一种防治脱发和促进生发的SIRNA及其制备方法和应用.pdf

本发明属于生物制剂技术领域，具体涉及一种防治脱发和促进生发的siRNA及其制备方法和应用。内容包括：构建可以在大肠杆菌中高效表达的与防治脱发和促进生发功能相关的长双链RNA(dsRNA)的表达载体pET－SRAR；转化大肠杆菌后发酵生产该长双链RNA，得到dsRNA；发酵的大肠杆菌菌体经均质机均质化破壁抽提大肠杆菌总RNA，抽提物经纯化获得dsRNA；再经水解纯化得到小干扰RNA(siRNAs)；用脂质体包埋siRNAs，复配后得到防治脱发和促进生发的siRNAs制剂。本发明制备的制剂具有明显防治脱发和促进生发的作用。

权利要求书
1、  一种防治脱发和促进生发的siRNA，其特征在于它由下述方法获得：将基因片断SR和AR连接而成的人工基因构建到表达有颈环结构SR-AR双链RNA的表达载体pET-SAAK上；转化大肠杆菌后进行发酵，表达生产dsRNA；离心收集大肠杆菌菌体，以均质机破碎法破菌，得到RNA抽提物，该抽提物用CF-11树脂进行吸附，洗去单链RNA和DNA分子，洗脱收集dsRNA部分，洗脱液通过酒精沉淀回收得到dsRNA；再以RNaseIII将长链的dsRNA切成18-25bp的siRNAs，除去RNase III，获得防治脱发和促进生发的siRNAs；其中，SR为睾丸激素还原酶基因片段，AR为雄激素受体基因片段。

2、  一种在大肠杆菌中表达dsRNA的表达载体pET-SRAR，其特征在于载体以pET-226为出发质粒，在Bam HI和Eco RI酶切位点之间插入一段非细菌来源的外源片段作为loop，得到pET-loop质粒，基本构成元件包括正向序列A片段、反向重复序列B片段，其中A、B片段由睾丸激素还原酶基因片段及雄激素受体基因片段经重组而成，两个片段的基因序列为SEQ.ID.NO1。

3、  一种siRNA脂质体，其特征在于由脂质对权利要求1所述的siRNAs进行脂质体包埋后获得。

4、  一种如权利要求1所述的siRNAs的制备方法，其特征在于具体步骤如下：
构建权利要求2所述的表达载体pET-SRAR，将基因片段SR及基因片段AR连接而成的人工基因构建到表达有颈环结构SR-AR双链RNA的表达载体pET-SAAK上；转化大肠杆菌后进行发酵，表达生产dsRNA；离心收集大肠杆菌菌体，以均质机破碎法破菌，得到RNA抽提物，该抽提物用CF-11树脂进行吸附，洗去单链RNA和DNA分子，洗脱收集dsRNA部分，洗脱液通过酒精沉淀回收得到dsRNA；再以RNase III将长链的dsRNA切成18-25bp的siRNAs(小分子干扰RNA)，除去RNase III，获得防治脱发和促进生发的siRNAs。

5、  一种如权利要求3所述的siRNAs脂质体的制备方法，其特征在于具体步骤如下：按照注射级大豆卵磷脂∶胆固醇∶维生素E＝100∶8-12∶0.8-1.2的配方，称取以上脂质，溶解于氯仿中，在35-40℃温度下经旋转减压薄膜浓缩法，蒸发形成脂膜，以氮气除去残存氯仿，35-40℃抽气条件下，加入5-8mm直径的玻璃珠数粒，以1克脂膜加入23-27毫升pH值为7.0-7.4的含0.5％吐温80、10mg维生素C和待包埋的siRNAs的磷酸盐缓冲液对脂膜进行旋转水化15-20分钟至乳白色；冰水浴条件下对水化液进行超声处理2-3次，每次3-5分钟；再用分子筛层析纯化得到包埋siRNAs的脂质体。

说明书一种防治脱发和促进生发的siRNA及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物制剂技术领域，具体涉及一种防治脱发和促进生发的siRNA及其制备方法，以及该siRNA在防治脱发和促进生发方面的应用。
技术背景
(1)关于脱发
随着现代工业化生产的污染、人们生活方式和生活水平的改变、日常工作的压力及基因突变的发生，脱发在整个人类社会已经变得越来越普遍，越来越严重，过高的花费也难以实现对脱发的控制，造成了各种形式的秃发，严重影响人们的身心健康和生活质量。最常见的秃发是男性秃发，每年，美国6千万人(2/3男性)花费约15亿美金征服秃发。
引起脱发的原因很多：主要可以归结于两个方面：(1)病因性脱发，由身体新陈代谢疾病或局部皮肤疾病变引起，如圆形秃发症、脂溢性秃发症、萎缩性秃发症、瘢痕性秃发症等，一些疾病如梅毒、红斑狼疮、甲状腺功能障碍、缺铁性贫血、营养不良等也可引起脱发，还有，环境及饮食的改变、情绪压力的异常或某些药物(如抗癌药、口服避孕药等)的使用也会造成不同程度的脱发。(2)基因性秃发，研究结果表明，睾丸激素在类固醇还原酶的作用下被转变为二氢睾丸激素(DHT)，后者在细胞内产生毒性，使细胞得不到血液供应而死亡。脱发患者的毛囊中的5-睾丸激素还原酶(steroid 5α-reductase，EC1.3.99.5)的浓度或活性过高，尤其在患者的前额、头顶部位的毛囊，酶的活性特别高，当男性荷尔蒙(testosterone)分泌时，这种酶会把睾丸激素代谢为二氢睾丸激素DHT，足够长时间和足够剂量的DHT留在毛囊里，DHT的毒性会让毛囊周边的血管收缩、血流减少，使得毛囊营养不足而逐渐萎缩、坏死，成为细发或头发完全停止生长，以致呈现各种程度的秃发。DHT的作用还包括：增加身体及面部毛发、粉刺及痤疮、鬼剃头(头发减少)、前列腺肥大。
雄激素对秃顶及体毛生长有积极作用，缺乏雄激素会引起头发组成型剥头皮生长，体毛生长也依赖于雄激素。雄激素起源的秃发症(Androgenetic alopecia，AGA)常被用于描述男性和女性遗传敏感型模式化头皮毛发丧失，也被称为男性样秃发(MPHL)，或男性秃顶，女性样秃发(FPHL)。MPHL和FPHL都发生于头皮毛囊对循环的雄激素的异常敏感。
二氢睾丸激素对雄激素受体的亲和力大于睾丸激素的5倍。有2类5αR，第一类出现于脂肪腺中，第二类分布与泌尿管和毛囊，都由肝脏合成分泌。因而雄激素受体的活性也与脱发存在一定的正向关系
FDA只批准2种治疗秃发药物，一种是minoxidil(Upjhon生产)，使用者不多；另一种是使用Finasteride(Merck Co.生产的Propacia)，效果明显，但会导致女性生殖缺陷，仅为男性使用，可抑制DHT(dihydrotestosterone)(二氢睾丸激素)的生成。两种药物都是还原酶的抑制剂，通过抑制DHT的产生而实现防治脱发，进而达到促进生发的目的，但两者都有一定的副作用。
防治脱发和促进生发的产品五花八门，多数产品有一定的副作用，使用麻烦，且见效差。寻找特异性、安全、无或低毒副作用、使用方便的防治脱发和促进生发的方法和产品是近年来医学、保健、美容行业一直追求的目标。本发明制备的防治脱发和促进生发的siRNAs具有作用靶位明确、特异、水溶方便使用的优点。
(2)关于RNA干扰技术
RNA干扰(RNAi)指双链RNA(dsRNA)分子可以特异性地诱发与其同源序列的mRNA分子被降解，导致相应基因表达抑制的现象，是一种特殊的转录后的基因沉默(PTGS)现象。RNAi技术是基于RNAi现象而开发的抑制特定基因表达的分子生物学技术。最早有关RNAi现象的报道出现在1990年，由两个不同的研究小组同时报道了转基因植物中的共抑制现象，以后又在线虫、果蝇、斑马鱼和小鼠等几乎所有真核生物中观察到了RNAi现象。1999年，Hamilton和Baulcombe在发生RNAi现象的植物中检测到了长度为21-25个核苷酸的RNA片段，这些RNA片段被证明是RNAi所必需的，称为小分子干扰RNA(siRNA)。果蝇中的研究成果基本阐明了RNAi的机制，当长链的dsRNA进入细胞时，它被一种Dicer核酸水解酶所识别并被剪切成21-25nt的siRNA，双链的siRNA被RNA解链酶解链，以单链的形式与另一核酸水解酶结合形成RNA酶复合体，复合体中的单链RNA象向导一样引导酶复合体识别序列与之互补的mRNA并将其水解，从而特异性地抑制基因的翻译表达。在线虫和植物中，单链的siRNA除了起“向导”作用之外，还可作为聚合反应的引物。在RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)的作用下，以mRNA为模板，单链的siRNA为引物合成互补链，使得单链的mRNA成为双链RNA，新合成的dsRNA则又被核酸酶剪切成siRNA。RdRP的作用使RNAi的信号得到放大，只要极微量的dsRNA就能引起强烈的基因表达抑制。RNAi高效而专一地抑制基因表达的特性首先在线虫功能基因组研究中得到广泛的应用。在哺乳动物细胞中，超过30bp的dsRNA会通过激活PKR系统和RNase L，导致翻译起始的抑制以及非特异的RNA降解，最终导致非特异性的基因表达抑制。这种机制阻碍了RNAi技术在哺乳动物细胞中的应用。Elbashir等人用人工合成的21nt的互补双链siRNA在多种哺乳动物细胞中诱发了RNAi机制，并避开了PKR系统和RNase L，专一性地抑制了目的基因的表达，表明RNAi技术可以成功被应用于哺乳动物。
RNAi技术应用于哺乳动物的关键是制备siRNA。目前siRNA制备有多种方法：化学合成法、细胞内表达法和体外转录长片段dsRNA后用大肠杆菌III型RNase或Dicer水解法等。但以上方法价格昂贵、不易操作和推广困难。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效、简便、成本低廉的防治脱发和促进生发的siRNAs分子及其制备方法和应用。
本发明将睾丸激素还原酶基因片段(SR)及雄激素受体基因片段(AR)连接而成的人工基因构建到表达有颈环结构SR-AR双链RNA(dsRNA)的表达载体pET-SAAK上；转化大肠杆菌后进行发酵，表达生产dsRNA；离心收集大肠杆菌菌体，以均质机破碎法破菌，得到RNA抽提物，该抽提物用CF-11树脂进行吸附，洗去单链RNA和DNA分子，洗脱收集dsRNA部分，洗脱液通过酒精沉淀回收得到dsRNA；再以RNase III将长链的dsRNA切成18-25bp的siRNAs(小分子干扰RNA)，除去RNase III获得防治脱发和促进生发的siRNAs。再经过(卵磷脂等)脂质对siRNAs进行脂质体包埋，制备得siRNA脂质体。该siRNA脂质体在脱发处的头皮涂抹，可防治脱发和促进生发。
本发明中，以催化雄激素代谢引起毛囊坏死的酶--毛囊中的5-睾丸激素还原酶(steroid5α-reductase，EC1.3.99.5)(SR)和雄激素受体(Androgen receptor)(AR)基因为靶位，筛选合适基因序列合成寡核苷酸片段；并通过分子生物学手段连接为目的人工基因，并设计引入特定限制性酶切位点，以特定限制性酶切位点进行分子克隆，获得一个重组基因SRAR(SEQ.ID.NO1)，并构建表达SR-AR双链RNA的大肠杆菌表达载体pET-SRAR。
构建的SR-AR双链RNA表达载体为一种颈环结构，在大肠杆菌中能够表达目的基因片段的dsRNA，通过发酵表达，表达水平达到400-500毫克/100克湿菌体。发酵后的菌体通过均质机均质化破壁抽提RNA，dsRNA经CF-11树脂吸附纯化获得dsRNA溶液，进一步以酒精沉淀或以正丁醇进行浓缩得到纯化的目的dsRNA。
本发明在大肠杆菌中表达防治脱发和促进生发的dsRNA的方法，包括构建一种可在大肠杆菌中高效表达dsRNA的表达载体pET-SRAR(见图1、2)，载体以pET-22b(购自美国Novagen公司)为出发质粒，在Bam HI和Eco RI酶切位点之间插入一段非细菌来源的外源片段作为loop，得到pET-loop质粒，结构如图1所示。基本构成元件包括正向序列A片段、反向重复序列B片段，其中A、B片段由睾丸激素还原酶基因片段(SR)及雄激素受体基因片段(AR)经重组而成(SRAR)，两个片段的基因序列见SEQ.ID.NO1。具体克隆流程见图2所示，在pET-loop质粒两侧以合适的酶切位点插入相反方向的SRAR基因片段，构建好的双链RNA的表达载体被称为pET-SRAR。通过常规的氯化钙法将表达载体转化到大肠杆菌[BL21-CodonPlus(DE3)-ril]中。挑转化的单菌落接种到含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，在37℃摇床中以250rpm的转速培养过夜，取20μL种子液接种到2mL新鲜的含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，同样条件下继续振荡培养，当菌液的600nm吸光值(OD600)达到1附近时，加入IPTG至终浓度0.1mM进行诱导，相同条件继续培养3小时以后收集菌体。通过碱裂解法抽提质粒DNA的方法从菌体中提取核酸，提取物用市售的RNaseA处理，以1％琼脂糖凝胶对处理样品电泳分析，EB染色分析表达结果。由于loop达到两端为重复互补序列，表达产物在生理条件下可以自然形成互补的长双链RNA。大规模发酵生产结果显示，本方法构建的表达dsRNA的表达载体在大肠杆菌中发酵，100g湿重的大肠杆菌菌体可得到400-500mg的dsRNA样品。
本发明中，重组基因片段的两个基因片段的序列分别通过合成的寡核苷酸片段经人工基因技术获得并测序正确，以特定限制性核酸内切酶酶切位点克隆为串联重组A片断(450bp)和与A片段互补而排列方向相反的B片段(450bp)。
本发明中，发酵生产长双链RNA的大肠杆菌ril经转化培养后，通过乳糖(6kg/300L)或异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(ITPG)(1.5g/300L)诱导发酵，以特异提高表达产量。
本发明制备的siRNAs，通过RNA干扰的机制有效而专一性地抑制引起毛发脱落的代谢关键酶(5-α-睾丸激素还原酶)基因及受体基因的表达，达到防治脱发和促进生发的作用。
本发明中，通过脂质体包埋siRNAs的步骤如下：按照注射级大豆卵磷脂∶胆固醇(AR)∶维生素E(AR)＝100∶8-12∶0.8-1.2的配方，称取以上脂质，溶解于适量氯仿中，梨形圆底烧瓶中在35-40℃温度下经旋转减压薄膜浓缩法，蒸发形成脂膜，以纯氮气除去残存氯仿。35-40℃抽气条件下，加入5-8mm直径的玻璃珠数粒，以1克脂膜加入23-27毫升pH7.0-7.4的磷酸盐缓冲液(含0.5％吐温80，10mg维生素C和待包埋的siRNAs)对脂膜进行旋转水化15-20分钟至乳白色。冰水浴条件下对水化液进行超声处理2-3次，每次3-5分钟。再用(Sephadex G-100)分子筛层析纯化得到包埋siRNAs的脂质体。
本发明制备的脂质体siRNAs经脱发处头皮涂抹渗透进入皮肤，达到防治脱发和促进生发的目的。
本发明的优点：
(1)直接以催化二氢睾丸激素(DHT)产生的睾丸激素还原酶基因和DHT发挥生物学作用必须的雄激素受体基因为干扰靶位，通过分子生物学技术对两个基因的基因片段进行重组，利用微生物的廉价生产体系发酵生产制备siRNAs所必须的dsRNA，dsRNA经RNase III水解被作用为有生物学活性作用的siRNAs，并利用小分子RNA干扰的作用特异而高效地抑制睾丸激素还原酶基因及雄激素受体基因的表达，以达到抑制DHT的形成和DHT发挥作用必须的雄激素受体的目的，从而实现防治脱发和促进生发。
(2)构建了能在大肠杆菌中高效表达dsRNA的表达载体。利用一系列的分子生物学技术，设计和克隆表达元件，构建了适于在大肠杆菌中特异表达dsRNA的表达载体pET-SRAR。
(3)提供了有效制备siRNA的方法。利用RNase III的酶学特性对经过提取和纯化的dsRNA进行水解，得到18-25bp的可用于小分子RNA干扰的siRNAs。
(4)提供了脂质体包埋siRNAs的方法，提高了siRNAs的稳定性和透皮性，使产品更适宜在皮肤外用。
附图说明
图1：双链RNA表达载体pET-loop结构示意图。
图2：pET-SRAR克隆结构示意图。
图3：SRAR dsRNA在大肠杆菌中表达的电泳分析图。
图注：M1：1Kb DNA分子量标记
1：未经IPTG诱导的表达菌株中的核酸经RNase A处理；
2：IPTG诱导后表达菌株中的核酸经RNase A处理。
箭头所指为表达的dsRNA。
图4：DEAE柱分离RNase III及其水解产物的洗脱曲线和电泳分析图。
图注：A、洗脱曲线；B、上部分是15％的非变性PAGE，下部分是10％的SDS-PAGE电泳分析图，蛋白质电泳用考马斯亮兰染色，核酸电泳用EB染色。Peak1是RNaseIII的洗脱峰(只有蛋白质显色)，peak2是混合的寡核苷酸片段(只有核酸显色峰)。
图5：Superdex 75分子筛层析分离纯化esiRNA。
图注：A是用两根Superdex75柱串连分离时的洗脱峰；B是A峰图所对应的纯化样品电泳图。15％非变性PAGE电泳分析收集到的样品。S为上样液，1-6为分子筛流出的各个组分。EB染色。图中纯化收集的2-4洗脱峰为21-25bp的目的siRNAs。
具体实施方式：
1.各表达元件的克隆：根据Genebank公布的人类睾丸激素还原酶及雄激素受体基因的序列，分别选择相关片段序列，设计和合成寡核苷酸片段，连接各寡核苷酸片段获得两个基因片段的人工基因片段SRAR(为SEQ.ID.NO1)，并引入特定限制性内切酶酶切位点用于克隆所需，按图1和图2的策略克隆双链RNA表达载体pET-SRAR，克隆后的表达质粒以PCR反应和酶切进行反应鉴定。
2.发酵生产：通过常规氯化钙转化法将pET-SRAR转化到大肠杆菌[BL21-CodonPlus(DE3)-RIL]中，挑取单菌落接种到含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，在37℃摇床中以250rpm的转速培养过夜，各取20μL种子液接种到2mL新鲜的含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，同样条件下继续振荡培养，当菌液的600nm吸光值(OD600)达到1.0附近时，加入IPTG至终浓度0.1mM，相同条件继续培养3小时后收集菌体。用碱法抽提质粒DNA的方法从菌体中提取核酸，提取物用RNase A处理，以1％琼脂糖凝胶对处理样品进行电泳分析，图3的EB染色结果显示，从经过诱导和未经诱导的培养菌株中抽提到的核酸经RNase A处理后，只有经过IPTG诱导的转化了表达发卡结构质粒的菌体裂解液中存在明显的RNA条带，而未经诱导的菌体裂解液中的RNA在RNase A作用后几乎没有任何条带。RNase A是一种单链特异性的RNA水解酶，结果表明，未被RNase A水解的小分子量RNA是经过诱导表达的dsRNA。发明中构建的pET-SRAR载体可以表达目的双链RNA。大规模发酵生产结果显示，本发明构建的表达载体在大肠杆菌中能较好地表达目的双链RNA，表达量达到每100克湿菌体为400-500毫克目的双链RNA。
3.dsRNA提取：取冻藏的大肠杆菌发酵菌体30-50克，充分悬浮于500-600mL的磷酸盐(PBS)缓冲液中，均质机均质破壁，68-72℃水浴锅加热30分钟，7000rpm低温离心30分钟去除变性的沉淀蛋白质，上清部分补加乙醇至终浓度为20％。
4.dsRNA的纯化：CF-11树脂(每500mL破壁上清用30克树脂)用20％乙醇平衡后，加到破壁上清处理液中搅拌均匀，混合物在冰浴上充分吸附过夜。过夜吸附液通过抽滤除去上清液，并用冰浴预冷的18％酒精溶液抽滤洗涤3-4次，充分洗去DNA和单链RNA。接着用预热至60-70℃的STE缓冲液抽滤洗脱收集双链RNA。收集到的dsRNA抽滤液中加入2倍体积的无水乙醇和0.1倍体积的3M NaAc，-20℃沉淀30分钟，10000rpm离心20分钟取沉淀，沉淀用70％的冷乙醇悬浮洗去盐份，离心流取沉淀，沉淀用10mM pH8.0的TE溶解得到纯化的dsRNA，-40℃冰箱保藏。图4为纯化前后的RNA样品的琼脂糖凝胶电泳图谱，从图中可以看出纯化得到的样品为单一的长链dsRNA。CF-11层析柱纯化得到的dsRNA的OD260/OD280＝2.0，表明样品的纯度高。100g大肠杆菌菌体共得到dsRNA样品400-500mg。
5.siRNA的获得：经CF-11层析柱纯化得到的dsRNA经定量后，按每微克ds RNA用0.02-0.03微克大肠杆菌来源的RNase III在37℃水解3小时。反应溶液中含1mM DTT，50mMTris-HCl，10mM MnCl2，50mM NaCl，pH7.5。反应液中加入EDTA终止反应，电泳检测结果显示水解1小时即达到好的水解效果，见图4所示。
6.siRNA的纯化：双链RNA被大肠杆菌RNase III水解后，溶液中补加NaCl至终浓度为250mM，然后上样到用上样缓冲液(10mM Tris-HCl，250mM NaCl，1mM EDTA，pH7.5)平衡过的DEAE柱上(1×10cm树脂)，继续用上样缓冲液洗至基线，然后用250mM至550mM的NaCl浓度梯度洗脱被吸附的水解产物。经DEAE柱纯化的水解产物中包含有各目标片段的siRNA和其它不同大小的寡核苷酸片段，进一步选用分子筛层析分离这种混合物，用BioRad公司的BIOLOGIC DUOFLOWTM CHROMATOGRAPHY SYSTEM和pharmacia的25mL Superdex75 FPLC column，缓冲液为PBS，洗脱产物经15％的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测后收集大小为21-25bp的产物，分装后冻存于-20℃贮藏备用。
7.siRNAs的脂质体包埋，按照卵磷脂∶胆固醇∶维生素E＝100∶8-12∶0.8-1.2的配方，分别秤取，溶解于适量氯仿中，梨形圆底烧瓶中35-40℃减压旋转蒸发形成脂膜，以纯氮气循环除去残留溶剂。加入十数粒5-8mm直径的玻璃珠，35-40℃温度并在充氮气条件下，以1克脂膜加入25毫升pH7.2的磷酸盐缓冲液(含0.5％吐温80和待包埋的siRNAs)对脂膜进行旋转水化15-20分钟至乳白色。冰水浴条件下对水化液进行超声处理2-3次，每次3-5分钟。Sephadex G-100分子筛层析纯化得到脂质体siRNAs。
8.用手指蘸取siRNAs脂质体溶液少许在脱发头皮区进行头皮的涂抹给药，每天早晚各一次，使用一周后脱发数量明显减少，并逐渐呈脱发消失现象。使用一个月后，不再出现异常脱发现象，局部可见新生长的细小毛发，继续使用至2个月，脱发头皮处可以明显出现新生头发。80％的使用者的使用结果显示，本发明制备的小干扰RNA具有明显的防治脱发和促进生发作用。
序列表
SEQ.ID.NO1：cgcgaagtga tccagaaccc gggccccagg cacccagagg ccgcgagcgc agcacctcccggcgccagtt tgctgctgct gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcagcagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcaag agactagccc caggcagcagcagcagcagc agggtgagga tggttctccc caagcccatc gacggcgacg gcgacggcggtggtggagga gcgcctgctg gctgcgttcg cctaccttca gtgcgccgtg ggctgcgcggtcttcgctcg gaatcgtcag acgaactcag tgtacagccg ccacgcgcca cccagccgcaggctccgagt gccggcgcgg gccacccggg tggtgcagaa gctgccctca ctggccctgccgctctacca gtacaccagt gagtccaccc