重组干扰素Α2（IFNΑ2）突变体.pdf

本发明提供了与野生型IFNα2相比具有提高的特异性激动活性或拮抗活性的IFNα2突变体及其活性片段、类似物、衍生物以及变体。本发明还提供了包括IFNα2突变体的药物组合物，所述药物组合物可用于治疗或预防与IFNα2表达增加有关的癌症、自身免疫性疾病、感染性疾病或病症。

权利要求书
1.  一种重组的干扰素α2(IFNα2)多肽及其活性片段、类似物、衍生物以及变体，所述多肽包括选自氨基酸残基57-89的至少一个氨基酸取代、C末端氨基酸残基159-165的至少一个氨基酸取代及其组合的突变，其中所述多肽与野生型IFNα2(SEQ ID NO：2)相比具有提高的特异性激动活性或拮抗活性。

2.  根据权利要求1的多肽，其中所述多肽包括选自H57A(SEQ ID NO：24)、E58A(SEQ ID NO：25)、Q61A(SEQ ID NO：26)、H57Y(SEQ ID NO：27)、E58N(SEQ ID NO：28)、Q61S(SEQ ID NO：29)及其组合的至少一种突变，其中所述多肽与野生型IFNα2(SEQ ID NO：2)相比具有提高的特异性激动活性或拮抗活性。

3.  根据权利要求1的多肽，其中所述多肽包括三突变体H57A，E58A，Q61A(SEQ ID NO：5)，其与野生型IFNα2(SEQ ID NO：2)相比具有提高的特异性活性。

4.  根据权利要求1的多肽，其中所述多肽包括四突变体N65A，L80A，Y85A，Y89A(SEQ ID NO：6)，其与野生型IFNα2(SEQ ID NO：2)相比具有拮抗活性。

5.  根据权利要求1的多肽，其中所述多肽包括C末端ESLRSKE至KRLKSKE的取代(SEQ ID NO：7)，其与野生型IFNα2(SEQ ID NO：2)相比具有提高的特异性活性。

6.  根据权利要求1的多肽，其中所述多肽包括三突变体H57A，E58A，Q61A和C末端ESLRSKE至KRLKSKE的取代的组合(SEQ IDNO：8)，其与野生型IFNα2(SEQ ID NO：2)相比具有提高的特异性活性。

7.  根据权利要求1的多肽，其中所述多肽包括四突变体N65A，L80A，Y85A，Y89A和C末端ESLRSKE至KRLKSKE的取代的组合(SEQ ID NO：9)，其与野生型IFNα2(SEQ ID NO：2)相比具有拮抗活性。

8.  根据权利要求1的多肽，其中所述多肽包括三突变体H57M，E58D，Q61L(SEQ ID NO：10)，其与野生型IFNα2(SEQ ID NO：2)相比具有提高的特异性活性。

9.  根据权利要求1的多肽，其中所述多肽包括三突变体H57Y，E58N，Q61S(SEQ ID NO：11)，其与野生型IFNα2(SEQ ID NO：2)相比具有提高的特异性活性。

10.  根据权利要求1的多肽，其中所述多肽包括三突变体H57M，E58D，Q61L和C末端ESLRSKE至KRLKSKE的取代的组合(SEQ IDNO：12)，其与野生型IFNα2(SEQ ID NO：2)相比具有提高的特异性活性。

11.  根据权利要求1的多肽，其中所述多肽包括三突变体H57Y，E58N，Q61S和C末端ESLRSKE至KRLKSKE的取代的组合(SEQ IDNO：13)，其与野生型IFNα2(SEQ ID NO：2)相比具有提高的特异性活性。

12.  根据权利要求1的多肽，其中所述多肽被进一步与PEG偶联。

13.  一种编码多肽的DNA分子，所述多肽包括选自氨基酸残基57-89的至少一个氨基酸取代、C末端氨基酸残基159-165的至少一个氨基酸取代及其组合的突变，其中所述多肽与野生型IFNα2(SEQ ID NO：2)相比具有提高的特异性激动活性或拮抗活性。

14.  根据权利要求13的DNA分子，其中所述DNA分子包括选自SEQID NO：15-23和SEQ ID NO：30-35的序列。

15.  一种包括根据权利要求13-14任一项的DNA分子的载体，所述载体与一个或多个转录调控元件可操作地连接。

16.  一种包括权利要求15的载体的宿主细胞。

17.  一种药物组合物，其包括作为活性成分的重组的干扰素α2(IFNα2)多肽及其活性片段、类似物、衍生物以及变体，且包括药学上可接受的载体，所述多肽包括选自氨基酸残基57-89的至少一个氨基酸取代、C末端氨基酸残基159-165的至少一个氨基酸取代及其组合的突变，其中所述多肽与野生型IFNα2(SEQ ID NO：2)相比具有提高的特异性激动活性或拮抗活性。

18.  根据权利要求17的药物组合物，其包括具有SEQ ID NO：5-13和SEQ ID NO：24-29任一者的重组干扰素α2(IFNα2)多肽及其片段、类似物、衍生物以及变体。

19.  根据权利要求18的药物组合物，其包括具有SEQ ID NO：5、7、8、10、11、12以及13任一者的重组干扰素α2(IFNα2)多肽及其片段、类似物、衍生物以及变体，其中所述多肽具有提高的特异性激动活性。

20.  根据权利要求18的药物组合物，其包括具有SEQ ID NO：6和9任一者的重组干扰素α2(IFNα2)多肽及其片段、类似物、衍生物以及变体，其中所述多肽具有提高的特异性拮抗活性。

21.  一种治疗或预防与干扰素(IFN)的调节有关的疾病或病症的方法，所述方法包括为需要其的受治疗者施用治疗有效量的权利要求19的药物组合物，其中所述疾病或病症选自癌症、自身免疫性疾病和感染性疾病。

22.  根据权利要求21的方法，其中所述癌症选自毛细胞性白血病、卡波济氏肉瘤、多发性骨髓瘤、慢性髓细胞性白血病、非何杰金氏淋巴瘤和黑素瘤。

23.  根据权利要求21的方法，其中所述自身免疫性疾病是多发性硬化症(MS)。

24.  根据权利要求23的方法，其中所述MS选自复发-缓解型MS、继发-进展型MS、原发-进展型MS以及进展-复发型MS。

25.  根据权利要求21的方法，其中所述感染性疾病为肝炎病毒感染。

26.  根据权利要求25的方法，其中所述肝炎病毒感染选自甲型肝炎、乙型肝炎以及丙型肝炎。

27.  一种用于治疗或预防与IFNα2表达增加有关的疾病的方法，其包括为需要其的受治疗者施用有效量的根据权利要求20的药物组合物。

28.  根据权利要求27的方法，其中所述疾病为胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)。

29.  根据权利要求27的方法，其中所述疾病为系统性红斑狼疮(SLE)。

30.  一种重组的干扰素α2(IFNα2)多肽及其活性片段、类似物、衍生物以及变体用于制备治疗或预防与IFN的调节有关的疾病或病症的药剂的用途，所述多肽包括选自氨基酸残基57-89的至少一个氨基酸取代、C末端氨基酸残基159-165的至少一个氨基酸取代及其组合的突变，其中所述多肽与野生型IFNα2(SEQ ID NO：2)相比具有提高的特异性激动活性或拮抗活性。

31.  根据权利要求2-12任一项的干扰素α2(IFNα2)突变体用于制备治疗或预防与IFN的调节有关的疾病或病症的药剂的用途。

说明书重组干扰素α2（IFNα2）突变体
技术领域
本发明涉及与野生型IFNα2相比具有提高的特异性激动活性或拮抗活性的重组干扰素α2(IFNα2)突变体及其活性片段、类似物、衍生物以及变体，还涉及其药物组合物，所述药物组合物可用于治疗或预防与IFNα2表达增加有关的癌症、自身免疫性疾病、感染性疾病和病症。
背景技术
IFN(干扰素)于1957年由Isaacs和Lindenmann发现，并因其干扰病毒增殖的能力而命名。IFN还可抵抗细菌和寄生虫感染，抑制细胞分裂，抑制自发性细胞凋亡，以及促进或阻止细胞分化。基于其受体特异性，公认有两种类型IFN：I型和II型。I型IFN是单体蛋白质家族，包括为白细胞产物的IFNα和IFNω，成纤维细胞产生的IFNβ，以及仅在有蹄类动物种类中描述的IFNτ。
唯一已知的II型IFN是专门由淋巴细胞产生的二聚体IFNγ。IFNα家族包括13个完全无内含子的翻译的基因(除了假基因以外)。各成员包括具有165或166个氨基酸残基的成熟蛋白质，其中具有两个保守的二硫键：Cys1-Cys98和Cys29-Cys138。在各种IFNα亚类中表现了高水平的序列同源性(80％)，且在这些亚类和IFNβ之间存在约35％的同源性。尽管不同亚类具有高同源性，但它们的抗增殖、抗病毒以及免疫调节方面的生物活性显著不同。
几种I型IFN的结构已经得到解答，包括小鼠IFNβ(1IFA、1RMI)、人类IFNβ(1AU1)、人类IFNα2(1RH2、HTF)以及羊IFNτ(1B5L)。结构上，IFN是α螺旋细胞因子家族的成员。所有I型IFN通过由IFNAR1和IFNAR2组成的普通受体复合物进行信号传导。I型干扰素受体的主要配体结合成分是IFNAR2，它对于IFNα2具有～10nM的结合亲和力。IFNAR2的细胞外部分的结构包括两个免疫球蛋白样结构域，IFNα2的结合位点位于N末端结构域和连接环。
成熟的IFNAR1是530个氨基酸的蛋白质，具有21个残基组成的跨膜片段，和100个残基的胞质结构域。IFNAR1的细胞外部分的结构尚未知，但从序列上来看，可以推测它由四个免疫球蛋白样结构域组成。IFNα2与IFNAR1的结合是弱的，于人工膜上检测的亲和力为1.5-5μM。牛IFNAR1(BoIFNAR1)和人类IFNAR1(HuIFNAR1)具有68％的同一性。HuIFNAR1的亚结构域2和3显示在与IFNα2的结合中起关键作用。通过使用同源性BoIFNAR1置换这些亚结构域，亲和力显著增加。可溶性BoIFNAR1可以以10nM的亲和力结合人类IFN，这比HuIFNAR1的亲和力大500倍。表达IFNAR2的小鼠细胞以8nM的亲和力结合IFNα2，而仅表达IFNAR1的细胞表现无配体结合。当IFNAR1和IFNAR2共表达时，观察到对于IFNα2的亲和力增加10倍。使用于人工膜上的体外研究，显示IFNAR1诱导的三元复合物结合亲和力增加的程度与该受体的相对表面浓度有关。IFN上IFNIFNAR1的结合位点的位置定位于位于B、C和D螺旋以及DE环上的IFNβ，而IFNα2的Ala扫描诱变提示IFNAR1的结合位点限制于B和C螺旋。
许多研究已经表明三元复合物的形成以顺序方式发生，从IFN结合IFNAR2形成中间复合物开始，然后是IFNAR1的募集。FNAR1-IFNβ-IFNAR2复合物显示具有1∶1∶1的化学计量。IFNAR1受体是IFN受体复合物的基本成分，IFNAR1无效突变或针对该受体的中和Ab的添加导致对IFNα和IFNβ的抗病毒和抗增殖应答完全丧失。IFNAR1和IFNAR2的结合刺激组成型相关的细胞内激酶Jak1和Tyk2的激活，导致酪氨酸磷酸化级联，该级联引起磷酸化的信号转导因子与转录活化因子(STAT)形成二聚体，并运输至细胞核，在细胞核中，它们结合特异性DNA序列并刺激成百上千的应答基因的转录。
关于IFN如何非常相似地诱导相同细胞类型的不同活性的问题仍未解决。还表明不同IFNα亚类的生物活性与它们各自的结合亲和力和所使用的细胞类型有关。
脊椎动物I型IFN由独享受体识别，所述受体由两个跨膜蛋白(IFNAR1和IFNAR2)组成，通过它们结合的Jak激酶表现其活性，将Stat转录因子作为其主要靶(Brierley，M.M.和Fish，E.N.2002.J Interferon Cytokine Res.22，835-845)。由于IFNAR2和IFNAR1通常通过它们的细胞外结构域(hCR结构域)的IgG样折叠被识别，它们分别被认为是结合蛋白和附属的转导因子-即异聚受体的α和β链。在该定义中隐含两条链的配体解离常数的差异。尽管如此，二者均促成高亲和力结合位点的建立。“普通”β链和不同识别链的组合是差异应答不同配体的异聚受体的特征。与不同α链相互作用的能力为差异受体表达建立了潜在的网络联系(Kotenko，S.V.和Langer，J.A.2004.Int Immunopharmacol 4，593-608)。当如IFNAR1，它们具有与不同信号传导途径的元件相互作用的能力时，它们可以建立用于差异基因表达的联系(Platanias，L.C.和Fish，E.N.1999.ExperimentalHematology 27，1583-1592)。
人类12号染色体的IFN具有不同的非等位基因α蛋白，一个β，一个ω。如从具有显著序列同源性、共享的3D核心结构和共享的受体的家族所预期的，I型IFN的活性重叠。尽管如此，可以识别它们并甚至通过其氨基酸差异而分类，已经注意到活性相对差异的许多情况。出现的画面是功能性差异仅在特定的生理学情况中出现。除了它们在赋予几乎任何细胞的抗病毒保护中的局部作用以外，它们还与第二道抗病毒防线的发展有关。注意到IFN之间的可能差异也许是它们紧密结合IFNAR1的潜能(Roisman等，2005.JMoI Biol.353，271-281)。
多年来，I型IFN的差异活性已经是深入研究的主题。特别注意到IFNβ与IFNα相比具有其他的活性。这两种IFN之间差异的详细分析表明在IFN应答基因的转录激活中IFNβ通常具有较高的活性，并且在IFN水平降低时具有活性。结合研究表明针对附属亚单位IFNAR1的亲和力是IFNα2和IFNβ之间的关键差异(Jaitin，2006.Mol Cell Biol.26，1888-1897)。
已知IFNα2具有抗癌作用。然而，这种治疗并非总是有效，并且有时导致与剂量和疗程相关的无法忍受的副作用。WO 97/12630公开了使用替莫唑胺联合IFNα2治疗癌症患者。WO 01/54678公开了使用替莫唑胺和聚乙二醇化的IFN治疗癌症患者。
在美国，丙型肝炎病毒(HCV)感染是最常见的慢性血源性感染。尽管新感染的数量已经下降，但慢性感染的负担显著，美国疾病控制中心(theCenter for Disease Control)估计在美国具有三百九十万(1.8％)受感染的人。慢性肝脏疾病是美国成人死亡的第十位主要原因，每年导致约25,000人死亡，或占所有死亡人数的约1％。研究表明40％的慢性肝脏疾病是HCV相关的，每年导致约8,000-10,000人死亡。HCV相关的末期肝脏疾病是成人肝脏移植最常见的适应症。
在过去十年，慢性丙型肝炎的抗病毒治疗进展迅速，在疗效方面可见到显著改进。尽管如此，即使使用聚乙二醇化的IFN-α加上病毒唑联合治疗，还是有40％至50％的患者治疗失败，即为非应答者或复发者。目前这些患者没有有效的治疗替代方法。特别地，肝组织活检具有晚期肝纤维化或肝硬化的患者处于发展晚期肝脏疾病的并发症(包括腹水、黄疸、静脉曲张破裂出血、脑病以及进行性肝衰竭)的显著风险和显著增加的肝细胞癌的风险中。
多发性硬化症(MS)是慢性神经性自身免疫性脱髓鞘疾病。MS可引起视力模糊、单侧视力丧失(视神经炎)、平衡丧失、协调性差、言语不清、震颤、麻木、极度疲劳、智力功能改变(如记忆和注意力)、肌肉无力、感觉异常，以及失明。许多受治疗者具有慢性进行性残疾，但长期的临床稳定性可能中断恶化期。神经病变可以是永久性或逐渐消失。MS的病理特征是针对中枢神经系统的异常免疫反应。特别地，T淋巴细胞被激活而针对中枢神经系统的髓鞘，引起脱髓鞘。在脱髓鞘过程中，髓磷脂被破坏，并被已知为斑块(plaque)的变硬的“硬化”组织的疤痕取代。这些损害在遍及脑、视神经以及脊髓的分散部位出现。在美国被批准用于治疗MS的这两种类型的IFN-β为IFN-β1a和IFN-β1b。
I型糖尿病，也称为自身免疫性糖尿病或胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)，是一种自身免疫性疾病，其特征是胰腺细胞被自身反应性T淋巴细胞选择性破坏(Bach，1994，Endocr.Rev.15：516-542)。IDDM的病理非常复杂，其涉及遗传易感宿主中表观遗传事件(可能病毒感染)、胰岛细胞以及免疫系统之间的的相互作用。许多细胞因子，包括IFN-α和IFN-γ，与人类和该疾病动物模型的IDDM的发病机理有关(Campbell等，1991，J.Clin.Invest.87：739-742)。似乎在对潜在的致糖尿病刺激例如病毒的应答中胰岛细胞的IFN-α局部表达可触发胰岛炎过程。
WO9304699公开了一种治疗胰岛素依赖性糖尿病的方法，其包括进行IFN-α拮抗剂的给药。
基于系统性红斑狼疮(SLE)患者的IFNα表达水平增加，IFNα与SLE的发病机理有关(Ytterberg和Schnitzer，1982，Arthritis Rheum.25：401-406)。WO02066649公开了用于治疗胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)和系统性红斑狼疮(SLE)的抗IFNα特异性抗体。
美国专利申请公布No.20040230040公开了IFNα2的半胱氨酸突变体。美国专利申请公布No.20040002474公开了在基于人类Daudi细胞系的测定中具有抗增殖活性的IFNα同系物。
美国专利No.4,588,585公开了突变的IFNβ1b，其中经由在密码子17的第一个碱基中T转换成A，Cys17被改变成Ser17，这防止了不正确的二硫键形成。WO2005016371公开了一种包括具有更大特异性活性的改进的重组人类IFNβ1b突变体的药物组合物。
对于与IFNα2的表达增加有关的癌症、感染性疾病、多发性硬化症以及自身免疫性疾病可使用的治疗是昂贵的，仅在一定比例的患者中有效，且常见有副作用。对于安全、可靠、有效以及费用合理的合适的治疗方法仍存在未满足的医学需要。
发明内容
本发明提供了具有重要治疗用途的新型IFNα2突变体。本发明的变体作为激动剂或拮抗剂与野生型IFNα2相比具有提高的特异性。
本发明首次公开了下述发现：重组IFNα2突变体模拟IFNβ(SEQ IDNO：3)的结合性质并显示差异IFNβ活性的重要特征。这包括增加的体外和体内抗增殖活性，和IFNAR2受体的特异性下调。
根据第一方面，本发明提供了一种重组干扰素α2(IFNα2)多肽及其活性片段、类似物、衍生物以及变体，其中所述多肽包括选自氨基酸残基57-89的至少一个氨基酸取代、C末端氨基酸残基159-165的至少一个氨基酸取代及其组合的突变，其中所述多肽与野生型IFNα2(SEQ ID NO：2)相比具有提高的特异性激动活性或拮抗活性。
根据某些实施方案，所述多肽包括选自H57A(SEQ ID NO：24)、E58A(SEQ ID NO：25)、Q61A(SEQ ID NO：26)、H57Y(SEQ ID NO：27)、E58N(SEQ ID NO：28)、Q61S(SEQ ID NO：29)及其组合的至少一个突变，其中所述多肽与野生型IFNα2(SEQ ID NO：2)相比具有提高的特异性激动活性或拮抗活性。
根据一个实施方案，本发明提供了一种三突变体H57A，E58A，Q61A(SEQ ID NO：5)，其与野生型IFNα2(SEQ ID NO：2)相比具有提高的特异性活性。
根据另一个实施方案，本发明提供了一种四突变体N65A，L80A，Y85A，Y89A(SEQ ID NO：6)，其与野生型IFNα2相比具有拮抗活性。
根据又一个实施方案，本发明提供了一种IFNα2蛋白质，其包括C末端ESLRSKE至KRLKSKE的取代(SEQ ID NO：7)，其与野生型IFNα2相比具有提高的特异性活性。
本发明IFNα2突变体的特异性突变各自位于所述蛋白质的不同位置，并因此可结合产生另外或增加的作用。
根据一个实施方案，本发明提供了一种IFNα2变体，其包括三突变体H57A，E58A，Q61A和C末端ESLRSKE至KRLKSKE的取代的组合(SEQ IDNO：8)，所述IFNα2变体具有非常高的特异性活性。
根据另一个实施方案，本发明提供了一种IFNα2变体，其包括四突变体N65A，L80A，Y85A，Y89A和C末端ESLRSKE至KRLKSKE的取代的组合(SEQ ID NO：9)，所述IFNα2变体对于IFNAR2具有增加的结合亲和力但具有非常低的生物活性。现在公开该IFNα2变体作为IFN拮抗剂起作用，其通过IFN的受体阻断它们的天然活性。
根据又一个实施方案，本发明提供了一种三突变体H57M，E58D，Q61L(SEQ ID NO：10)，其与野生型IFNα2(SEQ ID NO：2)相比具有提高的特异性活性。
根据又一个实施方案，本发明提供了一种三突变体H57Y，E58N，Q61S(SEQ ID NO：11)，其与野生型IFNα2(SEQ ID NO：2)相比具有提高的特异性活性。
根据又一个实施方案，本发明提供了一种IFNα2变体，其包括三突变体H57M，E58D，Q61L和C末端ESLRSKE至KRLKSKE的取代的组合(SEQID NO：12)，其与野生型IFNα2(SEQ ID NO：2)相比具有提高的特异性活性。
根据又一个实施方案，本发明提供了一种IFNα2变体，其包括三突变体H57Y，E58N，Q61S和C末端ESLRSKE至KRLKSKE的取代的组合(SEQID NO：13)，其与野生型IFNα2(SEQ ID NO：2)相比具有提高的特异性活性。
根据某些实施方案，本发明提供了具有增加的特异性活性的聚乙二醇化的IFNα2突变体。
根据另一方面，本发明提供了编码本发明多肽的DNA分子。根据一个实施方案，所述DNA分子包括选自SEQ ID NO：15-23、SEQ ID NO：30-35的序列。
根据另一方面，本发明提供了一种包括本发明DNA分子的载体，其中所述载体能够在原核宿主细胞或真核宿主细胞中表达突变体IFNα2多肽。
根据又一方面，本发明提供了一种包括本发明载体的宿主细胞。
根据另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包括作为活性成分的重组干扰素α2(IFNα2)多肽及其活性片段、类似物、衍生物以及变体且包括药学上可接受的载体，其中所述多肽包括选自氨基酸残基57-89的至少一个氨基酸取代、C末端氨基酸残基159-165的至少一个氨基酸取代及其组合的突变，其中所述多肽与野生型IFNα2(SEQ ID NO：2)相比具有提高的特异性激动活性或拮抗活性。
根据某些实施方案，所述药物组合物包括具有SEQ ID NO：5-13和SEQID NO：24-29任一者的重组干扰素α2(IFNα2)多肽及其片段、类似物、衍生物以及变体。
根据一个实施方案，所述药物组合物包括具有SEQ ID NO：5、7、8、10、11、12以及13任一者的重组干扰素α2(IFNα2)多肽及其片段、类似物、衍生物以及变体，其中所述多肽具有提高的特异性激动活性。
根据另一个实施方案，所述药物组合物包括具有SEQ ID NO：6和9任一者的重组干扰素α2(IFNα2)多肽及其片段、类似物、衍生物以及变体，其中所述多肽具有提高的特异性拮抗活性。
根据又一方面，本发明提供了一种治疗或预防与IFN的调节有关的疾病或病症的方法，所述方法包括给药于具有其需要的受治疗者治疗有效量的本发明药物组合物，其中所述疾病或病症选自癌症、自身免疫性疾病和感染性疾病。
根据一个实施方案，所述自身免疫性疾病是多发性硬化症(MS)。根据一个优选的实施方案，所述MS选自复发-缓解型MS、继发-进展型MS、原发-进展型MS以及进展-复发型MS。
根据某些实施方案，具有SEQ ID NO：5、7、8、10、11、12以及13任一者的IFNα2突变体可用于治疗或预防MS。
根据一个实施方案，所述癌症选自毛细胞性白血病、卡波济氏肉瘤、多发性骨髓瘤、慢性髓细胞性白血病、非何杰金氏淋巴瘤和黑素瘤。
根据另一个实施方案，本发明提供了一种抑制癌细胞生长的方法，所述方法包括将癌细胞暴露于具有SEQ ID NO：5、7、8、10、11、12以及13任一者的IFNα2突变体及其片段、类似物以及衍生物。
根据一个实施方案，所述感染性疾病是肝炎病毒感染。
根据某些实施方案，所述肝炎选自甲型肝炎、乙型肝炎以及丙型肝炎。
根据另一个实施方案，所述具有SEQ ID NO：5、7、8、10、11、12以13任一者的IFNα2突变体可用于治疗或预防感染性肝炎病毒感染。
根据又一个实施方案，本发明公开了与IFNα2表达增加有关的疾病的治疗或预防的方法，所述疾病包括但不限于胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)和系统性红斑狼疮(SLE)，所述方法包括给药于具有其需要的受治疗者具有SEQ ID NO：6和9的IFNα2突变体及其片段、类似物以及衍生物。
根据又一方面，本发明提供了本发明的IFNα2突变体用于制备治疗或预防与IFN的调节有关的疾病或病症的药剂的用途。
结合下文的附图、说明书以及权利要求书，本发明的这些和其他实施方案将变得显而易见。

附图简述
图1A-1C显示了通过IFNα2的亲和捕获和结合I型IFN受体-细胞外结构域(IFNAR1-EC)的固定作用。
图1A显示了捕获的IFNAR1与固定的mAb DB2的结合曲线，之后是与mAb AA3交联的结合曲线。
图1B显示了稳定态亲和力分析。IFNα2E58A(浓灰色)和E96A(淡黑色)以0.25和4μM之间的不同浓度(见图中的数字)与固定于表面的IFNAR1的结合。
图1C显示了实时追踪的IFNα2、IFNβ以及三突变体H57A，E58A，Q61A(SEQ ID NO：5)从表面固定的IFNAR1-EC的解离反应。解离速率直接与结合亲和力有关，数据总结于表1和3中。
图2显示了IFNAR1和IFNAR2与IFNα2结合的分析。将I型IFN相对于IFNα2进行比对。加下划线的残基为至Ala的突变体不改变与任何受体的结合的那些。上方的“+”和“-”标记表示当突变时突变是否引起IFNα2的结合亲和力增加或减少(见表1)。上方的数字表示改变是否由于与IFNAR1(1)或IFNAR2(2)结合的原因。IFNα8上的C末端残基用大写表示来标记SEQ ID 7中所做的改变。被框的残基为与SEQ ID 5-13有关的那些。
图3A-3B显示了IFNα2上结合IFNAR1的功能表位。
图3A显示了我们所分析的所有突变体蛋白质与IFNAR1和IFNAR2的结合亲和力改变的图表。
图3B显示了先前确定的IFNα2和IFNAR2的复合物模型的表面示意图。给出突变时改变与IFNAR1的结合的残基的编号。突变时增加结合亲和力＞2倍的残基标有下划线(57、58、61)。该图包括PyMol。
图4A-4C显示了IFN对WISH细胞的抗病毒和抗增殖反应的浓度依赖性。
图4A显示了当进行系列稀释的IFN(250nM-0.48pM的IFNα2和125nM-0.24pM的IFNβ)给药时抗增殖反应的一组原始数据。
图4B和4C显示了三个非依赖性抗增殖(4B)和抗病毒(4C)实验且还包括三突变体H57A，E58A，Q61A(SEQ ID NO：5)的光密度读数。数据为6个重复显示，包括标准差。曲线符合剂量反应方程，并表现了组合数据的最佳适合。
图5A-5B显示了IFN突变体的生物活性。
图5A显示了21IFNα2单突变体，三突变体H57A，E58A，Q61A(SEQ IDNO：5)，四突变体N65A，L80A，Y85A，Y89A(SEQ ID NO：6)、(SEQ IDNO：7)，三突变体H57Y，E58N，Q61S(SEQ ID NO：11)以及IFNβ的与相对抗增殖活性进行比较而标绘的相对抗病毒活性(与野生型相比)。
图5B显示了与其对于IFNAR1-EC的相对结合亲和力比较而标绘的相同蛋白质的相对抗病毒和抗增殖活性。所有数据均来自表1-4。直线表示生物活性和亲和力之间的理论关系。线上方的点为生物活性变化(抗病毒或抗增殖)比它们的亲和力变化弱的突变体，线下方的点相反。
图6A-6C显示了通过斑点寡核苷酸微阵列实验监测的IFN对基因表达的作用。对于不同的16小时长的IFN处理进行试验：0.3nM(1,000单位)野生型IFNα2；3nM(10,000单位)野生型IFNα2；0.3nM HEQ(SEQ ID NO：5)以及0.15nM IFNβ(1,000单位)。各条件通过在染色交换微阵列复制中对于IFN处理与未处理进行比较来表示。另外，包括未处理与另一个样品的未处理比较的微阵列实验的四个复制物表示无IFN处理作为对照。
图6A显示了根据倍数改变以升序标绘的395个基因的相对表达水平(与未处理相比)。
图6B显示了相对于添加0.15nM IFNβ时的表达水平标绘的表达水平。仅有的例外是未处理对照(黑点)的表达水平，其相对于第二组对照标绘，以评价随机的波动水平。
图6C显示了四个处理的IFN诱导的基因的聚类分析。IFNβ和HEQ(SEQ ID NO：5)的基因表达模式聚集在一起，它们之间具有非常短的距离。使用3nM野生型IFNα2聚类处理的细胞的表达次之，而0.3nM野生型IFNα2的基因表达更远。
本发明详细说明
本发明提供了与野生型IFNα2(SEQ ID NO：2)相比具有提高的激动活性或拮抗活性的IFNα2突变体及其活性片段、类似物、衍生物以及变体。本发明的突变体提供了提高的治疗效用，其包括选自提高的特异性或选择性，提高的作用持续时间、提高的稳定性以及更小的副作用的至少一种优点。
本发明还提供了包括IFNα2突变体的药物组合物，其可用于治疗或预防与IFNα2表达增加有关的癌症、多发性硬化症、感染性疾病和病症，例如胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)和系统性红斑狼疮(SLE)。
定义
术语“IFN(干扰素)”是指分泌性蛋白质家族，它们是具有抗病毒、抗原虫、免疫调节和细胞生长调节活性的细胞因子。最初通过其来源将IFN分为：白细胞IFNα1(SEQ ID NO：1)、IFNα2(SEQ ID NO：2)、成纤维细胞IFNβ(SEQ ID NO：3)以及免疫细胞IFNγ(SEQ ID NO：4)。特别受关注的是IFNα、IFNβ以及IFNγ。IFN α是白细胞产生的IFN的主要类型。
当提到本发明的改进的IFNα2多肽时，术语“类似物”、“片段”、“衍生物”以及“变体”意思是保留与改进的IFNα2多肽基本相似的功能性活性或基本相同的生物学功能或活性的所述改进的IFNα2多肽的类似物、片段、衍生物以及变体。
“类似物”包括这样一种改进的IFNα2多肽，即其中至少一个氨基酸被另一个氨基酸取代，产生与本文所列的多肽相比具有增加的活性、稳定性或较长的半衰期的本发明多肽的活性类似物。
“片段”是本发明的改进的IFNα2多肽的一部分，它保留与改进的IFNα2多肽基本相似的功能性活性或基本相同的生物学功能或活性，如本申请下文所描述的本文公开的体外测定中所显示的。
“衍生物”包括对于本发明的改进的IFNα2多肽的所有修饰，其基本保留本文所述的功能，且包括其他结构和伴随功能，如具有较长半衰期的聚乙二醇化多肽。
“变体”包括具有氨基酸序列的多肽，其包括本发明突变体IFNα2多肽的组合，所述多肽保留与原始突变体IFNα2多肽相比基本相似的功能性活性或增加的功能性活性。
“基本相似的功能性活性”和“基本相同的生物学功能或活性”分别是指当通过相同操作或测定来确定各多肽的生物活性时，其生物活性度在与之相比的多肽所表现的生物活性的约50％至100％之内或更多、更优选在80％至100％之内或更多以及更优选在约90％至100％之内或更多。
两种多肽之间的“相似性”通过将一种多肽的氨基酸序列与另一种多肽的序列进行比较而确定。如果具有同一性或是保守性氨基酸取代，其中一种多肽的氨基酸与另一种多肽的相应氨基酸相似。保守性取代包括下列参考文献中描述的那些：Dayhoff，M.O.，编辑，The Atlas of Protein Sequenceand Structure 5，National Biomedical Research Foundation，Washington，D.C.(1978)，和Argos，P.(1989)EMBO J.8：779-785。例如，属于下述组之一的氨基酸表示保守性改变或取代：Ala：-Pro，Gly，Gln，Asn，Ser，Thr：-Cys，Ser，Tyr，Thr；-Val，He，Leu，Met，Ala，Phe；-Lys，Arg，His；-Phe，Tyr，Trp，His；以及-Asp，Glu。
本文使用的关于本发明的IFNα2突变体的“特异性活性”是指IFNα2的生物活性或功能。IFNα2的生物活性或功能为本领域公知，包括但不限于抗增殖活性。所述特异性活性可使用本文所述的方法或使用本领域已知的任何方法测定和检测。
本文所使用的“提高的特异性活性”是指本发明的IFNα2组合物的特异性活性或拮抗活性大于对照的野生型IFNα2组合物的特异性活性或拮抗活性。如本文所述或本领域已知，本发明的IFNα2组合物的特异性活性可以使用测定和/或检测IFNα2特异性活性的方法与对照的野生型IFNα2组合物的特异性活性比较而进行分析。
“IFNα2组合物”是指IFNα2多肽及其片段、类似物、衍生物或变体，或包括IFNα2多肽及其片段、类似物、衍生物或变体的组合物(如药物组合物)。
术语“重组蛋白质或多肽”是指通过重组DNA技术产生的蛋白质或多肽，即从编码所需蛋白质或多肽的外源性重组DNA表达构建体转化的原核细胞或真核细胞(包括如微生物或哺乳动物细胞)产生的蛋白质或多肽。于大多数细菌培养物中表达的蛋白质或多肽通常无聚糖。酵母中表达的蛋白质或多肽具有与哺乳动物细胞中表达的蛋白质或多肽不同的糖基化形式。
本文所使用的“表达载体”是指当转化、转染或转导至宿主细胞中时，能够复制和表达感兴趣的基因的核酸分子。所述表达载体包括一种或多种表型选择性标记和复制起点，以确保载体的维持并且如需要提供在宿主中的扩增。选择性标记包括例如赋予抗生素抗性标记的序列(例如青霉素、四环素和卡那霉素抗性序列)，其可用于通过选择获得成功的转化体，或提供不能从复合培养基获得的关键营养素。合适的表达载体可以是衍生自例如pBR322的质粒或各种pUC质粒，它们可商购获得。其他表达载体可衍生自噬菌体、噬菌粒或粘粒表达载体，所有均描述于Sambrook等，(Molecular Cloning：A Laboratory Manual.第3版，2001，Cold Spring HarborLaboratory Press)的1.12-1.20部分。分离的质粒和DNA片段被切割、修剪以及以特定顺序连接在一起而产生所需的载体，如本领域公知(参见，例如Sambrook等，如上)。
术语“天然的”、“天然存在的”或“野生型”(wt)蛋白质或多肽是指从天然存在的来源中获得的蛋白质或多肽。术语“天然的IFN”或“野生型IFN”包括天然或野生型IFN，并包括IFN的翻译后修饰，包括但不限于乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂质化、酰化以及切割。
术语“重组表达载体或质粒”是可复制的DNA载体或质粒构建体，用于扩增或表达编码本发明的蛋白质或多肽的DNA。表达载体或质粒含有DNA调控序列和编码序列。DNA调控序列包括启动子序列、核糖体结合位点、多聚腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调节结构域以及增强子。本文所定义的重组表达系统经调节元件诱导时表达本发明的蛋白质或多肽。
术语“转化的宿主细胞”是指已经被外源性DNA转化和转染的细胞。外源性DNA可以被或不被整合(即共价结合)至构成宿主细胞基因组的染色体DNA。例如，在原核细胞和酵母中外源性DNA可保留在游离型元件上，例如质粒，或稳定整合至染色体DNA中。关于真核细胞，稳定转化的细胞是外源性DNA已整合至染色体中的细胞。该稳定性通过真核细胞系或克隆经复制产生含有外源性DNA的子代细胞群的能力来表现。
本文所使用的术语“引物”是指这样一种寡核苷酸，即无论是纯化的限制性酶切消化而天然存在还是合成产生的，当置于诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下能够作为合成的起点起作用，所述条件即在核苷酸和诱导剂如DNA聚合酶的存在下和合适的温度和pH。所述引物可为单链或双链并且必须足够长以在所述诱导剂的存在下引导所需延伸产物的合成。
“治疗有效量”是指本发明的改进的IFNα2多肽当给药于具有其需要的受治疗者时足够治疗疾病或病症的量。例如，用于与IFNα2表达增加有关的复发-缓解型多发性硬化症(MS)、癌症、感染性疾病或病症，例如胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)和系统性红斑狼疮(SLE)。
术语“受治疗者”是指人类受治疗者和非人类受治疗者。
术语“癌症”意于包括所有类型的癌性生长或致癌过程、转移组织或恶性转化的细胞、组织或器官，不考虑组织病理类型或侵袭阶段。癌症的实例包括但不限于实体瘤和白血病，包括：APUD瘤(apudoma)、迷芽瘤、鳃原瘤、恶性类癌综合征、类癌心脏症、癌(例如沃克癌、基底细胞癌、基底鳞状癌、布-皮癌、导管癌、艾氏癌、非小细胞肺癌、燕麦细胞癌、乳头状癌、细支气管癌、支气管原癌、鳞状上皮细胞癌以及移行细胞癌)、组织细胞疾病、白血病(如B细胞性白血病、混合细胞性白血病、无标记血细胞性白血病、T细胞性白血病、慢性T细胞白血病、人T细胞白血病病毒-II(HTLV-II)相关性白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、肥大细胞性白血病以及骨髓性白血病)、组织细胞增多病、何杰金氏病、免疫增生性小肠疾病(immunoproliferative small)、非何杰金氏淋巴瘤、浆细胞瘤、网状内皮组织增殖、黑素瘤、成软骨细胞瘤、软骨瘤、软骨肉瘤、纤维瘤、纤维肉瘤、巨细胞瘤、组织细胞瘤、脂肪瘤、脂肉瘤、间皮瘤、粘液瘤、粘液肉瘤、骨瘤、骨肉瘤、尤因肉瘤、滑膜瘤、腺纤维瘤、腺淋巴瘤、癌肉瘤、脊索瘤、颅咽管瘤、无性细胞瘤、错构瘤、间叶瘤、中肾瘤、肌肉瘤、成釉细胞瘤、牙骨质瘤、牙瘤、畸胎瘤、胸腺瘤、滋养层细胞瘤、腺癌、腺瘤、胆管瘤、胆脂瘤、圆柱瘤、囊腺癌、囊腺瘤、粒层细胞瘤、两性胚细胞瘤、肝癌、汗腺瘤、胰岛细胞瘤、睾丸间质细胞瘤、绒毛状瘤、睾丸支持细胞瘤、泡膜细胞瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、成肌细胞瘤、肌肉瘤、横纹肌瘤、横纹肌肉瘤、室管膜瘤、神经节瘤、神经胶质瘤、成神经管细胞瘤、脑脊膜瘤、神经鞘瘤、成神经细胞瘤、神经上皮瘤、神经纤维瘤、神经瘤、副神经节瘤、非嗜铬性副神经节瘤、血管角质瘤、嗜酸细胞增多性血管淋巴样增生、硬化性血管瘤、血管瘤病、血管球瘤、血管肉皮瘤、血管瘤、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、淋巴管瘤、淋巴管肌瘤、淋巴管肉瘤、松果体瘤、癌肉瘤、软骨肉瘤、囊性肉瘤、叶状瘤(phyllodes)、纤维肉瘤、血管肉瘤、平滑肌肉瘤、白血病性肉瘤、脂肉瘤、淋巴管肉瘤、肌肉瘤、粘液肉瘤、卵巢癌、横纹肌肉瘤、肉瘤(如伊文氏肉瘤、实验性肉瘤、卡波济氏肉瘤以及巨细胞肉瘤)、神经纤维瘤病、宫颈非典型增生，以及细胞变得永久性或被转化的其他病症。
本文所使用的“治疗MS”涵盖受治疗者的疾病状态的治疗，所述疾病状态的特征为与MS相关的症状，例如无力、麻木、震颤、视力丧失、疼痛、麻痹、平衡丧失、膀胱和肠机能障碍以及认知改变(原发性症状)、反复尿路感染、废用性虚弱、姿势调整和躯干控制欠佳、肌肉失衡、骨密度降低、呼吸浅无力以及褥疮(继发性症状)；以及抑郁(三级症状(tertiarysymptom))，并包括：(i)抑制疾病，即阻止其发展；或(ii)缓解疾病，即引起疾病复原。
术语“肝炎病毒感染”是指甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁丙型肝炎病毒或戊型肝炎病毒的一种或多种的感染，其中血源性肝炎病毒感染尤其令人关注。
如本文所使用，本文中可与“肝纤维变性”互换使用的术语“肝纤维化”是指在慢性肝炎感染过程中出现的肝脏中疤痕组织的生长。
本文所使用的术语“聚乙二醇化的IFNα2突变体”是指聚乙二醇修饰的IFNα2突变体的偶联物。优选的聚乙二醇-IFNα2突变体的偶联物为可逆性偶联物，其在生理条件下被缓慢转化为药物，例如根据WO2004089280所述的方法所制备的。其他IFNα2突变体偶联物可通过将IFNα2突变体与水溶性聚合物偶联而制备。此类聚合物的非限制性实例包括其他聚烯基氧化物均聚物，例如聚丙二醇、聚氧乙烯化多元醇、其共聚物和嵌段共聚物。作为基于聚烯基氧化物聚合物的替代物，也可以使用有效非抗原性物质例如葡聚糖、聚乙烯吡咯酮、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、基于碳水化合物的聚合物等。这些IFNα聚合物偶联物描述于美国专利No.4,766,106和美国专利No.4,917,888。
如本文所使用，“微阵列”是指附着于载体的多个分离的核酸分子或寡核苷酸探针，其中每个核酸分子或寡核苷酸探针在唯一的预选区附着于载体。术语“核酸”可与术语“多核苷酸”互换使用。术语“多核苷酸”是指核苷酸链。优选地，所述链具有约20至10,000个核苷酸，更优选约150至3,500个核苷酸。术语“探针“是指能够与基因转录物或其互补序列杂交而形成多核苷酸探针/基因转录物复合物的多核苷酸序列。
术语“基因“包括可被转录为RNA的区域，这是因为本发明考虑了RNA或其等同物(例如cDNA和cRNA)的检测。本发明的基因包括但不限于：特定生物过程特有或有关的和/或提示生物过程的基因，所述生物过程例如细胞凋亡、分化、应激反应、老化、增殖等；细胞机制基因，如细胞周期、信号转导、毒性化合物的代谢等；疾病相关基因，例如癌症、多发性硬化症、感染等有关的基因。例如，所述基因可为癌基因，其在细胞中的表达诱导该细胞从正常细胞转化成肿瘤细胞。基因的其他实例包括但不限于细胞因子基因、朊病毒基因、编码诱导血管发生的分子的基因、编码粘附分子的基因、编码细胞表面受体的基因、编码与转移和/或侵袭过程有关的蛋白质的基因、胰蛋白酶基因，以及调节细胞凋亡和细胞周期的分子的基因。
根据本发明，基因转录物的水平可通过使用半定量法如微阵列杂交或更多定量的方法例如定量qPCR检测基因转录物如RNA的水平来确定。
如本文所使用，术语“调节表达和/或活性”通常是指作用以控制或调节细胞成分的量或活性(功能性)的任何过程。静态调节以某种给定水平维持表达和/或活性。上调是指表达和/或活性的相对增加。因此，下调是指表达和/或活性的相对减少。下调与给定的细胞成分的活性的抑制同义。
本发明的改进的IFNα2多肽的特征
将三个单突变(H57A，E58A，Q61A)(SEQ ID NO：5)引入IFNα2，这与野生型蛋白质(SEQ ID：NO 2)相比，特异性增加了其针对IFNAR1受体的结合亲和力约30倍。本文所使用的称为HEQ的突变体IFNα2蛋白质的亲和力与对于IFNβ所检测的相似(表3)，大大超过任何其他IFN亚类。对于HEQ的生物活性的评价表明其获得IFNβ(SEQ ID NO：3)的非常相似的特征。因此，与野生型IFNα2(SEQ ID NO：2)相比，HEQ仅促进其抗病毒效能增加2倍，但促进其抗增殖效能增加24倍(表4)。
将另外两组突变引入IFNα2中与HEQ：H57M，E58D，Q61L(本文称为MDL，SEQ ID NO：10)和H57Y，E58N，Q61S(本文称为YNS，SEQ ID NO：11)相同的位置。两者的抗病毒活性均在野生型的3倍之内(表4)。然而，它们的抗增殖活性高于IFNβ的HEQ的抗增殖活性。对于MDL，其活性与野生型相比高40倍，对于YNS，其活性在WISH细胞中高160倍，在MDA231细胞中高70倍，这比对于IFNβ(SEQ ID NO：3)所检测的高3-7倍。
通过寡核苷酸微阵列实验检测HEQ(SEQ ID NO：5)的基因转录模式。HEQ基因活性比相同蛋白浓度的IFNα2高得多，与记录的IFNβ(SEQ IDNO：3)的基因活性相似。在疾病治疗中，YNS或HEQ与野生型IFNα2或IFNβ相比，可潜在地为更有效的药物。YNS和HEQ优于野生型IFNα2的优点在于其较大的抗增殖特异性，这有助于减轻副作用和治疗癌症或多发性硬化症。YNS的优点是其与IFNβ相比较高的抗增殖作用，特别是在人类乳腺癌细胞MDA231中所检测的。
本发明还提供了本文所使用的称为NLYY的四突变体N65A，L80A，Y85A，Y89A(SEQ ID NO：6)，其与野生型蛋白质相比抗增殖活性减小1000倍，抗病毒活性减小100倍，但仍旧以野生型亲和力结合IFNAR2(表2)。
本发明提供了IFNα2蛋白，其包括C末端ESLRSKE至KRLKSKE的取代(SEQ ID NO：7)，如本文使用的称为α8尾。将α8尾突变体改造成具有IFNα8的尾以使IFNα2和其受体IFNAR2之间的静电结合能最佳。结合检测显示α8尾突变体与野生型相比结合亲和力高18倍(表2)。α8尾突变体的抗病毒活性与野生型相比高3倍，抗增殖活性与野生型相比高10倍(表2)。
本发明的三种IFNα2突变体的特异性突变分别位于蛋白质的不同位置，并因此可组合产生另外或增加的作用。本发明提供了变体，其包括三突变体HEQ(SEQ ID NO：5)、MDL(SEQ ID NO：10)或YNS(SEQ ID NO：11)和C末端ESLRSKE至KRLKSKE的取代(SEQ ID NO：7)的组合。这些变体(SEQ ID NO：8、12以及13)可证明在治疗癌症中较有效，特别是因为它们的抗增殖活性增加。另外，它们的较高的结合能力可克服癌细胞中受体下调的问题。由于HEQ由三个至Ala的单点突变组成，并且α8尾突变体包括天然IFNα8的C末端取代IFNα2的C末端，特异性免疫原性应答的可能性小。
本发明还提供了一种对IFNAR2的结合亲和力增加但生物活性非常低的变体，其包括四突变体N65A，L80A，Y85A，Y89A和C末端ESLRSKE至KRLKSKE的取代的组合(SEQ ID NO：9)。该IFNα2变体是IFN拮抗剂，其通过IFN的受体阻断它们的天然活性。
本发明的改进的IFNα2组合物包括IFNα2突变体多肽或其片段、类似物、衍生物以及变体，它们比对照的野生型IFNα2组合物的特异性活性大至少2倍，优选至少10倍，更优选至少100倍，甚至更优选1000倍。在某些实施方案中，本发明的IFNα2组合物对于野生型IFNα2具有拮抗活性。
本发明的拮抗剂
IFNα拮抗剂被定义为能够在体内干扰IFNα生物活性的任何物质。不一定所述拮抗剂完全中和IFNα活性，而仅中和至足以在体内发挥IDDM或SLE治疗活性的程度。已知IFNα具有多种生物活性。本文所使用的拮抗剂可减轻、抑制或中和这些活性中的一种或多种。通常所述拮抗剂干扰IFNα的抗病毒、抗增殖或免疫调节活性中的至少一种(且优选所有)。
所述拮抗剂一般选自下列几类：IFNα受体的可溶形式，阻断IFNα与其受体结合或合适相互作用的抗IFNα受体抗体，能够结合并中和IFNα自身的抗体，与IFNα竞争受体结合位点但它们自身不表现明显的IFNα活性的非IFN多肽。本发明的拮抗剂为拮抗IFNα和IFNβ活性的IFNα的突变体。
IFNα2诱变
在特定位置改变氨基酸的作用可通过引入氨基酸取代和使用本文所述的测定检测改变的IFNα2多肽的生物活性来进行试验。可使用本领域已知的任何诱变技术，包括但不限于化学诱变，使用例如QuikChange定点诱变试剂盒(Stratagene)进行体外定点诱变等。例如丙氨酸扫描诱变的技术特别适于这种方法。
核酸
本发明进一步提供了编码本发明的改进的IFNα2多肽的核酸分子。
可使用重组DNA技术(如聚合酶链式反应(PCR)扩增、克隆)或化学合成产生核酸分子。核酸序列包括天然核酸序列及其同系物，包括但不限于天然等位基因变体和修饰的核酸序列，其中核苷酸以如下方式被插入、删除、取代和/或转化：即所述修饰不显著干扰核酸分子编码本发明重组IFNα2多肽的能力。
多核苷酸或寡核苷酸序列可从蛋白质的遗传密码推导，然而，必须考虑密码子的简并性，本发明的核酸序列还包括因遗传密码而具有简并性的序列，本领域普通技术人员可容易地确定所述序列。
本文所使用的术语“核酸”和“多核苷酸”是指寡核苷酸、多核苷酸或核苷酸及其片段或部分，以及基因组或合成来源的DNA或RNA，它们可以是单链或双链，并代表有义链或反义链。该术语还应理解为包括如由核苷酸类似物制备和适用于所述实施方案的RNA或DNA的等同物、类似物。
术语“寡核苷酸”是指具有至少约6个核苷酸至约60个核苷酸、优选约15至30个核苷酸以及更优选约20至25个核苷酸的核酸序列，其可用于PCR扩增或杂交测定，或微阵列。如本文所使用，“寡核苷酸”大体上等同于本领域通常定义的术语“扩增引物”、“引物”、“寡聚物”以及“探针”。
如本文所使用，高严谨条件是指能耐受达约5％至约25％、优选达约5％至约15％序列差异的那些条件。非限制地，高严谨条件(低于所计算的杂交物的Tm-10℃)的实例在低于所计算的杂交物的Tm的合适的Ti(温育温度)下使用0.1 X SSC(标准柠檬酸盐)和0.5％SDS的洗液。条件的最终严谨性主要取决于洗涤条件，特别是如果所使用的杂交条件为允许随同稳定杂交物一起形成较不稳定的杂交物的那些条件。然后较高严谨的洗涤条件去除较不稳定的杂交物。可与上述高严谨至中度严谨洗涤条件一起使用的普通杂交条件为在合适的Ti于6 X SSC(或6 X SSPE)、5 X Denhardt试剂、0.5％SDS、100μg/ml变性的鲑精DNA片段的溶液中杂交。(通常参见Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，ColdSpring Harbor Press(1989)对于合适的高严谨条件的描述)。
严谨条件为杂交实验和洗涤中使用的温度、杂交溶液和洗液中单价阳离子的摩尔浓度以及杂交液中甲酰胺的百分数的函数。通常，与探针杂交的敏感度受探针的量和特异性活性、靶核酸的量、标记的可检测性、杂交速率以及杂交的持续时间影响。对于DNA:DNA杂交物，杂交速率在低于Tm约20℃-25℃的Ti为最大，对于DNA:RNA杂交物，杂交速率在低于Tm约10℃-15℃的Ti为最大。约1.5M Na+的离子强度也使其最大化。所述速率与双链体长度成正比，与错配度成反比。
然而，杂交的特异性是所需杂交物和“本底”杂交物之间稳定性差异的函数。杂交稳定性是双链体长度、碱基组合物、离子强度、错配以及去稳定剂(如果有的话)的函数。DNA:DN杂交物的理想杂交的Tm可使用Meinkoth等(Anal Biochem.1984；138(2)：267-84)的方程式来估计。
改进的IFNα2多肽的表达与纯化
有几种在细菌尤其是大肠杆菌(E.coli)中表达和纯化重组人类IFNα2的方法，来获得具有提高的激动活性或拮抗活性的IFNα2多肽。已知的方法可用于在细菌中表达克隆基因。为在原核系统中获得克隆的真核基因的高水平表达，优选构建含有指导mRN转录的强启动子的表达载体。
适于该目的的调控区的实例为大肠杆菌β葡萄糖苷酶基因的启动子和操纵子区、大肠杆菌色氨酸生物合成途径，或噬菌体A的左侧启动子。大肠杆菌中所转化的DNA质粒中包括选择性标记也是有用的。所述标记的实例包括负责抗青霉素、四环素或氯霉素的基因。在原核细胞表达系统大肠杆菌中不发生翻译后修饰，例如糖基化。另外，具有复合二硫键连接模式的蛋白质当在大肠杆菌中表达时可被折叠。对于原核系统，所表达的蛋白质以不溶解形式存在于细胞质，存在于所谓的包涵体中，在细胞裂解后可见于可溶部分，或通过添加合适的分泌信号序列被定向至周质中。如果所表达的蛋白质在不溶解的包涵体中，通常需要包涵体的增溶和随后重折叠。
许多原核表达载体为本领域技术人员已知，并可商购获得，例如pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)，pKK233-2(Clontech，Palo Alto，CA，USA)，以及pGEM 1(Promega Biotech，Madison，WI，USA)。重组微生物表达系统中通常使用的启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖启动子系统(Chang，A.C.等，1978，Nature 275：617-624)、色氨酸(trp)启动子系统和Tac启动子(Sambrook，J.F.等，MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，N.Y.1989)。其他有用的细菌表达系统应用λ-噬菌体pL启动子和clts857温度诱导的阻抑物(Bernard等，1979，Gene 5：59-76)。
目前，使用下列方案：将编码IFNα2的基因克隆至基于pT7T3-18U质粒的双顺反子的表达载体，其中我们添加起始密码子上游的第二顺反子。第二顺反子是1pp 5`基因的最开始9个氨基酸，包括其侧邻XbaI和NdeI限制性酶切位点的SD位点。插入第二顺反子的原因是提高异源蛋白表达产量。另外，为了提高表达水平，将最开始的23个氨基酸的密码子改变成：TGT GAT CTG CCG CAG ACT CAC TCT CTG GGT TCT CGT CGTACT CTG ATG CTG CTG GCT CAG ATG CGT CGT(SEQ ID NO：14)。蛋白在BL21细胞中表达，于丰富培养基中过夜。IFNα2存在于包涵体中，所述包涵体溶于含有5mM DTT的8M尿素中。IFNα2通过20倍稀释过夜而重折叠。使用标准方法进行蛋白质纯化。蛋白质的通常产量为10mg/L细胞培养物。在SDS-PAGE上IFNα2跑出18kDa的单条带。
改进的IFNα2多肽的类似物及其片段、衍生物以及变体
本发明的改进的IFNα2多肽的类似物及其片段、衍生物或变体可为：(i)其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基取代的那些；或(ii)其中一个或多个氨基酸残基包括取代基的那些；或(iii)其中改进的IFNα2多肽与另一种化合物融合的那些，所述另一种化合物例如增加改进的IFNα2多肽的半衰期的化合物(例如聚乙二醇)；或(iv)其中另外的氨基酸与成熟的改进的IFNα2多肽融合的那些，所述另外的氨基酸例如前导序列或分泌序列，或用于纯化成熟的改进的IFNα2多肽的序列；或(v)其中改进的IFNα2多肽与较大的多肽融合用于增加作用持续时间的那些，所述较大的多肽即人类白蛋白、抗体或Fc。从本文的教导内容来看，认为所述类似物及其片段、衍生物以及变体在本领域技术人员的能力范围内。“保守性氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代的那些。具有相似侧链的氨基酸残基的家族在本领域中有定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(如天门冬氨酸、谷氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(如甘氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β支链侧链的氨基酸(如苏氨酸缬氨酸、异亮氨酸)以及具有芳香族侧链的氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸组氨酸)。对于保守性氨基酸残基或存在于保守性蛋白质结构域中的氨基酸残基不进行非保守性取代。片段或生物活性部分包括适于用作药剂、研究试剂等的多肽片段。片段包括含有足够相似于或衍生自本发明的改进的IFNα2多肽的氨基酸序列并表现所述多肽的至少一种活性但包括比本文所公布的全长多肽较少的氨基酸的肽。通常，生物活性部分包括具有所述多肽至少一种活性的结构域或基序。所述生物活性部分可合成和通过重组技术制备并可通过本文所公开和/或本领域公知的方法用于评价本发明的多肽的一种或多种功能性活性。
本发明的优选衍生物包括与另一种化合物融合的改进的IFNα2多肽，所述另一种化合物例如增加所述多肽的半衰期和/或降低所述多肽潜在免疫原性的化合物(例如聚乙二醇，“PEG”)。PEG可用于赋予水溶性、大小、减慢肾脏清除率以及降低对融合蛋白的免疫原性。参见，例如美国专利No.6,214,966。在聚乙二醇化的情况下，所述改进的IFNα2多肽与PEG的融合可通过本领域技术人员已知的任何方法实现。例如，可通过首先将半胱氨酸突变引入改进的IFNα2多肽然后使用PEG-马来酰亚胺进行位点特异性衍生来实现。半胱氨酸残基可添加至改进的IFNα2多肽的C末端。参见，例如Tsutsumi，Y.等，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：8548-8553。
本发明的改进的IFNα2多肽的变体包括具有足够与原始的改进的IFNα2多肽的氨基酸序列相似的氨基酸序列的多肽或其组合。所述变体包括由于诱变导致氨基酸序列不同的改进的IFNα2多肽。可通过筛选突变体的组合文库鉴定具有提高的活性的变体，例如本发明的改进的IFNα2多肽的平截或点突变体。
在一个实施方案中，变体的多样性文库通过核酸水平的组合诱变产生并通过多样性基因文库编码。变体的多样性文库通过例如酶催化将合成的寡核苷酸与基因序列连接而产生，使得一组简并的潜在变体氨基酸序列可作为单个多肽表达，或者作为一组其中含有所述组序列的较大的改进的IFNα2多肽表达(例如用于噬菌体展示)。有多种方法可用于自简并的寡核苷酸序列产生潜在的变体的文库。可于自动DNA合成仪中进行简并性基因序列的化学合成，并且然后将合成基因连接至合适的表达载体。简并组基因的用途使得以一种混合物形式提供编码所需组潜在变体序列的所有序列。合成简并性寡核苷酸的方法为本领域已知(参见，例如，Itakura，K.等，1984，Annu.Rev.Biochem.53：323-356)。
用于筛选通过点突变或平截制备的组合文库的基因产物和筛选cDNA文库的具有所选性质的基因产物的几种技术为本领域已知。所述技术适于快速筛选由改进的IFNα2多肽的组合诱变产生的基因文库的特异性活性。适于筛选大基因文库的高通量分析的最广泛使用的技术通常包括将基因文库克隆至可复制的表达载体、使用产生的载体文库转化合适的细胞，以及在下述的条件下表达组合基因，所述条件即其中所需活性促进编码其产物可被检测的基因的载体的分离的条件。一种增强文库中功能性突变频率的技术——回归总体诱变(Recursive ensemble mutagenesis，REM)，可联合筛选测定用于鉴定所需变体。
本发明的药物组合物
本发明还提供了可给药于患者以实现治疗作用的药物组合物。本发明的药物组合物可通过将具有所需纯度的药学有效量的改进的IFNα2多肽与药学上可接受的载体组合而制备用于给药。
本发明的改进的IFNα2多肽和药物组合物可用于胃肠外(例如静脉内、肌内和皮下)、表面、口服、可吸入或局部给药。
本发明的改进的多肽可以以药物组合物形式用于任何合适的给药方法，包括但不限于静脉、皮下、肌内或鞘内给药。因此，上述多肽优选与药学上可接受的无菌药物载体组合，例如5％葡萄糖、乳酸林格氏溶液、生理盐水、无菌水或任何其他被设计用于静脉输注的商业上制备的生理缓冲液。应理解载体溶液的选择以及所述组合物的剂量和给药根据受治疗者和具体的临床使用情况而不同，并受标准医学规程管理。
根据本发明的方法，这些药物组合物可以以有效抑制或缓解与MS、癌症、IDDM或SLE有关的病理结果或症状的量给药。
本发明的改进的IFNα2多肽可通过静脉快速浓注、通过持续静脉输注或通过两种途径结合来给药。可选地，或另外，与合适的赋形剂混合的改进的IFNα2多肽可经肌肉内部位被摄取至循环中。
明确地，多肽由于对胃酸或肠酶的消化易感而较不适于口服给药，然而，在某些实施方案中，特定的制剂可用于口服给药。
在制备口服液体剂型(如悬浮液、酏剂以及溶液)的组合物中，可使用通常的药物基质例如水、乙二醇、油、乙醇、调味剂、防腐剂、着色剂等。类似地，当制备口服固体剂型时(例如粉剂、片剂以及胶囊)，可应用载体诸如淀粉、糖、制粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。由于片剂和胶囊容易给药，它们表现为本发明药物组合物的理想口服剂型。
多肽较不适于局部给药，然而对于局部治疗可使用特定的制剂。
对于局部给药，本发明的改进的IFNα2多肽可使用温和、增加水分的基质配制，例如软膏或乳剂。合适的软膏基质的实例为凡士林油、凡士林油加硅酮、羊毛脂以及油包水乳剂。
对于通过吸入给药，根据本发明使用的IFNα2多肽可方便地采用从使用合适的推进剂的加压包装或喷雾器的气雾剂喷雾形式来递送，所述推进剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳。在加压气雾剂的情况中，可通过提供递送测定量的阀来确定剂量单位。可配制用于吸入器或吹入器的如明胶的胶囊和药筒，其含有所述肽和合适的粉末基质(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
本发明的改进的IFNα2多肽以及药物组合物可特别用于静脉内给药。用于给药的组合物通常包括溶于药学上可接受的载体、优选水载体的改进的IFNα2多肽的溶液。多种水载体可使用，例如缓冲盐水等。这些溶液为无菌并通常无不合乎需要的物质。所述组合物可通过传统的公知的灭菌技术进行灭菌。本领域普通技术人员可容易确定静脉给药的常用组合物。给药量明确地为蛋白质特异性并依赖于其效能和药代动力学类型。用于制备可胃肠外给药的组合物的实际方法为本领域技术人员已知或对他们来说是显而易见的，并较详细描述于像Remington′s Pharmaceutical Science，第18版，Mack Publishing Company，Easton，PA，1990的出版物中。
在治疗性治疗中，可进行含有本发明的改进的IFNα2多肽的组合物或其鸡尾酒形式(即具有其他蛋白质)的给药。在治疗性应用中，将足够治愈或至少部分阻止疾病的组合物给药于患有MS、癌症以及与IFNα2表达增加有关的疾病的患者。适于实现该目的的量被定义为“治疗有效量”。该用途的有效量取决于疾病的严重性和患者健康的一般状况。
所述组合物的单次或多次给药可根据患者所需和所能耐受的剂量和频率而给药。在任何情况下，所述组合物可提供足够量的本发明的改进的IFNα2多肽以有效治疗患者。通常，根据预期的给药模式，药学上可接受的组合物含有约1％至约99％(按重量)的本发明的改进的IFNα2多肽，以及99％-1％(按重量)的合适的药物赋形剂或载体。优选地，所述组合物具有约5％-75％(按重量)的本发明的改进的IFNα2多肽，其余是合适的药物赋形剂或载体。
本发明的改进的IFNα2多肽或其药学上可接受的组合物可以以治疗有效量给药，所述治疗有效量根据下列多种因素而不同：包括所应用的具体的改进的IFNα2多肽的特异性活性；改进的IFNα2多肽的代谢稳定性和作用时间；患者的年龄、体重、一般健康、性别和饮食；给药模式和时间；分泌速率；药物联合；具体疾病状况的严重性；以及经受治疗的宿主。通常，本发明的改进的IFNα2多肽每天的治疗有效剂量为每次给予约0.1μg至约1000μg/kg体重，优选，每次给予约0.5μg至约100μg/kg体重。例如，根据治疗方案，对于70kg人的给药，本发明的改进的IFNα2多肽的剂量范围为每次给予约10μg至约100μg。例如，如果本发明的改进的IFNα2多肽或含有所述多肽的制剂每天1至几次给药，那么较制剂每周、每月或更不频繁给药需要较低的剂量。
预期以合适的剂量进行本发明的改进的IFNα2多肽的给药。通常将剂量调整成处于或低于最大耐受剂量(MTD)。提示IFN毒性的体征记录为血液学毒性，贫血、血小板减少、白细胞减少；胃肠毒性，腹泻、消化不良、吞咽困难、N/V、腹痛；肝脏毒性，胆红素、碱性磷酸酶以及LFT增加；肾脏和膀胱毒性，显微镜性血尿、脓尿、氮质血症、蛋白尿(proteinuria)、急性肾功能衰竭、肾病综合征、糖尿、蛋白尿(albuminuria)；肺脏毒性，端坐呼吸、呼吸困难、支气管痉挛、咳嗽、肺水肿、ARDS；心脏毒性，晕厥、MI、SVT、心动过缓、心动过速、眩晕、血压过低、血压过高。神经毒性为思维混乱、震颤、麻木、感觉异常、肌收缩无力、嗜睡、幻觉、脑病、癫痫发作、昏迷、精神运动性阻滞、记忆障碍、口干燥、出汗、人格障碍、精神激动、神经病理、抑郁、焦虑、失语、具有视力丧失的视网膜梗塞、目痛、偏盲、味觉改变、头痛、晕厥、失眠。记录了皮疹、荨麻疹、表皮坏死、斑丘疹的皮肤毒性。代谢毒性表现为高血糖。另外，对于血凝固检测到PT/PTT增加。另外，咽炎、脱发、疲劳、倦怠、食欲减退、体重减轻、发烧、寒战、肌痛、关节痛、发绀为对IFN的潜在毒性反应。
治疗适应症
多发性硬化症(TMS)
两种形式的IFN，IFNβ1a和IFNβ1b，被批准用于治疗复发-缓解型MS。IFN-β也用于治疗生殖器疣。本发明的改进的IFNα2多肽可用于上述疾病、病症或疾患，并且还可用于治疗其他类型的MS，包括继发-进展型MS、原发-进展型MS以及进展-复发型MS。对于“可用于”是指所述改进的IFNα2多肽对于治疗疾病可用于治疗疾病，例如预防疾病，或预防疾病进展至较严重的状况，或缓解或减轻疾病症状或结果，例如MS。
癌症
尽管在癌症治疗中的许多进展、可大大减小癌症风险的公知的生活方式改变以及某些癌症提供的预警体征，但许多患者仍然发展癌症，对于癌症无提供治愈或显著缓解的任何合理希望的常规治疗可以使用。已知，IFNα2具有抗癌作用。
患有晚期癌症的患者可表现一种或多种下列的体征或症状：存在癌性肿瘤、疲劳、疼痛、肿瘤负荷的体力状态减少以及公知的与各具体癌症相关的症状。
为了实践本发明，以足够消除或至少缓解一种或多种体征或症状的量将IFNα2突变体给药于表现一种或多种上述体征或症状的患者。
肝炎病毒(HCV)感染
目前治疗HCV感染的疗法具有某些缺点。涉及经长期治疗期每天(QD)、每隔一天(QOD)或每隔两天(TIW)注射IFN-α的给药方案具有一种或多种下列缺点：(1)给药方案令患者感到不适，且在某些情况下，导致患者顺应性减小；(2)给药方案常与副作用有关，引起患者其他不适，且在某些情况下，导致患者顺应性减小；(3)给药方案导致血清IFNα浓度的“峰(Cmax)”和“谷(Cmin)”，在“谷”期间，病毒可复制和/或感染其他细胞，和/或突变；(4)在许多情况下，在早期病毒反应过程中病毒滴度的对数减少不足以影响最终导致病毒清除的持续的病毒反应。本发明可对治疗肝炎病毒感染的治疗潜在性的进展具有显著影响。
胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)
IDDM的病因是讨论得非常多的问题。似乎是多因素，包括遗传倾向和环境影响。已经鉴定了IDDM和由位于第6号染色体短臂的主要组织相容性复合物区编码的特异性HLA之间的紧密联系。主要的高危等位基因为DR3和DR4。被认为重要的环境影响包括病毒，并且几条证据支持该观点。某些致糖尿病的或相关的病毒(腮腺炎病毒、麻疹病毒、风疹脑心肌炎M病毒、柯萨奇病毒B以及rheovirus)在流行病学上与IDDM的发展有关并当接种至啮齿类动物时可引起糖尿病。致糖尿病病毒可直接感染培养的B细胞。另外，已从死于严重酮症酸中毒的患有新发病的IDDM的男孩的胰腺分离了柯萨奇病毒B4，并且该病毒产生实验动物的糖尿病以及受感染动物的B细胞的病毒抗原。IDDM患者的B细胞分泌αIFN，因此，本发明的拮抗剂IFNα2多肽可对IDDM的治疗潜在性的进展具有显著影响。
红斑狼疮(LE)
LE是自身免疫性疾病，引起对不同机体组织和部分的炎症和破坏，包括关节、肾脏、心脏、肺脏、脑、血管以及皮肤。LE的最常见的症状包括关节疼痛或肿胀(关节炎)、发烧、疲劳延长或极度疲劳、皮疹和肾脏问题。尽管LE的病因尚未知，但认为LE是由遗传、环境以及可能的激素因素组合而引起。LE的特征为疾病或发作期以及好转或缓解期。因此，LE的有效治疗的目标是预防发作、使器官破坏和并发症最小化，以及维持正常的机体功能。LE的常用处方药包括非类固醇类的抗炎症药物(NSAID)、扑热息痛、皮质类固醇类、抗疟药以及免疫调节药。由于目前可用的药剂的有限成功以及它们的潜在严重副作用，提供对于LE的可选有效治疗是重要的。
本发明的组合物可有效最小化和/或消除LE患者的各种症状。
现在已经大体描述了本发明，通过参考下列实施例将更容易理解本发明，所述实施例通过举例说明的方式而提供，且非意于限制本发明。
实施例
方法：
(i)定点诱变.如先前所述(Piehler，J.和Schreiber，G.1999，J.MoI.Biol 294，223-237)，通过使用高保真聚合酶pwo(Boehringer Mannheim)和pfu(Stratagene)使用含有突变密码子的18-21核苷酸引物进行表达质粒pT72Cα2的PCR扩增。在磷酸化和连接之后，将突变的质粒转化至大肠杆菌TG1细胞中。通过DNA测序鉴定含有突变的整个表达基因的序列。
(ii)蛋白表达和纯化.如先前所述(Piehler，J.和Schreiber，G.1999，J.MoI.Biol 289，57-67)，在大肠杆菌中表达IFNα2和IFNAR2-EC并通过离子交换和尺寸排除色谱法纯化。从280nm的吸光度检测蛋白浓度，对于IFNα2，ε280＝18070Cm-1M-1，对于IFNAR2-EC，ε280＝26500Cm-1M-1。如先前所述(Arduini，R.M.等，1999，Protein Science 8，1867-1877)在Sf9昆虫细胞中表达IFNAR1-EC并纯化。
通过SDS-PAGE在非还原条件下分析蛋白纯度。如先前所述(Piehler，J.和Schreiber，G.1999，J.MoI.Biol.289，57-67)，通过IFNAR2-EC的分析凝胶过滤测定所有突变体的活性IFNα2蛋白的浓度。对于配体结合研究，使用马来酰亚胺化学作用来位点特异性标记IFNα2和IFNβ。通过在HBS中温育2倍摩尔多的Oregon Green 488(OG488)马来酰亚胺(MolecularProbes)，直接在其自由半胱氨酸残基C17标记IFNβ。在掺入其他半胱氨酸残基(突变S136C)之后使用OG488标记IFNα2，所述其他半胱氨酸残基显示不影响与IFNAR1-EC或IFNAR2-EC的相互作用(Gavutis等，2005，Biophysical Journal 88(6)：4289-4302).
(iii)IFNα2-YNS突变体的生长和重折叠.在750ml烧瓶中培养大肠杆菌。将该细菌离心，使用30ml裂解缓冲液重悬浮，并进行细菌学声处理5次，每次30秒。在16,000rpm离心30分钟之后，将沉淀物(包涵体)重悬于～30ml triton洗液(0.5％triton，50mM Tris8以及100mM NaCl)中。在25,000g(于ss34sorval中14,500rpm)离心包涵体，并洗涤4-5次。最后一次洗涤使用含有100mM NaCl的50mM Tris(8.4)进行以去除triton。将纯化的包涵体于4℃轻搅拌下溶解于5ml的6M胍中约12小时。在25000g离心20分钟之后，保留上清液，并去除沉淀物。
对于重折叠，使用pH 9.3的0.8M精氨酸以1∶20稀释上清液，于涡漩振荡器上缓慢轻柔搅拌，并在20℃震荡2小时。在16,000rpm离心20分钟之后，使用Tris 7.4透析，通过离子交换色谱法纯化蛋白，获得：～5mg/L的纯蛋白。
(iv)结合亲和力的检测.通过反射计量干扰光谱法(RIfS)在流通条件下检测重组IFNAR1-EC和IFNα2之间的相互作用(Schmitt，H.M.等，1997，Biosens.和Bioelectron.12，809-816)。该方法在界面上将生物分子相互作用作为在薄二氧化硅层的明显光学厚度的变化进行检测。将与表面的结合作为干扰光谱的变化来检测。表面上1pm的变化对应于约1pg/mm2蛋白。应用于实时结合检测的另一种方法为通过使用ProteON(Biorad)的SPR(表面等离振子共振)。所有检测均使用HBS(20mM HEPES pH 7.5，150nM NaCl以及0.01％Triton X100)作用电泳缓冲液进行。IFNAR1受体亚单位与芯片表面的结合通过两种方法进行。在一种方法中，非中和性抗IFNAR1-EC mAb DB2通过氨基酸偶联化学作用经其暴露的氨基偶联至(氨基官能化葡聚糖AMD 500)表面。IFNAR1-EC被亲和捕获至表面，之后与第二mAb AA3交联。在另一种方法中，IFNAR1的His标记尾直接与芯片的NTA表面连接。用于检测IFN-IFNAR2-EC相互作用的方法的详细描述可见于(Piehler，J.和Schreiber，G.2001，Anal.Biochem.289，173-186)。对于弱结合，解离常数KD的确定从针对蛋白浓度标绘并根据质量作用定律确定的平衡反应获得。对于较紧密的结合相互作用，从比值k解离(koff)/k结合(kon)＝KD测定动力学速率常数并直接从平衡反应计算亲和力。
(v)抗病毒保护活性测定.将野生型和IFNα2变体的抗病毒活性作为抑制水泡性口膜炎病毒(VSV)对人类WISH细胞的细胞病变效应的作用进行测定(Evinger，M.等，1981，Arch.Biochem.Biophys.210，319-329)。将IFNα2突变体的相对活性作为与50％保护所需的野生型IFNα2的浓度相比50％细胞保护所需的浓度来检测。
(vi)抗增殖测定.如先前所述(Piehler，J.等，2000，J.Biol.Chem.275，40425-40433)，测定IFNα2对Daudi Burkitt淋巴细胞的抗增殖活性。使用IFN处理细胞60小时。然后基于四唑盐XTT分解为甲月替的色度检测使用细胞染色试剂盒(Biological Industries Co，Israel)测定活细胞的数量。通过将不同浓度IFN添加至生长培养基实施对WISH细胞的抗增殖测定，在通过龙胆紫染色72小时之后检测细胞密度。
(vii)误差.于RIfS上检测的IFNα2-IFNAR2结合的KD的误差(σ)为20％，相对亲和力(wt/mut)为30％。对于IFNα2-IFNAR1，KD的误差(σ)为35％，相对亲和力(wt/mut)为50％。使用2σ(95％置信度)作为基础置信水平，这表明2倍变化的最小值可看作是显著的。各生物活性检测值(不管是抗病毒或抗增殖)的误差(σ)大小为35％。因此，两个检测值之间的2σ置信水平表明小于2倍的差异在实验误差范围内。
(viii)斑点寡核苷酸微阵列实验.含有几乎19,000个不同探针(Compugen人类寡核苷酸组)的聚L赖氨酸包被的玻璃微阵列购自CAG(Center for Applied Genomics，New Jersey)。使用包括青色素(Cy)3或Cy5标记的cDNA探寻表示IFN处理与未处理(对照)比较的微阵列。使用不同IFN处理WISH细胞16小时，并提取它们的RNA(RNeasy Midi kit，Qiagen)，使用于核苷酸混合物中aa-dUTP与dTTP以4∶1比值混合的氨烷基修饰的dUTP核苷酸将其中100μg RNA经受逆转录(M-MLV H-点突变体RT酶，Promega)。使用结合aa-dUTP的NHS激活的Cy3或Cy5荧光探针(Amersham)标记产生的cDNA。评价掺入(NanoDrop分光光度计)，并以100μl目标体积将标记的cDNA与等量的荧光染料(各自100pmol)混合(使用一种颜色处理并使用另一种颜色作为对照)于最终的2X SSC，0.08％SDS和6μl封闭液(Amersham)，在95℃退火3分钟，冷却并在凸起的盖玻片(LifterSlip，Erie Scientific Company)和微阵列之间应用。于暗处中55℃进行杂交12小时。之后，于55℃在2X SSC，0.5％SDS中洗涤玻片5分钟，于室温在0.5X SSC中洗涤5分钟，最后于室温在0.05X SSC中洗涤5分钟。然后，通过在1000rpm旋转3分钟干燥，并于暗处储存直至扫描。
(ix)微阵列图像和数据分析.使用DNA微阵列扫描仪(Agilent)进行杂交微阵列扫描。使用SpotReader(Niles Scientific)软件进行自动斑点检测、本底扣除和强度定量。使用GeneSpring(SiliconGenetics)软件进行数据标准化、过滤和聚类分析。所述分析基于对各斑点的处理与对照的比值，并包括诸如相对于本底(噪音)的SpotReader输出标志的数据过滤(信号性质的指示)的操作。通过两个染料交换微阵列重复表示各处理(条件)。通过在至少两个条件中超过1.7阈值的基因整合起始系列的调节IFN的基因，其仅耐受一个“缺乏”(“A”)标志，提示在每个基因的所有条件中的“噪音”斑点。在了解于超过一个IFN处理中观察到真实的上调或下调之后选择该标准，因此，选择两个条件作为最小值，低严谨阈值有必要包括以较低水平修饰的ISG。
将这些基因的系列输出成Excel工作表，并含有平均处理与对照的比值、复制值、t检验p值，t检验p值是基于复制物和标志密码子之间的距离对于微阵列技术误差的估计值。然后，通过比较各对复制物之间以及条件之间的距离，并观察p值和“A”标志的存在，肉眼扫描基因的显著性差异。因为每个条件产生的低量复制物的较大噪音，统计选择使得上调/下调清楚显现，该费事的分析是必需的。认为超过1.7阈值的平均值不是真正的调节，而是技术噪音，并且因此将该基因从该系列排除，所述平均值具有其复制物之一在该阈值以下，或相对于平均值具有较大的复制物之间距离，以及无其他条件具有相似和显著水平。最后一列包括395个基因，在处理16小时被IFN上调或下调。在将该系列输入回GeneSpring之后对其进行聚类分析。
实施例1使用光学生物传感器系统对IFNα2-IFNAR1-EC相互作用进行表征
使用RIfS通过无标记固相检测研究IFNAR1-EC与IFNα2的相互作用。该技术需要相互作用的化合物之一固定于芯片表面。使用了先前成功应用于IFNAR2-EC的方法，其中使用自身经由氨基偶联固定于表面的mAb固定受体(Piehler，J.和Schreiber，G.2001，Anal.Biochem.289，173-186)。将非中和的抗IFNAR1-EC mAb DB2经其暴露的氨基偶联至氨基官能化的葡聚糖AMD 500表面。IFNAR1-EC在与第二mAb AA3交联之后被亲和捕获至mAb表面。如下实时RIfS中的过程示于图1A。通过以0.12 to 4μM范围的浓度注射IFNα2蛋白来检测IFNAR1-EC与RIfS表面的结合活性。由于IFNα2与IFNAR1-EC的低结合亲和力，不能检测到结合和解离的动力学数据。因此，通过根据质量作用定律标绘稳定态反应与蛋白浓度检测结合亲和力。这导致野生型IFNα2的亲和力常数为1.5μM(Lamken，P.等，2004，J Mol Biol 341，303-318)。
实施例2制作IFNα2对于IFNAR1的结合位点的图谱
为了对IFNα2上IFNAR1的结合位点进行定位，进行了位于B和C螺旋上的大多数残基的Ala扫描(图2和3)。共产生了21个单点突变，通过RIfS或ProteON检测它们对IFNAR2和IFNAR1的结合亲和力。由于突变位于IFNα2上的IFNAR2结合位点相对表面，不同突变体蛋白对IFNAR2的结合亲和力与野生型IFNα2对IFNAR2的结合亲和力非常相似(表1)。这是令人确信的，因为它证实了所有突变体蛋白的合适折叠及它们的活性浓度。尽管IFNα2与IFNAR2-EC的结合提供了明确的动力学信号，其对IFNAR1-EC的结合较弱，并不得不通过变化配体的浓度根据稳定态亲和力的折射单位(RU)信号进行分析。在该情况下，所有IFNα2蛋白的正确和精确的浓度的知识是必需的。因此，对于所有突变体蛋白浓度在分析性凝胶过滤柱上通过其结合IFNAR2-EC的能力进行了证实。所有结合检测结果总结于表1和3以及图3A.。三种单突变(H57A、E58A、Q61A)引起结合的增加，而6种突变(F64A、N65A、T69A、L80A、Y85A、Y89A)引起结合减少。然而，没有鉴定到结合的热点，因此没有突变导致亲和力超过5倍的变化。为了确证单突变作用，制备了含有单突变L80A，Y85A，Y89A的三突变体(本文称为LYY)以及四突变N65A，L80A，Y85A，Y89A(SEQ ID NO：6)(本文称为NLYY)。这两种突变体蛋白的结合低于检测的阈值。
表1：突变体IFNα2(B和C螺旋以及C-D环)与IFNAR2-EC和IFNAR1-EC的相互作用的热力学和动力学常数

实施例3IFNα2突变体的抗增殖和抗病毒活性
将抗病毒活性作为水泡性口膜炎病毒(VSV)对于WISH细胞(人类羊膜起源的上皮细胞系)的细胞病变效应来进行测定。将抗增殖活性作为细胞生长的50％抑制检测了对于WISH细胞和Daudi细胞的抗增殖活性(如方法部分所描述)。图4A显示了应用系列稀释浓度的IFNα2和IFNβ72小时WISH细胞染色之后表现的强度有关的结果，从该结果可推导出IFN促进抗增殖作用的浓度。扫描培养孔以进行光密度分析，并将结果与所应用的蛋白浓度进行比较来标绘(图4B)。进行相同的处理来检测IFN对WISH细胞的抗病毒效能(图4C)。从IFN剂量反应曲线(方程1)推导50％的活性点以及活性变化率(斜率)。
y＝A0+A/(1+(c/c50)s)        [方程1]
其中y是与细胞数量有关的透射率，A0是偏移，A是变幅，c是浓度，C50是给出50％活性的浓度，s是斜率。促进50％抗病毒保护的IFNα2和IFNβ的平均浓度分别为0.85和0.43pM(平均经6次实验)。促进50％抗增殖活性的IFNα2和IFNβ的平均浓度为1360和29pM(分别平均经17和7次实验)。有趣的是，促进Daudi细胞中50％抗增殖活性的IFNα2浓度仅0.5pM(表2)，这低于对WISH细胞所检测的1000倍，证明使用相同细胞系进行所有实验的重要性。
对于所有IFN突变体蛋白的抗病毒和抗增殖活性相对于野生型IFNα2(野生型/突变体)的抗病毒和抗增殖活性进行了检测，结果总结于表2和4中。如从对于IFNAR1-EC的结合亲和力可见到的，抗病毒和抗增殖活性不显著改变突变。引起抗病毒活性显著减小(＞2倍)的唯一突变体为E58A。L80A、Y85A以及Y89A引起抗病毒活性显著减小(但无一超过6倍)。然而，LYY和NLYY突变体组合分别减小抗病毒效能30和100倍。该减小大致符合单突变的累加效应(对于LYY，0.5×0.26×0.20＝0.029，与三突变体所获得的结果相似)。对相同组的突变体的抗增殖活性的作用较显著，E58A和Q61A均引起活性显著增加，而N65A、T69A、L80A、Y85A以及Y89A引起活性显著减小。另外，在使用WISH细胞的抗增殖测定中检测的活性减小的程度显著大于对于抗病毒保护所检测的。多重的LYY和NLYY突变体分别减小活性190和1100倍。在该情况下，单突变过高估计了对于多重突变体检测的作用约30倍(对于LYY，0.14×0.035×0.044＝0.00022，实验检测值0.0057；对于NLYY，0.16×0.14×0.035×0.044＝0.000035，实验检测值0.00092)。对于所有突变体的抗病毒和抗增殖分析结果绘于图5A。方便起见，我们还添加了IFNβ的检测值。从该曲线图可看出对特异性IFNα2突变体的抗增殖反应较抗病毒反应更为敏感。另外，该倾向符合IFNβ的数据，IFNβ的抗病毒活性比IFNα2的抗病毒活性高约2倍(与E58A突变体的抗病毒活性相似)，而其抗增殖活性高～50倍。将生物活性与所检测的对于IFNAR1的结合亲和力进行比较，显示两种活性均大致与结合亲和力成比例，但不超过整体比例(图5B)。
表2：IFNα2突变体的生物活性

实施例4与IFNα2相比HEQ增强三元复合物的稳定性
由于发现Ala的三种突变可增加结合2至4倍，将这三种IFNα2突变(H57A、E58A、Q61A)组合成单个IFNα2突变体蛋白，如本文所使用，称为HEQ(SEQ ID NO：5)。
通过总体内反射荧光光谱法(TIRFS)研究IFN与I型干扰素受体细胞外结构域(IFNAR1-EC)的结合以及与包括IFNAR1-EC和IFNAR2-EC的三元复合物的结合。IFNAR2-EC和IFNAR1-EC通过它们的C末端组氨酸标签连接至固体支持的脂质双层上。通过TIRFS检测的野生型IFNα2、HEQ以及IFNβ自IFNAR1-EC的解离动力学在图1C中进行比较。观察到与IFNα2相比，HEQ的复合物寿命增加20倍，并观察到IFNβ的相似解离动力学(表3)。相比之下，对于所有这三种均获得了非常相似的解离速率常数。从这些数据，确定了HEQ/IFNAR1-EC复合物的平衡解离常数KD＝83nM，YNS/IFNAR1-EC复合物的KD＝33nM，野生型IFNα2/IFNAR1-EC复合物的KD＝1.6μM，IFNβ/IFNAR1-EC复合物的KD＝66nM。HEQ与IFNAR2-EC的结合亲和力与对野生型IFNα2(5nM)所检测的相似，比IFNβ与IFNAR2-EC的结合亲和力弱约10倍(表3)。因此，仅HEQ对于IFNAR1的亲和力与IFNβ的相似，但对于IFNAR1的亲和力与IFNβ的不相似。
IFN通过以1∶1∶1化学计量形成三元复合物(IFNAR1-IFN-IFNAR2)诱导生物活性。因为协同结合两个结合表面的受体亚单位，明显的配体结合亲和力较仅结合IFNAR2的结合力高，并且依赖于相对和绝对的受体表面浓度(Lamken，P.等，2004，J Mol Biol 341，303-318)。三元复合物通过增加对于IFNAR1的亲和力而稳定性增加可通过配体解离动力学来探寻。因此，以化学计量比值在不同浓度的IFNAR1-EC和IFNAR2-EC比较IFNα2(SEQID NO：2)、HEQ(SEQ ID NO：5)、YNS(SEQ ID NO：11)、α8尾(SEQ ID NO：7)以及IFNβ(SEQ ID NO：3)的解离。对于IFNβ，使用I47A突变体检测对于IFNAR2的作用，其以5nM亲和力结合IFNβ，类似于IFNα2与野生型IFNAR2的亲和力(表3)。这仅比较了IFNAR1表面浓度对配体解离的作用。而对于IFNα2，解离动力学显著依赖于受体表面浓度，观察到IFNβ和HEQ的上面的解离曲线。这明确证明了与FNβ和HEQ形成的三元复合物的较高稳定性。即使在最高的受体浓度(大于1000受体/细胞的细胞受体浓度)，也观察到野生型IFNα2的解离较最低受体浓度的IFNβ和HEQ的解离快。然而，如果受体表面浓度进一步增加，最终野生型IFNα2以与IFNβ或HEQ可比的速率解离。三元复合物的稳定性为表面受体浓度和对各受体的结合亲和力的组合函数。假定三元复合物的稳定性与生物活性有关，那么较紧密结合的IFN的差异活性可天然(像在Daudi细胞中)或由于转染而隐含在具有高受体数量的细胞内并不令人惊讶。这还凸显了通常被忽视的问题，即以非天然水平使用细胞表面受体转染细胞的危险性。
表3：野生型IFNα2、IFNβ以及IFNα2突变体与IFNAR1-EC和IFNAR2-EC的相互作用的速率常数和亲和力

a使用Oregon Green 488马来酰亚胺进行位点特异性标记的突变体S136C
b使用Oregon Green 488马来酰亚胺在自由C17残基位点进行位点特异性标记的
c与IFNAR2-EC I47A相互作用
实施例5IFNα2突变体HEQ、MDL、α8尾以及YNS的抗病毒和抗增殖活性
已经注意到与IFNα2相比IFNβ对WISH细胞的抗病毒效能仅高2倍，而其抗增殖活性高约50倍。图4B-4C显示了野生型IFNα2、HEQ(SEQ IDNO：5)以及IFNβ的抗病毒和抗增殖活性。在该测定中，HEQ的活性谱与IFNβ的活性谱具有可比性。尽管HEQ对IFNAR1的结合亲和力大大增加，但其抗病毒效能比野生型IFNα2的抗病毒效能仅高2倍。其抗增殖活性增加～25倍，相比之下，IFNβ的抗增殖活性增加42倍(表4)。相同的倾向对于MDL(SEQ ID NO：10)和YNS(SEQ ID NO：11)也是真实的。而它们的抗病毒活性大致是IFNα2的抗病毒活性，它们的抗病毒活性较高。MDL表现与IFNβ相同的活性水平，而YNS表现甚至更高的抗增殖活性水平。抗增殖活性增加与这两种IFN对IFNAR1的亲和力增加是一致的。如先前所注意到的，与IFNα2相比IFNβ似乎能更快速阻止生长。因此，应用高浓度IFN之后的细胞计数比应用IFNβ之后的细胞计数小。该现象不能通过使用较高浓度的IFNα2而补偿，而是性质上的差异(图4B)。在该方面，HEQ和YNS象野生型IFNα2一样起作用，但与IFNβ不同。HEQ的滴定曲线斜率(与依赖浓度的起始有关)在野生型IFNα2和IFNβ两者之间。
表4：野生型IFNα2、突变体以及IFNβ的相对生物活性

实施例6使用基因芯片技术监测基因活性
基因芯片已经成为获得差异基因活性的完整信息的标准技术。确实，已经进行了许多研究来探究IFN诱导时的基因表达模式(de Veer，M.J.等，2001，J Leukoc Biol.69，912-920)。通过斑点寡核苷酸微阵列实验监测IFN对基因表达的作用。使用0.3nM IFNα2、3nM(10,000单位)IFNα2；0.3nMHEQ以及0.15nM IFNβ(1,000单位)处理WISH细胞16小时。选择WISH细胞中产生＞90％抗增殖反应(3nM野生型IFNα2、HEQ以及IFNβ)或低于10％抗增殖反应(0.3nM野生型IFNα2)的浓度。在各条件下，在染色交换微阵列重复中进行IFN处理与未处理比较的实验。另外，包括未处理与与未处理比较的的四重复的微阵列实验用作另外的对照。两种颜色之间的标准化比值作为诱导水平。用于确定IFN的调节基因系列的选择标准描述于方法部分。
基因芯片结果可基于每个基因的基础进行分析，或观察基因诱导的一般倾向。图6给出了使用IFNβ(0.15nM)、HEQ以及野生型IFNα2(分别0.3nM和3nM)处理后16小时对于395个调节IFN的基因的表达水平变化所记录的倾向概况。在图6A中，根据倍数变化以升序标绘395个基因的相对(与未处理的比较)表达水平。黑色斑点为对照芯片，其含有于两个颜色通道上仅未处理的样品的混合物。这提供了预期的随机变异的估计值。所记录的对照芯片的表达水平的最小和最大变化为0.65-1.6倍，最多95％的基因的两个通道之间的比值仅0.75-1.4倍。基因表达的低水平随机变异提供了数据性质的高置信度。通常，IFNβ(0.15nM)和HEQ(0.3nM)的基因表达水平相似(图6A)，而对于野生型IFNα2(0.3nM)记录了较低的诱导水平。添加3nM野生型IFNα2时的基因诱导在所记录的野生型IFNα2(0.3nM)和IFNβ(0.15nM)或HEQ(0.3nM)的水平之间。分析差异表达水平的可选方法是标绘不同处理之间基因活性的变化比值(图6B)。由于IFNβ诱导最大变化，相对于IFNβ诱导计算了所有其他数值。对照与图6A中的相同。另外，IFNβ和HEQ似乎诱导了所有基因的相同水平的变化(绿色线在作为对照的黑色线之后)。这意味着当使用IFNβ诱导时与HEQ相比单基因作用并非显著不同。这个惊人的结果表明这两种IFN如此相似。发现IFNβ和野生型IFNα2(0.3nM)之间的最大差异表达。另外，野生型IFNα2(3nM)的结果在所记录的野生型IFNα2(0.3nM)和HEQ的结果之间。
对四种处理进行的IFN诱导的基因的聚类分析给出图6A和6B中图示的结果的独立证实。图6C显示了IFNβ和HEQ聚集一起的基因表达模式，它们之间具有非常短的距离。使用3nM野生型IFNα2聚类处理的细胞的表达次之，而0.3nM野生型IFNα2的基因表达更远。基因表达模式与观察到的INFβ和IFNα2之间的差异生物活性极其一致，并且还表明HEQ是具有IFNβ的所有特征的IFNα2。
基因芯片提供了包括基因组的各基因的表达水平的详细信息。分析IFNβ与野生型IFNα2相比的基因表达模式的最令人感兴趣的方面之一是研究差异活性，以及差异活性和IFN浓度之间的关系(Der，S.D.等，1998，Proc Natl Acad Sd U S A 95，15623-15628)。从395个被诱导的基因中，根据不同处理之间它们的差异活性水平选择59个上调的基因和9个下调的基因(Jaitin等，2006，Mol Cell Biol 26(5)：1888-1897，表3)。
IFNβ和HEQ(SEQ ID NO：5)对大多数基因表达的作用比IFNα2以同等抗病毒活性浓度(即分别0.15和0.3nM)诱导的作用强得多，所述基因包括许多未受0.3nM浓度的IFNα2影响的基因。
实施例7MDA231肿瘤预防模型
为了建立皮下(s.c.)肿瘤，将MDA231细胞体外培养至70％汇合，使用胰蛋白酶消化，并以108个细胞/ml的浓度悬浮于PBS，并将107个细胞皮下注射至裸鼠的胁腹。然后将小鼠随机分配成3个处理组，每组6只。处理方案从第1天开始，并持续至第34天。对小鼠使用PBS皮下注射或使用特定处理1周两次，共34天。在处理34天后，处死小鼠，切除肿瘤并测定肿瘤大小。结果总结于表5中。结果明确表明与组织培养实验一致，YNS在体内非常有效地抑制了MDA231乳腺癌细胞的生长。在使用YNS处理34天后，所有使用YNS处理的小鼠的肿块清除，而5/6的IFNα2处理的小鼠和所有6只PBS处理的小鼠具有不同大小的肿块。
表5：MDA231肿瘤预防模型的结果

实施例8：实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)
实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)，也称为实验性变应性脑脊髓炎，是多发性硬化症(MS)的动物模型。各种EAE模型为本领域中已知，其依赖于诱导方法、动物品系以及用于诱导该疾病的抗原。EAE是急性或慢性复发获得性炎症和脱髓鞘自身免疫性疾病。不同形式的EAE与各种形式和时期的MS非常相似。
在目前研究中，通过注射髓磷脂碱蛋(MBP)诱导EAE，这是一种已知建立急性期MS模型的方法。在该模型中，通过诱导后约10天出现临床症状观察到疾病的发病。在疾病诱导后约第15天观察到疾病进展和临床评分增加，并在疾病诱导后约第23天观察到自发恢复。
给雌性Lewis大鼠(平均体重130-180g，Harlan，Israel)的后爪皮下注射于0.1ml完全福氏佐剂(Difco)中乳化的25μg纯化的豚鼠髓磷脂碱蛋白(MBP，Sigma)。根据12小时光亮/12小时黑暗方案，在22℃的恒温下维持这些动物，使其随意摄入食物和水。从诱导后第8天开始，每天随访这些动物。结果记录为临床评分：0分表示无临床体征的正常动物，0.5分表示尾巴末梢部分丧失张力，1分表示整个尾巴瘫痪，1.5分表示一条后腿无力，2分表示两条后腿无力，2.5分表示一条前腿无力，3分表示四条腿均瘫痪，4分表示身体完全瘫痪和濒死状态，5分表示死亡。在疾病发病后～15天，记录动物的临床评分，直至诱导后研究的25天结束，在该期间计算曲线下面积(AUC)。
从疾病发病开始连续3天，使用HEQ(SEQ ID NO：5)、YNS(SEQ IDNO：11)或载体对照处理可临床评分为0.5和1之间的表现疾病临床症状的动物(在疾病诱导后的～第9-11天)。评价几条给药途径，例如以5ml/kg的体积剂量静脉内(于载体中)或通过强饲口服(于载体中)给药。在研究(约第25天)的最后一天，使用戊巴比妥钠100mg/kg腹膜内注射对动物实施安乐死。
结果表示为平均值±SEM，并通过方差分析(ANOVA)然后通过杜凯氏事后检验(Tukey′s post hoc test)分析处理组之间的差异。认为p＜0.05的值是统计学上显著的，在相关处理组数字上标记星号。
使用甲泼尼龙作为阳性对照建立模型的有效性。当通过MBP注射诱导疾病那天开始以30mg/kg静脉内进行连续5天的类固醇给药时，记录了AUC减小34％。
实施例9系统性红斑狼疮(SLE)的动物模型
雌性(NZB X NZW)F1杂种小鼠(下文称为“NZB/W”小鼠)自发发展狼疮样疾病，其特征是存在双链DNA(dsDNA)的血清自身抗体。最终经历完全肾脏衰竭的这些小鼠，常用作旨在更好理解和治疗人类狼疮的实验模型。NZB/W小鼠的该疾病随时间进展为肾脏功能障碍，表现为出现蛋白尿。
32周龄的雌性NZB/W小鼠用于实验中以确定NLYY(SEQ ID NO：6)是否能延迟狼疮样疾病的发展。将这些小鼠分成两组，每隔1天使用NLYY(10只小鼠的组)或作为对照的大鼠IgG(10只小鼠的组)通过腹膜内注射给药对各组进行处理。处理持续5周，并且每周评定小鼠蛋白尿的存在。
先前对于具体实施方案的说明完全公开了本发明的一般性质，对此其他人在无不适当的实验和不背离一般概念的情况下可通过应用当前的信息容易地修改和/或改变所述具体实施方案以用于不同应用，且因此，所述改变和修改应该并意于包括在所公开的实施方案的等同物的含义和范围内。尽管已经结合其具体实施方案描述了本发明，但应该清楚许多替代、修改和变化对于本领域技术人员来说是显而易见的。因此，意于包括落在附属权利要求精神和宽范围内的所有所述替代、修改和变化。
应理解表明本发明优选实施方案的详细说明和具体实施例仅通过举例说明的方式给出，这是因为从所述详细说明来看，本发明精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员来说是显而易见的。
序列表
<110>耶达研究与发展有限公司
吉迪昂·施雷伯
莱拉·C·罗伊斯曼
迭戈·亚伊丁
伊亚尔·卡列
<120>重组干扰素α2(IFNα2)突变体
<130>耶达058PCT
<160>35
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>166
<212>PRT
<213>IFNa1
<400>1
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile
1               5                   10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Pro Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe
        35                  40                  45
Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Thr Trp Glu Gln Ser
65                  70                  75                  80
Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Asn Gln Gln Leu Asn Asp Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
            100                 105                 110
Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Lys Ile Phe Gln Glu
145                 150                 155                 160
Arg Leu Arg Arg Lys Glu
                165
<210>2
<211>165
<212>PRT
<213>IFNa2
<400>2
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met
1               5                   10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln
        35                  40                  45
Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe
    50                  55                  60
Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu
65                  70                  75                  80
Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu
                85                  90                  95
Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys
            100                 105                 110
Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu
        115                 120                 125
Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg
    130                 135                 140
Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser
145                 150                 155                 160
Leu Arg Ser Lys Glu
                165
<210>3
<211>165
<212>PRT
<213>IFNb
<400>3
Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln Cys
1           5                   10                  15
Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu Lys
            20                  25                  30
Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln Gln
        35                  40                  45
Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln Asn
    50                  55                  60
Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu
65                  70                  75                  80
Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His
                85                  90                  95
Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr Arg
            100                 105                 110
Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile
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Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr Ile
    130                 135                 140
Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr
145                 150                 155                 160
Gly Tyr Leu Arg Asn
                165
<210>4
<211>165
<212>PRT
<213>IFNg
<400>4
Met Lys Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Ile Val Leu
1               5                   10                  15
Gly Ser Leu Gly Cys Tyr Cys Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu
            20                  25                  30
Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn
        35                  40                  45
Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Glu Glu Ser Asp Arg
    50                  55                  60
Lys Ile Met Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys
65                  70                  75                  80
Asn Phe Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys
                85                  90                  95
Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp
            100                 105                 110
Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln
        115                 120                 125
Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro
    130                 135                 140
Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly
145                 150                 155                 160
Arg Arg Ala Ser Gln
                165
<210>5
<211>165
<212>PRT
<213>HEQ
<400>5
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met
1               5                   10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln
        35                  40                  45
Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu Ala Ala Met Ile Gln Gln Ile Phe
    50                  55                  60
Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu
65                  70                  75                  80
Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu
                85                  90                  95
Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys
            100                 105                 110
Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu
        115                 120                 125
Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg
    130                 135                 140
Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser
145                 150                 155                 160
Leu Arg Ser Lys Glu
                165
<210>6
<211>165
<212>PRT
<213>NLYY
<400>6
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met
1               5                   10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln
        35                  40                  45
Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe
    50                  55                  60
Ala Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Ala
65                  70                  75                  80
Leu Asp Lys Phe Ala Thr Glu Leu Ala Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu
                85                  90                  95
Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys
            100                 105                 110
Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu
        115                 120                 125
Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg
    130                 135                 140
Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser
145                 150                 155                 160
Leu Arg Ser Lys Glu
                165
<210>7
<211>165
<212>PRT
<213>a8尾
<400>7
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met
1               5                   10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln
        35                  40                  45
Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe
    50                  55                  60
Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu
65                  70                  75                  80
Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu
                85                  90                  95
Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys
            100                 105                 110
Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu
        115                 120                 125
Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg
    130                 135                 140
Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Lys Arg
145                 150                 155                 160
Leu Lys Ser Lys Glu
                165
<210>8
<211>165
<212>PRT
<213>HEQ+a8尾
<400>8
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met
1               5                   10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln
        35                  40                  45
Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu Ala Ala Met Ile Ala Gln Ile Phe
    50                  55                  60
Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu
65                  70                  75                  80
Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu
                85                  90                  95
Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys
            100                 105                 110
Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu
        115                 120                 125
Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg
    130                 135                 140
Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Lys Arg
145                 150                 155                 160
Leu Lys Ser Lys Glu
                165
<210>9
<211>165
<212>PRT
<213>NLYY+a8尾
<400>9
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met
1               5                   10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln
        35                  40                  45
Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe
    50                  55                  60
Ala Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Ala
65                  70                  75                  80
Leu Asp Lys Phe Ala Thr Glu Leu Ala Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu
                85                  90                  95
Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys
            100                 105                 110
Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu
        115                 120                 125
Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg
    130                 135                 140
Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Lys Arg
145                 150                 155                 160
Leu Lys Ser Lys Glu
                165
<210>10
<211>165
<212>PRT
<213>MDL
<400>10
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met
1               5                   10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln
        35                  40                  45
Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu Met Asp Met Ile Leu Gln Ile Phe
    50                  55                  60
Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu
65                  70                  75                  80
Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu
                85                  90                  95
Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys
            100                 105                 110
Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu
        115                 120                 125
Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg
    130                 135                 140
Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser
145                 150                 155                 160
Leu Arg Ser Lys Glu
                165
<210>11
<211>165
<212>PRT
<213>YNS
<400>11
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met
1               5                   10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln
        35                  40                  45
Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu Tyr Asn Met Ile Ser Gln Ile Phe
    50                  55                  60
Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu
65                  70                  75                  80
Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu
                85                  90                  95
Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys
            100                 105                 110
Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu
        115                 120                 125
Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg
    130                 135                 140
Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser
145                 150                 155                 160
Leu Arg Ser Lys Glu
                165
<210>12
<211>165
<212>PRT
<213>MDL+a8尾
<400>12
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met
1               5                   10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln
        35                  40                  45
Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu Met Asp Met Ile Leu Gln Ile Phe
    50                  55                  60
Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu
65                  70                  75                  80
Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu
                85                  90                  95
Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys
            100                 105                 110
Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu
        115                 120                 125
Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg
    130                 135                 140
Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Lys Arg
145                 150                 155                 160
Leu Lys Ser Lys Glu
                165
<210>13
<211>165
<212>PRT
<213>YNS+a8尾
<400>13
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met
1               5                   10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln
        35                  40                  45
Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu Tyr Asn Met Ile Ser Gln Ile Phe
    50                  55                  60
Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu
65                  70                  75                  80
Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu
                85                  90                  95
Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys
            100                 105                 110
Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu
        115                 120                 125
Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg
    130                 135                 140
Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Lys Arg
145                 150                 155                 160
Leu Lys Ser Lys Glu
                 165
<210>14
<211>69
<212>DNA
<213>DNA
<400>14
tgtgatctgc cgcagactca ctctctgggt tctcgtcgta ctctgatgct gctggctcag    60
atgcgtcgt                                                            69
<210>15
<211>501
<212>DNA
<213>HEQ
<400>15
atgtgtgatc tgccgcagac tcactctctg ggttctcgtc gtactctgat gctgctggct     60
cagatgcgtc gtatctctct tttctcctgc ttgaaggaca gacatgactt tggatttccc    120
caggaggagt ttggcaacca gttccaaaag gctgaaacca tccctgtcct cgctgcgatg    180
atcgcgcaga tcttcaatct cttcagcaca aaggactcat ctgctgcttg ggatgagacc    240
ctcctagaca aattctacac tgaactctac cagcagctga atgacctgga agcctgtgtg    300
atacaggggg tgggggtgac agagactccc ctgatgaagg aggactccat tctggctgtg    360
aggaaatact tccaaagaat cactctctat ctgaaagaga agaaatacag cccttgtgcc    420
tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttttctt tgtcaacaaa cttgcaagaa    480
agtttaagaa gtaaggaatg a                                              501
<210>16
<211>501
<212>DNA
<213>NLYY
<400>16
atgtgtgatc tgccgcagac tcactctctg ggttctcgtc gtactctgat gctgctggct     60
cagatgcgtc gtatctctct tttctcctgc ttgaaggaca gacatgactt tggatttccc    120
caggaggagt ttggcaacca gttccaaaag gctgaaacca tccctgtcct ccatgagatg    180
atccagcaga tcttcgctct cttcagcaca aaggactcat ctgctgcttg ggatgagacc    240
gccctagaca aattcgccac tgaactcgcc cagcagctga atgacctgga agcctgtgtg    300
atacaggggg tgggggtgac agagactccc ctgatgaagg aggactccat tctggctgtg    360
aggaaatact tccaaagaat cactctctat ctgaaagaga agaaatacag cccttgtgcc    420
tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttttctt tgtcaacaaa cttgcaagaa    480
agtttaagaa gtaaggaatg a                                              501
<210>17
<211>501
<212>DNA
<213>a8尾
<400>17
atgtgtgatc tgccgcagac tcactctctg ggttctcgtc gtactctgat gctgctggct     60
cagatgcgtc gtatctctct tttctcctgc ttgaaggaca gacatgactt tggatttccc    120
caggaggagt ttggcaacca gttccaaaag gctgaaacca tccctgtcct ccatgagatg    180
atccagcaga tcttcaatct cttcagcaca aaggactcat ctgctgcttg ggatgagacc    240
ctcctagaca aattctacac tgaactctac cagcagctga atgacctgga agcctgtgtg    300
atacaggggg tgggggtgac agagactccc ctgatgaagg aggactccat tctggctgtg    360
aggaaatact tccaaagaat cactctctat ctgaaagaga agaaatacag cccttgtgcc    420
tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttttctt tgtcaacaaa cttgcaaaaa    480
aggttaaaaa gtaaggaatg a                                              501
<210>18
<211>501
<212>DNA
<213>HEQ+a8尾
<400>18
atgtgtgatc tgccgcagac tcactctctg ggttctcgtc gtactctgat gctgctggct     60
cagatgcgtc gtatctctct tttctcctgc ttgaaggaca gacatgactt tggatttccc    120
caggaggagt ttggcaacca gttccaaaag gctgaaacca tccctgtcct cgctgcgatg    180
atcgcgcaga tcttcaatct cttcagcaca aaggactcat ctgctgcttg ggatgagacc    240
ctcctagaca aattctacac tgaactctac cagcagctga atgacctgga agcctgtgtg    300
atacaggggg tgggggtgac agagactccc ctgatgaagg aggactccat tctggctgtg    360
aggaaatact tccaaagaat cactctctat ctgaaagaga agaaatacag cccttgtgcc    420
tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttttctt tgtcaacaaa cttgcaaaaa    480
aggttaaaaa gtaaggaatg a                                              501
<210>19
<211>501
<212>DNA
<213>NLYY+a8尾
<400>19
atgtgtgatc tgccgcagac tcactctctg ggttctcgtc gtactctgat gctgctggct     60
cagatgcgtc gtatctctct tttctcctgc ttgaaggaca gacatgactt tggatttccc    120
caggaggagt ttggcaacca gttccaaaag gctgaaacca tccctgtcct ccatgagatg    180
atccagcaga tcttcgctct cttcagcaca aaggactcat ctgctgcttg ggatgagacc    240
gccctagaca aattcgccac tgaactcgcc cagcagctga atgacctgga agcctgtgtg    300
atacaggggg tgggggtgac agagactccc ctgatgaagg aggactccat tctggctgtg    360
aggaaatact tccaaagaat cactctctat ctgaaagaga agaaatacag cccttgtgcc    420
tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttttctt tgtcaacaaa cttgcaaaaa    480
aggttaaaaa gtaaggaatg a                                              501
<210>20
<211>501
<212>DNA
<213>MDL
<400>20
atgtgtgatc tgccgcagac tcactctctg ggttctcgtc gtactctgat gctgctggct     60
cagatgcgtc gtatctctct tttctcctgc ttgaaggaca gacatgactt tggatttccc    120
caggaggagt ttggcaacca gttccaaaag gctgaaacca tccctgtcct catggatatg    180
atcctacaga tcttcaatct cttcagcaca aaggactcat ctgctgcttg ggatgagacc    240
ctcctagaca aattctacac tgaactctac cagcagctga atgacctgga agcctgtgtg    300
atacaggggg tgggggtgac agagactccc ctgatgaagg aggactccat tctggctgtg    360
aggaaatact tccaaagaat cactctctat ctgaaagaga agaaatacag cccttgtgcc    420
tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttttctt tgtcaacaaa cttgcaagaa    480
agtttaagaa gtaaggaatg a                                              501
<210>21
<211>501
<212>DNA
<213>YNS
<400>21
atgtgtgatc tgccgcagac tcactctctg ggttctcgtc gtactctgat gctgctggct     60
cagatgcgtc gtatctctct tttctcctgc ttgaaggaca gacatgactt tggatttccc    120
caggaggagt ttggcaacca gttccaaaag gctgaaacca tccctgtcct ctataacatg    180
atctctcaga tcttcaatct cttcagcaca aaggactcat ctgctgcttg ggatgagacc    240
ctcctagaca aattctacac tgaactctac cagcagctga atgacctgga agcctgtgtg    300
atacaggggg tgggggtgac agagactccc ctgatgaagg aggactccat tctggctgtg    360
aggaaatact tccaaagaat cactctctat ctgaaagaga agaaatacag cccttgtgcc    420
tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttttctt tgtcaacaaa cttgcaagaa    480
agtttaagaa gtaaggaatg a                                              501
<210>22
<211>501
<212>DNA
<213>MDL+a8尾
<400>22
atgtgtgatc tgccgcagac tcactctctg ggttctcgtc gtactctgat gctgctggct     60
cagatgcgtc gtatctctct tttctcctgc ttgaaggaca gacatgactt tggatttccc    120
caggaggagt ttggcaacca gttccaaaag gctgaaacca tccctgtcct catggatatg    180
atcctacaga tcttcaatct cttcagcaca aaggactcat ctgctgcttg ggatgagacc    240
ctcctagaca aattctacac tgaactctac cagcagctga atgacctgga agcctgtgtg    300
atacaggggg tgggggtgac agagactccc ctgatgaagg aggactccat tctggctgtg    360
aggaaatact tccaaagaat cactctctat ctgaaagaga agaaatacag cccttgtgcc    420
tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttttctt tgtcaacaaa cttgcaaaaa    480
aggttaaaaa gtaaggaatg a                                              501
<210>23
<211>501
<212>DNA
<213>YNS+a8尾
<400>23
atgtgtgatc tgccgcagac tcactctctg ggttctcgtc gtactctgat gctgctggct     60
cagatgcgtc gtatctctct tttctcctgc ttgaaggaca gacatgactt tggatttccc    120
caggaggagt ttggcaacca gttccaaaag gctgaaacca tccctgtcct ctataacatg    180
atctctcaga tcttcaatct cttcagcaca aaggactcat ctgctgcttg ggatgagacc    240
ctcctagaca aattctacac tgaactctac cagcagctga atgacctgga agcctgtgtg    300
atacaggggg tgggggtgac agagactccc ctgatgaagg aggactccat tctggctgtg    360
aggaaatact tccaaagaat cactctctat ctgaaagaga agaaatacag cccttgtgcc    420
tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttttctt tgtcaacaaa cttgcaaaaa    480
aggttaaaaa gtaaggaatg a                                              501
<210>24
<211>165
<212>PRT
<213>H57A
<400>24
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met
1               5                   10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln
        35                  40                  45
Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu Ala Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe
    50                  55                  60
Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu
65                  70                  75                  80
Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu
                85                  90                  95
Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys
            100                 105                 110
Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu
        115                 120                 125
Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg
    130                 135                 140
Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser
145                 150                 155                 160
Leu Arg Ser Lys Glu
                165
<210>25
<211>165
<212>PRT
<213>E58A
<400>25
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met
1               5                   10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln
        35                  40                  45
Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Ala Met Ile Gln Gln Ile Phe
    50                  55                  60
Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu
65                  70                  75                  80
Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu
                85                  90                  95
Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys
            100                 105                 110
Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu
        115                 120                 125
Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg
    130                 135                 140
Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser
145                 150                 155                 160
Leu Arg Ser Lys Glu
                165
<210>26
<211>165
<212>PRT
<213>Q61A
<400>26
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met
1               5                   10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln
        35                  40                  45