酶法制备富含藻油n-3多不饱和脂肪酸的甘油酯的方法技术领域
本发明属于多不饱和脂肪酸甘油酯的生物合成及酶催化技术领
域，涉及一种酶法制备富含藻油n-3多不饱和脂肪酸的甘油酯的方法，
具体的说，涉及一种利用全生物酶法催化合成高n-3多不饱和脂肪酸
含量甘油酯的方法。
背景技术
n-3多不饱和脂肪酸(n-3PUFA)对人类健康有着举足轻重的作
用，近年来已愈来愈受到人们的重视。其特征脂肪酸DHA(cis-4，7，10，
13，16，19-Docosahexaenoic Acid，二十二碳六烯酸)和EPA(cis-5，8，11，
14，17-Eicosapentaenoic Acid，二十碳五烯酸)因具有多种独特的生理
功能而备受人们青睐。其中，EPA具有改善血液循环、调节血脂、降
血压、软化血管以及抗炎等作用，可用于治疗血栓、心肌梗塞等，被
誉为“血管清道夫”；DHA具有营养大脑、促进大脑发育、保护视力、
调节免疫以及抗癌等作用，因其容易通过血脑屏障进入大脑，作用于
神经系统，因而被誉为“脑黄金”。鉴于DHA对人体健康的重要功能，
1991年加拿大政府率先将其列入“营养素推荐量”名单之中。1992年英
国提出了“对健康成人膳食不饱和脂肪酸摄入量”的建议。联合国粮农
组织和世界卫生组织也都在膳食指南中明确规定，婴儿配方奶粉中必
须含有DHA。
人类和多种其他动物自身不能合成n-3PUFA，因而必须通过饮食
获取。传统的n-3PUFA的来源主要是深海鱼油，但是大量捕捞导致鱼
资源紧缺，食物链的富集作用导致提取的鱼油中含有重金属离子和高
胆固醇，并且不同鱼种的油含量以及油中多不饱和脂肪酸的含量差异
较大，基于上述弊端，利用微藻发酵生产多不饱和脂肪酸的方法应运
而生。与鱼油相比，藻油是从培养的藻类中直接提取，不经食物链的
富集，不含任何色素和重金属离子，安全无污染，且为可再生资源，
更重要的是其脂肪酸组成较为简单，多不饱和脂肪酸含量一般是鱼油
的3-10倍。因此以藻油为多不饱和脂肪酸的来源是安全清洁可靠的。
DHA和EPA的天然存在形式为甘油酯型，而对其人为富集的主
要形式包括甲乙酯型、游离脂肪酸型和甘油酯型。由于DHA和EPA
大多应用于医药和保健品领域，所以人们对甲乙酯型和游离脂肪酸型
提出了安全性方面的质疑。甲酯型在制备中使用了有毒的甲醇，因此
可能存在甲醇毒性，食用不安全；乙酯型产品不易被胰酯酶水解而难
以被人体消化利用，且分解后产生乙醇，一些对乙醇耐受性差的人会
引起过敏等不良反应；游离脂肪酸型虽然易于被人体消化和吸收，但
其游离形式不稳定，易被氧化分解，给保存和运输带来很大困难，而
且其口感不佳，很难作为日常药品和保健品为人们所接受。相比较而
言，甘油酯型为其天然存在形式，符合人体消化和吸收机制，安全有
效且性状稳定、口感较佳，因此以甘油酯型富集的DHA和EPA是最
有效安全的产品形式。
目前，有多种方法可将DHA和EPA以不同形式进行富集，主要
包括低温结晶法、分子蒸馏法、金属盐沉淀法、银离子络合法、尿素
包合法、高效液相色谱法、超临界萃取法和脂肪酶法等。其中，脂肪
酶法与其他物理化学法相比具有催化效率高、反应条件温和、能耗低
和环境友好等优点而得到广泛重视。尤其，对于多不饱和脂肪酸的富
集来说，由于多不饱和脂肪酸所含双键较多，极易在高温高压下氧化
分解，产生有害产物，若摄入体内极易导致各种生理异常，所以脂肪
酶富集法的优势尤为突出。本发明的全部过程均采用脂肪酶进行催
化，最大程度的保护了多不饱和脂肪酸。
目前已公开发表的文章或专利中，酶法富集的工艺主要包括酶促
选择性水解、酶促选择性酸解、酶促选择性醇解和酶促酯化合成等。
酶促选择性水解工艺较为简单，富集效率不高，n-3PUFA在甘油酯中
含量仅能达到50％左右；酶促选择性酸解、酶促选择性醇解法对酶的
选择性要求较高，且酶促选择性醇解产物为混合甘油酯；酶促酯化合
成反应底物脂肪酸和甘油分散在两相体系中，不利于反应传质；且大
多数报道都是富集鱼油多不饱和脂肪酸，如中国专利CN101161819A
和CN101348807A都公开了利用鱼油n-3PUFA浓缩物和甘油通过酯
化反应富集DHA和EPA。但是，上述两个专利均以鱼油为原料，在
整个工艺中都是通过化学法水解制备n-3PUFA浓缩物，化学法反应温
度较高，且使用大量的碱作为催化剂，不仅对易氧化的n-3PUFA会有
一定的破环，而且产生大量的碱废水等污染物；合成反应都是以甘油
和化学法制备得到的n-3PUFA浓缩物为底物进行酯化反应，由于二者
是互不相溶的两种底物，所以反应传质方面会受到影响，导致反应时
间较长。
因此，目前需要研究开发一种原料来源清洁安全，整个工艺全部
采用生物酶法，产品中DHA和EPA含量高，反应过程高效灵活，可
操作性强的经济高效的酶法制备富含n-3PUFA的甘油酯的制备技术。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供了
一种酶法制备富含藻油n-3多不饱和脂肪酸的甘油酯的方法。该方法
以微生物藻油为原料，利用脂肪酶的催化特异性，将酶法部分水解和
全部水解相结合，分别制得部分水解的甘油酯和游离脂肪酸，后者又
通过尿素包合制得n-3多不饱和脂肪酸浓缩物，再以部分水解的甘油
酯和n-3多不饱和脂肪酸浓缩物为底物，合成富含n-3多不饱和脂肪
酸的甘油酯，所制得产物中DHA和EPA的含量显著提高。该方法以
微生物藻油作为n-3多不饱和脂肪酸的来源，原料安全清洁、成本低
廉，反应过程高效灵活，可操作性强。
为实现上述目的，本发明提供了一种酶法制备富含藻油n-3多不
饱和脂肪酸的甘油酯的方法，包括：
步骤A，酶法部分水解藻油，获得的主产物为初步富集了n-3多
不饱和脂肪酸的部分水解的甘油酯，副产物为游离脂肪酸；
步骤B，酶法全部水解藻油，制得游离脂肪酸；
步骤C，采用尿素包合法分离游离脂肪酸中的n-3多不饱和脂肪
酸，制得n-3多不饱和脂肪酸浓缩物；
步骤D，固定化脂肪酶催化合成富含n-3多不饱和脂肪酸的甘油
酯；
其中，步骤D以初步富集了n-3多不饱和脂肪酸的部分水解的甘
油酯和n-3多不饱和脂肪酸浓缩物为底物，以有机溶剂为反应介质，
在惰性气体保护及固定化脂肪酶的催化下，进行振荡反应，所获得的
反应液经中和、萃取、水洗、过滤、干燥及减压蒸馏制得富含n-3多
不饱和脂肪酸的甘油酯。
根据本发明方法，步骤D中所述初步富集了n-3多不饱和脂肪酸
的部分水解的甘油酯和n-3多不饱和脂肪酸浓缩物的摩尔比为
1∶1～10。所述有机溶剂为Log P(P为有机溶剂在辛醇和水两相体系中
的分配系数)不小于3的有机溶剂，其用量为10～15ml/g酸。所述有
机溶剂选自正己烷、正庚烷、正辛烷、异辛烷、正壬烷、正癸烷中的
一种或多种。
所述固定化脂肪酶由脂肪酶固定在固定化载体上制得，其添加量
为2500～4000U/g酸。所述固定化载体选自软质聚氨酯海绵、绵绸、
微球、纤维、尼龙及大孔树脂等中的一种或多种，优选所述固定化载
体为软质聚氨酯海绵。
本发明所用单位“U/g酸”中的“酸”是指n-3多不饱和脂肪酸
浓缩物。
所述脂肪酶为对多不饱和脂肪酸与部分水解的甘油酯的反应具
有催化作用的脂肪酶，例如，Candida sp.99-125脂肪酶，该脂肪酶依
照中国发明专利CN1948470A公开的方法制备，使用批次在10批左
右。所述多不饱和脂肪酸与部分水解的甘油酯的反应为酯化和/或转酯
化反应。
所述固定化脂肪酶，例如，可选自Novozym435脂肪酶、
Rhizomucormiehei脂肪酶、Alcaligenes sp.脂肪酶以及Candida sp.
99-125脂肪酶中的一种或多种，优选所述固定化脂肪酶为Candida sp.
99-125固定化脂肪酶，该酶由Candida sp.99-125脂肪酶固定于软质
聚氨酯海绵载体上制成。
在步骤D的反应过程中，所述反应的温度为40～50℃，反应的时
间为24～96h。进行振荡反应的振荡器转速为200rpm。反应结束后，
反应液用碱进行中和，用萃取剂进行萃取，用去离子水洗至中性，并
通过无水Na2SO4进行干燥。其中，所述萃取剂为正己烷等，所述碱
为NaOH、KOH等。
在本发明的一个具体实施例中，在上述反应过程中，初步富集了
n-3多不饱和脂肪酸的部分水解的甘油酯与n-3多不饱和脂肪酸浓缩
物摩尔比为1∶1～10，有机溶剂的用量为10～15ml/g酸，固定化脂肪酶
添加量为2500～4000U/g酸；充入氮气作为惰性气体进行密封保护，
在40～50℃条件下，以200rpm的转速振荡反应24～96h；反应结束后，
反应液用KOH中和，加入正己烷萃取富含n-3多不饱和脂肪酸的甘
油酯，水洗至中性，过无水Na2SO4进行干燥，减压蒸馏除去溶剂后
得到富含n-3多不饱和脂肪酸的甘油酯产品；经气相色谱检测，所制
得的产品中DHA含量为60％～68％，EPA含量为21％～27％，n-3多不
饱和脂肪酸总含量不低于80％。
根据本发明方法，步骤A将藻油与缓冲液及水解酶混合后，在惰
性气体保护条件下进行部分水解反应，反应结束滤除水解酶后，滤液
经中和，萃取，所分离出的萃取液经水洗，干燥及减压蒸馏，制得作
为主产物的初步富集了n-3多不饱和脂肪酸的部分水解的甘油酯，水
化层则经酸化，萃取，水洗，干燥及减压蒸馏，获得作为副产物的游
离脂肪酸，其中，水解反应的水解率控制在40％～60％。
根据本发明方法，在步骤A中，所述藻油与缓冲液的质量比为
1∶0.6～1。所述水解酶为脂肪酶酶粉或者固定化脂肪酶，其添加量为
600～1500U/g藻油，所述固定化脂肪酶由脂肪酶固定在固定化载体上
制得，所述脂肪酶为对藻油的水解反应有催化作用的脂肪酶，例如，
Candida sp.99-125脂肪酶，该脂肪酶依照中国发明专利CN1948470A
公开的方法制备，使用批次在10批左右。所述固定化载体选自软质
聚氨酯海绵、绵绸、微球、纤维、尼龙及大孔树脂等中的一种或多种，
优选所述固定化载体为软质聚氨酯海绵。
所述酶粉，例如，优选为Candida sp.99-125脂肪酶酶粉。所述
固定化脂肪酶，可选自Novozym435脂肪酶、Rhizomucormiehei脂肪
酶、Alcaligenes sp.脂肪酶以及Candida sp.99-125脂肪酶中的一种或
多种，优选所述固定化脂肪酶为Candida sp.99-125固定化脂肪酶。
在步骤A的水解反应过程中，所述水解反应的温度为35～50℃。
反应结束滤除水解酶后，滤液用碱进行中和，用萃取剂进行萃取，所
分离出的萃取液用去离子水洗至中性，并过无水Na2SO4进行干燥，
其中，所述萃取剂为正己烷等，所述碱为NaOH、KOH等。而水化层
则用盐酸酸化，然后用萃取剂进行萃取，用去离子水洗至中性，并过
无水Na2SO4进行干燥，其中，所述萃取剂为正己烷等，所述碱为
NaOH、KOH等。
在根据本发明方法的一个优选实施例中，步骤A将藻油与缓冲
液、脂肪酶酶粉及环糊精混合后，在惰性气体保护条件下进行部分水
解反应，其中，所述环糊精的加入量为脂肪酶酶粉质量的0.5～2倍。
部分水解反应结束后，滤除脂肪酶酶粉，滤液经中和，萃取，所分离
出的萃取液经水洗，干燥及减压蒸馏，制得作为主产物的初步富集了
n-3多不饱和脂肪酸的部分水解的甘油酯，水化层则经酸化，萃取，
水洗，干燥及减压蒸馏，获得作为副产物的游离脂肪酸。
在本发明的一个具体实施例中，在上述反应过程中，藻油与缓冲
液的质量比为1∶0.6～1，脂肪酶酶粉添加量为600～1500U/g藻油，加入
脂肪酶酶粉质量0.5～2倍的环糊精；充入氮气作为惰性气体进行密封
保护，在35～50℃条件下进行水解反应，控制水解率在40％～60％，此
时部分水解的甘油酯中n-3多不饱和脂肪酸含量最高；反应结束后，
抽滤除去脂肪酶酶粉，滤液用KOH中和，加入萃取剂进行萃取，并
所分离出的萃取液用去离子水洗至中性，过无水Na2SO4进行干燥，
减压蒸馏除去溶剂制得作为主产物的初步富集了n-3多不饱和脂肪酸
的部分水解的甘油酯。水化层则经盐酸酸化，加入萃取剂萃取游离脂
肪酸，去离子水洗至中性，过无水Na2SO4进行干燥，减压蒸馏除去
溶剂，获得作为副产物的游离脂肪酸。经气相色谱检测，所获得主产
物部分水解的甘油酯中n-3多不饱和脂肪酸含量为DHA 45％～50％，
EPA 15～20％，主产物部分水解的甘油酯的得率为86％～92％。
根据本发明方法，步骤B将藻油与缓冲液、盐及水解酶混合后，
在惰性气体保护条件下进行全部水解反应，水解过程中补加脂肪酸中
和剂，反应结束滤除水解酶后，滤液经中和，萃取，所分离出的萃取
液经水洗、干燥、减压蒸馏，获得未被水解的藻油甘油酯重新作为原
料使用；水化层则经酸化，萃取，水洗，干燥及减压蒸馏，获得游离
脂肪酸。经过全部水解反应后，上述水解反应过程中所分离出的萃取
液中所含未被水解的藻油甘油酯仅为少量，其得率低于10wt％。
根据本发明方法，在步骤B中，所述藻油与缓冲液的质量比为
1∶0.6～1。所述水解酶为脂肪酶酶粉或者固定化脂肪酶，其添加量为
600～1500U/g藻油，所述固定化脂肪酶由脂肪酶固定在固定化载体上
制得，所述脂肪酶为对藻油的水解反应有催化作用的脂肪酶，例如，
Candida sp.99-125脂肪酶，该脂肪酶依照中国发明专利CN1948470A
公开的方法制备，使用批次在10批左右。所述固定化载体选自软质
聚氨酯海绵、绵绸、微球、纤维、尼龙及大孔树脂等中的一种或多种，
优选所述固定化载体为软质聚氨酯海绵。
所述酶粉，例如，优选为Candida sp.99-125脂肪酶酶粉。所述
固定化脂肪酶，可选自Novozym435脂肪酶、Rhizomucormiehei脂肪
酶、Alcaligenes sp.脂肪酶以及Candida sp.99-125脂肪酶中的一种或
多种，优选所述固定化脂肪酶为Candida sp.99-125固定化脂肪酶。
在步骤B的水解反应过程中，所述水解反应的温度为35～50℃，
水解反应的时间为48～96h。所述盐为对酶活有促进作用的金属盐，其
包括CaCl2和/或MgCl2，其加入量为5～10mM。优选所述金属盐为
CaCl2。所述水解过程中补加脂肪酸中和剂，是在水解率达到20％～30％
后，补加一次脂肪酸中和剂，其加入量为藻油量的0.5wt％～1.0wt％。
所述脂肪酸中和剂是固体碱，其选自KOH、NaOH及Ca(OH)2中的一
种或几种。优选所述固体碱为Ca(OH)2。
反应结束滤除水解酶后，滤液用碱进行中和，用萃取剂进行萃取，
用去离子水洗至中性，并过无水Na2SO4进行干燥，其中，所述萃取
剂为正己烷，所述碱为NaOH、KOH等。所分离出的萃取液用去离子
水洗至中性，并过无水Na2SO4进行干燥，其中，所述萃取剂为正己
烷等，所述碱为NaOH、KOH等。水化层用盐酸酸化，用萃取剂进行
萃取，用去离子水洗至中性，过无水Na2SO4进行干燥，其中，所述
萃取剂为正己烷等，所述碱为NaOH、KOH等。
在根据本发明方法的一个优选实施例中，步骤B将藻油与缓冲
液、脂肪酶酶粉及环糊精混合后，在惰性气体保护条件下进行全部水
解反应，其中，所述环糊精的加入量为脂肪酶酶粉质量的0.5～2倍。
水解过程中补加脂肪酸中和剂，反应结束后，滤除脂肪酶酶粉，滤液
经中和，萃取，所分离出的萃取液经水洗、干燥、减压蒸馏，获得未
被水解的藻油甘油酯重新作为原料使用；水化层则经酸化，萃取，水
洗，干燥及减压蒸馏，获得游离脂肪酸。
在本发明的一个具体实施例中，在上述反应过程中，藻油与缓冲
液的质量比为1∶0.6～1，缓冲液中加入5～10mM CaCl2，脂肪酶酶粉添
加量为600～1500U/g藻油，环糊精添加量为脂肪酶酶粉的0.5～2倍；
充入氮气作为惰性气体进行密封保护，在35～50℃条件下进行水解反
应，在水解率达到20％～30％后，补加藻油量0.5wt％～1.0wt％的
Ca(OH)2以促进反应平衡向产物方向移动，水解反应总时间为48～96h。
反应结束后，抽滤除去脂肪酶酶粉，滤液用KOH中和，加入正
己烷萃取，所分离出的萃取液用去离子水洗至中性，过无水Na2SO4
进行干燥，经减压蒸馏，所获得未被水解的藻油甘油酯可重新作为水
解原料使用；而水化层用2mol/L HCl酸化，然后用正己烷萃取游离脂
肪酸，水洗至中性，并过无水Na2SO4进行干燥，减压蒸馏除去溶剂
后得到游离脂肪酸。上述水解反应过程的水解率为80％～85％，游离脂
肪酸得率为85％～90％；
上述反应过程中，在缓冲液中加入5～10mM金属盐以及在水解
率达到20～30％后加入藻油量0.5wt％～1.0wt％的固体碱，可以将水解
率提高5％～10％。
本发明步骤A及步骤B中，所用原料为含有n-3多不饱和脂肪酸
的微生物藻油，该原料清洁安全，且n-3多不饱和脂肪酸含量较高，
其n-3多不饱和脂肪酸含量在20％～60％之间。
在本发明步骤A及步骤B中，所述脂肪酶在催化甘油酯水解过程
中对甘油酯上的脂肪酰基具有一定的选择性，通过有效控制水解率，
可对含有n-3多不饱和脂肪酸的藻油进行部分水解和全部水解，部分
水解后的甘油酯中n-3多不饱和脂肪酸的含量得到一定程度的提高。
本发明中，步骤A中催化藻油部分水解所采用的脂肪酶及步骤B
中催化藻油全部水解所采用的脂肪酶，与步骤D中催化多不饱和脂肪
酸与部分水解的甘油酯进行酯化和/或转酯化反应的脂肪酶可以是不
同种脂肪酶，也可以是同种脂肪酶，优选为同种脂肪酶，以简化操作，
便于控制。
根据本发明方法，步骤C在惰性气体保护条件下，将游离脂肪酸
与尿素和醇类溶剂共混后，进行静置包合，包合结束后滤除尿素包合
物，滤液经酸化、萃取、水洗、干燥及减压蒸馏，制得n-3多不饱和
脂肪酸浓缩物。
根据本发明，在步骤C中，所述游离脂肪酸与尿素和醇类溶剂共
混，是在尿素与醇类溶剂混合形成澄清透明溶液后，再加入60℃下预
热的游离脂肪酸进行共混。所述脂肪酸∶尿素∶醇类溶剂为
1∶2～4∶5～10(w/w/v)。所述醇类溶剂为甲醇和/或乙醇，优选所述醇类溶
剂为乙醇。所述共混的温度为60～80℃，共混的时间为60～90min。所
述包合的温度为0～4℃，包合的时间为16～20h。包合结束后，滤除尿
素包合物，滤液用盐酸酸化，然后用萃取剂进行萃取，用去离子水洗
至中性，并过无水Na2SO4进行干燥。
在本发明的一个具体的实施例中，在上述反应过程中，按照脂肪
酸∶尿素∶乙醇为1∶2～4∶5～10(w/w/v)的比例将步骤A及步骤B中藻油水
解后得到的游离脂肪酸与尿素和乙醇共混；先在尿素与乙醇混合形成
澄清透明溶液后，充入氮气作为惰性气体进行保护，并加入60℃下预
热的游离脂肪酸进行共混，然后在60～80℃条件下共混60～90min，然
后在0～4℃条件下静置包合16～20h；包合结束后，抽滤除去尿素包合
物，将富含脂肪酸乙酯的滤液用2mol/L的HCl酸化，然后用正己烷
萃取，水洗至中性，并过无水Na2SO4进行干燥，减压蒸馏后制得n-3
多不饱和脂肪酸浓缩物。其中，DHA含量为68％～73％，EPA含量为
20％～25％，n-3多不饱和脂肪酸浓缩物收率为85％～90％。
本发明中，将所制得富含n-3多不饱和脂肪酸的甘油酯产品，以
及反应过程中所获得的产物，包括初步富集了n-3多不饱和脂肪酸的
部分水解的甘油酯、游离脂肪酸以及n-3多不饱和脂肪酸浓缩物，分
别进行甲酯化后，并采用气相色谱仪(GC2010，日本岛津)检测其
DHA和EPA的含量。
水解反应过程中，水解率采用碱滴定法进行测定，并按照下列公
式进行计算：
本发明以微生物藻油为原料，以脂肪酶为催化剂，采用全新的工
艺路线，利用脂肪酶催化甘油酯水解时的脂肪酸特异性，即优先水解
低碳饱和度高的脂肪酸，而空间位阻较大的多不饱和脂肪酸在反应后
半程才逐渐被水解，将酶法部分水解和全部水解相结合，分别制得部
分水解的甘油酯和游离脂肪酸，后者又通过尿素包合制得n-3多不饱
和脂肪酸浓缩物，然后再利用部分水解的甘油酯与n-3多不饱和脂肪
酸浓缩物为底物反应富集DHA和EPA。
采用根据本发明方法的工艺路线，首先，通过控制水解率将藻油
部分水解，当水解率达到40％～60％后停止反应，此时甘油酯中n-3多
不饱和脂肪酸含量达到最高，除酸后得到初步富集了n-3多不饱和脂
肪酸的部分水解的甘油酯；其次，以藻油为原料，通过控制水解率，
将藻油全部水解得到游离脂肪酸，利用尿素包合法富集得到n-3多不
饱和脂肪酸浓缩物；最后，以n-3多不饱和脂肪酸浓缩物和部分水解
的甘油酯为底物，在固定化脂肪酶的催化下合成富含n-3多不饱和脂
肪酸的甘油酯。
根据本发明方法所制得的富含n-3多不饱和脂肪酸的甘油酯产品
中DHA和EPA的含量至少可达80％，比脂肪酶部分水解法更高，且
富集形式为天然甘油酯型，有利于人体消化和吸收，很好的改善和提
升了其药用和保健价值；同时，与直接酯化法相比，本发明是在保留
了藻油中原n-3多不饱和脂肪酸的基础上，使用部分水解的甘油酯与
n-3多不饱和脂肪酸浓缩物为底物，在固定化脂肪酶催化下合成富含
n-3多不饱和脂肪酸的甘油酯，避免了n-3多不饱和脂肪酸与甘油的从
头合成，从工艺上来说更加高效合理；与酸解或醇解反应相比，该工
艺反应底物的空间位阻小，更容易进入酶的催化活性中心，酯化和/
或转酯化过程更加高效。
本发明以微生物藻油替代鱼油作为n-3多不饱和脂肪酸来源，不
仅安全清洁、成本低廉，也对海洋环境的保护和海洋资源的可持续发
展具有重要意义；本发明中甘油酯的水解与合成反应既可采用不同种
脂肪酶，又可采用同种脂肪酶，工艺上具有较大的操作灵活性，尤其
是当甘油酯的水解与合成反应全部采用同种脂肪酶催化时，操作过程
更加简便高效；本发明工艺不仅为生产高含量的n-3多不饱和脂肪酸
的甘油酯提供了新颖的技术路线，并且全程采用生物酶法进行富集，
真正做到了环境友好、条件温和、能耗低以及可循环利用，为一条绿
色生态环保的技术路线，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是实施例1～6中酶法制备富含藻油n-3多不饱和脂肪酸的甘
油酯的工艺流程图。
具体实施方式
下面将结合实施例和附图来详细说明本发明，这些实施例和附图
仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。
(1)酶法部分水解藻油
称取一定量藻油样品，按照藻油与缓冲液的质量比为1∶0.6～1的
量加入pH8.0的磷酸盐缓冲液，按照600～1500U/g藻油的量加入脂肪
酶酶粉，按照脂肪酶酶粉质量0.5～2倍的量加入环糊精，充入惰性气
体进行密封保护，在35～50℃条件下进行水解反应，控制水解率在
40％～60％，抽滤除去脂肪酶酶粉，滤液用碱中和，加入正己烷萃取部
分水解的甘油酯，并将分离出的萃取液用去离子水洗至中性，过无水
Na2SO4，减压蒸馏除去溶剂，制得作为主产物的初步富集了n-3多不
饱和脂肪酸的部分水解的甘油酯。而水化层则用2mol/L的HCl酸化，
然后用正己烷进行萃取游离脂肪酸，水洗至中性，并过无水Na2SO4
进行干燥，减压蒸馏除去溶剂后得到副产物游离脂肪酸。
(2)酶法全部水解藻油
称取一定量藻油样品，按照藻油与缓冲液的质量比为1∶0.6～1的
量加入pH8.0的含5～10mM金属盐的磷酸盐缓冲液，按照
600～1500U/g藻油的量加入脂肪酶酶粉，按照脂肪酶酶粉0.5～2倍的
量加入环糊精，充入惰性气体进行密封保护，在35～50℃条件下进行
水解反应，在水解率达到20％～30％后，按照0.5wt％～1.0wt％藻油的量
补加脂肪酸中和剂，在总水解时间达到48～96h，停止反应，抽滤除去
脂肪酶酶粉，滤液用碱中和，加入正己烷萃取，所分离出的萃取液用
去离子水洗至中性，过无水Na2SO4进行干燥，经减压蒸馏，所获得
未被水解的藻油甘油酯重新作为水解原料使用；而水化层用2mol/L
的HCl酸化，然后用正己烷萃取游离脂肪酸，水洗至中性，过无水
Na2SO4，减压蒸馏除去溶剂后得到游离脂肪酸。
(3)尿素包合法制备n-3多不饱和脂肪酸浓缩物
按照脂肪酸∶尿素∶乙醇为1∶2～4∶5～10(w/w/v)的比例将步骤(1)和
(2)中所获得的游离脂肪酸与尿素和乙醇共混，先在尿素与乙醇混
合形成澄清透明溶液后，充入氮气作为惰性气体进行保护，再加入
60℃下预热的游离脂肪酸进行共混，在60～80℃条件下共混90min，
0～4℃条件下静置包合16～20h。反应结束后，抽滤除去尿素包合物，
富含脂肪酸乙酯的滤液用2mol/L的HCl酸化，然后用正己烷萃取，
用去离子水洗至中性，并过无水Na2SO4进行干燥，减压蒸馏后制得
n-3多不饱和脂肪酸浓缩物。
(4)固定化酶催化合成n-3多不饱和脂肪酸甘油酯
按照部分水解的甘油酯与n-3多不饱和脂肪酸浓缩物的摩尔比为
1∶1～10的量，将0.5g部分水解的甘油酯和n-3多不饱和脂肪酸浓缩物
加入反应器，按照10～15ml/g酸的量加入有机溶剂成有机相，按照
2500～4000U/g酸的量加入固定化脂肪酶，充入惰性气体进行密封保
护，在40～50℃条件下，以200rpm的转速振荡反应24～96h，反应液
用KOH中和，加入正己烷萃取甘油酯，水洗至中性，过无水Na2SO4
进行干燥，减压蒸馏除去溶剂后得到n-3多不饱和脂肪酸的甘油酯。
实施例
实例1：
(1)酶法部分水解藻油
称取藻油样品10g，按照藻油与缓冲液的质量比为1∶0.6的量加入
pH8.0的磷酸盐缓冲液，按照1500U/g藻油的量加入Candida sp.99-125
脂肪酶酶粉，按照酶粉质量2倍的量加入环糊精，充入氮气作为惰性
气体进行密封保护，在50℃条件下水解，至水解率达到60％后，停止
反应，抽滤除去酶粉，滤液用KOH中和，加入正己烷萃取部分水解
的甘油酯，并将萃取液用去离子水洗至中性，过无水Na2SO4进行干
燥，减压蒸馏除去溶剂，制得作为主产物的初步富集了n-3多不饱和
脂肪酸的部分水解的甘油酯。而水化层则用2mol/L的HCl酸化，然
后用正己烷进行萃取游离脂肪酸，水洗至中性，并过无水Na2SO4进
行干燥，减压蒸馏除去溶剂后得到副产物游离脂肪酸。计算所获得的
产物的收率，并将其进行甲酯化后用气相色谱仪(GC2010，日本岛津)
检测其DHA和EPA的含量，结果见表1。
(2)酶法全部水解藻油
称取藻油样品10g，按照藻油与缓冲液的质量比为1∶0.6的量加入
pH8.0的含10mM CaCl2的磷酸盐缓冲液，按照1500U/g藻油的量加入
Candida sp.99-125脂肪酶酶粉，按照酶粉2倍的量加入环糊精，充入
氮气作为惰性气体进行密封保护，在50℃条件下进行水解反应，在水
解率达到30％后，按照1.0wt％藻油的量补加Ca(OH)2作为脂肪酸中和
剂，当总水解时间达到96h时，停止反应，抽滤除去酶粉，滤液用
KOH中和，加入正己烷萃取，所分离出的萃取液用去离子水洗至中性，
过无水Na2SO4进行干燥，经减压蒸馏，所获得未被水解的藻油甘油
酯重新作为水解原料使用；而水化层用2mol/L的HCl酸化，然后用
正己烷萃取游离脂肪酸，水洗至中性，过无水Na2SO4进行干燥，减
压蒸馏除去溶剂后得到游离脂肪酸。计算上述水解过程的水解率和游
离脂肪酸的收率，并将游离脂肪酸进行甲酯化后用气相色谱仪
(GC2010，日本岛津)检测其DHA和EPA的含量，结果见表1。
(3)尿素包合法制备n-3多不饱和脂肪酸浓缩物
按照脂肪酸∶尿素∶乙醇为1∶4∶10(w/w/v)的比例将步骤(1)和(2)
中所获得的游离脂肪酸与尿素和乙醇共混，先在尿素与乙醇混合形成
澄清透明溶液后，充入氮气作为惰性气体进行保护，再加入60℃下预
热的游离脂肪酸进行共混，在80℃条件下共混90min，0℃条件下静
置包合20h，包合结束后，抽滤除去尿素包合物，滤液用2mol/L的
HCl酸化，然后用正己烷萃取，水洗至中性，并过无水Na2SO4进行干
燥，减压蒸馏后制得n-3多不饱和脂肪酸浓缩物。计算n-3多不饱和
脂肪酸浓缩物收率，并将其进行甲酯化后用气相色谱仪(GC2010，日
本岛津)检测其DHA和EPA的含量，结果见表1。
(4)固定化酶催化合成n-3多不饱和脂肪酸甘油酯
按照部分水解的甘油酯与n-3多不饱和脂肪酸浓缩物的摩尔比为
1∶10的量，将0.5g部分水解的甘油酯和n-3多不饱和脂肪酸浓缩物加
入反应器，按照10ml/g酸的量加入异辛烷构成有机相，按照4000U/g
酸的量加入Candida sp.99-125固定化脂肪酶(固定化载体为软质聚氨
酯海绵)，充入氮气作为惰性气体进行密封保护，在50℃条件下，以
200rpm的转速振荡反应96h，反应液用KOH中和，加入正己烷萃取
n-3多不饱和脂肪酸的甘油酯，水洗至中性，过无水Na2SO4进行干燥，
减压蒸馏除去溶剂后得到n-3多不饱和脂肪酸的甘油酯。计算n-3多
不饱和脂肪酸的甘油酯收率，并将其进行甲酯化后用气相色谱仪检测
其DHA和EPA的含量，结果见表1。
实例2：
实施例2与实施例1不同的是：
步骤(1)中，藻油与缓冲液的质量比为1∶1，按照600U/g藻油
的量加入脂肪酶酶粉，按照酶粉质量0.5倍的量加入环糊精；在35℃
条件下水解，至水解率达到40％后，停止反应。
步骤(2)中，按照藻油与缓冲液的质量比为1∶1的量加入含5mM
CaCl2的磷酸盐缓冲液，按照600U/g藻油的量加入脂肪酶酶粉，按照
酶粉质量0.5倍的量加入环糊精；在35℃下进行水解反应，在水解率
达到20％后，按照0.5wt％藻油的量补加Ca(OH)2，总水解时间为48h。
步骤(3)中，脂肪酸∶尿素∶乙醇为1∶2∶5(w/w/v)，在60℃条件下
共混60min，4℃条件下包合16h。
步骤(4)中，部分水解的甘油酯与n-3多不饱和脂肪酸浓缩物的
摩尔比为1∶1，按照15ml/g酸的量加入异辛烷构成有机相，按照
2500U/g酸的量加入固定化脂肪酶，在40℃条件下，振荡反应24h。
其余条件与实施例1相同，按照与实施例1相同的方式计算反应
过程的水解率，以及产物和产品的收率，并按照与实施例1相同的方
法检测反应产物及产品中DHA和EPA的含量，结果见表1。
实例3：
实施例3与实施例1不同的是：
步骤(1)中，藻油与缓冲液的质量比为1∶0.8，按照1200U/g藻
油的量加入脂肪酶酶粉，按照酶粉质量1.5倍的量加入环糊精；在40℃
条件下水解，至水解率达到59％后，停止反应。
步骤(2)中，按照藻油与缓冲液的质量比为1∶0.8的量加入含8mM
CaCl2的磷酸盐缓冲液，按照1200U/g藻油的量加入脂肪酶酶粉，按
照酶粉质量1.5倍的量加入环糊精；在40℃条件下进行水解反应。
步骤(3)中，脂肪酸∶尿素∶乙醇为1∶3.5∶9(w/w/v)，在70℃条件
下共混。
步骤(4)中，部分水解的甘油酯与n-3多不饱和脂肪酸浓缩物的
摩尔比为1∶8，按照3500U/g酸的量加入固定化脂肪酶，在45℃条件
下，振荡反应72h。
其余条件与实施例1相同，按照与实施例1相同的方式计算反应
过程的水解率，以及产物和产品的收率，并按照与实施例1相同的方
法检测反应产物及产品中DHA和EPA的含量，结果见表1。
实例4：
实施例4与实施例1不同的是：
步骤(1)中，藻油与缓冲液的质量比为1∶0.9，按照1000U/g藻
油的量加入脂肪酶酶粉，按照酶粉质量1倍的量加入环糊精；在40℃
条件下水解，至水解率达到50％后，停止反应。
步骤(2)中，按照藻油与缓冲液的质量比为1∶0.9的量加入含5mM
CaCl2的磷酸盐缓冲液，按照1000U/g藻油的量加入脂肪酶酶粉，按
照酶粉质量1倍的量加入环糊精；在40℃条件下进行水解反应，在水
解率达到25％后，补加NaOH，总水解时间为72h。
步骤(3)中，脂肪酸∶尿素∶乙醇为1∶3∶7.5(w/w/v)，在60℃条件
下共混70min，3℃条件下包合18h。
步骤(4)中，部分水解的甘油酯与n-3多不饱和脂肪酸浓缩物的
摩尔比为1∶3，按照3000U/g酸的量加入固定化脂肪酶，在45℃条件
下，振荡反应60h。
其余条件与实施例1相同，按照与实施例1相同的方式计算反应
过程的水解率，以及产物和产品的收率，并按照与实施例1相同的方
法检测反应产物及产品中DHA和EPA的含量，结果见表1。
实例5：
实施例5与实施例1不同的是：
步骤(1)中，藻油与缓冲液的质量比为1∶0.7，按照900U/g藻油
的量加入脂肪酶酶粉，按照酶粉质量1.5倍的量加入环糊精；在42℃
条件下水解，至水解率达到47％后，停止反应。
步骤(2)中，藻油与缓冲液的质量比为1∶0.7，金属盐为MgCl2，
按照900U/g藻油的量加入脂肪酶酶粉，按照酶粉质量1.5倍的量加入
环糊精；在40℃条件下进行水解反应，在水解率达到25％后，按照
0.8wt％藻油的量补加KOH，总水解时间为60h。
步骤(3)中，脂肪酸∶尿素∶乙醇为1∶2.5∶6.5(w/w/v)，在70℃条
件下共混80min。
步骤(4)中，部分水解的甘油酯与n-3多不饱和脂肪酸浓缩物的
摩尔比为1∶5，按照12ml/g酸的量加入异辛烷构成有机相，按照
3500U/g酸的量加入固定化脂肪酶，在45℃条件下，振荡反应48h。
其余条件与实施例1相同，按照与实施例1相同的方式计算反应
过程的水解率，以及产物和产品的收率，并按照与实施例1相同的方
法检测反应产物及产品中DHA和EPA的含量，结果见表1。
实例6：
实施例6与实施例1不同的是：
步骤(1)中，按照800U/g藻油的量加入脂肪酶酶粉；在40℃条
件下水解，至水解率达到45％后，停止反应。
步骤(2)中，加入含6mM MgCl2的磷酸盐缓冲液，按照800U/g
藻油的量加入脂肪酶酶粉；在40℃条件下进行水解反应，在水解率达
到20％后，按照0.5wt％藻油的量补加KOH，总水解时间为80h。
步骤(3)中，脂肪酸∶尿素∶乙醇为1∶3∶7.5(w/w/v)，在60℃条件
下共混，包合时间为16h。
步骤(4)中，部分水解的甘油酯与n-3多不饱和脂肪酸浓缩物的
摩尔比为1∶7，按照15ml/g酸的量加入异辛烷构成有机相，按照
3000U/g酸的量加入固定化脂肪酶，在42℃条件下，振荡反应80h。
其余条件与实施例1相同，按照与实施例1相同的方式计算反应
过程的水解率，以及产物和产品的收率，并按照与实施例1相同的方
法检测反应产物及产品中DHA和EPA的含量，结果见表1。
实例7：
实施例7与实施例1不同的是：
步骤(1)中，藻油与缓冲液的质量比为1∶0.8，按照1000U/g藻
油的量加入Novozym435脂肪酶，不加环糊精；在40℃条件下水解，
至水解率达到55％后，停止反应。
步骤(2)中，按照藻油与缓冲液的质量比为1∶0.8的量加入含7mM
CaCl2的磷酸盐缓冲液，按照1000U/g藻油的量加入Novozym435脂
肪酶，不加环糊精；在40℃条件下进行水解反应，在水解率达到20％
后，按照0.5wt％藻油的量补加NaOH，总水解时间为48h时。
步骤(3)中，脂肪酸∶尿素∶乙醇为1∶2∶5.5(w/w/v)，在65℃条件
下共混80min，包合时间为16h。
步骤(4)中，部分水解的甘油酯与n-3多不饱和脂肪酸浓缩物的
摩尔比为1∶5，按照15ml/g酸的量加入异辛烷构成有机相，固定化脂
肪酶为Novozym435脂肪酶，在45℃条件下，振荡反应48h。
其余条件与实施例1相同，按照与实施例1相同的方式计算反应
过程的水解率，以及产物和产品的收率，并按照与实施例1相同的方
法检测反应产物及产品中DHA和EPA的含量，结果见表1。
实例8：
实施例8与实施例1不同的是：
步骤(1)中，藻油与缓冲液的质量比为1∶0.7，按照1400U/g藻
油的量加入Rhizomucormiehei脂肪酶，不加环糊精；在32℃条件下水
解，至水解率达到40％后，停止反应。
步骤(2)中，按照藻油与缓冲液的质量比为1∶0.7的量加入含6mM
CaCl2的磷酸盐缓冲液，按照1400U/g藻油的量加入Rhizomucormiehei
脂肪酶，不加环糊精；在32℃条件下进行水解反应，在水解率达到
20％后，补加NaOH，总水解时间为48h。
步骤(3)中，脂肪酸∶尿素∶乙醇为1∶2∶5(w/w/v)，在70℃条件下
共混70min，3℃条件下进行包合。
步骤(4)中，部分水解的甘油酯与n-3多不饱和脂肪酸浓缩物的
摩尔比为1∶8，按照18ml/g酸的量加入异辛烷构成有机相，按照
3500U/g酸的量加入Rhizomucormiehei脂肪酶，在45℃条件下，振荡
反应96h。
其余条件与实施例1相同，按照与实施例1相同的方式计算反应
过程的水解率，以及产物和产品的收率，并按照与实施例1相同的方
法检测反应产物及产品中DHA和EPA的含量，结果见表1。
实例9：
实施例9与实施例1不同的是：
步骤(1)中，按照1500U/g藻油的量加入Pseudomonas sp.脂肪
酶，不加环糊精；在40℃下水解，至水解率达到59％后，停止反应。
步骤(2)中，按照藻油与缓冲液的质量比为1∶0.7的量加入含5mM
CaCl2的磷酸盐缓冲液，按照1500U/g藻油的量加入Pseudomonas sp.
脂肪酶，不加环糊精；在40℃条件下进行水解反应，在水解率达到
20％后，补加NaOH，总水解时间为72h。
步骤(3)中，脂肪酸∶尿素∶乙醇为1∶4∶8(w/w/v)，在60℃条件下
共混80min，4℃条件下包合18h。
步骤(4)中，部分水解的甘油酯与n-3多不饱和脂肪酸浓缩物的
摩尔比为1∶4，按照16ml/g酸的量加入异辛烷构成有机相，按照
4000U/g酸的量加入Alcaligenes sp.脂肪酶，振荡反应时间为72h。
其余条件与实施例1相同，按照与实施例1相同的方式计算反应
过程的水解率，以及产物和产品的收率，并按照与实施例1相同的方
法检测反应产物及产品中DHA和EPA的含量，结果见表1。
表1