一种自然封顶矮秆紧凑甘蓝型油菜的育种方法.pdf

本发明公开了一种适宜机械收获的主花序自然封顶、有限结角、矮秆紧凑甘蓝型油菜育种方法，包括：以甘蓝型矮杆油菜3H004和株型紧凑型油菜7399-8为亲本杂交，得到F1代；在初花期选用F1植株主花序和上部分枝花序上长度3.0-4.0mm花蕾，用EMS(甲基磺酸乙酯)诱变处理后经秋水仙碱加倍和小孢子诱导培养获得DH分离群体；以植株高度、分枝特征、主花序长度、总角果数、生育期和含油量等主要性状对DH分离群体进行多年多点田间表型特征鉴定，选择主花序自然封顶、有限结角、高度低于上部分枝，花期及角果层集中、矮秆紧凑的变异类型材料，得到主花序自然封顶、有限结角、丰产抗倒、矮秆紧凑型适于机械化收获的油菜品种，其推广应用有利于降低油菜种植成本，具有良好的经济效益。

权利要求书
1.  一种适宜机械收获的主花序自然封顶、有限结角、矮秆紧凑甘蓝型油菜的育种方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)以陕西省杂交油菜研究中心自育的甘蓝型矮杆油菜3H004为母本，株型紧凑型油菜7399-8为父本进行杂交，得到杂种F1代；
2)对步骤1)得到的F1植株，在初花期取植株主花序和上部分枝花序上幼蕾的花粉进行小孢子培养，利用EMS进行诱变和秋水仙碱进行染色体加倍，得到双单倍体(DH)系群体；
3)对于步骤2)获得的、移栽至大田的双单倍体(DH)系群体进行三年每年两个试验点的田间表型鉴定，选择株高、株型、分枝特征、主花序长度、主花序角果数、全株角果数、生育期、油菜籽含油量八个主选性状与普通油菜存在差异的表型为矮杆、株型紧凑、分枝与主茎夹角较小、主花序为自然封顶及有限结角、全株总角果数接近两亲本角果总数的均值、花期集中、油菜籽含油量较高的油菜变异类型材料，获得主花序自然封顶、有限结角、矮杆紧凑型油菜品种。

2.  如权利要求1所述的育种方法，其特征在于，所述步骤2)中油菜小孢子的诱变和分离提取步骤为：在油菜初花期，取杂种F1植株主花序和上部分枝花序上长度为3.0-4.0mm的花蕾放入含有0.01-0.05％(wt/wt)EMS和1-10mg/LABA的B5培养基中研磨，诱变处理10-30min后用不含EMS和ABA的B5培养基漂洗3-5次，以提取小孢子。

3.  如权利要求1所述的育种方法，其特征在于，所述步骤2)中染色体加倍具体为：将经EMS诱变处理过的小孢子放入添加有50mg/L秋水仙碱的NLN培养基中加倍48小时，再换至无秋水仙碱且含有0.01-0.05mg/LTDZ和0.01-0.05mg/LNAA的NLN培养基中进行小孢子诱导培养，获得双单倍体(DH)系群体。

4.  如权利要求1所述的育种方法，其特征在于，所述步骤3)中对移栽至大田的双单倍体(DH)系群体进行田间表型鉴定与选择标准为：植株高度120-160cm；分枝与主茎夹角≤30度，且分枝部位较为集中；主花序为自然封顶、有限结角，角果数为两亲本主花序角果均值的1/3-1/2；全株总角果数接近两亲本角果总数的均值；角果层高度40-60cm；开花期集中，比两亲本均值缩短5-7天；油菜籽的含油量大于46.0％。

说明书一种自然封顶矮秆紧凑甘蓝型油菜的育种方法
技术领域
本发明属于油菜育种技术领域，具体涉及一种适宜机械化收获的主花序自然封顶、有限结角、矮秆紧凑型油菜的育种方法。
背景技术
我国油菜生产械化水平低，适于机械化收获的品种少，投工投劳多、劳动强度大、比较收益不高，加之农村劳动力短缺、成本高，使得我国油菜产业面临严峻挑战。据统计，在油菜生产过程中，仅收获环节人工投入就占总用工量的60％。选育高产优质，特别是适于机械化收获的新品种是降低油菜生产成本、提高种植效益的一个重要措施。而创制符合育种目标的特异种质资源，又是培育符合育种目标性状的理想品种、促进农作物增产增收的基础。传统的育种技术主要依赖于杂交后代的自交重组及人工选择，这不仅需要很大的分离群体和较长的试验周期，对育种者本人的经验和主观认知也有较高要求，因此，费工费时且效率低下。
油菜为无限花序作物，主花序高于上部分枝，多数品种植株高大、分枝及角果比较分散，易于倒伏，且花期较长(一般可持续20-30天)，主茎、分枝上不同层次角果成熟时间不一致，往往主花序下部角果已经成熟变黄，而中上部及分枝角果仍处于绿色不能成熟，很难进行一次性机械收获与脱粒，针对这些特点，我国春油菜区及加拿大等国采用分段收获脱粒法，即油菜成熟期先利用割晒机割倒晾晒，经后熟晾干后再进行捡拾脱粒，但其与一次性机械收获脱粒相比显然增加了成本和田间损失，这些特点使其不利于规模化、机械化收获，不利于种植效益的提高。因此，国内外均将创制矮秆紧凑、花期及角果层集中、抗裂角、抗倒耐密植等新型油菜种质，培育适于机械化收获的品种作为油菜遗传改良的主攻目标。
近年来，我国在紧凑、矮化、抗裂角油菜种质的创制和适宜于机械化直播、耐密植甘蓝型油菜品种的培育方面均取得了较大进展。其中，华中农业大学傅延栋等研究出一种适宜机械化收获的矮杆紧凑型油菜的育种方法(专利申请号：200810048092.5)，由该方法培 育得到的甘蓝型油菜具有矮杆、株型紧凑、花期集中等优点，是很好的种质资源，但该油菜主花序非自然封顶、单株角果数仅为100个左右，丰产性一般。
无限花序是油菜植株高大、角果分散、易于倒伏、花期较长的主要原因，如果选育出主花序自然封顶、有限结角类型的油菜品种，将会使上述不良性状大大改善，对于油菜品种改良，培育矮秆紧凑、丰产抗倒、适于机械化收获的油菜品种将具有极其重要意义。目前，尚未有关于选育主花序自然封顶、有限结角类型油菜新品种方法的报道。
发明内容
本发明目的在于提供一种选育主花序自然封顶、有限结角、矮秆紧凑型油菜新品种的育种方法。利用该方法培育矮秆紧凑型适于机械化收获的油菜种质，比传统选育方法的目标性更强，效率更高。
本发明通过以下技术方案实现：一种适宜机械收获的自然封顶矮秆紧凑甘蓝型油菜的育种方法，包括如下步骤：1)以陕西省杂交油菜研究中心自育的甘蓝型矮杆油菜3H004为母本，株型紧凑型油菜7399-8为父本进行杂交，得到杂种F1代；2)对步骤1)得到的F1植株，在初花期取植株主花序和上部分枝花序上幼蕾的花粉进行小孢子培养，利用EMS进行诱变和秋水仙碱进行染色体加倍，得到双单倍体(DH)系群体；3)对于步骤2)获得的、移栽至大田的双单倍体(DH)系群体进行三年，每年两个试验点的田间表型鉴定，选择株高、株型、分枝特征、主花序长度、主花序角果数、全株角果数、生育期、油菜籽含油量八个主选性状与普通油菜存在差异的表型为矮杆、株型紧凑、分枝与主茎夹角较小、主花序为自然封顶及有限结角、全株总角果数接近两亲本角果总数的均值、花期集中、油菜籽含油量较高的油菜变异类型材料，获得自然封顶、有限结角、矮杆紧凑型油菜品种。
其中，油菜小孢子的诱变和分离提取步骤为：在油菜初花期，取杂种F1植株主花序和上部分枝花序上长度为3.0-4.0mm的花蕾放入含有0.01-0.05％(wt/wt)EMS和1-10mg/LABA的B5培养基中研磨，诱变处理10-30min后用不含EMS和ABA的B5培养基漂洗3-5次，以提取小孢子。
为了获得较高的诱变率和一定的成胚率，申请人在对油菜小孢子诱变处理前，以不含EMS的B5培养液做对照，进行了诱变剂浓度和诱变时间的梯度试验，得到最佳诱变处理 条件为：以半致死剂量的0.01-0.05％EMS诱变处理10-30min，该条件既可以获得较高的诱变率，又获得了一定的产胚量。
染色体加倍步骤为：将经EMS诱变处理过的小孢子放入添加有50mg/L秋水仙碱的NLN培养基中加倍48小时，再换至无秋水仙碱且含有0.01-0.05mg/LTDZ和0.01-0.05mg/LNAA的NLN培养基中进行小孢子诱导培养，最终获得双单倍体(DH)系群体。
对移栽至大田的双单倍体(DH)系群体进行田间表型鉴定与选择标准为：植株高度120-160cm；分枝与主茎夹角≤30度，且分枝部位较为集中；主花序为自然封顶、有限结角，角果数为两亲本主花序角果均值的1/3-1/2；全株总角果数接近两亲本角果总数的均值；角果层高度40-60cm；开花期集中，比两亲本均值缩短5-7天；油菜籽的含油量大于46％。
采用上述育种方法，申请人选育出的油菜品种09-3048(如图1所示)的田间表型为：株高140cm左右；主花序自然封顶、有限结角，高度低于上部分枝高度；主花序长度20-26cm，角果数20-26个；全株总角果数200个左右；一次分枝数5-6个；分枝与主茎夹角≤30度；角果层高度40-50cm左右；开花期15-20天；油菜籽含油量48.6％。
由于移栽至大田的自然封顶矮秆紧凑型油菜09-3048表型稳定，具体为株型紧凑、分枝与主茎夹角较小、主花序高度低于上部分枝、开花期集中、角果层紧密且抗倒性、丰产性好，上述表型与普通油菜区分显著(如图2、图3所示)，非常适于高密度种植和机械化收获，因此，上述植株形态特征可以用来鉴别主花序自然封顶、有限结角、矮秆紧凑型油菜及其衍生后代。
本发明将本研究中心以往创制的紧凑与矮杆油菜种质进行杂交，再充分聚合化学诱变、小孢子培养等多基因聚合定向育种技术进行种质创新，比传统单一育种技术的效率更高，可在多个目标基因聚合的基础上，通过诱变、小孢子培养和筛选鉴定更快地获得优异的纯合种质。本方法创制的矮秆紧凑型油菜种质具有主花序自然封顶、有限结角特征性状，该性状为显性遗传，其杂种F1代也具有该特征性状，其推广应用对于油菜品种改良，培育矮秆紧凑、丰产抗倒适于机械化收获的油菜品种具有极其重要意义。
综上所述，与背景技术相比，本发明提供了一种快速有效的甘蓝型油菜育种方法，该方法培育出的油菜新品种具有主花序自然封顶、有限结角特征特性，克服了油菜无限花序引起的植株高大、角果分散、易于倒伏、花期较长等不良性状；该特征性状为显性遗传， 其杂种F1代同样具有自然封顶、有限结角特性。其推广应用对于油菜品种改良，培育矮秆紧凑、丰产抗倒适于机械化收获的油菜品种具有重要意义，能使油菜增产增收、提高油菜种植效益。
附图说明
图1：本发明方法选育得到的自然封顶、矮秆紧凑型油菜新品种09-3048形态图。
图2：本发明方法选育得到的油菜新品种09-3048与普通油菜的区别。
图3：本发明方法选育得到的自然封顶、矮杆紧凑型油菜新品种的大田形态图。
具体实施方式
实施例1：主花序自然封顶、有限结角、矮秆紧凑型油菜育种试验
(1)杂交：以陕西省杂交油菜研究中心自育的甘蓝型矮秆油菜3H004为母本，株型紧凑型油菜7399-8为父本进行杂交，得到杂种F1。秋季将亲本和杂种F1种植于田间，在室外通过春化后移栽于温室。
(2)建立双单倍体(DH)系群体：对步骤(1)得到的F1植株，在初花期取植株主花序和上部分枝花序上幼蕾的花粉进行小孢子培养，利用EMS进行诱变和秋水仙碱进行染色体加倍，得到446个双单倍体(DH)系群体，具体步骤如下：
1)油菜小孢子的诱变及分离提取：在油菜初花期，取杂种F1植株主花序和上部分枝花序上长度为3.0-4.0mm的花蕾(用生物显微镜抽检小孢子发育是否处于单核晚期)用蒸馏水冲洗干净；在超净工作台上先用70％酒精灭菌30s，再用20％次氯酸钠灭菌15-30min，然后用无菌水冲洗3次；取灭菌好的花蕾放入含有0.01％-0.05％(wt/wt)EMS和1-10mg/LABA的B5液体培养基中研磨成匀浆，用300目双层尼龙网过滤，10ml离心管收集滤液；静置诱变处理10-30min后，经800rpm离心5min，用不含EMS和ABA的B5液体培养基漂洗3次，弃去上清液备用。2)染色体加倍：在上述离心管中加入含有50mg/L秋水仙碱的NLN培养基，悬浮小孢子，并分装于直径60mm培养皿中(每皿20-30个花蕾，5-8ml培养液)，Parafilm封口，32℃暗培养48h。
3)小孢子培养：将经过上述处理的培养物1000rpm离心5min，弃去上清液，去除秋 水仙碱，并加入含TDZ0.01-0.05mg/L和NAA0.01-0.05mg/L的NLN培养基悬浮小孢子，将其分装于直径为90mm的无菌培养皿中(每皿10-15ml，约20-30个花蕾)，Parafilm封口，然后转移至25℃的水浴恒温培养箱中培养。当肉眼可见胚状体时，将培养皿转移至25℃，40-60rpm摇床上暗培养。直到胚状体发育成熟，将胚状体接种到含0.1mg/LGA3的B5固体培养基上分化成苗后将其转移至含有6-BA0.1mg/L+0.01mg/LNAA的MS固体培养基上进行继代和增殖，适时移栽至大田。
(3)获得主花序自然封顶、有限结角、矮秆紧凑型油菜：根据育种目标和油菜在不同生态环境下的表型特点，在春油菜区(甘肃张掖)和冬油菜区(陕西大荔)对该群体进行不同生态区穿梭筛选鉴定。其中，在冬油菜区主要对分离群体的株型、株高以及主花序的有限结角特性进行鉴定、归类和选择；在春油菜区除对群体的上述性状进行选择外，主要对其花期、早熟性、种子的含油量和耐密植特性等进行鉴定选择。依据株高、株型、分枝特征、主花序长度、主花序角果数、全株角果数、生育期等性状，对446个DH系群体进行田间鉴定，编号为09-3048的DH系这些性状与其他不同。对09-3048进行不同生态区(陕西大荔冬油菜区、甘肃张掖春油菜区)田间鉴定，其株高、株型、分枝特征、主花序长度、角果层高度、开花期等性状十分稳定。这些性状具体表现为：株高140cm左右(普通油菜180cm左右)；主花序高度低于上部分枝(普通油菜主花序高于上部分枝)；主花序长度20-26cm(普通油菜大于50cm)；主花序角果数20-26个左右(普通油菜大于50个)；全株角果数200个左右(普通油菜200-300个)；角果层40-50cm(普通油菜超过70cm)；开花期15-20天(普通油菜20-30天)；油菜籽含油量48.6％。正常栽培条件下，本发明培育的主花序自然封顶、有限结角、矮秆紧凑型油菜种植密度可达到4万株/亩，普通油菜一般1-2万株/亩。