中度嗜热芽孢杆菌对蔗糖的发酵 本发明涉及中度嗜热芽孢杆菌 (Bacillus) 菌株的遗传修饰， 以将利用蔗糖的能 力提供给最初不具有该能力的芽孢杆菌菌株。
中度嗜热芽孢杆菌菌种， 优选为兼性厌氧和同型乳酸的那些菌种， 是用于乳酸的 工业生产的理想生物体。
在本发明的内容中， 中度嗜热芽孢杆菌菌种能够在 37 至 65℃下生长， 并且可以在 高于 50℃的温度下进行工业发酵。这种高发酵温度在以工业规模发酵时具有几个优点 ： 感 染的风险较低， 并且因此产物纯度较高、 反应较快等等。此外， 这些细菌的营养需求比那些 乳酸细菌 ( 如， 乳杆菌属 (Lactobacillus) 菌种 ) 的需求要低， 这还使得工业过程相对廉 价。
中度嗜热芽孢杆菌菌种包括需氧菌种和兼性厌氧菌种。优选使用兼性厌氧菌种， 因为这些菌种使得可以在厌氧条件下， 或至少在低氧分压下进行发酵， 这对于工业规模是 理想的。 这样的条件不需要高成本的通风， 并且能够使用低成本培养基， 同时最小化污染风 险， 乃至允许非无菌生产程序。
还优选使用同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌菌种。同型乳酸性质使得可以从烃源 ( 包括己糖和戊糖 ； 参见 WO04/063382) 生产乳酸， 而没有形成超过 15wt％的副产物， 如甲 酸和乙酸。同型乳酸表型的遗传修饰可以用于将同型乳酸菌株转化成同型发酵菌株， 用于 可从糖酵解， 如从磷酸烯醇丙酮酸和 / 或丙酮酸获得的其他工业产物。这些化合物的实例 是丙酮酸、 乙酰乳酸、 双乙酰、 醋偶姻、 2， 3- 丁二醇、 1， 2- 丙二醇、 醋酸、 甲酸盐、 乙醛、 乙醇、 L- 丙氨酸、 草酰乙酸、 S- 苹果酸、 琥珀酸盐、 延胡索酸、 2- 酮戊二酸、 草酰琥珀酸、 异柠檬酸、 柠檬酸、 乙醛酸。
优选地， 这些生产菌株是产孢缺陷型的。
中 度 嗜 热 且 兼 性 厌 氧 芽 孢 杆 菌 菌 种 的 实 例 是 凝 结 芽 孢 杆 菌 (Bacillus coagulans)、史 氏 芽 孢 杆 菌 (Bacillus smithii)、热 嗜 淀 粉 芽 孢 杆 菌 (Bacillus thermoamylovorans) 和热阴沟芽孢杆菌 (Bacillus thermocloacae)， 至少头两种菌种也是 同型乳酸的。优选的菌种是凝结芽孢杆菌。
在工业发酵中， 理想的是在发酵培养基中使用廉价的原材料。 例如， 蔗糖或含蔗糖 物质常常被用作用于工业发酵的低成本碳源。然而， 发现了不是所有用于工业发酵的中度 嗜热芽孢杆菌菌株都具有利用蔗糖作为碳源的能力。这是个缺陷， 尤其是如果这样的菌株 已经经过改造来提高它们以工业规模的发酵能力或生产潜能。 例如， 凝结芽孢杆菌菌株 DSM 1 看来是非常差的蔗糖发酵菌。使用蔗糖作为唯一碳源时， 观察到仅有很少的生长和酸形 成， 这可能是由于系统对利用其他糖的非特异性活性引起的。
在 文 献 中， 提 及 凝 结 芽 孢 杆 菌 的 蔗 糖 利 用 能 力 是 可 变 的 (De Clerck， E.， M.Rodriguez-Diaz， G.Forsyth， L.Lebbe， N.Logan， 2004 ： Polyphasic characterization of Bacillus coagulans strains.( 凝 结 芽 孢 杆 菌 菌 株 的 多 相 表 征 ))， Syst.Appl. Microbiol.27 ： 50-60)。然而， 没有任何可获得的关于蔗糖分解代谢中所涉及的基因的 信息， 并且在凝结芽孢杆菌 36D1 基因组序列中不存在任何为蔗糖分解代谢注释的基因
(http://genome.jgi-psf.org/draft microbes/bacco/bacco.home.html)。
因此， 本发明的一个目的是对最初不能利用蔗糖作为碳源的中度嗜热芽孢杆菌菌 株进行遗传修饰， 以提供具有利用蔗糖作为碳源的能力的菌株。本发明的另一个目的是利 用一种方法来生产目标化合物， 包括依靠含蔗糖的碳源来培养中度嗜热芽孢杆菌菌株。
不能利用蔗糖作为碳源的中度嗜热芽孢杆菌菌株可能缺少一个或多个蔗糖利用 中所涉及的基因。
现在本发明公开了蔗糖分解代谢中所涉及的并且可获自中度嗜热芽孢杆菌菌种 的新的基因和多肽， 优选获自中度嗜热且兼性厌氧的芽孢杆菌菌种， 最优选获自是同型乳 酸的中度嗜热且兼性厌氧的芽孢杆菌菌种。
新的多肽令人惊讶地展示出与来自其他芽孢杆菌菌种的相应多肽具有相当低的 同源性， 而观察到与来自乳杆菌菌种的相应多肽具有较高的同源性。新的基因和多肽可以 将蔗糖利用能力引入与从其可以获得新基因和多肽的菌种相同 ( 或密切相关 ) 的菌种的非 蔗糖利用中度嗜热芽孢杆菌菌株中。特别地， 新基因可以通过自体无性繁殖 ( 即， 利用物种 特异性遗传物质 ) 来引入遗传物质。
因此， 在本发明的一个方面中， 提供了从不能利用蔗糖作为碳源的亲本中度嗜热 芽孢杆菌菌株构建能够利用蔗糖作为碳源的中度嗜热杆菌菌株的方法。
特别地， 通过用实现蔗糖的利用必需的多核苷酸 ( 基因 ) 转化不能利用蔗糖作为 碳源的亲本中度嗜热芽孢杆菌菌株从所述亲本菌株产生能够利用蔗糖作为碳源的中度嗜 热芽孢杆菌菌株。如在此所公开的， 这种必需多核苷酸包括编码如下多肽的 DNA 序列， 所述 多肽具有蔗糖特异性磷酸转移酶活性和具有 i)SEQ ID NO ： 1 的氨基酸序列或 ii) 与 SEQ ID NO ： 1 的序列具有至少 70％， 优选至少 75、 80、 85、 90、 95％同一性的氨基酸序列， 和 / 或包括 编码如下多肽的 DNA 序列， 所述多肽具有蔗糖 -6- 磷酸水解酶活性和具有 iii)SEQ ID NO ： 2 的氨基酸序列或 iv) 与 SEQ ID NO ： 2 的序列具有至少 70％， 优选至少 75、 80、 85、 90、 95％ 同一性的氨基酸序列。
可以使用本领域技术人员已知的任何合适的转化程序来进行将用于实现蔗糖的 利用的多核苷酸引入目标中度嗜热芽孢杆菌菌株中， 所述转化程序包括原生质体转化或 原生质体融合、 电穿孔、 生物射弹转化、 接合或天然感受态细胞的转化。例如， 可以使用如 WO2007/085443 中公开的转化程序， 在此将该文献引入作为参考。
可以使用自主复制质粒或通过染色体整合来引入用于实现蔗糖的利用的多核苷 酸。对于工业应用， 优选后者， 因为通常认为染色体整合更稳定， 并且将确保多核苷酸在后 代细胞中的稳定分配。 蔗糖发酵自身可能是维持用于实现蔗糖的利用的多核苷酸的选择压 力。可以通过非同源性以及同源性重组来进行多核苷酸引入染色体中。
优选同源性重组， 因为其打开了将功能性引入细菌染色体中、 从细菌染色体中除 去功能性或同时将功能性引入细菌染色体中和从细菌染色体中除去功能性的机会。 当试图 进行同源性重组时， 转化多核苷酸进一步含有与待工程化的特定芽孢杆菌的基因组目标序 列同源的 DNA 序列。对于该目的， 可以选择任何合适的目标序列。例如， 合适的基因组目标 序列位于基因组的非编码区。本领域技术人员将理解不需要 100％的同一性来获得同源性 重组。约 90％的同一性百分比也将满足要求。通常， 待通过同源性重组插入染色体中的目 标 DNA 序列两侧为具有足够长度的同源性序列， 以能够进行同源性重组。这样的长度可以是至少约 100bp， 例如， 约 200 至约 1500bp， 优选约 200 至约 1000bp。
为了完成用于实现蔗糖的利用的多核苷酸的表达， 给多核苷酸的编码序列提供了 必需的调控序列。这些调控序列可以是天然调控序列或可以是与所讨论的编码序列异源 的。
在进一步的方面中， 提供了新的多肽， 即， 具有蔗糖特异性磷酸转移酶活性的多肽 和具有蔗糖 -6- 磷酸水解酶活性的多肽。具有蔗糖特异性磷酸转移酶活性的多肽具有 i) SEQ ID NO ： 1 的氨基酸序列或 ii) 与 SEQ ID NO ： 1 的序列具有至少 70％， 优选至少 75％， 更优选至少 80％， 再更优选至少 85％， 再更优选至少 90％， 最优选至少 95％同一性的氨基 酸序列。具有蔗糖 -6- 磷酸水解酶活性的多肽具有 i)SEQ ID NO ： 2 的氨基酸序列或 ii) 与 SEQ ID NO ： 2 的序列具有至少 70％， 优选至少 75％， 更优选至少 80％， 再更优选至少 85％， 再更优选至少 90％， 最优选至少 95％同一性的氨基酸序列。
具有 SEQ ID NO ： 1 的氨基酸序列的蔗糖特异性磷酸转移酶多肽与来自戊糖片球 菌 (Pediococcus pentosaceus) 和植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)( 在蛋白质水 平上都是 62 ％的同一性 ) 以及其他乳酸细菌的蔗糖特异性 PTS 系统 EIIBCA 组成部分享 有显著的同源性。令人惊讶地， 与其他芽孢杆菌菌种的同源性低得多， 与克劳氏芽孢杆菌 (Bacillus clausii) 同源物具有最高的同一性 ( 在蛋白质水平上为 44％同一性 )。 具有 SEQ ID NO ： 2 的氨基酸序列的蔗糖 -6- 磷酸水解酶多肽与来自清酒乳杆菌 (Lactobacillus sakei)( 在蛋白质水平为 50％同一性 ) 以及其他乳酸细菌的蔗糖 -6- 磷 酸水解酶享有显著的同源性。对于这种多肽， 也令人惊讶地看到了与其他芽孢杆菌同源物 的同源性低于与乳酸细菌的。最接近的芽孢杆菌同源物来自克劳氏芽孢杆菌 ( 在蛋白质水 平上为 41％同一性 )。
对于本发明的目的， 两个氨基酸序列之间的同一性程度指的是两个序列之间相 同氨基酸的百分比。使用 BLAST 算法确定同一性程度， 所述算法描述于 Altschul 等， J.Mol.Biol.215 ： 403-410(1990)。 用于进行 BLAST 分析的软件通过国家生物技术信息中心 (NationalCenter for Biotechnology Information)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) 可 公开获得。BLAST 算法参数 W、 T 和 X 决定比对的灵敏度和速度。BLASTP 算法作为缺省值使 用： 字长 ： 3； 预期值 ： 10 ； Hitlist 大小 100 ； Gapcosts ： 11， 1； 矩阵 ： BLOSUM62。
在进一步的方面中， 提供了编码前一方面的多肽的多核苷酸， 例如， 具有根据 SEQ ID NO ： 3 或 SEQ ID NO ： 4 的序列的多核苷酸。
以上方面的多肽和多核苷酸可用于构建如在此所述的能够利用蔗糖作为碳源的 中度嗜热芽孢杆菌菌株。
在进一步的方面中， 提供了生产目标化合物的方法， 包括依靠含蔗糖碳源培养中 度嗜热芽孢杆菌菌株。 该方法的特征在于通过给不能利用蔗糖作为碳源的亲本中度嗜热芽 孢杆菌菌株提供利用蔗糖作为碳源的能力， 从所述亲本菌株产生待培养的中度嗜热芽孢杆 菌菌株。
使用之前方面中所述的方法和多核苷酸， 给不能利用蔗糖作为碳源的亲本中度嗜 热芽孢杆菌菌株提供利用蔗糖作为碳源的能力。使用这种方法和多核苷酸， 本发明有利地 可以依靠含蔗糖碳源培养适应工业培养条件和 / 或选择以具有高生产潜能和最初不具有 利用蔗糖能力的中度嗜热芽孢杆菌菌株。
用于培养中度嗜热芽孢杆菌菌株的碳源可以含有至少 0.5％ (w/w) 水平的蔗糖， 基于碳源的总重。还可以使用蔗糖作为唯一碳源。
可以在本领域技术人员公知的常规条件下进行进一步的培养。
培养后， 当需要时， 任选地从发酵培养基中分离出所形成的目标化合物并纯化。 常 规纯化 / 分离方法， 例如， 用于乳酸的， 是蒸馏、 萃取、 电渗析、 吸附、 离子交换、 结晶等， 以及 上述纯化 / 分离方法的组合。
目标化合物可以是乳酸。术语 “乳酸” 意指游离酸或盐形式的 2- 羟基 - 丙酸。乳 酸含有手性碳原子， 并且为此以 (R) 和 (S) 对映异构体存在。如本申请中所用的术语 “乳 酸” 包括纯的 (R) 和 (S) 异构体， 及其混合物， 包括外消旋混合物。对于 R- 乳酸的生产， 可 以使用按照 WO2007/085443 中所述的进行遗传修饰的生产菌株， 在此将该文献引入作为参 考。
目标化合物可以进一步地是丙酮酸， 使用其中丙酮酸转化成乳酸被阻断的菌株。 目标化合物可以进一步地是源自丙酮酸的化合物， 使用其中使丙酮酸改变方向朝着产生这 种化合物的方向的菌株， 所述化合物包括乙酰乳酸、 双乙酰、 醋偶姻、 2， 3- 丁二醇、 1， 2- 丙 二醇、 醋酸、 甲酸盐、 乙醛、 乙醇、 L- 丙氨酸、 草酰乙酸、 S- 苹果酸、 琥珀酸、 延胡索酸、 2- 酮戊 二酸、 草酰琥珀酸、 异柠檬酸、 柠檬酸、 乙醛酸。
附图描述
图 1 显示了来自凝结芽孢杆菌的蔗糖操纵子的基因组图谱， 描绘了蔗糖 PTS 酶 II 基因 (scrA) 和蔗糖 -6- 磷酸水解酶基因 (scrB)。
图 2 显示了 pMH84 的质粒图谱。用箭头描绘了复制基因 (repA 和 repB)、 氯霉素 抗性基因 (cat)、 蔗糖 PTS 酶 II 基因 (scrA) 和蔗糖 -6- 磷酸水解酶基因 (scrB)。用框表 示了对于双交叉重组的同源上游 (us) 和下游 (ds) 区域 ( 灰色 )、 凝结芽孢杆菌启动子区 域 (Bco ； 白色 )， 和 lox 位点 (lox71 和 lox66 ； 黑色 )。对于 Bg1II 和 NcoI， 只包括了用于 构建的相关位点。 实施例 菌株和培养条件
凝结芽孢杆菌 DSM1 获自德国 DSMZ， Braunschweig。将凝结芽孢杆菌在含有 50g/ l 葡萄糖的 BC- 培养液 (WO 2007/085443) 中， 在需氧条件 (120rpm) 下， 在 50 ℃下， 常规 地生长。如果合适， 给培养基补充 7mg/l 的氯霉素。按照之前所述的 (WO 2007/085443)， 用 Gelrite 制备 BC 平板。为了评价碳利用， 将凝结芽孢杆菌生长在化学限定培养基 (CDM) 中， 所述培养基每升含有 2.0g(NH4)2HPO4、 3.5g(NH4)2SO4、 10g Bis-Tris 缓冲剂 ( 二 [2- 羟 甲基 ] 亚氨基三 [ 羟甲基 ]- 甲烷 )、 0.5gKCl、 0.234g L- 精氨酸、 0.304g L- 天冬氨酸、 0.026g L- 胱氨酸、 0.470g 谷氨酸、 0.093g L- 组氨酸、 0.360g L- 异亮氨酸、 0.581g L- 亮氨 酸、 0.111g L- 甲硫氨酸、 0.197g L- 脯氨酸、 0.308g L- 丝氨酸、 0.350g L- 苏氨酸、 0.345g L- 缬 氨 酸、 0.2g MgCl2·6H2O、 50mg CaCl2·2H2O、 16mg MnCl2、 7mg FeSO4·7H2O、 0.1mg 硫 胺素、 0.5mg 烟酸、 0.1mg 泛酸、 0.5mg 吡哆胺、 0.5mg 吡哆醛、 0.1mg D- 生物素、 0.1mg 叶酸、 0.1mgp- 氨基苯甲酸、 0.1mg 钴胺素。如果合适， 给 CDM 补充每升 5g 葡萄糖或 5g 蔗糖。 Gasson 描 述 了 乳 酸 乳 球 菌 (Lactococcus lactis)MG1363(Gasson， M.J.， 1983 ： Plasmid
complements of Streptococcus lactis NCDO 712 and other lactic streptococci after protoplast-induced curing， J.Bacteriol.154 ： 1-9)。在含有 5g/l 葡萄糖的 M17 培养液 (Difco) 中， 在 30℃下， 常规地培养乳酸乳球菌。
将细菌贮存在甘油储液中， 使用 15％ (v/v) 甘油， 在 -80℃下。
DNA 操纵技术
按 照 Sambrook 和 Russell(J.Sambrook 和 D.W.Russell.2001 ： Molecular Cloning， a laboratory manual， 第 3 版， Cold Spring Harbor Laboratory Press， New York) 所述的， 进行了标准 DNA 操纵技术。
按照制造商的说明， 使用 Jetstar 2.0Plasmid Maxiprep (Genomed)， 进行 了从 100mL 培养物的大规模质粒 DNA 分离。按照制造商的说明， 使用 Nucleospin Plasmid Quick (Macherey-Nagel) 试剂盒， 进行了从 1mL 培养物的小规模质粒 DNA 分离。
在整合质粒 pMH84 的构建过程中， 乳酸乳球菌用作中间宿主 ( 图 2)。按照 Holo 和 Nes(Holo， H. 和 I.F.Nes， 1989 ： High-frequency transformation， by electroporation， of Lactococcus lactis subsp.cremoris grown with glycine in osmotically stabilized media， Appl.Environ.Microbiol.55 ： 3119-3123) 所述的， 进行了乳酸乳球菌感受态细胞 的制备和电穿孔。 按照 WO 2007/085443 中所述的， 通过电穿孔来转化凝结乳杆菌。
按照制造商的说明， 使用高保真度 Pwo 聚合酶 (Roche)， 进行了用于克隆目的的 PCR 反应。
按照 WO 2007/085443 中所述的， 使用菌落 -PCR 分析来证明氯霉素抗性菌落中 pNW33N 的存在。
发酵
在 50℃下， 使用 10ml BC 培养液或 CDM， 在螺帽试管 (13mL) 中进行凝结芽孢杆菌 分批发酵。在发酵结束时， 取出样品， 用于测量发酵培养液在 600nm 下的浊度、 pH 和有机酸 含量。对于后者， 将样品离心， 并通过使用 Millex GP 0.22μm 滤器 (Millipore) 的过滤 来除去上清液中剩余的碎片。将滤液冷冻， 直至进一步的分析。
使用衍生和 GLC 来测量有机酸 ( 甲酸、 乙酸、 丙酸、 乙醇、 丁酸、 丙酮酸、 乳酸、 2- 羟 基丁酸、 乙醇酸、 草酸、 山梨酸、 富马酸、 琥珀酸、 苯甲酸、 马来酸、 苹果酸、 柠檬酸 )。将 R- 和 S- 乳酸甲基化成甲基 - 乳酸， 并通过手性柱上的顶部空间分析来测量。
实施例 1. 凝结芽孢杆菌蔗糖利用整合质粒的构建
选定蔗糖发酵凝结芽孢杆菌菌株的随机序列分析揭示了与蔗糖 PTS 酶 II 和蔗 糖 -6- 磷酸水解酶基因具有序列同源性的两个基因的区域 ( 分别为 scrA 和 scrB)。该区 域的基因图谱显示于图 1 中。使用引物 5′ -AGTACTGCATGCTTAAAGAGTAGCTTTCGGTGTTAAAGT G-3′ ( 引入 SphI 位点， SEQ ID NO ： 6) 和 5′ -AGTACTGAGCTCCTATTTATTAATAGAATGAAGACTCC AGTAGTTCCC-3′ ( 引入 SacI 位点， SEQ ID NO ： 7)， 与来自蔗糖发酵凝结芽孢杆菌菌株的基 因组 DNA 作为模板 DNA 结合， 用高保真度 PCR 产生了含有 scrAB 基因簇及其启动子 (SEQ ID NO ： 5 中所述 ) 的 DNA 片段。 或者 scrAB 基因簇可以作为具有 SEQ ID NO ： 5 中所示序列的合 成 DNA 产生。将凝结芽孢杆菌整合质粒进行了修饰， 使得可以在凝结芽孢杆菌 DSM 1 染色 体中整合 scrAB 基因簇。将染色体整合位点的 1.0kb 上游和下游片段用于重组。整合载体
pMH84( 图 2) 是基于乳球菌克隆载体 pMH 3(WO 2007/085443) 并且具有在凝结芽孢杆菌中 的热敏复制子。 首先， 通过凝结芽孢杆菌启动子替代 cat 启动子。 为此， 通过翻译融合至 cat 基因的组成型凝结芽孢杆菌启动子的融合 PCR 产物替代含有 cat 基因的 pMH3 Bg1II-SalI 片段， 同时引入与 cat 起始密码子 (SEQ ID NO ： 18) 重叠的 NcoI 位点。 使用引物组合 ( 正向 )5′ -CGCGTCGACTGTGGATAAGACAACAGGATTCGTATG-3′ ( 引入 SalI 位点， SEQ ID NO ： 8) 和 ( 反 向 )5′ -CTAAATCAATTTTATTAAAGTCCATGGGTCCACCCCGTTCTTTTCTTTTTGTG-3′ ( 引入 NcoI 位 点， SEQ ID NO ： 9)， 以及来自蔗糖发酵凝结芽孢杆菌菌株的基因组 DNA 作为模板 DNA， 产生 了启动子部分。使用引物组合 ( 正向 )5′ -CACAAAAAGAAAAGAACGGGGTGGACCCATGGACTTTAAT AAAATTGATTTAG-3′ ( 引入 NcoI 位点， SEQ ID NO ： 10) 和 ( 反向 )5′ -CGCAGATCTCCTTCTT CAACTAACGGG-3′ ( 引入 BglII 位点， SEQ ID NO ： 11)， 使用 pMH3 作为模板， 产生了 cat 基 因。将两个产物都用作新 PCR 反应中的模板， 使用启动子正向和 cat 反向引物。该片段还 可以作为具有 SEQ ID NO ： 18 中所示序列的合成 DNA 产生。将所得到质粒命名为 pMH71。 为了能够多重使用 Cre-lox 系统， 使用引物 5′ -CCCGTCGACGCTAGCTACCGTTCGTATAATGTATG CTATACGAAGTTATGTGGATAAGACAACAGGATTCG-3′ ( 引 lox66， SalI 和 NheI 位点， SEQ ID NO ： 12) 和 5′ -CGCAGATCTTACCGTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCCTTCTTCAACTAACGGGGCAGGT TAG-3′ ( 引入 lox71 和 BglII 位点， SEQ ID NO ： 13) 以及 pMH71 作为模板， 通过 PCR， 在启 动子 -cat 片段两侧引入了 lox66 和 lox71 位点 (Langer， S.J.， A.P.Ghafoori， M.Byrd， 和 L.Leinwand， 2002 ： A genetic screen identifies novel non-compatible loxP sites， Nucleic Acids Res.30 ： 3067-3077.， Lambert， J.M.， R.S.Bongers， 和 M.Kleere-bezem， 2007 ： Cre-lox-based system for multiple gene deletions and selectable-market removal in Lactobacillus plantarum， Appl.Environ.Microbiol.73 ： 1126-1135)。所得 到的 PCR 产物用 BglII-SalI 消化并用于与 pMH71 的 BglI-SalI 启动子 -cat 片段交换， 产 生质粒 pMH77。使用引物 5′ -CGCCTCGAGAGATCTGGCCGGGCTTTATGGGAGG-3′ ( 引入 XhoI 和 BglII 位点， SEQ ID NO ： 14) 和 5′ -GCCGAGCTCGCATGCCCCTGATCAACCGGGTCAGTGC( 引入 SacI 和 SphI 位点， SEQ ID NO ： 15) 以及凝结芽孢杆菌 DSM 1 染色体 DNA 作为模板， 通过 PCR， 产生 了整合位点的上游片段。 使用 SacI 和 XhoI， 在 pMH77 中克隆 PCR 产物。 这产生了 pMH82。 使 用引物 5′ -CCCGCTAGCCGTTTCAATCACATAGTCGTATTG( 引 NheI 位点， SEQ ID NO ： 16) 和 5′ -C CGGTCGACGGCCTTCATGTGCTTTTGCCGCAAATTC( 引入 SalI 位点， SEQ ID NO ： 17) 以及凝结芽孢 杆菌 DSM 1 染色体 DNA 作为模板， 通过 PCR， 产生了整合位点的下游片段。作为 SalI-NheI 片段， 在 pMH82 中克隆了 PCR 产物， 产生 pMH83。在用相同的酶消化的 pMH83 中， 作为 SphI 和 SacI 片段， 克隆了含有 scrAB 基因的 DNA 片段， 这产生了整合载体 pMH84( 图 2)。分离质 粒 pMH84 并且通过 DNA 序列分离证实了 scrAB 基因簇、 上游和下游区域以及 lox 位点的完 整性。
实施例 2. 凝结芽孢杆菌 DSM1 中 scrAB 的基因组整合
为了 scrAB 基因通过基因组整合至凝结芽孢杆菌 DSM1 中， 通过电穿孔将质粒 pMH84 转化至该菌株中， 并涂布于补充了氯霉素的 BC 平板上。通过菌落 PCR 筛选转化体中 质粒的存在。将阳性菌落进行培养， 用于质粒分离， 并通过限制性分析证实了质粒的完整 性。选择一个转化体用于进一步的实验。在 60℃下培养并且选择氯霉素抗性菌落后， 建立 了通过双重交叉交换的蔗糖基因的整合。 选择一个整合体用于进一步的研究并且作为甘油储液进行贮存。通过融合位点的 PCR 分析和序列分离证实了该正确的整合。将该菌株命名 为凝结芽孢杆菌 DSM 1::scrAB。
实施例 3. 使用凝结芽孢杆菌的蔗糖发酵
在该实施例中， 发明人证明了怎样能够修饰不能有效蔗糖发酵的凝结芽孢杆菌菌 株以变成蔗糖发酵的。 将来自甘油储液的凝结芽孢杆菌 DSM 1 和 DSM 1::scrAB 接种于 10ml 不含糖的 BC 肉汤中， 并且在 120rpm 下， 在 50 ℃下培养。将过夜培养物转移 (2 ％ v/v) 至 10ml 补充了葡萄糖的 CDM 中。过夜培养后， 使培养物成团， 并且将团状物重悬浮于 10ml 不 含糖的 CDM 中。 对于每个菌株， 从重悬浮的培养物接种 (2％ v/v)10ml CDM 的三个重复部分 中， 所述 CDM 补充了 5g 葡萄糖 / 升， 5g 蔗糖 / 升， 或不含糖。在螺帽试管中 50 小时静止培 养后， 测定了肉汤上清液在 600nm 处的浊度、 pH 和有机酸含量 ( 表 1)。结果证明了适当的 厌氧生长需要糖， 并且凝结芽孢杆菌 DSM 1::scrAB 能够将蔗糖发酵成乳酸， 而凝结芽孢杆 菌 DSM1 不能。糖的不存在导致两种凝结芽孢杆菌菌株都没有生长且没有酸化。在蔗糖的 存在下， DSM 1 显示出没有生长且没有酸化， 而凝结芽孢杆菌 DSM 1::scrAB 具有良好的生 长和酸化。乳酸是培养物上清液中检测到的唯一一种有机酸。这证明了引入凝结芽孢杆菌 scrAB 基因盒对于使用凝结芽孢杆菌的有效蔗糖发酵是足够的。
表 1.50 小时培养后的发酵特征 a
中度嗜热芽孢杆菌菌种， 优选为兼性厌氧和同型乳酸的那些菌种， 是用于乳酸的 工业生产的理想生物体。
在本发明的内容中， 中度嗜热芽孢杆菌菌种能够在 37 至 65℃下生长， 并且可以在 高于 50℃的温度下进行工业发酵。这种高发酵温度在以工业规模发酵时具有几个优点 ： 感 染的风险较低， 并且因此产物纯度较高、 反应较快等等。此外， 这些细菌的营养需求比那些 乳酸细菌 ( 如， 乳杆菌属 (Lactobacillus) 菌种 ) 的需求要低， 这还使得工业过程相对廉 价。
中度嗜热芽孢杆菌菌种包括需氧菌种和兼性厌氧菌种。优选使用兼性厌氧菌种， 因为这些菌种使得可以在厌氧条件下， 或至少在低氧分压下进行发酵， 这对于工业规模是 理想的。 这样的条件不需要高成本的通风， 并且能够使用低成本培养基， 同时最小化污染风 险， 乃至允许非无菌生产程序。
还优选使用同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌菌种。同型乳酸性质使得可以从烃源 ( 包括己糖和戊糖 ； 参见 WO04/063382) 生产乳酸， 而没有形成超过 15wt％的副产物， 如甲 酸和乙酸。同型乳酸表型的遗传修饰可以用于将同型乳酸菌株转化成同型发酵菌株， 用于 可从糖酵解， 如从磷酸烯醇丙酮酸和 / 或丙酮酸获得的其他工业产物。这些化合物的实例 是丙酮酸、 乙酰乳酸、 双乙酰、 醋偶姻、 2， 3- 丁二醇、 1， 2- 丙二醇、 醋酸、 甲酸盐、 乙醛、 乙醇、 L- 丙氨酸、 草酰乙酸、 S- 苹果酸、 琥珀酸盐、 延胡索酸、 2- 酮戊二酸、 草酰琥珀酸、 异柠檬酸、 柠檬酸、 乙醛酸。
优选地， 这些生产菌株是产孢缺陷型的。
中 度 嗜 热 且 兼 性 厌 氧 芽 孢 杆 菌 菌 种 的 实 例 是 凝 结 芽 孢 杆 菌 (Bacillus coagulans)、史 氏 芽 孢 杆 菌 (Bacillus smithii)、热 嗜 淀 粉 芽 孢 杆 菌 (Bacillus thermoamylovorans) 和热阴沟芽孢杆菌 (Bacillus thermocloacae)， 至少头两种菌种也是 同型乳酸的。优选的菌种是凝结芽孢杆菌。
在工业发酵中， 理想的是在发酵培养基中使用廉价的原材料。 例如， 蔗糖或含蔗糖 物质常常被用作用于工业发酵的低成本碳源。然而， 发现了不是所有用于工业发酵的中度 嗜热芽孢杆菌菌株都具有利用蔗糖作为碳源的能力。这是个缺陷， 尤其是如果这样的菌株 已经经过改造来提高它们以工业规模的发酵能力或生产潜能。 例如， 凝结芽孢杆菌菌株 DSM 1 看来是非常差的蔗糖发酵菌。使用蔗糖作为唯一碳源时， 观察到仅有很少的生长和酸形 成， 这可能是由于系统对利用其他糖的非特异性活性引起的。
在 文 献 中， 提 及 凝 结 芽 孢 杆 菌 的 蔗 糖 利 用 能 力 是 可 变 的 (De Clerck， E.， M.Rodriguez-Diaz， G.Forsyth， L.Lebbe， N.Logan， 2004 ： Polyphasic characterization of Bacillus coagulans strains.( 凝 结 芽 孢 杆 菌 菌 株 的 多 相 表 征 ))， Syst.Appl. Microbiol.27 ： 50-60)。然而， 没有任何可获得的关于蔗糖分解代谢中所涉及的基因的 信息， 并且在凝结芽孢杆菌 36D1 基因组序列中不存在任何为蔗糖分解代谢注释的基因
(http://genome.jgi-psf.org/draft microbes/bacco/bacco.home.html)。
因此， 本发明的一个目的是对最初不能利用蔗糖作为碳源的中度嗜热芽孢杆菌菌 株进行遗传修饰， 以提供具有利用蔗糖作为碳源的能力的菌株。本发明的另一个目的是利 用一种方法来生产目标化合物， 包括依靠含蔗糖的碳源来培养中度嗜热芽孢杆菌菌株。
不能利用蔗糖作为碳源的中度嗜热芽孢杆菌菌株可能缺少一个或多个蔗糖利用 中所涉及的基因。
现在本发明公开了蔗糖分解代谢中所涉及的并且可获自中度嗜热芽孢杆菌菌种 的新的基因和多肽， 优选获自中度嗜热且兼性厌氧的芽孢杆菌菌种， 最优选获自是同型乳 酸的中度嗜热且兼性厌氧的芽孢杆菌菌种。
新的多肽令人惊讶地展示出与来自其他芽孢杆菌菌种的相应多肽具有相当低的 同源性， 而观察到与来自乳杆菌菌种的相应多肽具有较高的同源性。新的基因和多肽可以 将蔗糖利用能力引入与从其可以获得新基因和多肽的菌种相同 ( 或密切相关 ) 的菌种的非 蔗糖利用中度嗜热芽孢杆菌菌株中。特别地， 新基因可以通过自体无性繁殖 ( 即， 利用物种 特异性遗传物质 ) 来引入遗传物质。
因此， 在本发明的一个方面中， 提供了从不能利用蔗糖作为碳源的亲本中度嗜热 芽孢杆菌菌株构建能够利用蔗糖作为碳源的中度嗜热杆菌菌株的方法。
特别地， 通过用实现蔗糖的利用必需的多核苷酸 ( 基因 ) 转化不能利用蔗糖作为 碳源的亲本中度嗜热芽孢杆菌菌株从所述亲本菌株产生能够利用蔗糖作为碳源的中度嗜 热芽孢杆菌菌株。如在此所公开的， 这种必需多核苷酸包括编码如下多肽的 DNA 序列， 所述 多肽具有蔗糖特异性磷酸转移酶活性和具有 i)SEQ ID NO ： 1 的氨基酸序列或 ii) 与 SEQ ID NO ： 1 的序列具有至少 70％， 优选至少 75、 80、 85、 90、 95％同一性的氨基酸序列， 和 / 或包括 编码如下多肽的 DNA 序列， 所述多肽具有蔗糖 -6- 磷酸水解酶活性和具有 iii)SEQ ID NO ： 2 的氨基酸序列或 iv) 与 SEQ ID NO ： 2 的序列具有至少 70％， 优选至少 75、 80、 85、 90、 95％ 同一性的氨基酸序列。
可以使用本领域技术人员已知的任何合适的转化程序来进行将用于实现蔗糖的 利用的多核苷酸引入目标中度嗜热芽孢杆菌菌株中， 所述转化程序包括原生质体转化或 原生质体融合、 电穿孔、 生物射弹转化、 接合或天然感受态细胞的转化。例如， 可以使用如 WO2007/085443 中公开的转化程序， 在此将该文献引入作为参考。
可以使用自主复制质粒或通过染色体整合来引入用于实现蔗糖的利用的多核苷 酸。对于工业应用， 优选后者， 因为通常认为染色体整合更稳定， 并且将确保多核苷酸在后 代细胞中的稳定分配。 蔗糖发酵自身可能是维持用于实现蔗糖的利用的多核苷酸的选择压 力。可以通过非同源性以及同源性重组来进行多核苷酸引入染色体中。
优选同源性重组， 因为其打开了将功能性引入细菌染色体中、 从细菌染色体中除 去功能性或同时将功能性引入细菌染色体中和从细菌染色体中除去功能性的机会。 当试图 进行同源性重组时， 转化多核苷酸进一步含有与待工程化的特定芽孢杆菌的基因组目标序 列同源的 DNA 序列。对于该目的， 可以选择任何合适的目标序列。例如， 合适的基因组目标 序列位于基因组的非编码区。本领域技术人员将理解不需要 100％的同一性来获得同源性 重组。约 90％的同一性百分比也将满足要求。通常， 待通过同源性重组插入染色体中的目 标 DNA 序列两侧为具有足够长度的同源性序列， 以能够进行同源性重组。这样的长度可以是至少约 100bp， 例如， 约 200 至约 1500bp， 优选约 200 至约 1000bp。
为了完成用于实现蔗糖的利用的多核苷酸的表达， 给多核苷酸的编码序列提供了 必需的调控序列。这些调控序列可以是天然调控序列或可以是与所讨论的编码序列异源 的。
在进一步的方面中， 提供了新的多肽， 即， 具有蔗糖特异性磷酸转移酶活性的多肽 和具有蔗糖 -6- 磷酸水解酶活性的多肽。具有蔗糖特异性磷酸转移酶活性的多肽具有 i) SEQ ID NO ： 1 的氨基酸序列或 ii) 与 SEQ ID NO ： 1 的序列具有至少 70％， 优选至少 75％， 更优选至少 80％， 再更优选至少 85％， 再更优选至少 90％， 最优选至少 95％同一性的氨基 酸序列。具有蔗糖 -6- 磷酸水解酶活性的多肽具有 i)SEQ ID NO ： 2 的氨基酸序列或 ii) 与 SEQ ID NO ： 2 的序列具有至少 70％， 优选至少 75％， 更优选至少 80％， 再更优选至少 85％， 再更优选至少 90％， 最优选至少 95％同一性的氨基酸序列。
具有 SEQ ID NO ： 1 的氨基酸序列的蔗糖特异性磷酸转移酶多肽与来自戊糖片球 菌 (Pediococcus pentosaceus) 和植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)( 在蛋白质水 平上都是 62 ％的同一性 ) 以及其他乳酸细菌的蔗糖特异性 PTS 系统 EIIBCA 组成部分享 有显著的同源性。令人惊讶地， 与其他芽孢杆菌菌种的同源性低得多， 与克劳氏芽孢杆菌 (Bacillus clausii) 同源物具有最高的同一性 ( 在蛋白质水平上为 44％同一性 )。 具有 SEQ ID NO ： 2 的氨基酸序列的蔗糖 -6- 磷酸水解酶多肽与来自清酒乳杆菌 (Lactobacillus sakei)( 在蛋白质水平为 50％同一性 ) 以及其他乳酸细菌的蔗糖 -6- 磷 酸水解酶享有显著的同源性。对于这种多肽， 也令人惊讶地看到了与其他芽孢杆菌同源物 的同源性低于与乳酸细菌的。最接近的芽孢杆菌同源物来自克劳氏芽孢杆菌 ( 在蛋白质水 平上为 41％同一性 )。
对于本发明的目的， 两个氨基酸序列之间的同一性程度指的是两个序列之间相 同氨基酸的百分比。使用 BLAST 算法确定同一性程度， 所述算法描述于 Altschul 等， J.Mol.Biol.215 ： 403-410(1990)。 用于进行 BLAST 分析的软件通过国家生物技术信息中心 (NationalCenter for Biotechnology Information)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) 可 公开获得。BLAST 算法参数 W、 T 和 X 决定比对的灵敏度和速度。BLASTP 算法作为缺省值使 用： 字长 ： 3； 预期值 ： 10 ； Hitlist 大小 100 ； Gapcosts ： 11， 1； 矩阵 ： BLOSUM62。
在进一步的方面中， 提供了编码前一方面的多肽的多核苷酸， 例如， 具有根据 SEQ ID NO ： 3 或 SEQ ID NO ： 4 的序列的多核苷酸。
以上方面的多肽和多核苷酸可用于构建如在此所述的能够利用蔗糖作为碳源的 中度嗜热芽孢杆菌菌株。
在进一步的方面中， 提供了生产目标化合物的方法， 包括依靠含蔗糖碳源培养中 度嗜热芽孢杆菌菌株。 该方法的特征在于通过给不能利用蔗糖作为碳源的亲本中度嗜热芽 孢杆菌菌株提供利用蔗糖作为碳源的能力， 从所述亲本菌株产生待培养的中度嗜热芽孢杆 菌菌株。
使用之前方面中所述的方法和多核苷酸， 给不能利用蔗糖作为碳源的亲本中度嗜 热芽孢杆菌菌株提供利用蔗糖作为碳源的能力。使用这种方法和多核苷酸， 本发明有利地 可以依靠含蔗糖碳源培养适应工业培养条件和 / 或选择以具有高生产潜能和最初不具有 利用蔗糖能力的中度嗜热芽孢杆菌菌株。
用于培养中度嗜热芽孢杆菌菌株的碳源可以含有至少 0.5％ (w/w) 水平的蔗糖， 基于碳源的总重。还可以使用蔗糖作为唯一碳源。
可以在本领域技术人员公知的常规条件下进行进一步的培养。
培养后， 当需要时， 任选地从发酵培养基中分离出所形成的目标化合物并纯化。 常 规纯化 / 分离方法， 例如， 用于乳酸的， 是蒸馏、 萃取、 电渗析、 吸附、 离子交换、 结晶等， 以及 上述纯化 / 分离方法的组合。
目标化合物可以是乳酸。术语 “乳酸” 意指游离酸或盐形式的 2- 羟基 - 丙酸。乳 酸含有手性碳原子， 并且为此以 (R) 和 (S) 对映异构体存在。如本申请中所用的术语 “乳 酸” 包括纯的 (R) 和 (S) 异构体， 及其混合物， 包括外消旋混合物。对于 R- 乳酸的生产， 可 以使用按照 WO2007/085443 中所述的进行遗传修饰的生产菌株， 在此将该文献引入作为参 考。
目标化合物可以进一步地是丙酮酸， 使用其中丙酮酸转化成乳酸被阻断的菌株。 目标化合物可以进一步地是源自丙酮酸的化合物， 使用其中使丙酮酸改变方向朝着产生这 种化合物的方向的菌株， 所述化合物包括乙酰乳酸、 双乙酰、 醋偶姻、 2， 3- 丁二醇、 1， 2- 丙 二醇、 醋酸、 甲酸盐、 乙醛、 乙醇、 L- 丙氨酸、 草酰乙酸、 S- 苹果酸、 琥珀酸、 延胡索酸、 2- 酮戊 二酸、 草酰琥珀酸、 异柠檬酸、 柠檬酸、 乙醛酸。
附图描述
图 1 显示了来自凝结芽孢杆菌的蔗糖操纵子的基因组图谱， 描绘了蔗糖 PTS 酶 II 基因 (scrA) 和蔗糖 -6- 磷酸水解酶基因 (scrB)。
图 2 显示了 pMH84 的质粒图谱。用箭头描绘了复制基因 (repA 和 repB)、 氯霉素 抗性基因 (cat)、 蔗糖 PTS 酶 II 基因 (scrA) 和蔗糖 -6- 磷酸水解酶基因 (scrB)。用框表 示了对于双交叉重组的同源上游 (us) 和下游 (ds) 区域 ( 灰色 )、 凝结芽孢杆菌启动子区 域 (Bco ； 白色 )， 和 lox 位点 (lox71 和 lox66 ； 黑色 )。对于 Bg1II 和 NcoI， 只包括了用于 构建的相关位点。 实施例 菌株和培养条件
凝结芽孢杆菌 DSM1 获自德国 DSMZ， Braunschweig。将凝结芽孢杆菌在含有 50g/ l 葡萄糖的 BC- 培养液 (WO 2007/085443) 中， 在需氧条件 (120rpm) 下， 在 50 ℃下， 常规 地生长。如果合适， 给培养基补充 7mg/l 的氯霉素。按照之前所述的 (WO 2007/085443)， 用 Gelrite 制备 BC 平板。为了评价碳利用， 将凝结芽孢杆菌生长在化学限定培养基 (CDM) 中， 所述培养基每升含有 2.0g(NH4)2HPO4、 3.5g(NH4)2SO4、 10g Bis-Tris 缓冲剂 ( 二 [2- 羟 甲基 ] 亚氨基三 [ 羟甲基 ]- 甲烷 )、 0.5gKCl、 0.234g L- 精氨酸、 0.304g L- 天冬氨酸、 0.026g L- 胱氨酸、 0.470g 谷氨酸、 0.093g L- 组氨酸、 0.360g L- 异亮氨酸、 0.581g L- 亮氨 酸、 0.111g L- 甲硫氨酸、 0.197g L- 脯氨酸、 0.308g L- 丝氨酸、 0.350g L- 苏氨酸、 0.345g L- 缬 氨 酸、 0.2g MgCl2·6H2O、 50mg CaCl2·2H2O、 16mg MnCl2、 7mg FeSO4·7H2O、 0.1mg 硫 胺素、 0.5mg 烟酸、 0.1mg 泛酸、 0.5mg 吡哆胺、 0.5mg 吡哆醛、 0.1mg D- 生物素、 0.1mg 叶酸、 0.1mgp- 氨基苯甲酸、 0.1mg 钴胺素。如果合适， 给 CDM 补充每升 5g 葡萄糖或 5g 蔗糖。 Gasson 描 述 了 乳 酸 乳 球 菌 (Lactococcus lactis)MG1363(Gasson， M.J.， 1983 ： Plasmid
complements of Streptococcus lactis NCDO 712 and other lactic streptococci after protoplast-induced curing， J.Bacteriol.154 ： 1-9)。在含有 5g/l 葡萄糖的 M17 培养液 (Difco) 中， 在 30℃下， 常规地培养乳酸乳球菌。
将细菌贮存在甘油储液中， 使用 15％ (v/v) 甘油， 在 -80℃下。
DNA 操纵技术
按 照 Sambrook 和 Russell(J.Sambrook 和 D.W.Russell.2001 ： Molecular Cloning， a laboratory manual， 第 3 版， Cold Spring Harbor Laboratory Press， New York) 所述的， 进行了标准 DNA 操纵技术。
按照制造商的说明， 使用 Jetstar 2.0Plasmid Maxiprep (Genomed)， 进行 了从 100mL 培养物的大规模质粒 DNA 分离。按照制造商的说明， 使用 Nucleospin Plasmid Quick (Macherey-Nagel) 试剂盒， 进行了从 1mL 培养物的小规模质粒 DNA 分离。
在整合质粒 pMH84 的构建过程中， 乳酸乳球菌用作中间宿主 ( 图 2)。按照 Holo 和 Nes(Holo， H. 和 I.F.Nes， 1989 ： High-frequency transformation， by electroporation， of Lactococcus lactis subsp.cremoris grown with glycine in osmotically stabilized media， Appl.Environ.Microbiol.55 ： 3119-3123) 所述的， 进行了乳酸乳球菌感受态细胞 的制备和电穿孔。 按照 WO 2007/085443 中所述的， 通过电穿孔来转化凝结乳杆菌。
按照制造商的说明， 使用高保真度 Pwo 聚合酶 (Roche)， 进行了用于克隆目的的 PCR 反应。
按照 WO 2007/085443 中所述的， 使用菌落 -PCR 分析来证明氯霉素抗性菌落中 pNW33N 的存在。
发酵
在 50℃下， 使用 10ml BC 培养液或 CDM， 在螺帽试管 (13mL) 中进行凝结芽孢杆菌 分批发酵。在发酵结束时， 取出样品， 用于测量发酵培养液在 600nm 下的浊度、 pH 和有机酸 含量。对于后者， 将样品离心， 并通过使用 Millex GP 0.22μm 滤器 (Millipore) 的过滤 来除去上清液中剩余的碎片。将滤液冷冻， 直至进一步的分析。
使用衍生和 GLC 来测量有机酸 ( 甲酸、 乙酸、 丙酸、 乙醇、 丁酸、 丙酮酸、 乳酸、 2- 羟 基丁酸、 乙醇酸、 草酸、 山梨酸、 富马酸、 琥珀酸、 苯甲酸、 马来酸、 苹果酸、 柠檬酸 )。将 R- 和 S- 乳酸甲基化成甲基 - 乳酸， 并通过手性柱上的顶部空间分析来测量。
实施例 1. 凝结芽孢杆菌蔗糖利用整合质粒的构建
选定蔗糖发酵凝结芽孢杆菌菌株的随机序列分析揭示了与蔗糖 PTS 酶 II 和蔗 糖 -6- 磷酸水解酶基因具有序列同源性的两个基因的区域 ( 分别为 scrA 和 scrB)。该区 域的基因图谱显示于图 1 中。使用引物 5′ -AGTACTGCATGCTTAAAGAGTAGCTTTCGGTGTTAAAGT G-3′ ( 引入 SphI 位点， SEQ ID NO ： 6) 和 5′ -AGTACTGAGCTCCTATTTATTAATAGAATGAAGACTCC AGTAGTTCCC-3′ ( 引入 SacI 位点， SEQ ID NO ： 7)， 与来自蔗糖发酵凝结芽孢杆菌菌株的基 因组 DNA 作为模板 DNA 结合， 用高保真度 PCR 产生了含有 scrAB 基因簇及其启动子 (SEQ ID NO ： 5 中所述 ) 的 DNA 片段。 或者 scrAB 基因簇可以作为具有 SEQ ID NO ： 5 中所示序列的合 成 DNA 产生。将凝结芽孢杆菌整合质粒进行了修饰， 使得可以在凝结芽孢杆菌 DSM 1 染色 体中整合 scrAB 基因簇。将染色体整合位点的 1.0kb 上游和下游片段用于重组。整合载体
pMH84( 图 2) 是基于乳球菌克隆载体 pMH 3(WO 2007/085443) 并且具有在凝结芽孢杆菌中 的热敏复制子。 首先， 通过凝结芽孢杆菌启动子替代 cat 启动子。 为此， 通过翻译融合至 cat 基因的组成型凝结芽孢杆菌启动子的融合 PCR 产物替代含有 cat 基因的 pMH3 Bg1II-SalI 片段， 同时引入与 cat 起始密码子 (SEQ ID NO ： 18) 重叠的 NcoI 位点。 使用引物组合 ( 正向 )5′ -CGCGTCGACTGTGGATAAGACAACAGGATTCGTATG-3′ ( 引入 SalI 位点， SEQ ID NO ： 8) 和 ( 反 向 )5′ -CTAAATCAATTTTATTAAAGTCCATGGGTCCACCCCGTTCTTTTCTTTTTGTG-3′ ( 引入 NcoI 位 点， SEQ ID NO ： 9)， 以及来自蔗糖发酵凝结芽孢杆菌菌株的基因组 DNA 作为模板 DNA， 产生 了启动子部分。使用引物组合 ( 正向 )5′ -CACAAAAAGAAAAGAACGGGGTGGACCCATGGACTTTAAT AAAATTGATTTAG-3′ ( 引入 NcoI 位点， SEQ ID NO ： 10) 和 ( 反向 )5′ -CGCAGATCTCCTTCTT CAACTAACGGG-3′ ( 引入 BglII 位点， SEQ ID NO ： 11)， 使用 pMH3 作为模板， 产生了 cat 基 因。将两个产物都用作新 PCR 反应中的模板， 使用启动子正向和 cat 反向引物。该片段还 可以作为具有 SEQ ID NO ： 18 中所示序列的合成 DNA 产生。将所得到质粒命名为 pMH71。 为了能够多重使用 Cre-lox 系统， 使用引物 5′ -CCCGTCGACGCTAGCTACCGTTCGTATAATGTATG CTATACGAAGTTATGTGGATAAGACAACAGGATTCG-3′ ( 引 lox66， SalI 和 NheI 位点， SEQ ID NO ： 12) 和 5′ -CGCAGATCTTACCGTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCCTTCTTCAACTAACGGGGCAGGT TAG-3′ ( 引入 lox71 和 BglII 位点， SEQ ID NO ： 13) 以及 pMH71 作为模板， 通过 PCR， 在启 动子 -cat 片段两侧引入了 lox66 和 lox71 位点 (Langer， S.J.， A.P.Ghafoori， M.Byrd， 和 L.Leinwand， 2002 ： A genetic screen identifies novel non-compatible loxP sites， Nucleic Acids Res.30 ： 3067-3077.， Lambert， J.M.， R.S.Bongers， 和 M.Kleere-bezem， 2007 ： Cre-lox-based system for multiple gene deletions and selectable-market removal in Lactobacillus plantarum， Appl.Environ.Microbiol.73 ： 1126-1135)。所得 到的 PCR 产物用 BglII-SalI 消化并用于与 pMH71 的 BglI-SalI 启动子 -cat 片段交换， 产 生质粒 pMH77。使用引物 5′ -CGCCTCGAGAGATCTGGCCGGGCTTTATGGGAGG-3′ ( 引入 XhoI 和 BglII 位点， SEQ ID NO ： 14) 和 5′ -GCCGAGCTCGCATGCCCCTGATCAACCGGGTCAGTGC( 引入 SacI 和 SphI 位点， SEQ ID NO ： 15) 以及凝结芽孢杆菌 DSM 1 染色体 DNA 作为模板， 通过 PCR， 产生 了整合位点的上游片段。 使用 SacI 和 XhoI， 在 pMH77 中克隆 PCR 产物。 这产生了 pMH82。 使 用引物 5′ -CCCGCTAGCCGTTTCAATCACATAGTCGTATTG( 引 NheI 位点， SEQ ID NO ： 16) 和 5′ -C CGGTCGACGGCCTTCATGTGCTTTTGCCGCAAATTC( 引入 SalI 位点， SEQ ID NO ： 17) 以及凝结芽孢 杆菌 DSM 1 染色体 DNA 作为模板， 通过 PCR， 产生了整合位点的下游片段。作为 SalI-NheI 片段， 在 pMH82 中克隆了 PCR 产物， 产生 pMH83。在用相同的酶消化的 pMH83 中， 作为 SphI 和 SacI 片段， 克隆了含有 scrAB 基因的 DNA 片段， 这产生了整合载体 pMH84( 图 2)。分离质 粒 pMH84 并且通过 DNA 序列分离证实了 scrAB 基因簇、 上游和下游区域以及 lox 位点的完 整性。
实施例 2. 凝结芽孢杆菌 DSM1 中 scrAB 的基因组整合
为了 scrAB 基因通过基因组整合至凝结芽孢杆菌 DSM1 中， 通过电穿孔将质粒 pMH84 转化至该菌株中， 并涂布于补充了氯霉素的 BC 平板上。通过菌落 PCR 筛选转化体中 质粒的存在。将阳性菌落进行培养， 用于质粒分离， 并通过限制性分析证实了质粒的完整 性。选择一个转化体用于进一步的实验。在 60℃下培养并且选择氯霉素抗性菌落后， 建立 了通过双重交叉交换的蔗糖基因的整合。 选择一个整合体用于进一步的研究并且作为甘油储液进行贮存。通过融合位点的 PCR 分析和序列分离证实了该正确的整合。将该菌株命名 为凝结芽孢杆菌 DSM 1::scrAB。
实施例 3. 使用凝结芽孢杆菌的蔗糖发酵
在该实施例中， 发明人证明了怎样能够修饰不能有效蔗糖发酵的凝结芽孢杆菌菌 株以变成蔗糖发酵的。 将来自甘油储液的凝结芽孢杆菌 DSM 1 和 DSM 1::scrAB 接种于 10ml 不含糖的 BC 肉汤中， 并且在 120rpm 下， 在 50 ℃下培养。将过夜培养物转移 (2 ％ v/v) 至 10ml 补充了葡萄糖的 CDM 中。过夜培养后， 使培养物成团， 并且将团状物重悬浮于 10ml 不 含糖的 CDM 中。 对于每个菌株， 从重悬浮的培养物接种 (2％ v/v)10ml CDM 的三个重复部分 中， 所述 CDM 补充了 5g 葡萄糖 / 升， 5g 蔗糖 / 升， 或不含糖。在螺帽试管中 50 小时静止培 养后， 测定了肉汤上清液在 600nm 处的浊度、 pH 和有机酸含量 ( 表 1)。结果证明了适当的 厌氧生长需要糖， 并且凝结芽孢杆菌 DSM 1::scrAB 能够将蔗糖发酵成乳酸， 而凝结芽孢杆 菌 DSM1 不能。糖的不存在导致两种凝结芽孢杆菌菌株都没有生长且没有酸化。在蔗糖的 存在下， DSM 1 显示出没有生长且没有酸化， 而凝结芽孢杆菌 DSM 1::scrAB 具有良好的生 长和酸化。乳酸是培养物上清液中检测到的唯一一种有机酸。这证明了引入凝结芽孢杆菌 scrAB 基因盒对于使用凝结芽孢杆菌的有效蔗糖发酵是足够的。
表 1.50 小时培养后的发酵特征 a
数据是来自 3 次发酵的平均值。有机酸浓度以％ (w/w) 给出。N.D.， 未测定。 甲酸 ( ＜ 0.02 ％ )、 乙酸 ( ＜ 0.02 ％ )、 丙酸 ( ＜ 0.02 ％ )、 丁酸 ( ＜ 0.01 ％ )、 丙酮酸 ( ＜ 0.02％ )、 2- 羟基丁酸 ( ＜ 0.01％ )、 乙醇酸 ( ＜ 0.20％ )、 草酸 ( ＜ 0.02％ )、 山梨酸 ( ＜ 0.01％ )、 富马酸 ( ＜ 0.02％ )、 琥珀酸 ( ＜ 0.02％ )、 苯甲酸 ( ＜ 0.03％ ) 和马来酸 ( ＜ 0.02％ ) 都低于检测极限。a9CN 102482335 A
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