说明书激发针对在癌细胞和肿瘤基质上表达的结构域和亚结构域表位的多价免疫应答的方法和组合物
发明背景
本申请要求于2005年6月17日递交的美国临时专利申请系列No.60/691,579的递交日期的利益，其无放弃地完全结合于此作为参考。
发明领域
本文公开的发明涉及诱导MHC I-类限制性免疫应答以及控制所述应答的性质和程度，由此促进在致病过程中的有效的免疫干预。本发明涉及可以刺激针对靶点细胞的细胞免疫应答的免疫原性组合物。本申请公开的是一种免疫原性组合物，其包含编码CTL表位PRAME425-433和PSMA288-297或者每一种或两种表位的交叉反应类似物的核酸构建体。本发明还提供使用所述免疫原性组合物在施用所述组合物的受试者中激发平衡的免疫应答的方法。
相关技术描述
癌症通常在当部分机体中的细胞以不同于以有序方式生长、分裂和死亡的正常细胞的无序方式持续生长和分裂时发生。尽管存在许多种类的癌症，但是它们通常由于异常细胞的超出控制的生长而起始。
用于癌症的常规治疗选择包括手术、放射性治疗和化学治疗。正在研发第四分枝治疗，其叫作免疫治疗。免疫治疗试图帮助免疫系统识别癌细胞，和/或增强针对癌细胞的应答，以消灭癌症。免疫治疗包括主动和被动免疫治疗。主动免疫治疗试图刺激机体自身的免疫系统以抵抗疾病。被动免疫治疗通常不是依靠机体来攻击疾病；相反，它们使用在患者机体外产生的免疫系统成分(诸如抗体)。
除了各种类型的癌症治疗之外，存在对于其它治疗选择的持续的需求。通过使用抗癌疫苗处理免疫系统是一种这样的方法。
为了产生疫苗或其它免疫原性组合物，将可以增加针对其的免疫应答的抗原或表位引入到受试者中。尽管赘生性(癌症)细胞来源于正常细胞，并且因此在遗传水平上与正常细胞基本上相同，但是已知许多赘生性细胞呈递肿瘤-相关的抗原(TuAAs)。在理论上，这些抗原可以被受试者的免疫系统所用，以识别并且攻击作为外来物的赘生性细胞。不幸地，赘生性细胞通常似乎被宿主的免疫系统所忽略。
免疫系统可以分成两类独立的效应器武器。第一类是先天性免疫，其包括许多细胞成分和应答所有的传染性刺激的可溶因子。另一类是适应性免疫应答，其定为特异性应答来自传染性介质的精确的表位。适应性免疫应答还分成两种效应器武器，叫做体液和细胞免疫系统。体液武器集中在由B-淋巴细胞产生抗体，而细胞武器包括细胞毒性T淋巴细胞的杀伤细胞活性。
细胞毒性T淋巴细胞(CTL)不识别在传染剂自身上的表位。相反，CTL检测展示在感染细胞表面的来源于传染剂的抗原片段。结果，只是在它们被感染细胞处理并且因此展示在细胞表面之后，抗原才为CTL明显可见。
所述细胞表面上的抗原处理和展示系统已被很好地建立。CTL识别短肽抗原，其与I类主要组织相容性复合体分子(MHC)非-共价缔合而展示在表面上。这些I类肽又来源于胞质蛋白的降解。
在大部分情形中，赘生性过程发展以避免免疫防御机制，其通过应用一定范围的导致免疫忽略、耐受性或背离的策略。有效破坏免疫耐受性或修复针对在癌细胞上表达的抗原的免疫背离的方法已在参考文献中描述(Okano F，等J Immunol.(免疫学杂志)2005，Mar 1；174(5)：2645-52；Mocellin S，等，Exp Cell Res.(表达细胞研究)2004 Oct 1；299(2)：267-78；Banat GA，等，Cancer Immunol Immunother.(癌症免疫免疫学治疗)2001Jan；49(11)：573-86)，并且除了它们与显著水平的系统免疫性相关外，所述方法几乎不导致肿瘤负担的减小。影响这一过程的显著有限的因子是抗—肿瘤效应器细胞的次优运输、局部活化和/或活性。实际上，在大部分情形中已经表明，免疫细胞的肿瘤内部呈递极少出现——与同炎性过程诸如器官排斥、传染性或自体免疫综合征相关的那些进行比较。
相对于针对不同的单个表位的免疫应答的量级，由暴露于包含多个表位的抗原(在天然介质中或当接种时)引起的免疫应答先天性地与层次相关。这发生在T细胞表位诸如MHC I类和II类限制性表位的情形中，其中已经很好地证明显性和亚显性。显性表位是激发显著的并且特异性的T细胞增殖的那些；而亚显性表位激发相对减小的应答，其特征在于具有减小的功能性的特异性T细胞的有限的增殖。
对于免疫应答集中在某种抗原内的表位子集上存在多种原因，而不管所述抗原是天然的还是工程化的。这些原因包括但不限于下述：在蛋白酶体(I类限制性)或内体(II类限制性)内产生特定的肽或多肽前体的效率；它们通过TAP(用于I类肽)和备选机制选择性转运到发生负荷到MHC上的区室；相对于占据新生成MHC分子的肽-结合裂口的蛋白伴侣或不变多肽链，以及相对于由相同的或备选底物加工形成的其它竞争肽，它们对于MHC分子的亲和力；获得的MHC-肽复合物的稳定性；和T细胞全体的功能性。
另外，由于它们的固有特性(诸如上文所述的那些)，来自在同一人工分子上一起产生的不同抗原的两个或多个表位呈现显性/亚显性关系。这限制组合分子用于免疫治疗目的的实际适用性，特别当进行共同靶向癌细胞(赘生性)和基质成分(诸如新生脉管系统)时。
发明概述
为了增强肿瘤过程的免疫介导的控制，除了对肿瘤细胞的直接攻击之外，本发明的实施方案提供对新生脉管系统的免疫介导的攻击，作为目的是在肿瘤内部建立炎性环境的二价或多价疫苗策略的成分，所述疫苗策略导致收缩、稳定或生长率和侵入的减少(局部或系统的)。这种方法可以比单独靶向癌细胞或新生脉管系统的策略更加有效地控制肿瘤过程，并且对于治疗指数(效率/安全性)有有利的影响。
一些实施方案涉及调节针对具有不同的固有免疫特性的表位的免疫应答的方法和组合物(例如，在给出的免疫情形中显性相对于亚显性的状况)，其以与增加亚显性表位的相对活性一致的方式进行，以实现针对多种表位的平衡的免疫应答的共同诱导。当共同靶向诸如由癌细胞和/或潜在的基质所表达的多种抗原时，本发明是有用的。
在一些实施方案中，共同靶向新生脉管系统和癌细胞，或者共同靶向癌细胞上的多种抗原可以通过包含表达载体的免疫治疗组合物而实现，所述表达载体诸如质粒，其激发针对转化的细胞、肿瘤细胞和新生脉管系统的内皮细胞的免疫性。按照题目为″EXPRESSION VECTORS ENCODINGEPITOPES OF TARGET-ASSOCIATED ANTIGENS AND METHODS FORTHEIR DESIGN(编码靶点-相关的抗原的表位的表达载体及它们的设计方法)″的美国专利公布申请No.20030228634中所公开，完成以“串珠”形式的质粒设计，所述申请完全结合于此作为参考。一个优选的实施方案是一种二价质粒，其包含来源于在癌细胞上表达的分子和在新生脉管系统上表达的分子的免疫原性成分。在本发明的特别的实施方案中，所述分子与PRAME和PSMA表位及其交叉反应类似物相对应。
在另一个实施方案中，诸如质粒的载体表达来源于由癌细胞和新生脉管系统共同表达的分子的免疫原性成分。在另一个实施方案中，诸如质粒的载体表达来源于受体及其配体的免疫原性成分，在其中受体或配体中的任一种由新生脉管系统表达，而癌细胞表达另一种。
在另一个实施方案中，载体编码来自于由癌细胞或新生脉管系统(或其它基质细胞)表达的分子的免疫原性成分，以及生物应答调节物，其包括通过B和T细胞上的抗原受体作用的调节物和不作用的那些。
在一些实施方案中，载体可以以时间顺序与其它免疫原性试剂——诸如肽一起施用——用于增强或者调节针对癌细胞、新生脉管系统或二者的治疗活性(在下列各项中公开：题目为″METHODS TO CONTROL MHCCLASS I-RESTRICTED IMMUNE RESPONSE(控制I类MHC-限制型免疫应答的方法)″的美国专利申请公布No.20050079152；于2004年12月29日提交的美国临时专利申请No.60/640,402，和美国公布No.__________，二者皆题目为METHODS TO ELICIT，ENHANCE，AND SUSTAINIMMUNE RESPONSE AGAINST MHC CLASSI-RESTRICTED EPITOPES，FOR PROPHYLACTIC OR THERAPEUTIC PURPOSES(用于预防或治疗目的而激发、增强并且维持针对I类MHC-限制型表位的免疫应答的方法)；和于2004年6月17日提交的题目为MULTIVALENTIMMUNOTHERAPEUTICS FOR CARCINOMA(用于癌症的多价免疫治疗)的美国临时申请No.60/691,581，和题目为MUTLIVALENTIMMUNOTHERAPIES FOR CARCINOMA(用于癌症的多价免疫治疗)(Atty.Docket No.MANNK.054A)的美国专利申请No._/__________，恰好在这个申请日期提交，一起均被授权，(filed on date even with this applicationboth entitled)，每一申请通过引用完全结合于此)和平衡针对亚显性和显性表位的应答的目的。
由于这类表位可以参与在患病个体中发生的阴性选择(中枢或外周)，所以在先天性抗原的情形中诱导针对“亚显性”表位的免疫应答为癌症治疗提供益处。因此，包含多拷贝亚显性表位的构建体可以用来诱导针对这样一种表位的增加的应答，同时保留针对显性表位的免疫性。
另外，有效地共同诱导针对来自于由同一分子呈递的不同抗原的表位的免疫应答可以提供一种产生针对多种抗原的免疫性的更加实用的方法。这对于肿瘤和传染疾病的治疗和预防有直接的暗示。
综上所述，通过所述方法和组合物获得的更广的免疫应答更有效地处理发病过程，这与主要由有限数目的特异性控制的免疫应答相反。另外，在所述方法和组合物中的多价载体的实用性可以减少获得平衡的、多价应答所使用的众多成分和繁琐的施用流程的需要。
一些实施方案涉及表达PRAME和PSMA表位序列的二价质粒(诸如在美国专利申请公布Nos.20030220239，20050221440，20050142144和题目为″EPITOPE SEQUENCES(表位序列)″的PCT专利公布No.PCT/US/11101中公开的那些，其都完全结合于此作为参考)，以及单独或与其它质粒组合使用这些组合物激发平衡的免疫应答的方法。所述方法可以包括一个起始或导引(entraining)步骤，在所述步骤中所述组合物可以被递送到动物上的不同位置，但是优选地递送到淋巴系统，例如淋巴结。所述导引步骤可以包括所述组合物的一次或多次递送，例如，在一段时间内分次(spread out)或者在一段时间内以连续的方式。
所述方法还可以包括增强步骤，其包括施用包含肽免疫原的组合物，所述肽免疫原具有与由核酸组合物编码的相应表位的基本的(substantial)相似性或功能相似性。例如，所述免疫原可以是相应的表位的交叉反应序列。增强步骤可以进行一次或多次，例如，在一段时间内间隔进行，以一次推注(bolus)，或者在一段时间内连续进行。尽管不需要在所有的实施方案中，但是一些实施方案可以包括包含免疫增强剂或佐剂的组合物的使用。
已经观察到，通过使用这种类型的免疫方案，所述质粒不但可以起始免疫应答，它还偏向所述应答及其随后针对效应器的增强，这与调节特征相反。无需这种在先的基于核酸的免疫，肽的重复施用导致总是更多地由调控性T细胞占优的应答。这种针对效应器应答的长时间的偏爱叫作导引(entrainment)。
其它实施方案包括其中所公开的质粒单独或以任意组合使用的那些。与这些表位相对应并且用于免疫策略的增强部分的所述肽组合物可以是天然序列或者与所述天然表位序列基本上相似或功能上相似的肽类似物。所述肽可以单独地或与2种、3种或4种免疫原组合而结合在增强方案中。关于使用少于全部肽表位的原因包括但不限于下述：1)任一种抗原的次最佳表达；2)患者不表达、或者不再表达相对应的抗原；3)产生针对一种或另一种所述表位的较不强的应答，在所述情形中，为了获得更加平衡的应答，所述肽可以在不存在其它肽时给出；和4)如果通过它产生某种免疫毒性，那么可以停止肽。
其它实施方案涉及通过改变核酸组合物中免疫原表位的相对数目而调节免疫应答的方法。这些实施方案还可以包括改变所述免疫原的固有免疫原性，例如，通过编码在所述免疫原表位内的氨基酸取代。
实施方案另外可以包括通过由肽加强进行的选择性上调而调节免疫应答的方法。与这一增强步骤相对应的肽组合物可以是天然序列或与所述天然表位序列基本上相似或功能上相似的肽类似物。所述选择性上调可以通过施用与亚显性表位相对应的肽而实现，以获得平衡的免疫应答。
其它实施方案包括编码PSMA或PRAME表位的任一种的类似物的质粒。其它实施方案可以包括不同的表位(诸如在题目皆为″EPITOPESEQUENCES(表位序列)″的美国专利申请公布Nos.20030220239和20040180354中公开的那些，所述专利申请公布通过引用完全结合于此)和以与在RP8和RP12质粒中所表达的表位相似的组合而取代的类似物，以及作为所述免疫策略的增强部分而施用的相应的肽免疫原(诸如在于2005年6月17日提交的题目为″EPITOPE ANALOGUES(表位类似物)″的美国临时专利申请No.60/691,889，并且其通过引用完全结合于此)。
一些实施方案涉及编码一种多肽的核酸构建体，所述多肽包括一个或多个拷贝的CTL表位PSMA288-297(SEQ ID NO：6)和一个或多个拷贝的CTL表位PRAME425-433(SEQ ID NO：5)，或包含一种或两种所述表位的1-3个取代的交叉-反应性类似物，其中所述多肽不包含完整的抗原。例如，所述一种或两种表位可以在释放序列(liberation sequence)内编码。所述多肽还可以包含编码一种或多种表位簇的序列。所述核酸构建体可以包含PRAME表位簇，例如，PRAME的氨基酸422-509。所述核酸构建体可以包含PSMA表位簇，例如，一种或多种表位簇可以是PSMA的氨基酸3-45或217-297。例如，PSMA表位类似物可以包含I297V取代。所述核酸构建体还可以包含一种或多种核输入序列、启动子(例如，巨细胞病毒(CMV)启动子)、poly-A序列，或者一种或多种CpG免疫刺激基序。PRAME和PSMA两种表位的释放序列可以位于，例如，所编码的多肽的N-端部分。例如，所编码的多肽可以是SEQ ID NO：2。PRAME和PSMA两种表位的释放序列可以位于，例如，所编码的多肽的C-端部分。例如，所编码的多肽可以是SEQ ID NO：4。
一些实施方案涉及包含上文以及本文其它地方所述的核酸构建体的免疫原性组合物。
一些实施方案涉及治疗患有癌症的个体的方法，所述方法可以包括施用治疗有效量的上文及本文其它地方所述的核酸构建体的步骤。例如，所述核酸构建体可以节内施用。个体可以患有在赘生性细胞或肿瘤-相关新生脉管系统细胞中表达PRAME、PSMA或两者的癌症。
一些实施方案涉及治疗患有癌症的个体的方法。所述方法包括下列步骤：施用有效量的上文及本文其它地方所述的核酸构建体，以诱导免疫应答；和通过用与所述核酸构建体所编码的表位相对应的至少一种肽类似物加强而增强免疫应答。例如，个体可以患有在癌细胞上表达PRAME并且在肿瘤-相关的脉管系统细胞上表达PSMA的癌症。所述个体可以患有在赘生性细胞或肿瘤-相关新生脉管系统细胞中表达PRAME、PSMA或两者的癌症。
一些实施方案涉及上文及本文其它地方所述的免疫原性组合物或核酸构建体在制备用于治疗患有癌症的个体的药物中的应用。所述药物可以通过节内施用药物而用于治疗患有癌症的个体。个体可以患有在赘生性细胞或肿瘤-相关新生脉管系统细胞中表达PRAME、PSMA或两者的癌症。
一些实施方案涉及上文及本文其它地方所述的免疫原性组合物或核酸构建体在制备用于诱导靶向肿瘤相关的新生脉管系统的免疫应答的药物中的应用。例如，所述肿瘤相关的新生脉管系统细胞展示PRAME。
附图简述
图1.两个单价质粒和一个二价质粒的结构。
图2.描述表达P2、R2和RP5质粒的细胞中的％特异性细胞裂解的51Cr-释放检测。数据描述如下：x-轴显示与不同效应器一起使用的靶点细胞与靶点的比例；y-轴显示相应的特异性裂解百分数。
图3.设计表达PRAME和PSMA表位的其它质粒的结构。描述单价PRAME质粒R2的结构。P2代表单价PSMA质粒。
图4.PRAME和PSMA的ELISpot分析，其描述通过包含来自图3所述的不同抗原的表位的质粒获得二价应答的诱导。在两侧淋巴结注射PRAME/PSMA二价质粒(1mg/ml)2次而将动物免疫。在显色之前，将5×105个分离的脾细胞与10μg PSMA288-297天然肽或10μg Prame425-433天然肽一起温育42小时。图标代表平均值+/-SEM。
图5.在RP12二价质粒免疫后PRAME和PSMA的四聚体分析。数据显示在只用质粒致敏的小鼠中针对PRAME和PSMA的二价免疫应答，具有针对PRAME表位的应答的相对优势。
图6A-6B.在接受RP12或RP8二价质粒免疫然后PSMA288-297(I297V)肽类似物加强的小鼠中的PRAME和PSMA的四聚体分析(图6A)。在经过RP12或RP8二价质粒免疫和PSMA288-297(I297V)肽类似物加强的个体动物中的PRAME和PSMA的四聚体分析(图6B)。
图7.在用RP12或RP8致敏并且用PSMA288-297(I297V)和PRAME425-433(L426Nva，L433Nle)肽类似物加强的动物中的ELISpot分析。
图8.RP8的多肽序列(SEQ ID NO：2)。
图9.RP12的多肽序列(SEQ ID NO：4)。
优选实施方案详述
实施方案涉及可以激发针对显性和亚显性表位的多价免疫应答的组合物。一些实施方案还涉及设计所述组合物的方法，其通过：选择由癌细胞和/或基质(新生脉管系统)细胞表达的抗原；定义具有不同的内在免疫特性的表位，其构成在所述癌症或基质细胞上的有效免疫靶点；并且通过减少显性和亚显性表位数目之间的比例而调节特定分子(诸如治疗载体)中的显性和亚显性表位的相对数目，同时提供用于在加工区室内的适当的产生的最佳侧连残基。
本发明描述其它方法，诸如用类似物序列或分子内优先配置的表位取代一个或多个拷贝的亚显性表位，以修饰所述表位的相对免疫原性，并且确保更平衡的、多价应答。检测功效可以在设计一系列候选表位之后进行。在致敏-增强免疫策略中，所述分子的使用可以通过选择性增强针对亚显性表位的应答而得到补充。
关于疫苗设计的一般方法可以包括：应用从天然或人工序列起始的确定运算法则来寻找质粒、载体和包含多拷贝的显性和亚显性表位的分子的显性和亚显性表位的正确比例；加工一系列化合物；体外和体内特性鉴定步骤；和选择激发理想的平衡免疫应答的适当的质粒或其它载体。
当在本文中引用时，表位是指能够刺激免疫应答的分子或物质。在优选的实施方案中，按照这一定义的表位包括但不必限于多肽和编码多肽的核酸，其中所述多肽能够刺激免疫应答。在其它优选的实施方案中，按照这一定义的表位包括但不必限于在细胞表面呈递的肽、与I类MHC的结合裂口非-共价结合的肽，以致它们可以与T细胞受体相互作用。
MHC表位在本文是指对于哺乳动物I类或II类主要组织相容性复合体分子(MHC)的具有已知的或预计的结合亲和性的多肽。
本文引用的免疫表位是指一种多肽片段，其为MHC表位，并且其在其中免疫蛋白体显著活跃的细胞上展示。在另一个优选的实施方案中，免疫表位定义为包含按照前述定义的免疫表位的多肽，其通过一个至几个额外的氨基酸侧连。在另一个优选的实施方案中，免疫表位定义为包含表位簇序列的多肽，其具有对于I类MHC具有已知的或预计的亲和性的至少两种多肽序列。在另一个优选的实施方案中，免疫表位定义为编码按照任一前述定义的免疫表位的核酸。
基本相似——这一术语用于指当通过检查所述序列判断时以不重要的(inconsequential)方式与参照序列不同的序列。编码相同氨基酸序列的核酸序列基本上相似，而不管在简并位置的差异或者在任意非-编码区的长度或组成的适度差异。仅通过保守取代或较小长度变化而不同的氨基酸序列基本上相似。另外，包含在N-端侧连残基数目上不同的持家表位的氨基酸序列，或者在任一端的侧连残基数目不同的免疫表位和表位簇，基本上相似。编码基本上相似的氨基酸序列的核酸本身也是基本上相似的。
功能相似——这一术语用于指当通过检查生物或化学特性判断时以不重要的方式与参照序列不同的序列，尽管所述序列可能不是基本上相似的。例如，两种核酸可以用作同一序列的杂交探针，但是编码不同的氨基酸序列。即使他们通过非保守氨基酸取代而不同(并且因此不满足基本相似的定义)，诱导交叉-反应性CTL应答的两种表位是功能相似的。识别同一表位的抗体对或TCRs可以彼此功能相似，而不管存在什么样的结构差异。在检测免疫原性的功能相似性时，技术人员通常用“改变的”抗原免疫，并且检测所激发的应答(Ab，CTL，细胞因子生成等)识别所述靶点抗原的能力。因此，两种序列可以设计成在某些方面不同而保留相同的功能。这样设计的序列变体在本发明的实施方案中。
I.质粒构建
本发明的一些实施方案提供许多质粒，例如，pRP8(SEQ ID NO：1)，pRP9，pRP10，pRP11，pRP12(SEQ ID NO：3)，和pRP13，其具有激发或促进针对肿瘤相关抗原PRAME和PSMA、特别是针对表位PRAME425-433和PSMA288-297的二价应答的能力。在本发明的特别的实施方案中，提供作为免疫原性组合物的质粒pRP12和pRP8。下文描述用于产生本发明的质粒构建体的方法。
在优选的实施方案中，质粒构建需要逐步连接一系列长的互补寡核苷酸，从而导致编码以“串珠”排列的表位的DNA序列的生成。这些DNA携带用于限制性酶的适当的粘性末端，其可以用于进一步连接编码表位簇区域的DNAs，所述粘性末端通过在作为模板的关于PSMA或PRAME的克隆cDNA上进行PCR而扩增。然后将完整的插入物连接到AflII和EcoRI限制性位点之间的载体骨架中。完整的编码序列通过DNA测序验证。基于PCR的诱变可以用来产生编码类似表位肽的序列，或者调整显性/亚显性表位的拷贝数目，以获得理想的比例。两种质粒RP8和RP 12的序列详细描述并且公开为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3。对于本文所述的具体的质粒，载体骨架是由Invitrogen(Carlsbad，CA)进行的pVAX的改良版本，其先前已在题目为Avoidance of Undesirable Replication Intermediates inPlasmid Propagation(在质粒增殖中避免不理想的复制中间体)的美国专利6,709,844和题目为Expression Vectors Encoding Epitopes ofTarget-Associated Antigens(编码靶点-相关抗原的表位的表达载体)的美国专利申请No.09/561,572中公开，每一专利通过引用完全结合于此。本领域的技术人员应该认识到，本发明的编码序列可以放置在适于用作疫苗的任何核酸载体中而不超出本发明的范围。例如，编码其它提及的质粒的序列可以插入到与在pRP8和pRP12质粒中所用的骨架相同或相似的骨架中。
pRP8和pRP12是编码具有来自于PSMA(288-297及其类似物)和PRAME(425-433)的HLAA2-限制性CTL表位的一种多肽的重组DNA质粒。两种多肽还包括包含PSMA(3-45，217-297)和PRAME(422-509)的表位簇的区域。侧连定义的PSMA和PRAME表位的是对于通过免疫蛋白体加工释放所讨论的表位的最优化的短的氨基酸序列。用于多肽在质粒中的编码序列受控于来自巨细胞病毒的启动子/增强子序列(CMVp)，当通过APCs摄取时，其允许用于所述多肽的mRNA的有效转录。在编码序列3′末端的牛生长素多聚腺苷酸信号(BGH poly A)提供用于信使多聚腺苷化以增加其稳定性，以及用于从核转出到用于翻译的细胞质中的信号。摄取后为了促进质粒转运到核，将来自于猿猴病毒40(SV40)的核输入序列(NIS)插入到质粒骨架中。所述质粒携带两个拷贝的CpG免疫刺激性基序，一个在NIS序列中，一个在质粒骨架中。最后，所述质粒中的两个原核遗传元件负责在大肠杆菌(E.coli)中扩增，卡那霉素抗性基因(Kan R)和pMB1细菌复制起点。
A.RP8重组DNA质粒
对于RP8，所编码的多肽的氨基酸序列(长度297个氨基酸残基；SEQID NO：2)包含两个释放序列，在其N-端用于PRAME425-433的17个氨基酸的底物(MKRPSIKR-SLLQHLIGL；SEQ ID NO：__)，和在其C-端用于PSMA288-297的66个氨基酸底物(RK-GLPSIPVHPI-LV-GLPSIPVHPI-KRISPEKEEQYIAKR-GLPSIPVHPI-KRPSIK-RGLPSIPVHPV；SEQ ID NO：8)。所编码的免疫原的完整的肽序列(SEQ ID NO：2)在图8中显示。
前8个氨基酸残基的片段是已经表现出促进免疫蛋白体对CTL表位的加工的人工序列。接下来的9个氨基酸(斜体)是PRAME425-433，在人PBMC的体外免疫和在小鼠中的体内免疫中都引发强抗-肿瘤免疫应答的有效的HLA A2-特异性CTL表位。这种PRAME表位序列之后是PRAME422-509片段(免疫原的氨基酸18-105)，其包含两个表位簇：PRAME422-443和PRAME459-487。两种PSMA表位簇(斜体)，PSMA3-45(氨基酸108-150；)和PSMA217-297(氨基酸151-231)，放置在PRAME表位簇之后。这些及其它PRAME和PSMA表位簇已经在美国专利申请Nos.10/117,937，11/067,064，和11/067,159中公开，每一申请题目为EpitopeSequences(表位序列)，并且每一申请通过引用完全结合于此。这些表位簇包含许多预测的HLAA2-特异性表位，并且因此可以用于产生针对免疫表位的应答(在题目为EPITOPE SYNCHRONIZATION IN ANTIGENPRESENTING CELLS(在抗原呈递细胞中的表位同步性)的美国专利申请公布No.20030215425和题目为EPITOPE CLUSTERS(表位簇)的美国专利申请公布Nos.20030228634；20040132088；和20040203051中描述，每一专利申请公布通过引用完全结合于此)。具有多拷贝PSMA288-297的“串珠”表位排列(GLPSIPVHPI(SEQ ID NO：6)；黑体)构成其余的多肽(氨基酸232-297)。4个拷贝的PSMA288-297结合最后的拷贝成为类似物(GLPSIPVHPV；SEQ ID NO：7)。已经表明，天然的PSMA288-297及其类似物都在人PBMC的体外免疫和小鼠的体内免疫中诱导显著的CTL免疫，其中所述类似物表现出升高的I类MHC结合和免疫原性。在PSMA288-297表位序列之间是短的氨基酸序列，其被指定为“切割辅助序列”，以促进表位的加工和释放。因此这两种表位以这样的方式编码，以致它们可以通过pAPCs表达、加工和呈递。
B.RP12重组DNA质粒
对于RP12质粒，所编码的多肽的氨基酸序列(长度275个氨基酸残基；SEQ ID NO：4)包含一种氨基酸底物或释放序列和在其C-端包含用于PRAME和PSMA两种表位释放的底物的杂合的“串珠”。所编码的免疫原的完整的多肽序列在图9中显示。SEQ ID NO：9代表的释放序列如下：KR-SLLQHLIGL-GDAAY-SLLQHLIGL-ISPEKEEQYIA-SLLQHLIGL-KRPSIKR-GLPSIPVHPV。
所编码免疫原的氨基酸片段2-44，45-126和127-213分别是一个与另一个连接的表位簇：PSMA3-45，PSMA217-297和PRAME422-509。在所述“串珠”杂合底物中，在所述多肽的C-端存在3个拷贝的PRAME425-433(SLLQHLIGL；黑体；SEQ ID NO：5)和1个拷贝的PSMA288-297类似物(GLPSIPVHPV；sans serif黑体；SEQ ID NO：7)。在PRAME425-433和PSMA288-297表位序列之间是短氨基酸序列，其被指定为“切割辅助序列”，以促进表位的加工和释放。因此，这两种表位以这样一种方式编码，以致它们可以由pAPCs表达、加工和呈递。
关于RP12质粒的其它详细内容在2005年6月17日提交的美国临时专利申请No.60/691,579中公开，其题目为METHODS ANDCOMPOSITIONS TO ELICIT MULTIVALENT IMMUNE RESPONSESAGAINST DOMINANT AND SUBDOMINANT EPITOPES，EXPRESSEDON CANCER CELLS AND TUMOR STROMA(激发针对在癌细胞和肿瘤基质上表达的显性和亚显性表位的多价免疫应答的方法和组合物)，其通过引用完全结合于此。应用如用于RP8和RP12的方法以相似的方式构建所有其它的质粒。质粒R2，还叫做pCTLR2，在实施例中公开。在图1和3中显示的P2质粒是单价PSMA质粒。RP5质粒包含来自P2和R2二者的元件。
在本领域中已经充分建立用于构建或者设计质粒的许多方法，并且本领域的技术人员应该已知这些方法。所述方法在许多参考文献中描述，诸如，例如，Molecular Cloning(分子克隆)，Sambrook J和Russell D.W.，CSHLPress，(2001)，其通过引用特意结合于此。
在构建编码本发明的多肽表位的核酸时，可以使用相关的肿瘤相关抗原(例如，PRAME和PSMA)的基因序列，或者所述多聚核苷酸可以由任意相对应的密码子组装。对于10个氨基酸的表位，这可以组成106数量级的不同序列，这取决于具体的氨基酸组成。尽管很大，但是这是一种代表这一长度的＞1018个可能的多核苷酸的少部分的清楚而易于定义的设置，并且因此在一些实施方案中，本文公开的具体序列的等价物包括在所列出的序列之上的这种清楚而易于定义的变异。在选择这些序列的具体的一种用于疫苗时，可以使用诸如密码子应用、自我-互补性、限制性位点、化学稳定性等的考虑，这对于本领域的技术人员应该是显而易见的。
本发明中考虑的表位簇是一种多肽、或编码其的核酸序列，其为包含两个或多个对于共有MHC限制型元件有结合亲和性的已知的或预测的表位的天然蛋白序列的片段，其中所述簇内表位的密度大于所有对于在完整的蛋白序列之内的共有MHC限制型元件有结合亲和性的已知的或预测的表位的密度。表位簇及其应用在美国专利申请公布Nos.20030220239，20050221440，20050142144；20030215425，20030228634，20040132088，20040203051和PCT专利申请公布No.PCT/US/11101中描述；所有这些都通过引用完全结合于此。
用于本发明的底物或释放序列是一种设计的或工程化的序列，其包含或者编码包埋在一种较大序列中的PRAME和/或PSMA表位，所述较大序列提供允许PRAME和/或PSMA表位通过直接或与N-端剪切或其它处理结合的免疫蛋白体处理而被释放的情形。
下述是可以用于一些实施方案的所编码的多肽序列的其它实例，例如，它们可以通过许多质粒编码或者用于所述方法，等等。
R2
MALQSLLQHLIGLSNLTHVLYPVPLESYEDIHGTLHLERLAYLHARLRELLCELGRPSMVWLSANPCPHCGDRTFYDPEPILCPCFMPNKRSLLQHLIGLGDAAYSLLQHLIGLISPEKEEQYIASLLQHLIGLKRPSIKRSLLQHLIGL
P2
MNLLHETDSAVATARRPRWLCAGALVLAGGFFLLGFLFGWFIKSAQLAGAKGVILYSDPADYFAPGVKSYPDGWNLPGGGVQRGNILNLNGAGDPLTPGYPANEYAYRRGIAEAVGLPSIPVHPIRKGLPSIPVHPILVGLPSIPVHPIKRISPEKEEQYIAKRGLPSIPVHPIKRPSIKRGLPSIPVHPI
RP5
MISPEKEEQYIASLLQHLIGLKRSLLQHLIGLKRPSIKRSLLQHLIGLALQSLLQHLIGLSNLTHVLYPVPLESYEDIHGTLHLERLAYLHARLRELLCELGRPSMVWLSANPCPHCGDRTFYDPEPILCPCFMPNKLNLLHETDSAVATARRPRWLCAGALVLAGGFFLLGFLFGWFIKSAQLAGAKGVILYSDPADYFAPGVKSYPDGWNLPGGGVQRGNILNLNGAGDPLTPGYPANEYAYRRGIAEAVGLPSIPVHPIRKGLPSIPVHPILVGLPSIPVHPIKRISPEKEEQYIAKRGLPSIPVHPIKRPSIKRGLPSIPVHPI
RP9
MISPEKEEQYIASLLQHLIGLKRPSIKRSLLQHLIGLALQSLLQHLIGLSNLTHVLYPVPLESYEDIHGTLHLERLAYLHARLRELLCELGRPSMVWLSANPCPHCGDRTFYDPEPILCPCFMPNKLNLLHETDSAVATARRPRWLCAGALVLAGGFFLLGFLFGWFIKSAQLAGAKGVILYSDPADYFAPGVKSYPDGWNLPGGGVQRGNILNLNGAGDPLTPGYPANEYAYRRGIAEAVGLPSIPVHPIRKGLPSIPVHPILVGLPSIPVHPVKRGLPSIPVHPVKRPSVKRGLPSIPVHPV
RP10
MISPEKEEQYIASLLQHLIGLALQSLLQHLIGLSNLTHVLYPVPLESYEDIHGTLHLERLAYLHARLRELLCELGRPSMVWLSANPCPHCGDRTFYDPEPILCPCFMPNKLNLLHETDSAVATARRPRWLCAGALVLAGGFFLLGFLFGWFIKSAQLAGAKGVILYSDPADYFAPGVKSYPDGWNLPGGGVQRGNILNLNGAGDPLTPGYPANEYAYRRGIAEAVGLPSIPVHPIRKGLPSIPVHPILVGLPSIPVHPVKRGLPSIPVHPVKRPSVKRGLPSIPVHPV
RP11
MKRSLLQHLIGLKRPSIKRSLLQHLIGLALQSLLQHLIGLSNLTHVLYPVPLESYEDIHGTLHLERLAYLHARLRELLCELGRPSMVWLSANPCPHCGDRTFYDPEPILCPCFMPNKLNLLHETDSAVATARRPRWLCAGALVLAGGFFLLGFLFGWFIKSAQLAGAKGVILYSDPADYFAPGVKSYPDGWNLPGGGVQRGNILNLNGAGDPLTPGYPANEYAYRRGIAEAVGLPSIPVHPIRKGLPSIPVHPVLVGLPSIPVHPVKRISPEKEEQYIAKRGLPSIPVHPIKRPSIKRGLPSIPVHPV
RP13
MKRSLLQHLIGLKRPSIKRSLLQHLIGLALQSLLQHLIGISNLTHVLYPVPLESYEDIHGTLHLERLAYLHARLRELLCELGRPSMVWLSANPCPHCGDRTFYDPEPILCPCFMPNKLNLLHETDSAVATARRPRWLCAGALVLAGGFFLLGFLFGWFIKSAQLAGAKGVILYSDPADYFAPGVKSYPDGWNLPGGGVQRGNILNLNGAGDPLTPGYPANEYAYRRGIAEAVGLPSIPVHPVLVGLPSIPVHPVKRISPEKEEQYIAKRGLPSIPVHPIKRPSIKRGLPSIPVHPV
II.本发明的免疫原性组合物
本发明考虑由癌细胞和由新生脉管系统表达的多种分子作为通过主动免疫治疗法治疗癌症中的治疗靶点的应用。所述分子包括肿瘤-相关抗原(TuAAs)，其为由癌细胞本身表达的抗原或者与肿瘤的非癌成分诸如肿瘤-相关的新生脉管系统或其它基质相关的抗原。确定TuAA表达图表可以帮助使患者的癌症状况或类型与适当的免疫治疗剂或方案相匹配。在具体的实施方案中，肿瘤相关抗原PRAME和PSMA的表位用于设计二价质粒，所述二价质粒可以在施用所述质粒作为癌症治疗剂的受试者中激发强免疫应答。PRAME和PSMA的交叉-反应类似物也在本发明的实施方案中得以考虑。
本发明所应用的肿瘤相关抗原PRAME还叫作MAPE、DAGE和OIP4。PRAME在本领域内叫作睾丸癌(CT)抗原。然而，与许多CT抗原不同，诸如：MAGE、GAGE和BAGE，它在急性骨髓白血病中表达。PRAME作为TuAA在美国专利No.5,830,753中公开，其通过引用完全结合于此。在优选的实施方案中，本发明提供PRAME的表位及其类似物。
本发明所应用的另一种TuAA是前列腺-特异性膜抗原(PSMA)。发现PSMA在前列腺癌细胞中高度表达。然而，在正常的前列腺上皮细胞中以及在非前列腺肿瘤的新生脉管系统中也注意到PSMA的表达。PSMA作为一种抗-新生脉管系统制剂在美国临时专利申请No.60/274,063、与美国专利公布申请Nos.20030046714和20050260234中公开；每一申请通过引用完全结合于此。PSMA作为TuAA在美国专利No.5,538,866中描述，其通过引用完全结合于此。在优选的实施方案中，本发明提供PSMA的表位及其类似物。
当用于本文时，交叉-反应性类似物可以指，与天然肽序列相比，一种包含1-3个氨基酸取代、和/或一个氨基酸删除或添加的肽，其诱导区别于背景、区别于与天然肽反应的CTL的效应器功能(例如，细胞溶解或细胞因子分泌)。在优选的实施方案中，效应器功能为由天然肽诱导的功能的至少30，50，60，70或80％。
在本发明的一些实施方案中，包含PRAME和PSMA的天然序列或(交叉-反应的)类似物的肽还可以作为与本发明的质粒结合的肽加强而施用。PRAME和PSMA的天然肽序列和肽类似物在美国专利申请No.20060057673和美国临时专利申请No.60/691,889中公开，每一申请通过引用完全结合于此。肽类似物，PRAME425-433 L426Nva，L433Nle和PSMA288-297 I297V在下述中描述：美国临时申请No.60/580,962；美国专利申请No.11/155,929；美国临时申请No.60/581,001；美国专利申请No.11/156,253；美国专利申请No.11/156,369，题目为PRAME PEPTIDEANALOGUES(PRAME肽类似物)(Atty Docket No.MANNK.052A)的美国临时专利申请No.60/691,889，美国专利申请No._/__________，题目为PSMA PEPTIDE ANALOGUES(PSMA肽类似物)(Atty Docket No.MANNK.052A2)的美国专利申请No._/__________，以及题目为MELANOMAANTIGEN PETIDE ANALOGUES(黑素瘤抗原肽)(Atty Docket No.MANNK.052A3)的美国专利申请No._/__________，每一申请通过引用完全结合于此。
如上文所讨论，一些实施方案涉及用于治疗癌症的免疫原性组合物，所述组合物包含编码PRAME和PSMA的CTL表位及其交叉类似物的质粒。所述免疫原性组合物可以激发充沛(robust)或强的细胞-介导的免疫应答，以靶向具体的癌症由此消除、根治或者减轻受试者的癌症。
III.对于施用的导引-和-增强治疗
在一个优选的实施方案中，本发明提供一种免疫原性组合物，所述组合物包含编码CTL表位PRAME425-433和PSMA288-297、或者这些表位中的任一种或二者的交叉-反应类似物的核酸构建体。在本发明的一些实施方案中，可以应用质粒致敏/肽加强方法，其中表达PRAME和PSMA表位的重组DNA质粒可以与合成肽诸如PRAME和/或PSMA肽或其类似物联合施用。
按照一种最优化的免疫时间表，包含编码CTL表位PRAME425-433和PSMA288-297、或者这些表位中的任一种或二者的交叉-反应类似物的核酸构建体的本发明的免疫原性组合物，可以通过淋巴结注射直接递送到器官中，在所述器官中激发并且增强免疫应答。本发明的实施方案可以对具有表达HLA-A2、特别是HLA-A*0201的肿瘤组织的患者实行。因此，可以施用包含一种质粒和一种或多种肽及其类似物的免疫原性组合物，用于治疗受试者中的癌症。本发明公开的实施方案涉及用于癌症的导引-和-增强治疗，所述治疗可以用于获得二价或多价攻击，提供增强肿瘤对攻击的敏感性的优点。
因此，在具体的实施方案中，本发明提供用于癌症治疗的二价导引-和-增强治疗。所述二价治疗可以靶向肿瘤细胞上多于一个的抗原。在靶向肿瘤细胞上多于一个抗原的情形中，因此增加抗肿瘤治疗的有效浓度。对与肿瘤相关的基质诸如脉管系统的攻击，可以增加肿瘤细胞对靶向它们的试剂的可接近性。因此，如果在二价或多价攻击中待靶向的其余抗原也不是由所述组织表达，那么甚至还在某些正常组织上表达的抗原可以受到更多的考虑。本发明的质粒可以与表达其它表位的其它的质粒以及相对应的增强肽联合使用，以产生更高效价的治疗流程。示例性的免疫原性产物在下述中公开：于2005年6月17日提交的美国临时专利申请No.60/691,581，和于恰好在本申请的日期提交的美国专利申请No.__/__(Atty.Docket No.MANNK.054A)，每一申请题目为MULTIVALENTENTRAIN-AND-AMPLIFY IMMUNOTHERAPEUTICS FORCARCINOMA(用于癌症的多价导引-和-增强免疫治疗)，并且每一申请通过引用完全结合。
当在本发明中考虑时，“导引”免疫原在许多实施方案中包括赋予T细胞的诱导系的免疫特性的特别的稳定性的诱导。
当在本发明中考虑时，关于T细胞应答的术语“加强或者增强”在许多实施方案中包括增加细胞数目、活化的细胞数目、活性水平、增殖速率、或参与特异的应答的T细胞的类似参数的过程。
本发明所用的导引-和-增强流程在下述中更详细地描述：美国专利公布No.20050079152，美国临时专利申请No.60/640,402，和美国专利申请No.11/323,572，每一题目为″METHODS TO ELICIT，ENHANCE ANDSUSTAIN IMMUNE RESPONSES AGAINST MHC CLASSI-RESTRICTED EPITOPES，FOR PROPHYLACTIC OR THERAPEUTICPURPOSES(用于预防或治疗目的而激发、增强并且维持针对I类MHC-限制型表位的免疫应答的方法)″，其通过引用完全结合于此。
IV.生物应答调节剂(BRMs)或免疫增强剂
在一些实施方案中，本发明还可以使用一种生物应答调节剂(BRM)或免疫增强剂与包含编码CTL表位PRAME和PSMA的重组DNA质粒的免疫原性组合物联合，用于激发免疫应答。本发明考虑的免疫增强剂或BRMs可以以免疫抑制或免疫刺激性方式作用，以介导免疫应答。本发明的免疫增强剂或BRMs可以是指通过除了与抗原受体之外的相互作用而调节免疫系统或其细胞的活性的任何分子。当在本发明中考虑时，BRMs还可以包括通过刺激先天免疫途径而行使免疫调节作用的天然的或合成的小有机分子。
在具体的实施方案中，本发明还考虑免疫增强剂或BRMs，其可以包括但不限于，例如：细胞因子诸如IL-12，IL-18，GM-CSF，flt3配体(flt3L)，干扰素、TNF-α等；趋化因子诸如IL-8，MIP-3α，MIP-1α，MCP-1，MCP-3，RANTES等。可以用于本发明的BRMs的其它实例是引起细胞因子或趋化因子生产的分子，诸如关于Toll-样受体(TLRs)的配体，肽聚糖、LPS或类似物、未甲基化的CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODNs)；dsRNAs诸如在APC和先天免疫细胞上的细菌dsDNA(其包含CpG基序)以及合成的dsRNA(polyI：C)，其分别结合TLR9和TLR3。一类BRM包括大多数的小的有机天然的或合成的分子，其通过刺激先天免疫途径而行使免疫调节作用。因此，可以使用结合TLRs的小分子，诸如新一代纯合成的抗病毒咪唑并喹啉，例如，咪喹莫特和瑞喹莫德，已经发现其通过结合TLRs 7和8而刺激免疫性的细胞途径(Hemmi，H.等，Nat Immunol(国家免疫学)3：196-200，2002；Dummer，R.等，Dermatology(皮肤病学)207：116-118，2003；其分别通过引用完全结合于此)。BRMs还可以包括激活pAPC或T细胞的免疫增强佐剂，包括，例如：内吞-模式的识别受体(PRR)配体、皂树皂苷、妥卡雷琐等。
V.递送本发明的组合物的方法
在本发明中，包含编码CTL表位PRAME和PSMA的重组DNA质粒的免疫原性组合物或者所述质粒然后通过一种或多种肽作为一次或多次加强的优选的施用通过淋巴结注射进行。其它免疫流程，例如，使用质粒用于除了初始给药之外，取决于质粒本身，或者使用其它类型的增强试剂，尽管是较不优选的实施方案，但是并不从本发明的范围中排除。本发明的实施方案包括表达两种免疫原PRAME和PSMA的二价质粒。在将本发明的免疫原性组合物递送到需要其的受试者中时，优选淋巴结注射，原因在于，它允许直接递送到器官，在所述器官中，按照最优化的免疫时间表，激发并且增强免疫应答。
为了将所述免疫原性组合物引入到患者的淋巴系统中，所述组合物优选地导向淋巴管、淋巴结、脾或淋巴系统的其它适当部分。在一些实施方案中，每一成分作为大丸剂施用。在其它实施方案中，一种或多种成分通过输注递送，通常持续几个小时到几天。优选地，将所述组合物导向淋巴结，诸如腹股沟或腋下淋巴结，通过向淋巴结中插入导管或针并且在整个递送过程中保持所述导管或针而进行。适当的针或导管可用金属或塑料(例如，聚氨基甲酸酯、聚氯乙烯(PVC)、TEFLON、聚乙烯等)制成。例如，在将导管或针插入到腹股沟淋巴结时，在超声波扫描控制下使用VialonTM Insyte WTM套管和使用TegadermTM透明包衣(TegadermTM，St.Paul，MN，USA)固定的24G3/4导管(Becton Dickinson，USA)，将腹股沟淋巴结刺破。通常是有经验的放射线学工作者进行这一步骤。导管顶端在腹股沟淋巴结中的位置通过注射最小体积的盐水而确定，注射的盐水立即并且明显地增加淋巴结的大小。后一步骤允许证实顶端在结内。这一步骤可以进行以保证顶端没有从淋巴结滑出，并且可以在移植导管之后的许多天重复进行。
本发明的治疗组合物可以以与本领域的一名普通技术人员公知的标准疫苗递送流程一致的方式施用给患者。施用包含质粒和TuAAs PRAME和PSMA的肽或肽类似物的本发明的免疫原性组合物的方法，包括但不限于，透皮的、节内的、节外、口服、静脉内、皮内、肌内、腹膜内和粘膜施用，通过注射或滴注或吸入递送。激发CTL应答的一种特别有用的疫苗递送方法在澳大利亚专利No.739189；题目皆为″A METHOD OFINDUCING A CTL RESPONSE(诱导CTL应答的方法)″的美国专利Nos.6,994,851和6,977,074中公开。
在将免疫原性组合物递送或者施用给受试者时，可以考虑各种参数。另外，可以使用剂量方案和免疫时间表。通常成分在治疗组合物中的量将随患者到患者和随抗原到抗原而不同，取决于如下因素，诸如：抗原诱导应答的活性；淋巴通过患者系统的流速；受试者的重量和年龄；治疗的疾病和/或病况的类型；疾病或病况的严重性；早先或并发的治疗干涉；个体的免疫系统合成抗体的能力；需要保护的程度；施用方式等，所有这些可以由操作者容易地确定。
一般地，所述治疗组合物可以以从约1到约500微升/小时或约24到约12000微升/天的速率递送。抗原的浓度如此，以致在24小时过程中将递送约0.1微克到约10,000微克的抗原。所述流速基于下述知识：每分钟大约约100到约1000微升的淋巴液流过成年人腹股沟淋巴结。目的是将疫苗制剂在淋巴系统中的局部浓度最大化。关于患者的一定量的经验研究应该是必要的，以确定对于一种给定的疫苗制剂在人中最有效的输注水平。
在具体的实施方案中，本发明的免疫原性组合物可以作为许多次连续剂量而施用。所述剂量可以是获得适当的免疫应答所需要的2、3、4次或更多次剂量。在本发明的其它实施方案中，预计免疫原性组合物的剂量将在彼此约几秒或几分钟内施用到右侧或左侧腹股沟淋巴结中。例如，质粒(致敏)可以首先注射到右侧淋巴结，然后在几秒或几分钟内将第二质粒注射到右侧或左侧腹股沟淋巴结。在其它情形中，可以施用表达一种或多种免疫原的一种或多种质粒的组合。优选在第一次注射到淋巴结后的后续注射应该在第一次注射的约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多分钟之内但是不大于约30，40，50或60分钟。类似的考虑应用到两种肽分别施用到右侧和左侧的淋巴结。可以理想地以几天的时间间隔施用本发明的免疫原性组合物的剂量，其中在后续施用之间间隔几天(1，2，3，4，5，6，或7或更多天)。在其它情形中，对于本发明的组合物的后续施用可以理想地在初始剂量施用之后约1，2，3或更多周内或约1，2，3或更多个月内通过两侧腹股沟淋巴结注射而实行。
施用可以以与剂量制剂相容的任何方式，并且以治疗有效的量进行。本发明的免疫原性组合物的有效量或剂量是在待治疗的受试者中提供理想的应答所需要的量。
除了在本申请中已经公开的那些，下述申请通过全文引用清楚地结合于此。使用所公开的类似物诱导、导引、维持、调节并且增强I类MHC-限制型T细胞应答，并且特别是针对抗原的效应器和记忆CTL应答的有用的方法在下述中描述：美国专利Nos.6,994,851(2/7/06)和6,977,074(12/20/2005)，二者题目皆为″A Method of Inducing a CTL Response(诱导CTL应答的方法)″；于2003年6月17日提交的题目为″METHODS TOCONTROL MHC CLASS I-RESTRICTED IMMUNE RESPONSE(控制I型MHC-限制型免疫应答的方法)″的美国临时申请No.60/479,393；和于2004年12月29日提交的美国专利申请No.10/871,707(Pub.No.20050079152)和临时美国专利申请No.60/640,402，二者题目皆为″Methods toelicit，enhance and sustain immune responses against MHC class I-restrictedepitopes，for prophylactic or therapeutic purpose(用于预防或治疗目的而激发、增强并且维持针对I类MHC-限制型表位的免疫应答的方法)″。类似物可以用于研究以获得另外最优化的类似物。在下述中提供许多持家表位：于2002年4月4日提交的美国申请Nos.10/117,937(Pub.No.20030220239A1)，和10/657,022(20040180354)，以及于2003年9月5日提交的PCT申请No.PCT/US2003/027706(Pub.No.WO04022709A2)；和于2001年4月6日提交的美国临时申请Nos.60/282,211；于2001年11月7日提交的60/337,017；于2002年3月7日提交的60/363,210；以及于2002年9月5日提交的60/409,123；每一申请题目为″Epitope Sequences(表位序列)″。类似物还可以用于这些申请中所述的各种模式中的任一种。表位簇，其可能包含或包括瞬时类似物，在于2000年4月28日提交的题目为EPITOPE CLUSTERS(表位簇)的美国专利申请No.09/561,571中公开并且更充分地定义。使用和递送所述瞬时类似物的方法在美国专利申请09/380,534和6977074(于2005年12月20日授权)以及PCT申请No.PCTUS98/14289(Pub.No.WO9902183A2)中描述，每一申请的题目皆为″METHOD OF INDUCING A CTL RESPONSE(诱导CTL应答的方法)″。用于所述免疫治疗的有益表位选择原则在下述中公开：于2000年4月28日提交的美国专利申请Nos.09/560,465，于2001年12月7日提交的10/026,066(Pub.No.20030215425A1)，和于2001年11月7日提交的10/005,905，所有申请题目皆为″Epitope Synchronization in AntigenPresenting Cells(在抗原呈递细胞中的表位同步性)″；6,861,234(01-3-2005授权；app.#09/561,074)，题目为″Method of Epitope Discovery(表位发现的方法)″；09/561,571，于2000年4月28日提交，题目为EPITOPE CLUSTERS(表位簇)；10/094,699(Pub.No.20030046714A1)，于2002年3月7日提交，题目为″Anti-Neovasculature Preparations for Cancer(用于癌症的抗-新生脉管系统制备物)″；申请Nos.10/117,937(Pub.No.20030220239A1)和PCTUS02/11101(Pub.No.WO02081646A2)，二者皆于2002年4月4日提交，并且题目皆为″EPITOPE SEQUENCES(表位序列)″；和申请Nos.10/657,022与PCT申请No.PCT/US2003/027706(Pub.No.WO04022709A2)，二者皆于2003年9月5日提交，并且题目皆为″EPITOPESEQUENCES(表位序列)″。疫苗质粒总设计的方面在下述中公开：于2000年4月28日提交的题目为″Expression Vectors Encoding Epitopes ofTarget-Associated Antigens(编码靶点-相关抗原的表位的表达载体)″的美国专利申请Nos.09/561,572，和于2002年11月7日提交的题目为″Expression Vectors Encoding Epitopes of Target-Associated Antigens andMethods for their Design(编码靶点-相关抗原的表位的表达载体以及它们的设计方法)″的10/292,413(Pub.No.20030228634A1)；于2002年8月20日提交的10/225,568(Pub No.2003-0138808)，于2003年8月19日提交的PCT申请No.PCT/US2003/026231(Pub.No.WO 2004/018666)，二者题目皆为″EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OFTARGET-ASSOCIATED ANTIGENS(编码靶点-相关抗原的表位的表达载体)″；以及题目为″AVOIDANCE OF UNDESIRABLE REPLICATIONINTERMEDIATES IN PLASMID PROPAGATION(在质粒增殖中避免不理想的复制中间体)″的美国申请No.6,709,844。在引导针对具体癌症的免疫应答中特别有益的特异性抗原的组合在下述中公开：于2003年6月17日提交的临时美国专利申请No.60/479,554，和于2004年6月17日提交的美国专利申请No.10/871,708，以及PCT专利申请No.PCT/US2004/019571(Pub.No.WO 2004/112825)，所有题目皆为″Combinations of tumor-associated antigens in vaccines for various types ofcancers(肿瘤-相关的抗原在用于各种类型的癌症的疫苗中的组合)″。与肿瘤新生脉管系统相关的抗原(例如，PSMA，VEGFR2，Tie-2)还用于与癌症疾病联系，这在于2002年3月7日提交的题目为″Anti-NeovasculaturePreparations for Cancer(用于癌症的抗-新生脉管系统制备物)″的美国专利申请No.10/094,699(Pub.No.20030046714A1)中公开。通过生物应答调节剂的靶向施用而引发、维持和调节免疫应答的方法在于2004年12月29日提交的美国临时申请No.60/640,727中公开。在诱导免疫应答时避开CD4+细胞的方法在于2004年12月29日提交的美国临时申请No.60/640,821中公开。示例性的疾病、生物体和抗原以及与目标生物体、细胞和疾病相关的表位在于2001年2月2日提交的题目为″METHOD OFINDUCING A CTL RESPONSE(诱导CTL应答的方法)″的美国申请No.6977074(于2005年12月20日授权)中描述。示例性的方法在于2004年6月17日提交的美国临时申请No.60/580,969和于2006年1月12日公布的美国专利申请No.2006-0008468-A1中找到，二者题目皆为″COMBINATIONS OF TUMOR-ASSOCIATED ANTIGENS INDIAGNOTISTICS FOR VARIOUS TYPES OF CANCERS(肿瘤-相关的抗原在各种类型的癌症的诊断中的组合)″。方法和组合物还在于2004年12月29日提交的题目为″COMBINATIONS OF TUMOR-AS SOCAITEDANTIGENS IN COMPOSITIONS FOR VARIOUS TYPES OF CANCER(肿瘤-相关的抗原在用于各种类型的癌症的组合物中的组合)″的美国临时申请No.60/640,598中公开。使用免疫方法包括使用瞬时类似物评估并且监测免疫应答性的诊断技术的结合在下述中更充分地讨论：于2004年6月17日提交的临时美国专利申请No.60/580,964，和美国专利申请No.US-2005-0287068-A1(于2005年12月29日公布)，二者题目皆为″Improvedefficacy of active immunotherapy by integrating diagnostic with therapeuticmethods(通过结合诊断和治疗方法而提高主动免疫治疗的功效)″。免疫原性多肽编码载体在下述中公开：于2002年11月7日提交的题目为Expression Vectors Encoding Epitopes of Target-Associated Antigens andMethods for their Design(编码肿瘤-相关抗原的表位的表达载体以及它们的设计方法)的美国专利申请No.10/292,413(Pub.No.20030228634A1)，和于2005年6月17日提交的题目为″Methods and compositions to elicitmultivalent immune responses against dominant and subdominant epitopes，expressed on cancer cells and tumor stroma(激发针对在癌细胞和肿瘤基质上表达的显性和亚显性表位的多价免疫应答的方法和组合物)″的美国临时申请No.60/691,579。其它有用的公开，包括相关的方法和组合物，在于2005年6月17日提交的题目为″Multivalent Entrain-and-AmplifyImmunotherapeutics for Carcinoma(用于癌症的多价导引-和-增强免疫治疗)″的美国临时申请No 60/691,581中找到。其它方法、组合物、肽和肽类似物在皆于2004年6月17日提交并且题目分别为″SSX-2PEPTIDEANALOGS(SSX-2肽类似物)″和″NY-ESO PEPTIDE ANALOGS(NY-ESO肽类似物)″的美国临时申请Nos.60/581,001和60/580,962中公开。在上述段落中提及的每一申请和专利通过引用将其教导的全部完全结合于此。其它类似物、肽和方法在下述中公开：题目为″SSX-2PEPTIDE ANALOGS(SSX-2肽类似物)″的美国专利申请公布No 20060063913；和于2006年3月16日公布题目为″EPITOPE ANALOGS(表位类似物)″的美国专利申请No.2006-0057673A1；以及题目为″EPITOPE ANALOGS(表位类似物)″的PCT申请公布No.WO/2006/009920；所有这些于2005年6月17日提交。其它方法和组合物在于2004年6月17日提交题目为″SSX-2PEPTIDE ANALOGS(SSX-2肽类似物)″的美国临时申请No.60/581,001和于2004年6月17日提交题目为″NY-ESO PEPTIDE ANALOGS(NY-ESO肽类似物)″的美国临时申请No.60/580,962中公开；每一申请通过引用完全结合于此。作为一个实例，但是不限于其，每一参考文献通过引用结合其关于I类MHC-限制型表位、类似物、类似物设计、表位和类似物的应用、应用和制备表位的方法以及用于其表达的核酸载体的设计和应用的教导。通过引用明确结合于此的其它申请为：美国专利申请系列No.11/156,253(公布No.20060063913)，于2005年6月17日提交，题目为″SSX-2PEPTIDE ANALOGS(SSX-2肽类似物)″；美国专利申请系列No.11/155,929，于2005年6月17日提交，题目为″NY-ESO-1PEPTIDEANALOGS(NY-ESO-1肽类似物)″(公布No.20060094661)；美国专利申请系列No.11/321,967，于2005年12月29日提交，题目为″METHODS TOTRIGGER，MAINTAIN AND MANIPULATE IMMUNE RESPONSES BYTARGETED ADMINISTRATION OF BIOLOGICAL RESPONSEMODIFIERS INTO LYMPHOID ORGANS(通过将生物应答调节剂靶点施用到淋巴器官而引发、维持和处理免疫应答的方法)″；美国专利申请系列No.11/323,572，于2005年12月29日提交，题目为″METHODS TOELICIT ENHANCE AND SUSTAIN IMMUNE REPONSES AGAINSTMCH CLASS I RESTRICTED EPITOPES，FOR PROPHYLACTIC ORTHERAPEUTIC PURPOSES(用于预防或治疗目的而激发、增强并且维持针对I类MHC-限制型表位的免疫应答的方法)″；美国专利申请系列No.11/323,520，于2005年12月29日提交，题目为″METHODS TO BYPASSCD4+CELLS IN THE INDUCTION OF AN IMMUNE RESPONSE(在诱导免疫应答中避开CD4+细胞的方法)″；美国专利申请系列No.11/323,049，于2005年12月29日提交，题目为″COMBINATION OFTUMOR-AS SOCIATED ANTIGENS IN COMPOSITIONS FOR VARIOUSTYPES OF CANCERS(肿瘤-相关的抗原在用于各种类型的癌症的组合物中的组合)″；美国专利申请系列No.11,323,964，于2005年12月29日提交，题目为″COMBINATIONS OF TUMOR-ASSOCIATED ANTIGENS INDIAGNOSTICS FOR VARIOUS TYPES OF CANCERS(肿瘤-相关的抗原在各种类型的癌症的诊断中的组合)″；美国专利申请系列No.60/691,889，于2005年6月17日提交，题目为″EPITOPE ANALOGS(表位类似物)″。
VI.实施例
包括下述实例表明在设计包含那个激发二价免疫应答的PSMA和PRAME的免疫原性表位的质粒中的本发明的优选实施方案。本领域的技术人员应该理解，在下述实例中公开的方法代表本发明人发现的方法在本发明的实践中作用良好，并且因此可以考虑构成用于其实践的优选模式。然而，按照本公开，本领域的技术人员应该理解，在公开的具体的实施方案中可以进行许多变化，并且仍然获得同样的或相似的结果，而不背离本发明的精神和范围。
实施例1
设计编码免疫原的质粒表达载体
质粒P2和R2(还叫做pCTLR2)分别包含来自PSMA(在宽范围的癌症新生脉管系统上或由前列腺癌细胞表达)和PRAME(由癌细胞表达)的元件(图1)。每一插入物包含抗原序列的片段以及由靶点细胞表达并且通过免疫介导的攻击可接近的多拷贝的表位。侧连这些表位的是编码已知促进表位肽在细胞区室中的处理和产生的氨基酸的序列。另外，质粒RP5包含来自P2和R2二者的元件，表达的免疫原彼此连接。
R2质粒按照上文所讨论以及在下述中公开的质粒构建流程进行构建：于2005年6月17日提交题目为EPITOPE ANALOGS(表位类似物)的美国临时专利申请No.60/691,889；和题目为PRAME EPITOPEANALOGS(PRAME表位类似物)的美国专利申请No._/__________(Atty.Docket No.MANNK.052A)，其通过引用完全结合于此。R2，还叫作pCTLR2，是一种重组DNA质粒疫苗，其编码具有来自PRAME的HLAA2-特异性CTL表位：SLLQHLIGL，氨基酸残基425-433，和PRAME的表位簇区域：氨基酸422-509的一种多肽。在构建这一质粒时，在质粒中编码所述多肽的DNA序列置于来自巨细胞病毒的启动子/增强子序列(CMVp)的控制下，当被抗原呈递细胞摄取时，其允许所述多肽的信使的有效转录。在所述编码序列3’末端的牛生长素多腺苷化信号(BGH polyA)为所述信使提供多腺苷化信号，以增强其稳定性以及从核移动出来到细胞质中。为了促进质粒转运到核中，将来自猿猴病毒40的核输入序列(NIS)插入到所述质粒骨架中。将一个拷贝的CpG免疫刺激性基序加工到所述质粒中以进一步加强免疫应答。另外，所述质粒中的两个原核遗传元件负责在大肠杆菌中的扩增，卡那霉素抗性基因(Kan R)和复制的pMB细菌起点。
R2(pCTLR2)的编码的多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：19)在长度上是150个氨基酸残基，显示如下：
malqsllqhliglsnlthvlypvplesyedihgtlhlerlaylharlrellcelgrpsmvwlsanpcphcgdrtfydpepilcpcfmpnkrsllqhliglgdaaysllqhliglispekeeqyiasllqhliglkrpsikrsllqhligl
氨基酸残基2-89对应代表PRAME422-509的表位簇区域。在这一表位簇区域内，使用多种表位预测运算法则已经找到许多潜在的HLAA2-特异性CTL表位。氨基酸残基90-150是具有4个嵌入拷贝的PRAME425-433CTL表位(黑体)的表位释放(synchrotopetm)序列。侧链确定的PRAME CTL表位的是短氨基酸序列，已经表明其在PRAME CTL表位的加工中起重要作用。另外，将氨基酸序列ISPEKEEQYI A(SEQ ID NO：__；对应PRAME氨基酸276-286，斜体)加工到这一串珠区域，以促进所编码的多肽表达的基于抗体的检测。
实施例2
工程化的免疫原性元件的显性/亚显性层次
进行研究，以评估将来自不同抗原的元件加工到同一表达载体中的策略是否在这些元件中产生显性/亚显性层次。
将4组HHD转基因小鼠用质粒P2、R2、RP5或P2和R2质粒的混合物免疫，通过在第1、4、15和18天对每一淋巴结将在25μl PBS中的25μg/质粒直接接种到腹股沟淋巴结而进行。加强后10天，用PRAME425-433或PSMA288-297肽先体外后体内刺激脾细胞，并且在不同的效应器针对靶点细胞比例(E∶T比例)下针对51Cr-标记的肽包被的-T2细胞进行检测。
简要地，将在其表面上表达抗原的靶点细胞用铬的放射性同位素(51Cr)标记。然后将脾细胞与靶点细胞混和，并且温育几个小时。温育后，收集上清，并且使用γ计数器在一式三份样品中检测细胞溶解活性。表达抗原的细胞的裂解将51Cr释放到培养基中。通过比较在存在或不存在效应器细胞时表达目的抗原或对照抗原的靶点细胞的裂解(即，铬释放)，计算细胞-特异性裂解，并且通常表示为％特异性裂解。
使用每一重复的孔的平均cpm，计算对于效应器细胞的每一浓度的校正的裂解百分数(图2)。使用下式计算特异性裂解百分数：释放百分数＝100×(实验释放-自发释放)/(最大释放-自发释放)。数据描述如下：x-轴显示效应器对靶点的比例；y-轴显示对应的特异性裂解百分数。结果表示为％特异性细胞毒性(质粒R2还叫作CTLR2)。
结果显示P2和R2分别激发显著的细胞毒性免疫应答。然而，当将P2和R2免疫原结合在RP5质粒内时，针对PRAME表位的免疫性保留，而针对PSMA288-297表位的应答失去。这表明，从免疫学观点看来，在这两种表位之间建立了层次。将P2和R2质粒混和恢复二价免疫性。
实施例3
其它质粒的结构
为了设计导致更加平衡的针对PRAME和PSMA两种表位的免疫性(在RP5背景中的显性和亚显性)的表达载体，设计一套免疫原，并且通过应用下述三种方法的各种组合而结合到同一质粒骨架中：
1)调整PRAME425-433(显性)表位的拷贝数和PSMA288-297(亚显性)表位的拷贝数之间的比例，使之有利于后者。
2)将较少显性的表位置于C端位置，以便其不依赖于蛋白体加工而具有正确的C-端。
3)将较少显性的表位(PSMA)突变(在表达的插入物内的一个或多个拷贝)，以提高固有的免疫原性特性，诸如与I类MHC结合和在I类MHC上的半衰期。
图3显示制备的各种质粒的设计图案。在图3中，“V”对应携带I297V突变的PSMA266-297表位。
实施例4
通过包含来自不同抗原的表位的质粒实现二价应答的诱导
检测按照上述实施例3中所述设计的质粒，以确定它们引发针对PRAME425-433和PSMA288-297肿瘤相关抗原的二价免疫应答的能力。
将6组HHD转基因小鼠(n＝8/组)用携带图3所示的插入物的质粒(RP8，RP9，RP10，RP11，RP12，或RP13)免疫，通过在第1和第4天对每一淋巴结将在25μl PBS中的25μg(质粒)直接接种到腹股沟淋巴结而进行。最后一次质粒注射后7天，在第11天，将所有免疫动物处死，包括5只首次用于实验的对照。通过检测IFN-γ生成斑点形成群落(SFC)的频率而进行ELISPOT分析，如下述。
简要地，在第11天将脾从处死的动物分离，并且在密度离心后(Lympholyte Mammal，Cedarlane Labs，Burlington，NC)，将单核细胞重悬在HL-1培养基中。将脾细胞(每孔5×105个或2.5×105个细胞)与10μgPSMA288-297或PRAME425-433，天然肽在96孔滤膜平板(Multi-screen IPmembrane 96-well plate，Millipore，MA)的三个复孔中温育。在显色之前，将样品在37℃5％CO2和100％湿度温育42小时。在与脾细胞一起温育之前，小鼠IFN-γ包被的抗体(IFN-γ抗体对，U-CyTech Biosciences，TheNetherlands)用作包被剂，然后伴随生物素酰化的检测抗体。GABA缀合物和U-CyTech Biosciences的有产权的物质用于IFN-γ斑点显色。使用校准用于IFN-γ斑点分析的ELISpot斑点读取软件版本3.2.3，在AID国际平板读取仪上显色后24小时检测免疫动物中的CTL应答。
图4显示的结果表示对每一实验组的平均IFN-γ斑点计数。数据表示为每次处理IFN-γ斑点(代表IFN-γ分泌细胞的群落)的频率，表示为个体动物应答的平均值+/-标准偏差(Std)。从免疫的或首次用于实验的小鼠分离并且用PSMA288-297天然肽刺激的脾细胞而产生的数据表明，与首次用于实验的对照(12.8+2.4 IFN-γ斑点)或其它处理组相比较，RP12诱导针对PSMA288-297抗原的最强的免疫性(55.8+/-1.6 IFN-γ斑点)。这代表使用RP12质粒的5-倍增强的PSMA免疫应答。
另外，从免疫的或首次用于实验的小鼠分离并且用PRAME425-433天然肽刺激的脾细胞而产生的数据也表明，与首次用于实验的对照(8.5+2.8IFN-γ斑点)或其它处理组相比较，用RP12免疫的动物表现出针对PRAME425-433抗原的最强的免疫应答(234.5+3.7 IFN-γ斑点)。这代表使用RP12质粒大于20-倍增强的PRAME免疫应答。
综上所述，图4所示的结果显示质粒RP12诱导针对PRAME和PSMA表位的强二价免疫性。使用RP9，观察到一些针对PRAME和PSMA表位的二价免疫性，并且对于RP13、RP10、RP11和RP8，观察到更小程度的二价免疫性——与质粒RP5(图2)相比，所有这些质粒具有相对于PRAME表位更有力的PSMA表位表现性。部分由于使用PSMA的I297V类似物，所以这一观察显而易见。
实施例5
RP12质粒诱导二价应答
基于实施例4中6种质粒(RP8，RP9，RP10，RP11，RP12和RP13)的比较，由于RP12是引发针对PRAME425-433和PSMA288-297二者的强二价免疫应答的唯一质粒，所以选择RP12用于进一步分析。
将2只代表性HHD转基因小鼠用携带插入物的RP12质粒(图3所示)免疫，通过在第1、4、15和18天对每一淋巴结将在25μl PBS中的25μg(质粒)直接接种到腹股沟淋巴结而进行。最后一次质粒注射后10天，通过外周血单核细胞的四聚体染色和关于CD8表达的共染色而检测PRAME和PSMA表位-特异性CD8+T细胞的频率。
简要地，密度离心(Lympholyte Mammal，Cedarlane Labs)后将单核细胞从外周血分离，并且用HLA-A*0201 PRAME MHC四聚体(BeckmanCoulter，T02001)和HLA-A*0201 PSMA MHC四聚体(Beckman Coulter，T02001)染色。然后将这些细胞用FITC缀合的大鼠抗-小鼠CD8a(Ly-2)单克隆抗体(BD Biosciences，553031)共染色。使用BD FACS Calibur流式细胞仪收集数据，并且使用Cellquest软件分析数据，通过控制(gating on)淋巴细胞群体并且计算CD8+CTL群体中四聚体阳性细胞的百分数而进行。
图5所示的结果表明，节内质粒免疫后，RP12质粒激发双免疫性，并且PRAME425-433特异性T细胞的频率比对PSMA亚显性表位特异的T细胞的频率高出几倍。
实施例6
在用PRAME和PSMA质粒致敏并且用肽加强的小鼠中的二价免疫应答
为了确定使用质粒RP12和RP8是否能够诱导针对肿瘤相关抗原Prame425-433和PSMA288-297的二价应答，在用PSMA288-297I297V类似物进行肽加强后，进行免疫动物的四聚体分析。
将HHD转基因小鼠用图3所示携带插入物的RP8或RP12质粒免疫，通过在第1、4、15和18天对每一淋巴结将在25μl PBS中的100μg(质粒)直接接种到腹股沟淋巴结而进行。在第29和32天，将小鼠用25μgPSMA288-297肽类似物(I297V)加强。在开始肽加强前一天和完成质粒加强后10天，通过四聚体染色(如上述)检测PRAME和PSMA表位-特异性T细胞的频率，并且与在最后一次肽加强后7天的四聚体结果进行比较。
显示在图6A中的结果，表示为特异性CD8+T细胞频率的平均值±SEM，表明在肽加强之前RP12质粒激发比RP8稍高的PSMA-特异性免疫性。另外，在RP12和RP8的两种情形中，发现在肽加强前针对PRAME的免疫性是显性的。然而，在使用PSMA亚显性表位加强后，针对PRAME和PSMA的免疫应答表现出更平衡的性质，特别在RP12的情形中，这表现出激发针对不同免疫层次的表位的平衡的免疫应答的策略的优点。
图6B显示在来自每组的3只代表性小鼠中的针对PRAME和PSMA的免疫应答，并且进一步举例说明由RP12质粒和PSMA(I297V)肽加强激发的增强的二价应答。
实施例7
在PSMA肽加强及随后的PRAME肽加强后的二价免疫应答
检验使用质粒RP12和RP8免疫在用PSMA288-297I297V类似物第一次肽加强和用Prame425-433L426Nva，L433Nle肽类似物第二次加强后是否能诱导针对Prame425-433和PSMA288-297表位那些肿瘤相关抗原的二价应答。
通过在第1、4、15和18天直接接种到腹股沟淋巴结而4次注射RP8或RP12质粒(4mg/ml)将小鼠免疫。在第29天和32天，将小鼠用PSMA288-297I297V肽类似物(0.5mg/ml)加强，随后在第42和59天分别用0.5mg/ml和0.05mg/ml的Prame425-433L426Nva，L433Nle肽类似物第二次加强。将小鼠处死，并且如下进行ELISPOT分析(图7)。
简要地，在最后一次Prame425-433 L426Nva，L433Nle肽注射后10天，将脾从处死的动物分离，并且在密度离心(Lympholyte Mammal，CedarlaneLabs，Burlington，NC)后，将单核细胞重悬在HL-1培养基中。将脾细胞(每孔2×105个细胞)与10μg PSMA288-297或PRAME425-433，天然肽在96孔滤膜平板(Multi-screen IP membrane 96-well plate，Millipore，MA)的三个复孔中温育。在显色之前，将样品在37℃5％CO2和100％湿度温育72小时。在与脾细胞一起温育之前，小鼠IFN-γ包被的抗体(IFN-γ抗体对，U-CyTechBiosciences，The Netherlands)用作包被剂，然后伴随生物素酰化的检测抗体。GABA缀合物和来自U-CyTech Biosciences的各种物质用于IFN-γ斑点显色。使用校准用于IFN-γ斑点分析的ELISpot斑点读取软件版本3.2.3，在AID国际平板读取仪上显色后24小时检测免疫动物中的CTL应答。
结果表明，在所有检测剂量，RP12质粒激发比RP8更高的PSMA-特异性免疫性。对于RP12和RP8两种质粒，发现针对PRAME的免疫性在所有检测的剂量都是显性的。此外，在用PSMA和PRAME表位加强后，RP12质粒表现出针对PRAME和PSMA的强平衡的免疫应答。
序列表
<110>曼康公司
裘志勇
阿德里安·博特
<120>激发针对在癌细胞和肿瘤基质上表达的结构域和
亚结构域表位的多价免疫应答的方法和组合物
<130>MANNK.053VPC
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<160>18
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>3950
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>工程化的肽
<400>1
cgttgacatt gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat 60
agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg 120
cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata 180
gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta 240
catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc 300
gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac 360
gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga 420
tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg 480
ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg 540
caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact 600
agagaaccca ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa 660
gctggctagc gtttaaactt aagccaccat gaagaggcca agtattaaga ggagtctcct 720
gcaacacctc atcgggcttg ccctgcagag tctcttgcag cacctcatcg ggctgagcaa 780
tctgacccac gtgctgtatc ctgtccccct ggagagttat gaggacatcc atggtaccct 840
ccacctggag aggcttgcct atctgcatgc caggctcagg gagttgctgt gtgagttggg 900
gcggcccagc atggtctggc ttagtgccaa cccctgtcct cactgtgggg acagaacctt 960
ctatgacccg gagcccatcc tgtgcccctg tttcatgcct aacaagctta atctccttca 1020
cgaaaccgac tcggctgtgg ccaccgcgcg ccgcccgcgc tggctgtgcg ctggggcgct 1080
ggtgctggcg ggtggcttct ttctcctcgg cttcctcttc gggtggttta taaaaagcgc 1140
tcagctggca ggggccaaag gagtcattct ctactccgac cctgctgact actttgctcc 1200
tggggtgaag tcctatccag atggttggaa tcttcctgga ggtggtgtcc agcgtggaaa 1260
tatcctaaat ctgaatggtg caggagaccc tctcacacca ggttacccag caaatgaata 1320
tgcttatagg cgtggaattg cagaggctgt tggtcttcca agtattcctg ttcatcctat 1380
tcgaaagggc cttccaagta ttcctgttca tccaattctc gtcggtcttc caagtattcc 1440
tgttcatcca attaagcgca tttccccgga gaaggaagag cagtatatcg ccaagcgcgg 1500
tcttccaagt attcctgttc atccaattaa gaggccaagt attaagaggg gtcttccaag 1560
tattcctgtt catccagttt agtgagaatt ctgcagatat ccatcacact ggcggccgct 1620
cgagtctaga gggcccgttt aaacccgctg atcagcctcg actgtgcctt ctagttgcca 1680
gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac 1740
tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat 1800
tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat tgggaagaca atagcaggca 1860
tgctggggat gcggtgggct ctatggcttc tactgggcgg ttttatggac agcaagcgaa 1920
ccggaattgc cagctggggc gccctctggt aaggttggga agccctgcaa agtaaactgg 1980
atggctttct tgccgccaag gatctgatgg cgcaggggat caagctctga tcaagagaca 2040
ggatgaggat cgtttcgcat gattgaacaa gatggattgc acgcaggttc tccggccgct 2100
tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg ctctgatgcc 2160
gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac cgacctgtcc 2220
ggtgccctga atgaactgca agacgaggca gcgcggctat cgtggctggc cacgacgggc 2280
gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg gctgctattg 2340
ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga gaaagtatcc 2400
atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg cccattcgac 2460
caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca cgtactcgga tggaagccgg tcttgtcgat 2520
caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg ctcgcgccag ccgaactgtt cgccaggctc 2580
aaggcgagca tgcccgacgg cgaggatctc gtcgtgaccc atggcgatgc ctgcttgccg 2640
aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct ggattcatcg actgtggccg gctgggtgtg 2700
gcggaccgct atcaggacat agcgttggct acccgtgata ttgctgaaga gcttggcggc 2760
gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac ggtatcgccg ctcccgattc gcagcgcatc 2820
gccttctatc gccttcttga cgagttcttc tgaattatta acgcttacaa tttcctgatg 2880
cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatcaggtg gcacttttcg 2940
gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc 3000
gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatag cacgtgctaa aacttcattt 3060
ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctccggaaga gtcaagaaca 3120
tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt 3180
tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc 3240
gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct 3300
ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg 3360
tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca 3420
agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact 3480
atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta 3540
acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta 3600
actacggcta cactagaaga acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct 3660
tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt 3720
tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga 3780
tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtcc 3840
ggccggaaac gtttggttgc tgactaattg agatgcatgc tttgcatact tctgcctgct 3900
ggggagcctg gggactttcc acacctcgcg atgtacgggc cagatatacg 3950
<210>2
<211>297
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>工程化的肽
<400>2
Met Lys Arg Pro Ser Ile Lys Arg Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly
1 5 10 15
Leu Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu Ser Asn Leu
20 25 30
Thr His Val Leu Tyr Pro Val Pro Leu Glu Ser Tyr Glu Asp Ile His
35 40 45
Gly Thr Leu His Leu Glu Arg Leu Ala Tyr Leu His Ala Arg Leu Arg
50 55 60
Glu Leu Leu Cys Glu Leu Gly Arg Pro Ser Met Val Trp Leu Ser Ala
65 70 75 80
Asn Pro Cys Pro His Cys Gly Asp Arg Thr Phe Tyr Asp Pro Glu Pro
85 90 95
Ile Leu Cys Pro Cys Phe Met Pro Asn Lys Leu Asn Leu Leu His Glu
100 105 110
Thr Asp Ser Ala Val Ala Thr Ala Arg Arg Pro Arg Trp Leu Cys Ala
115 120 125
Gly Ala Leu Val Leu Ala Gly Gly Phe Phe Leu Leu Gly Phe Leu Phe
130 135 140
Gly Trp Phe Ile Lys Ser Ala Gln Leu Ala Gly Ala Lys Gly Val Ile
145 150 155 160
Leu Tyr Ser Asp Pro Ala Asp Tyr Phe Ala Pro Gly Val Lys Ser Tyr
165 170 175
Pro Asp Gly Trp Asn Leu Pro Gly Gly Gly Val Gln Arg Gly Asn Ile
180 185 190
Leu Asn Leu Asn Gly Ala Gly Asp Pro Leu Thr Pro Gly Tyr Pro Ala
195 200 205
Asn Glu Tyr Ala Tyr Arg Arg Gly Ile Ala Glu Ala Val Gly Leu Pro
210 215 220
Ser Ile Pro Val His Pro Ile Arg Lys Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val
225 230 235 240
His Pro Ile Leu Val Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Ile Lys
245 250 255
Arg Ile Ser Pro Glu Lys Glu Glu Gln Tyr Ile Ala Lys Arg Gly Leu
260 265 270
Pro Ser Ile Pro Val His Pro Ile Lys Arg Pro Ser Ile Lys Arg Gly
275 280 285
Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Val
290 295
<210>3
<211>3884
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>工程化的肽
<400>3
cgttgacatt gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat 60
agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg 120
cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata 180
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tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg 480
ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg 540
caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact 600
agagaaccca ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa 660
gctggctagc gtttaaactt aagccaccat gaatctcctt cacgaaaccg actcggctgt 720
ggccaccgcg cgccgcccgc gctggctgtg cgctggggcg ctggtgctgg cgggtggctt 780
ctttctcctc ggcttcctct tcgggtggtt tataaaaagc gctcagctgg caggggccaa 840
aggagtcatt ctctactccg accctgctga ctactttgct cctggggtga agtcctatcc 900
agatggttgg aatcttcctg gaggtggtgt ccagcgtgga aatatcctaa atctgaatgg 960
tgcaggagac cctctcacac caggttaccc agcaaatgaa tatgcttata ggcgtggaat 1020
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gcagcacctc atcgggctga gcaatctgac ccacgtgctg tatcctgtcc ccctggagag 1140
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tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct 1680
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gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg 1800
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gctgatgcaa tgcggcggct gcatacgctt gatccggcta cctgcccatt cgaccaccaa 2400
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cgctatcagg acatagcgtt ggctacccgt gatattgctg aagagcttgg cggcgaatgg 2700
gctgaccgct tcctcgtgct ttacggtatc gccgctcccg attcgcagcg catcgccttc 2760
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cctggggact ttccacacct cgcgatgtac gggccagata tacg 3884
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>工程化的肽
<400>4
Met Asn Leu Leu His Glu Thr Asp Ser Ala Val Ala Thr Ala Arg Arg
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Pro Arg Trp Leu Cys Ala Gly Ala Leu Val Leu Ala Gly Gly Phe Phe
20 25 30
Leu Leu Gly Phe Leu Phe Gly Trp Phe Ile Lys Ser Ala Gln Leu Ala
35 40 45
Gly Ala Lys Gly Val Ile Leu Tyr Ser Asp Pro Ala Asp Tyr Phe Ala
50 55 60
Pro Gly Val Lys Ser Tyr Pro Asp Gly Trp Asn Leu Pro Gly Gly Gly
65 70 75 80
Val Gln Arg Gly Asn Ile Leu Asn Leu Asn Gly Ala Gly Asp Pro Leu
85 90 95
Thr Pro Gly Tyr Pro Ala Asn Glu Tyr Ala Tyr Arg Arg Gly Ile Ala
100 105 110
Glu Ala Val Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Ile Ala Leu Gln
115 120 125
Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu Ser Asn Leu Thr His Val Leu
130 135 140
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Leu Glu Arg Leu Ala Tyr Leu His Ala Arg Leu Arg Glu Leu Leu Cys
165 170 175
Glu Leu Gly Arg Pro Ser Met Val Trp Leu Ser Ala Asn Pro Cys Pro
180 185 190
His Cys Gly Asp Arg Thr Phe Tyr Asp Pro Glu Pro Ile Leu Cys Pro
195 200 205
Cys Phe Met Pro Asn Lys Arg Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu
210 215 220
Gly Asp Ala Ala Tyr Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu Ile Ser
225 230 235 240
Pro Glu Lys Glu Glu Gln Tyr Ile Ala Ser Leu Leu Gln His Leu Ile
245 250 255
Gly Leu Lys Arg Pro Ser Ile Lys Arg Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val
260 265 270
His Pro Val
275
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<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>5
Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu
1 5
<210>6
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>6
Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Ile
1 5 10
<210>7
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>工程化的肽
<400>7
Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Val
1 5 10
<210>8
<211>66
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>工程化的肽
<400>8
Arg Lys Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Ile Leu Val Gly Leu
1 5 10 15
Pro Ser Ile Pro Val His Pro Ile Lys Arg Ile Ser Pro Glu Lys Glu
20 25 30
Glu Gln Tyr Ile Ala Lys Arg Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro
35 40 45
Ile Lys Arg Pro Ser Ile Lys Arg Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val His
50 55 60
Pro Val
65
<210>9
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>工程化的肽
<400>9
Lys Arg Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu Gly Asp Ala Ala Tyr
1 5 10 15
Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu Ile Ser Pro Glu Lys Glu Glu
20 25 30
Gln Tyr Ile Ala Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu Lys Arg Pro
35 40 45
Ser Ile Lys Arg Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Val
50 55 60
<210>10
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>工程化的肽
<400>10
Met Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu Ser Asn Leu
1 5 10 15
Thr His Val Leu Tyr Pro Val Pro Leu Glu Ser Tyr Glu Asp Ile His
20 25 30
Gly Thr Leu His Leu Glu Arg Leu Ala Tyr Leu His Ala Arg Leu Arg
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Ile Leu Cys Pro Cys Phe Met Pro Asn Lys Arg Ser Leu Leu Gln His
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Leu Ile Gly Leu Gly Asp Ala Ala Tyr Ser Leu Leu Gln His Leu Ile
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Gly Leu Ile Ser Pro Glu Lys Glu Glu Gln Tyr Ile Ala Ser Leu Leu
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Gln His Leu Ile Gly Leu
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>工程化的肽
<400>11
Met Asn Leu Leu His Glu Thr Asp Ser Ala Val Ala Thr Ala Arg Arg
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Pro Arg Trp Leu Cys Ala Gly Ala Leu Val Leu Ala Gly Gly Phe Phe
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Leu Leu Gly Phe Leu Phe Gly Trp Phe Ile Lys Ser Ala Gln Leu Ala
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Gly Ala Lys Gly Val Ile Leu Tyr Ser Asp Pro Ala Asp Tyr Phe Ala
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65 70 75 80
Val Gln Arg Gly Asn Ile Leu Asn Leu Asn Gly Ala Gly Asp Pro Leu
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100 105 110
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115 120 125
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Pro Val His Pro Ile Lys Arg Ile Ser Pro Glu Lys Glu Glu Gln Tyr
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Ile Ala Lys Arg Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Ile Lys Arg
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Pro Ser Ile Lys Arg Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Ile
180 185 190
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>工程化的肽
<400>12
Met Ile Ser Pro Glu Lys Glu Glu Gln Tyr Ile Ala Ser Leu Leu Gln
1 5 10 15
His Leu Ile Gly Leu Lys Arg Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu
20 25 30
Lys Arg Pro Ser Ile Lys Arg Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu
35 40 45
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50 55 60
His Val Leu Tyr Pro Val Pro Leu Glu Ser Tyr Glu Asp Ile His Gly
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Pro Cys Pro His Cys Gly Asp Arg Thr Phe Tyr Asp Pro Glu Pro Ile
115 120 125
Leu Cys Pro Cys Phe Met Pro Asn Lys Leu Asn Leu Leu His Glu Thr
130 135 140
Asp Ser Ala Val Ala Thr Ala Arg Arg Pro Arg Trp Leu Cys Ala Gly
145 150 155 160
Ala Leu Val Leu Ala Gly Gly Phe Phe Leu Leu Gly Phe Leu Phe Gly
165 170 175
Trp Phe Ile Lys Ser Ala Gln Leu Ala Gly Ala Lys Gly Val Ile Leu
180 185 190
Tyr Ser Asp Pro Ala Asp Tyr Phe Ala Pro Gly Val Lys Ser Tyr Pro
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Asp Gly Trp Asn Leu Pro Gly Gly Gly Val Gln Arg Gly Asn Ile Leu
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Asn Leu Asn Gly Ala Gly Asp Pro Leu Thr Pro Gly Tyr Pro Ala Asn
225 230 235 240
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245 250 255
Ile Pro Val His Pro Ile Arg Lys Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val His
260 265 270
Pro Ile Leu Val Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Ile Lys Arg
275 280 285
Ile Ser Pro Glu Lys Glu Glu Gln Tyr Ile Ala Lys Arg Gly Leu Pro
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Ser Ile Pro Val His Pro Ile Lys Arg Pro Ser Ile Lys Arg Gly Leu
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Pro Ser Ile Pro Val His Pro Ile
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<211>297
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>工程化的肽
<400>13
Met Lys Arg Pro Ser Ile Lys Arg Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly
1 5 10 15
Leu Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu Ser Asn Leu
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Thr His Val Leu Tyr Pro Val Pro Leu Glu Ser Tyr Glu Asp Ile His
35 40 45
Gly Thr Leu His Leu Glu Arg Leu Ala Tyr Leu His Ala Arg Leu Arg
50 55 60
Glu Leu Leu Cys Glu Leu Gly Arg Pro Ser Met Val Trp Leu Ser Ala
65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Gly Ala Leu Val Leu Ala Gly Gly Phe Phe Leu Leu Gly Phe Leu Phe
130 135 140
Gly Trp Phe Ile Lys Ser Ala Gln Leu Ala Gly Ala Lys Gly Val Ile
145 150 155 160
Leu Tyr Ser Asp Pro Ala Asp Tyr Phe Ala Pro Gly Val Lys Ser Tyr
165 170 175
Pro Asp Gly Trp Asn Leu Pro Gly Gly Gly Val Gln Arg Gly Asn Ile
180 185 190
Leu Asn Leu Asn Gly Ala Gly Asp Pro Leu Thr Pro Gly Tyr Pro Ala
195 200 205
Asn Glu Tyr Ala Tyr Arg Arg Gly Ile Ala Glu Ala Val Gly Leu Pro
210 215 220
Ser Ile Pro Val His Pro Ile Arg Lys Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val
225 230 235 240
His Pro Ile Leu Val Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Ile Lys
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260 265 270
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275 280 285
Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Val
290 295
<210>14
<211>304
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>工程化的肽
<400>14
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20 25 30
His Leu Ile Gly Leu Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly
35 40 45
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65 70 75 80
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<220>
<223>工程化的肽
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1 5 10 15
His Leu Ile Gly Leu Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly
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<220>
<223>工程化的肽
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<220>
<223>工程化的肽
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Pro Arg Trp Leu Cys Ala Gly Ala Leu Val Leu Ala Gly Gly Phe Phe
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<220>
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