一种制备高纯度胰激肽原酶原料药的方法.pdf

本发明涉及一种制备高纯度生物原料药的方法，特别是一种高纯度胰激肽原酶原料药的方法。该方法由胰激肽原酶中间体在优化的分离条件下，经过QAE－Sepharose Fast Flow离子柱层析纯化制得的激肽原酶的原料药。该原料药的纯度高达75％以上，效价增加55单位/mg以上，比活达到350单位/mg蛋白以上。

权利要求书
1、  一种制备高纯度胰激肽原酶原料药的方法，其特征在于包括以下步骤：

1.  配制：配制0.15-0.5mol/L的NH4AC缓冲液和0.1-0.5mol/L的NH4AC缓冲液，调整至pH6.0，并测电导值；

2.  层析：

2.  1平衡：将装有QAE-Sepharose Fast Flow离子柱填料的层析柱，用pH6.0的0.15-0.5mol/L的NH4AC缓冲液平衡，直至进出溶液pH值一致、电导值相同后平衡完毕；

2.  2进样：调胰激肽原酶中间体的pH值与平衡液相近(6.1～6.2)，电导值略低于平衡液电导值(略低0.2～0.3×104μs/cm)，根据每升填料最大交换量2000万单位计算上样量并将上样液上柱；

2.  3洗涤：用pH6.0的0.15-0.5mol/L的NH4AC缓冲液冲洗柱子，同时用分光光度计跟踪检测流出液在280nm处的吸收值，冲洗至洗出液OD值低于0.5时停止；

2.  4洗脱：用pH6.0的0.1-0.5mol/L的NH4AC缓冲液以500～600ml/min流速洗脱柱子，同时用分光光度计进行跟踪检测其在253nm处的吸收值，收集峰液；

3.  超滤脱盐：将收集液加纯化水超滤脱盐浓缩，当超出液电导值小于0.1×104μs/cm以下时，即可停止加纯化水，继续浓缩；

4.  浓缩液过滤；

5.  加辅料冻干；

6.  过筛、分装。

2、  权利要求1所述的制备高纯度胰激肽原酶原料药的方法，其中层析时所用层析柱为￠40cm，体积为50L。

3、  权利要求1所述的制备高纯度胰激肽原酶原料药的方法，其中以洗脱液效价大于50单位/cm时为洗脱收集起点，以洗脱液效价小于50单位/cm为洗脱收集终点，收集峰液体积约为30～60L。

4、  权利要求1所述的制备高纯度胰激肽原酶原料药的方法，其中超滤脱盐时的截留分子量为10000dt。

5、  权利要求1所述的制备高纯度胰激肽原酶原料药的方法，其中步骤3中当浓缩至液体体积6～11L时，关闭超滤机，纯化水冲膜，至回管效价低于50单位/ml时，得浓缩液，取样送检。

6、  权利要求1所述的制备高纯度胰激肽原酶原料药的方法，其中步骤4中将浓缩液用0.22μm膜的筒式过滤器过滤，得过滤浓缩液。

7、  权利要求1所述的制备高纯度胰激肽原酶原料药的方法，其中加辅料冻干的步骤如下：根据浓缩液的效价，控制成品比活力350单位/mg蛋白以上和效价在70单位/mg以上，计算明胶、乳糖的用量，并分别用注射用水加热溶解并通过0.22μm膜过滤，待冷却至25℃以下，加入过滤浓缩液中混合均匀后进冻干箱冻干；冻干时每盘均匀分装1～3L液体，视液体总量而定；冻干工艺条件为：预冻：制品温度-20℃--40℃，视盘中液量，保温2-4小时。

8、  权利要求1所述的制备高纯度胰激肽原酶原料药的方法，其中将冻干好的成品粉碎并过80目筛并混合均匀后用药用复合袋分装，装于铝听内，加盖密封。

说明书一种制备高纯度胰激肽原酶原料药的方法
技术领域
本发明涉及一种制备高纯度生物原料药的方法，特别是一种制备高纯度胰激肽原酶原料药的方法。
背景技术
胰激肽原酶是一种具有扩张血管改善微循环作用的周围血管扩张药。它能够激活纤溶酶，抑制磷脂酶A2，具有降低血粘度，防止血小板聚集，防止血栓形成等作用。其主要用于微循环障碍性疾病，如糖尿病引起的肾病、周围神经病、视网膜病、眼底病及缺血性脑血管病的治疗，也可用于高血压病的辅助治疗。
胰激肽原酶是从哺乳动物的胰脏中经提取纯化而得到的，即从胰脏本身、胰酶粉以及胰激肽原酶粗品(中间体)中提取，并通过纯化而制得。现有胰激肽原酶的纯化方法包括使用多糖非树脂物料进行纯化，例如使粗的胰激肽原酶吸附到一种弱碱性阴离子交换纤维素上并分离(见日本专利发行No.11697/62)；或者将一种铝盐或者锌盐加入含有胰激肽原酶的水溶液中，将产生的胰激肽原酶的沉淀吸附到弱碱性的阴离子交换纤维素上或交联葡聚糖(Sephadex)上，并分离之(见日本公开专利发行No.56886/73)；另一种已知的纯化方法是使用离子交换树脂，即加入一种蛋白质沉淀剂到胰脏提取液中，产生的胰激肽原酶吸附到大孔强碱性阴离子交换树脂，并分离之(见日本公开专利No.103715/73)。然而，利用上述多糖型非树脂物料进行吸附的方法缺点是离子交换物料的物理强度不够，不能进行大规模制备。而离子交换树脂法不能使产品在洗脱时除去不需要的杂质。因此，上述方法得到产品的纯度还有待于进一步提高。
《中国生化药物杂志》2005Vol.26No.1P.37-38《离子交换色谱法制备高纯度胰激肽原酶》作者张建新、姜标、刘长亮。
发明人原来采用的方法是通过离子交换色谱法一步纯化胰激肽原酶粗品，采用3-4倍丙酮沉淀，纯化得到的胰激肽原酶，比活在300U/mg蛋白质以上，活性回收率在65％以上。但是原有PK洗脱液的价格极高，而且在使用丙酮沉淀过程中会造成大量的损失。而且纯度也不高。为了解决以上种种问题，发明人采用了新的工艺方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备高纯度胰激肽原酶原料药的方法，该方法由胰激肽原酶中间体在优化的分离条件下，经过QAE-SepharoseFast Flow离子柱层析纯化制得的激肽原酶原料药。该原料药的纯度高达75％以上，效价增加55单位/mg以上，比活达到350单位/mg蛋白以上，参见表1和表2。
本发明的方法如下：
1.配制：配制0.15-0.5mol/L的NH4AC缓冲液和0.1-0.5mol/L的NH4AC缓冲液，调整至pH6.0，并测电导值；
2.层析：
2.1平衡：将装有QAE-Sepharose Fast Flow离子柱填料的层析柱，用pH6.0的0.15-0.5mol/L的NH4AC缓冲液平衡，直至进出层析柱的溶液pH值一致、电导值相同后平衡完毕；
2.2进样：调胰激肽原酶中间体的pH值与平衡液相近(6.1～6.2)，电导值略低于平衡液电导值(略低0.2～0.3×104μs/cm)，根据每升填料最大交换量2000万单位计算上样量，将上样液上柱；
2.3洗涤：用pH6.0的0.15-0.5mol/L的NH4AC缓冲液冲洗柱子，同时用分光光度计跟踪检测流出液在280nm处的吸收值，冲洗至洗出液的OD值低于0.5时停止；
2.4洗脱：用pH6.0的0.1-0.5mol/L的NH4AC缓冲液洗脱柱子，同时用分光光度计进行跟踪检测其在253nm处的吸收值，收集峰液；
3.超滤脱盐：将收集液加纯化水超滤脱盐浓缩，当超出液电导值小于0.1×104μs/cm时，即可停止加纯化水，继续浓缩；
4.浓缩液过滤；
5.加辅料冻干；
6.过筛、分装。
在上述方法中优选使用下列条件进行操作：
在步骤1中，配制0.15mol/L的NH4AC缓冲液和0.5mol/L的NH4AC
缓冲液时分别用乙酸和氨水调整pH。
在步骤2中，所用的层析柱为￠40cm，体积为50L；以洗脱液效价大于50单位/cm时为洗脱收集起点，以洗脱液效价小于50单位/cm为洗脱收集终点，收集峰液体积约为30～60L。
在步骤3中，超滤脱盐的截留分子量为10000dt；当浓缩至液体体积6～11L时，关闭超滤机，纯化水冲膜，至回管效价低于50单位/ml时，得浓缩液，取样送检。
在步骤4中，将浓缩液用0.22μm膜的筒式过滤器过滤，得过滤浓缩液。
在步骤5中，加辅料冻干的具体步骤如下：根据浓缩液的效价，控制成品比活力350单位/mg蛋白以上和效价在70单位/mg以上，计算明胶、乳糖的用量，分别用注射用水加热溶解并通过0.22μm膜过滤，待冷却，加入过滤浓缩液中，混合后进冻干箱冻干。冻干工艺条件为：预冻：制品温度-20℃--40℃，视盘中液量，保温2-4小时。升华：导热油升温速度10℃/小时，至油温升至30℃，过程控制前箱真空度不大于15Pa。干燥：制品温度达23℃时，保温4小时以上直至干燥终点。
在步骤6中，将冻干好的成品粉碎并过80目筛并混合均匀后用药用复合袋分装，装于铝听内，加盖密封。
具体实施方式
实施例1
1.配制洗脱液
配制0.15mol/L的NH4AC缓冲液和0.5mol/L的NH4AC缓冲液，分别用乙酸和氨水调整至pH6.0，并测电导值。
2.层析
2.1装柱平衡：将离子柱填料QAE-Sepharose Fast Flow装于￠40cm，体积为50L的层析柱中，用pH6.0的0.15mol/L的NH4AC缓冲液平衡，直至进出溶液pH值一致、电导值相同后平衡完毕。
2.2进样：调胰激肽原酶中间体pH值与平衡液相近(6.1～6.2)，
电导值略低于平衡液电导值(略低0.2～0.3×104μs/cm)，根据每升填料最大交换量2000万单位，计算上样量。将上样液上柱。
2.3洗涤：用pH6.0的0.5mol/L的NH4AC缓冲液冲洗柱子，同时用分光光度计跟踪检测流出液在280nm处的吸收值，冲洗至洗出液OD值低于0.5时停止。
2.4洗脱：用pH6.0的0.5mol/L的NH4AC缓冲液洗脱柱子，同时用分光光度计进行跟踪检测其在253nm处的吸收值，收集峰液。
3.超滤脱盐
3.1将收集液加纯化水超滤脱盐浓缩，当超出液电导值小于0.1×104μs/cm以下时，即可停止加纯化水，继续浓缩。
3.2当浓缩至液体体积6～11L时，关闭超滤机，纯化水冲膜，至回管效价低于50单位/ml时，得浓缩液，取样送检。
4.浓缩液过滤：将浓缩液用0.22μm膜的筒式过滤器过滤，得过滤浓缩液。
5.加辅料冻干：根据浓缩液的效价，控制成品比活力350单位/mg蛋白以上和效价在70单位/mg以上，计算明胶、乳糖的用量。并分别用注射用水加热溶解并通过0.22μm膜过滤，待冷却至25℃以下，加入过滤浓缩液中混合均匀后进冻干箱冻干。冻干时每盘均匀分装1～3L液体，视液体总量而定，冻干。冻干工艺条件为：预冻：制品温度-20℃--40℃，视盘中液量，保温2-4小时。升华：导热油升温速度10℃/小时，至油温升至30℃，过程控制前箱真空度不大于15Pa。干燥：制品温度达23℃时，保温4小时以上直至干燥终点。
6.过筛、分装：将冻干好的成品粉碎并过80目筛并混合均匀后用药用复合袋分装，装于铝听内，加盖密封。
实施例2
1.配制洗脱液
配制0.5mol/L的NH4AC缓冲液和0.1mol/L的NH4AC缓冲液，分别用乙酸和氨水调整至pH6.0，并测电导值。
2.层析
2.1装柱平衡：将离子柱填料QAE-Sepharose Fast Flow装于￠40cm，体积为50L的层析柱中，用pH6.0的0.15mol/L的NH4AC缓冲液平衡，直至进出溶液pH值一致、电导值相同后平衡完毕。
2.2进样：调胰激肽原酶中间体pH值与平衡液相近(6.1～6.2)，电导值略低于平衡液电导值(略低0.2～0.3×104μs/cm)，根据每升填料最大交换量2000万单位，计算上样量。将上样液上柱。
2.3洗涤：用pH6.0的0.5mol/L的NH4AC缓冲液冲洗柱子，同时用分光光度计跟踪检测流出液在280nm处的吸收值，冲洗至洗出液OD值低于0.5时停止。
2.4洗脱：用pH6.0的0.1mol/L的NH4AC缓冲液洗脱柱子，同时用分光光度计进行跟踪检测其在253nm处的吸收值，收集峰液。
3.超滤脱盐
3.1将收集液加纯化水超滤脱盐浓缩，当超出液电导值小于0.1×104μs/cm以下时，即可停止加纯化水，继续浓缩。
3.2当浓缩至液体体积6～11L时，关闭超滤机，纯化水冲膜，至回管效价低于50单位/ml时，得浓缩液，取样送检。
4.浓缩液过滤：将浓缩液用0.22μm膜的筒式过滤器过滤，得过滤浓缩液。
5.加辅料冻干：根据浓缩液的效价，控制成品比活力350单位/mg蛋白以上和效价在70单位/mg以上，计算明胶、乳糖的用量。并分别用注射用水加热溶解并通过0.22μm膜过滤，待冷却至25℃以下，加入过滤浓缩液中混合均匀后进冻干箱冻干。冻干时每盘均匀分装1～3L液体，视液体总量而定，冻干。冻干工艺条件为：预冻：制品温度-20---40℃，视盘中液量，保温2-4小时。升华：导热油升温速度10℃/小时，至油温升至30℃，过程控制前箱真空度不大于15Pa。干燥：制品温度达23℃时，保温4小时以上直至干燥终点。
6.过筛、分装：将冻干好的成品粉碎并过80目筛并混合均匀后用药用复合袋分装，装于铝听内，加盖密封。
实施例3
1.配制洗脱液
配制0.35mol/L的NH4AC缓冲液和0.3mol/L的NH4AC缓冲液，分别用乙酸和氨水调整至pH6.0，并测电导值。
2.层析
2.1装柱平衡：将离子柱填料QAE-Sepharose Fast Flow装于￠40cm，体积为50L的层析柱中，用pH6.0的0.15mol/L的NH4AC缓冲液平衡，直至进出溶液pH值一致、电导值相同后平衡完毕。
2.2进样：调胰激肽原酶中间体pH值与平衡液相近(6.1～6.2)，电导值略低于平衡液电导值(略低0.2～0.3×104μs/cm)，根据每升填料最大交换量2000万单位，计算上样量。将上样液上柱。
2.3洗涤：用pH6.0的0.35mol/L的NH4AC缓冲液冲洗柱子，同时用分光光度计跟踪检测流出液在280nm处的吸收值，冲洗至洗出液OD值低于0.5时停止。
2.4洗脱：用pH6.0的0.3mol/L的NH4AC缓冲液洗脱柱子，同时用分光光度计进行跟踪检测其在253nm处的吸收值，收集峰液。
3.超滤脱盐
3.1将收集液加纯化水超滤脱盐浓缩，当超出液电导值小于0.1×104μs/cm以下时，即可停止加纯化水，继续浓缩。
3.2当浓缩至液体体积10L时，关闭超滤机，纯化水冲膜，至回管效价低于50单位/ml时，得浓缩液，取样送检。
4.浓缩液过滤：将浓缩液用0.22μm膜的筒式过滤器过滤，得过滤浓缩液。
5.加辅料冻干：根据浓缩液的效价，控制成品比活力350单位/mg蛋白以上和效价在70单位/mg以上，计算明胶、乳糖的用量。并分别用注射用水加热溶解并通过0.22μm膜过滤，待冷却至25℃以下，加入过滤浓缩液中混合均匀后进冻干箱冻干。冻干时每盘均匀分装1～3L液体，视液体总量而定，冻干。冻干工艺条件为：预冻：制品温度-20℃--40℃，视盘中液量，保温2-4小时。升华：导热油升温速度10℃/小时，至油温升至30℃，过程控制前箱真空度不大于15Pa。干燥：制品温度达23℃时，保温4小时以上直至干燥终点。
6.过筛、分装：将冻干好的成品粉碎并过80目筛并混合均匀后用药用复合袋分装，装于铝听内，加盖密封。
表1原料药的新工艺与原有技术纯度对比表选择五个批号  批号  纯度％(应＞65％)  结论  新技术方案  A  80.21  √  B  81.22  √  原有技术方案  C  52.98  不合格  D  57.18  不合格  E  62.09  不合格
结论：新技术方案纯度较高
原有技术方案：发明人原来采用的方法是通过离子交换色谱法一步纯化胰激肽原酶粗品，采用3-4倍丙酮沉淀，纯化得到的胰激肽原酶。
新工艺标准：采用新技术方案
表2原料药的新工艺与原有技术主要指标对比表  项目  新工艺标准  原有技术  纯度  85％  65％  pH  5.8～7.2  5.5～7.5  干燥失重  不超过4.0％  不超过5.0％  效价(增加项)  55单位/mg  ------  比活  350单位/mg蛋白  300单位/mg蛋白
结论：新工艺技术生产产品各项指标均优于原有技术
表3不同的冻干温度对纯度和pH的影响  制品温度  纯度  pH  -60℃  66％  8.4  -50℃  71％  8.1  -40℃  82％  7.2  -30℃  84％  6.8  -20℃  83％  5.9  -10℃  76％  4.3  -5℃  69％  4.2
结论：-20℃----40℃纯度较高，pH更稳定