTACTAAT TTTGGGCGGA GAGTGTTTGC CAGGTTTCAA TGTGGGCTGC AGCTTTTTGT 1680GCTCCTTCTC TGGTTTGCAT GTGTAATGAG TTCATAAGCT AAATTTTCAG AAAGAATTTT 1740GTTTAAGATT ATGCCTCTTA TCTACTTGAG AGCAACATGT CTTTTCAATC ATGGGATTGA 1800CACATGAAAA ATAAAGTTAT TTCTTAATCA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAA 1859