重组人胰腺癌黏液蛋白核心肽DNA疫苗.pdf

本发明属生物技术领域，涉及一种编码人胰腺癌MUC1单个重复序列的重组DNA分子，及所构建的DNA疫苗及其用途。所述重组DNA分子将以MUC1的最具免疫原性的重复序列的编码基因为核心，在氨基端插入MCP-I信号肽基因序列，同时在起始码前插入KOZAK促真核翻译序列。将所述的重组DNA分子定向克隆入真核表达载体MCS中，构建重组人胰腺癌黏液蛋白核心肽DNA疫苗。本发明疫苗转染真核细胞后可在细胞内外表达VNTR，动物实验结果显示，所述疫苗对抗肿瘤攻击有保护性作用，对表达人MUC1的小鼠胰腺癌有治疗作用，能特异性杀伤表达MUC1的人胰腺癌细胞，对人胰腺癌有治疗作用。

权利要求书
1.  重组人胰腺癌黏液蛋白核心肽DNA疫苗，其特征是由编码人胰腺癌MUC1核心序列的重组DNA分子和真核表达载体构成，所述的编码人胰腺癌MUC1核心序列的重组DNA分子是以单个VNTR编码序列为核心，其核苷酸序列：GGT GTCACC TCG GCC CCG GAC ACC AGG CCG GCC CCG GGC TCC ACC GCC CCCCCA GCC CAC；所述的真核表达载体为pcDNA3.1/Myc-his(+)A质粒。

2.  按权利要求1所述的重组人胰腺癌黏液蛋白核心肽DNA疫苗，其特征是所述的编码人胰腺癌MUC1核心序列的重组DNA分子在VNTR的氨基端依次插入内质网插入信号序列MCPI信号肽基因序列：ATG AAG TGG GTA ACC TTT CTCCTC CTC CTC TTC ATC TCC GGT TCT GCC TTT TCT AGG GGT。

3.  按权利要求1所述的重组人胰腺癌黏液蛋白核心肽DNA疫苗，其特征是所述的编码人胰腺癌MUC1核心序列的重组DNA分子在VNTR的氨基端依次插入促真核翻译序列KOZAK序列：GCC GCC ACC。

4.  按权利要求1或2或3所述的重组人胰腺癌黏液蛋白核心肽DNA疫苗的制备方法，其特征是通过下述技术方案和步骤进行：
1)设计和合成重组DNA分子；
2)将重组DNA分子定向克隆入载体中；
3)将重组MUC1 DNA疫苗转染COS7细胞，Western blot检测VNTR的表达；
4)将重组MUC1 DNA疫苗免疫正常C57BL/6小鼠，评价其免疫原性；
5)表达人MUC1的小鼠胰腺癌细胞攻击MUC1 DNA疫苗免疫小鼠，评价疫苗的免疫保护作用；
6)小鼠胰腺癌攻击后的小鼠予以MUC1 DNA疫苗治疗，评价疫苗对表达人MUC1的小鼠胰腺癌的治疗效果；
7)通过体外转染杀伤实验，评价疫苗对人胰腺癌的治疗作用。

5.  按权利要求4所述的制备方法，其特征是所述的步骤5的表达人MUC1的小鼠胰腺癌细胞，是将人全长MUC1 cDNA序列转染小鼠胰腺癌细胞株后，筛选出的稳定表达株。

6.  权利要求1所述的重组人胰腺癌黏液蛋白核心肽DNA疫苗在制备治疗或预防人胰腺癌药物中的用途。

说明书重组人胰腺癌黏液蛋白核心肽DNA疫苗
技术领域
本发明属生物技术领域，涉及重组人胰腺癌黏液蛋白核心肽(MUC1)DNA疫苗，具体涉及一种编码人胰腺癌MUC1核心序列的重组DNA分子，以及所构建的DNA疫苗及其用途。
背景技术
本领域公知，胰腺癌预后很差。有关胰腺癌的治疗，至今仍没有突破性的进展。据有关统计显示，65％胰腺癌患者在诊断明确后半年内死亡，约90％的患者一年内死亡。有研究表明，90％胰腺癌细胞都有MUC1的表达，其多肽骨架由胞外段、跨膜段(28aa)和胞内段(72aa)组成。胞外段含有20～125个连续重复序列(variable numbersof tandem repeats，VNTRs)，每个VNTR由20个氨基酸组成(GVTSAPDTRPAPGSTAPPAH)。由于糖基转移酶活性增高而导致糖基化不完全，使其连续重复序列(VNTR)区域的APDTR序列被暴露出来，成为免疫治疗的靶点。
有研究报道，宿主接种以MUC1为靶抗原构建的疫苗，可诱发MUC1特异的体液免疫和细胞免疫，杀伤表达MUC1的肿瘤细胞。Goydos人工合成了含有5个VNTR的105个氨基酸的MUC1肽链，与BCG混合免疫胰腺癌患者，针对MUC1多肽的DTH反应较术前明显增强，肿瘤标本中T细胞渗透明显加强MUC1特异的CTL前体也增加2-4倍，表明MUC1多肽疫苗可有效诱发抗原特异的细胞免疫反应。
但是，MUC1肽链疫苗提供的是外源性抗原。在体内，外源性抗原被抗原递呈细胞(APC)捕获、胞饮或吞噬，从而进入位于细胞质中的内体，降解成抗原肽，与通过γ链导入内体中的MHCII类分子形成抗原肽-MHCII类分子复合物，再通过内体膜与细胞膜的融合，表达于APC表面，与成熟CD4+TH细胞的TCR/CD3复合体相互识别，活化TH细胞，从而激发以特异性体液免疫为主的抗肿瘤免疫反应。特异性细胞免疫反应不足是肽链疫苗存在的主要缺陷。同时，尽管VNTR能被BCR、TCR识别，但单个或较少VNTR组成的MUC1肽链疫苗，在APC加工处理时，可能由于表位难于保持完整，也难于激发有效的免疫应答。
DNA疫苗(DNAvaccine)，其本质为将外源性抗原编码基因片段克隆在真核质粒DNA表达载体上，直接接种成功转染体内APC后，则可在APC产生内源性抗原，主要以MHCI类途径诱发机体产生特异性细胞免疫为主的抗肿瘤免疫反应，从而达到预防和治疗疾病的目的。细胞免疫是抗肿瘤免疫最为重要的组分，同时DNA疫苗具有制备简单，性质稳定等优点，因而被认为是继减毒、灭活疫苗和基因工程疫苗亚单位疫苗之后的第三代疫苗，为未来疫苗，尤其是肿瘤疫苗的主要发展方向。
Johnen将全长MUC1裸DNA接种小鼠后可保护宿主不受表达MUC1的肿瘤细胞(MC38-muc1)攻击。国内袁时芳构建了MUC1全基因疫苗可诱导机体产生MUC1特异的CTL应答和抗体应答，抑制表达MUC1的EMT6细胞的攻击。这些研究都表明了以MUC1为靶抗原的DNA疫苗对表达MUC1的肿瘤具有良好的免疫保护作用。然而，全长基因疫苗表达的完整抗原的包含着一些抑制性表位和其他表位、无关序列。抑制性表位可引起免疫抑制现象，而其他表位、无关序列的干扰也可降低免疫效应，而且，增加了自身免疫性疾病等免疫安全性的风险。而以仅含有7-8个氨基酸的单个抗原表位构建DNA疫苗，也有难以高效表达，抗原性弱，难以激发有效的免疫效应的缺点。
因此，提高人胰腺癌MUC1 DNA疫苗的免疫效应和免疫安全性成为亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种免疫效应和免疫安全性好的重组人胰腺癌黏液蛋白核心肽DNA疫苗。
本发明提供了一种编码人胰腺癌MUC1核心序列的重组DNA分子。本发明通过DNA分子的重组设计，包含CTL表位和B细胞表位，提高疫苗的免疫原性，同时不含有抑制性表位和其他表位、无关序列，增加了疫苗免疫安全性。
本发明的另一目的是以重组DNA分子构建MUC1 DNA疫苗并提供其用途。
本发明采取单个VNTR编码序列为重组DNA分子的核心。
所述的VNTR由20个氨基酸组成(GVTSAPDTRPAPGSTAPPAH)，形成一个稳定的β转角。胰腺癌MUC1的免疫原性主要体现在其多肽骨架上，单个VNTR也包含了所有重复序列串联在一起所涵盖的抗原信息，同样含有B细胞表位和T细胞表位。Austin研究院根据VNTR的20个氨基酸人工合成了3种短肽：①P1-24(PDTRPAPGSTAPPAHGDTSAPDTR)，包括第一个VNTR的20个氨基酸和下一个VNTR的前4个氨基酸；②P1-15(PDTRPAPGSTAPPAH)，含前15个氨基酸；③P16-24(GDTSAPDTR)，含后9个氨基酸。抗MUC1的单克隆抗体BC1、BC2、BC3均可与P1-24和P16-24反应，而与P1-15无反应性。而在P1-15尾部加一个丙氨酸，则A-P1-15有反应性。
本发明提供的重组DNA分子的核心单个VNTR编码序列(GGT GTC ACC TCGGCC CCG GAC ACC AGG CCG GCC CCG GGC TCC ACC GCC CCC CCA GCC CAC)不含有抑制性表位和其他表位、无关序列，其本身可以最大程度地减少对免疫效应的干扰和影响，同时表达的VNTR多肽没有侧链，也不会引起自身免疫反应性疾病(尽管正常腺细胞的腺腔面也会有少量MUC1的表达，但由于有多量的糖蛋白侧链，使得其多肽骨架上的VNTR被保护了起来)。
本发明在重组DNA分子中引入了内质网插入信号序列，在VNTR编码序列的氨基端插入，可引导VNTR在翻译的同时直接进入内质网加强MHCI类抗原加工途径。本发明在重组DNA分子中还引入了促真核翻译序列，能提高VNTR翻译的精确性和产率。
所述的内质网插入信号序列为人单核细胞趋化蛋白(monocyte chemoattractantprotein，MCP)I信号肽基因序列：ATG AAG TGG GTA ACC TTT CTC CTC CTC CTCTTC ATC TCC GGT TCT GCC TTT TCT AGG GGT。
所述的促真核翻译序列为KOZAK序列(GCC GCC ACC)，此序列可依次对40S核糖体亚基进行调节变构，促进翻译时AUG的准确定位。
本发明将重组DNA分子定向克隆入真核表达载体中，构建MUC1 DNA疫苗。所述疫苗在转染COS7细胞并进行Western blot检测到了VNTR的表达。
为评价所述DNA疫苗的免疫原性，将DNA疫苗免疫正常C57BL/6小鼠，评价疫苗所诱发的体液免疫(检测血清抗VNTR的特异性抗体)和细胞免疫(CTL活性)。疫苗对胰腺癌的免疫保护作用实验证实疫苗免疫小鼠后可抑制后续接种的表达人MUC1的小鼠胰腺癌细胞的生长；而小鼠先接种胰腺癌细胞再接种疫苗治疗肿瘤的生长明显减慢。此外，本发明进行了体外转染杀伤实验评价所述疫苗对表达MUC1的人胰腺癌细胞的杀伤作用。
所述的真核表达载体为pcDNA3.1/Myc-his(+)A质粒(市购)，含有氨苄青霉素抗性(ampicillin resistance，Ampr)基因以用作筛选标记。所述的抗性基因中含有2个可显著增强基因免疫效果的六寡核苷酸序列5′-AACGTT-3′，此序列含CpG结构，称为免疫激活DNA序列(immuno-stimulatory DNA sequence，ISS)，通过非特异性多克隆激活作用可激活免疫细胞，刺激产生IL-12和IL-18，并继而促进IFN-γ合成，使幼稚T细胞发育为TH1细胞。
所述的表达人MUC1的小鼠胰腺癌细胞为将人全长MUC1 cDNA序列转染小鼠胰腺癌细胞株Panc02(市购)，筛选出的稳定表达株，即Panc02-muc。
所述的体外转染杀伤实验，在体外模拟DC的成熟过程和DNA疫苗在体内的免疫学转归，在体外将所述疫苗转染DC，再与同源PBMC共同孵育，诱生出MUC1特异的CD8+CTL，以自体胰腺癌细胞为靶细胞，通过CTL杀伤实验评价疫苗的治疗作用。
本发明通过下述技术方案和步骤进行：
1.重组DNA分子的设计和合成：
重组DNA分子依次为KOZAK序列、hMCP-I信号肽序列、VNTR序列，两端分别插入Hind III酶酶切位点、EcoRI酶酶切位点；由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，并被克隆于pUC18质粒。
2.构建MUC1 DNA疫苗：
将pUC18质粒PCR产物(重组DNA分子)、真核表达载体pcDNA3.1/Myc-his(+)A质粒分别用Hind III酶、EcoR I酶进行双酶切，形成不同的粘性末端，通过T4 DNA连接酶的聚合作用，使重组DNA分子定向克隆入载体中，构建MUC1 DNA疫苗，即pcDNA3.1-VNTR/Myc-his(+)A重组质粒。
3.体外转染试验
采用Cacl2法将pcDNA3.1-VNTR/Myc-his(+)A重组质粒转染COS7细胞。转染48小时后，收集培养液上清、细胞裂解物上清采用12％SDS-PAGE进行Western blot检测VNTR的表达，结果显示，疫苗可在细胞内外高效表达VNTR。
4.DNA疫苗的免疫原性实验
6-8周龄C57BL/6雌鼠，随机分组(空表达载体、生理盐水做对照)，每组15只。肌注接种，初次免疫后4周加强免疫，加强免疫2周后，采用ELISA法检测血清抗VNTR的特异性抗体；无菌取小鼠脾脏，制备单细胞悬液，采用Calcein AM法进行CTL杀伤实验，结果显示，疫苗免疫正常小鼠可诱导MUC1特异的CTL应答和抗体应答。
5.疫苗对胰腺癌的免疫保护作用动物实验
将人全长MUC1 cDNA序列转染小鼠胰腺癌细胞株Panc02，筛选出的稳定表达株Panc02-muc为表达人MUC1的小鼠胰腺癌细胞株。
6-8周龄C57BL/6雌鼠，随机分3组(空表达载体Neo、PBS做对照)，肌注接种，初次免疫后每2周加强免疫1次，共2次，方法同前。
第2次加强免疫，接种后观察肿瘤细胞生长情况，测量肿瘤长径(a)及肿瘤(b)，按照公式Volume(mm3)＝a×b2/2计算肿瘤体积，观察疫苗对抗肿瘤攻击的保护性作用。结果显示，疫苗组小鼠的肿瘤发生时间晚，肿瘤体积小，小鼠的生存期明显延长，证实本发明疫苗对抗小鼠胰腺癌细胞攻击有保护性作用。
6.疫苗对胰腺癌的治疗作用动物实验
C57BL/6小鼠，左前肢腋下皮下种植胰腺癌细胞悬液Panc02-muc，随机分组组(MUC1组、MUC1+GM-CSF组、GM-CSF佐剂对照组、空表达载体Neo对照组、PBS对照组)，分别接种Panc02细胞做靶细胞阴性对照和接种疫苗，接种后观察肿瘤细胞生长情况，测量肿瘤长径(a)及肿瘤(b)，按照公式Volume(mm3)＝a×b2/2计算肿瘤体积，观察疫苗的治疗性作用。结果显示，疫苗组治疗后，肿瘤的生长明显减慢，体积小于对照组，生存期延长，证实本发明疫苗对小鼠胰腺癌也具有一定的治疗作用。
7.体外转染杀伤实验
本发明从健康人外周血分离PBMC，在体外以GM-CSF、IL-4诱导并大量扩增出树突状细胞，培养细胞至第5日，采用LipofectamineTM 2000转染疫苗(空表达载体、脂质体做对照)，24小时后荧光显微镜下检测DC质粒转染情况，Western Blot检测VNTR多肽表达。按照10∶1比例，将DC加入同源PBMC共同孵育，诱生出VNTR特异的CD8+CTL。按不同的效靶比将效应细胞和靶细胞Capan-2(表达MUC1)分别加入96孔U底板，AsPC-1(不表达MUC1)做靶细胞阴性对照进行LDH细胞毒杀伤实验。结果显示，MUC1疫苗体外转染DC可诱导VNTR特异的CD8+CTL，可特异性杀伤表达MUC1的人胰腺癌细胞。
附图说明：
图1是本发明实施实例所用重组人胰腺癌MUC1DNA疫苗pcDNA3.1-VNTR/Myc-his(+)A质粒示意图(a)及测序图(b)。
图2是MUC1 DNA疫苗Western blot检测，其中，
泳道1为pcDNA3.1-VNTR/Myc-his(+)A重组质粒转染的COS7细胞培养液上清；
泳道2为pcDNA3.1-VNTR/Myc-his(+)A重组质粒转染的COS7细胞沉淀；
泳道3为pcDNA3.1/Myc-his(+)A质粒转染的COS7细胞培养液上清；
泳道4为pcDNA3.1/Myc-his(+)A质粒转染的COS7细胞沉淀；
泳道5为人工合成的VNTR多肽。
图3是MUC1 DNA疫苗的免疫原性实验结果，
其中，a.：免疫小鼠特异性CTL杀伤；b：免疫小鼠CTL应答的多肽特异性，
结果显示，疫苗组(V组)C57BL/6小鼠(H-2b)脾细胞CTL的特异性杀伤率显著高于空质粒对照组(D组)和生理盐水对照组(a)，疫苗所诱生的CTL杀伤活性是VNTR特异性的，CTL只对含有靶抗原VNTR的EL4有特异性杀伤，将MUC1的单克隆抗体VU3C6(识别VNTR上的GVTSAPDTRPAP序列)与靶细胞EL4-VNTR+结合，可抑制CTL杀伤活性(b)。
图4MUC1 DNA疫苗的免疫保护作用，
其中，a.：Panc02-muc攻击不同免疫小鼠后肿瘤生长情况；b.：不同肿瘤细胞攻击MUC1 DNA免疫小鼠后肿瘤生长情况；c.：Panc02-muc攻击后不同免疫小鼠生存曲线；d.：不同肿瘤细胞攻击后MUC1 DNA免疫小鼠生存曲线，
结果显示，C57BL/6小鼠(H-2b)以MUC1 DNA疫苗免疫3次免疫后接种1×106Panc02-muc细胞，肿瘤细胞的生长显著比对照组慢(a)，但接种1×106Panc02细胞，肿瘤细胞的生长没有被抑制(b)，表明疫苗具有MUC1特异的免疫保护作用；以肿瘤体积＞1000mm3作为观察终点，MUC1组小鼠中位生存期为27天，大于Neo组21天及PBS组20天(P＜0.05，)(c)；而疫苗组对于不表达MUC1的小鼠胰腺癌细胞Panc02的攻击则没有免疫保护作用，其中位生存期为15天(d)。
图5是MUC1 DNA疫苗的治疗作用，
其中，a.：接种Panc02-muc的C57BL/6小鼠疫苗治疗后肿瘤生长情况；b.：接种不同肿瘤细胞小鼠疫苗治疗后肿瘤生长情况；c：接种Panc02-muc的C57BL/6小鼠疫苗治疗后生存曲线；d.：接种不同肿瘤细胞小鼠疫苗治疗后生存曲线，
结果显示，C57BL/6小鼠(H-2b)接种1×106 Panc02-muc细胞后第4、9、14天分别肌注接种疫苗进行治疗，MUC1组、MUC1+GM-CSF组小鼠肿瘤生长显著慢于GM-CSF组、Neo组及PBS组(a)；以肿瘤体积＞1000mm3作为观察终点，MUC1组、MUC1+GMCSF组小鼠中位生存期显著长于GM-CSF组、PBS组及Neo组(c)；而接种不表达MUC1的Panc02细胞的小鼠，不管有无分别GM-CSF为佐剂，疫苗治疗后均未能抑制肿瘤细胞的生长(b)，生存期也未延长(d)。
图6是MUC1 DNA疫苗体外转染杀伤实验结果，
其中，a：40×光镜下树突状细胞成集落生长图；b：混和淋巴细胞反应结果；c：流式细胞仪树突状细胞表型鉴定图；d.：荧光显微镜下转染荧光质粒pcDNA3.1-GFP的树突细胞；e.：质粒转染树突细胞状体外刺激自体T细胞增殖实验；f：体外诱生的CTL对Capan-2(MUC1+，HLA-A2+)的杀伤；g：MUC1单克隆抗体VU 3C6对CTL特异性杀伤的抑制；h：体外诱生的CTL对不同靶细胞的CTL杀伤。
具体实施方式
实施例1
1.重组DNA分子的设计和合成：
重组DNA分子的设计：依次为Hind III酶酶切位点、KOZAK序列(GCCGCCACC)、hMCP-I信号肽序列(划线部分)、VNTR序列(斜体部分)、EcoRI酶酶切位点。
5′-AAG CTT GCC GCC ACC ATG AAG TGG GTA ACC TTT CTC CTC CTC CTCTTC ATC TCC GGT TCT GCC TTT TCT AGG GGT GGT GTC ACC TCG GCC CCG GACACC AGG CCG GCC CCG GGC TCCACC GCC CCC CCA GCC CAC GAA TTC-3′。
重组DNA分子的合成：由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，并被克隆于pUC18质粒。
2.构建MUC1 DNA疫苗：
将pUC18质粒PCR产物(重组DNA分子)、真核表达载体pcDNA3.1/Myc-his(+)A质粒分别用Hind III酶、EcoR I酶进行双酶切，形成不同的粘性末端，通过T4 DNA连接酶的聚合作用，使重组DNA分子定向克隆入载体中，构建MUC1 DNA疫苗，即pcDNA3.1-VNTR/Myc-his(+)A重组质粒。自转化平板挑取单菌落，酶切鉴定后挑取酶切片段大小约140bp的阳性克隆进行测序(博亚公司)(图1a、b)。
3.体外转染试验
采用Cacl2法将pcDNA3.1-VNTR/Myc-his(+)A重组质粒转染COS7细胞(转染时配置含5ug GFP质粒、2.5M Cacl2和2×HBS-Hepes缓冲液、5ugpcDNA3.1-VNTR/Myc-his(+)A重组质粒)。转染48小时后，收集培养液上清、细胞裂解物上清采用12％SDS-PAGE进行Western blot检测VNTR的表达，VNTR合成多肽(GVTSAPDTRPAPGSTAPPAH，深圳市翰宇生物工程有限公司，纯度为97.5％，分子量为1887)为阳性对照，一抗为鼠抗人MUC1单抗VU 3C6，识别MUC1的VNTR多肽的GVTSAPDTRPAP序列，1∶500。
图2显示的泳道1、2分别代表pcDNA3.1-VNTR/Myc-his(+)A重组质粒转染的COS7细胞裂解物和培养液上清，结果表明细胞内外均有VNTR的表达，以胞内为主。而空白载体pcDNA3.1/Myc-his(+)A质粒转染的COS7细胞(泳道3、4，阴性对照)在胞内外均没有VNTR的表达。由于重组质粒表达的VNTR含有信号肽和Myc、His等表位，分子量比人工合成的VNTR多肽(泳道5，阳性对照)明显大。
4.DNA疫苗的免疫原性实验
6-8周龄C57BL/6雌鼠，体重19-25克(购自上海西普尔一必凯实验动物有限公司)，随机分为3组(空表达载体、生理盐水做对照)，每组15只。肌注接种：先用0.75％戊巴比妥钠120-180μl腹腔小鼠(50μg/g体重)麻醉后，用100u胰岛素注射器(购自BD公司)于双侧胫前肌进针，缓慢注入质粒DNA生理盐水溶液，每侧50μg/50ul。初次免疫后4周加强免疫，方法同前。加强免疫2周后，自内眦静脉内取血0.5ml，分离血清，采用ELISA法检测血清抗VNTR的特异性抗体；无菌取实验小鼠脾脏，制备单细胞悬液，采用Calcein AM法进行CTL杀伤实验：以3000rad的γ射线灭活同系未免疫小鼠脾细胞悬液制备成刺激细胞。在脾细胞中以20∶1的比例加入刺激细胞共培养6天，加mIL-2 20U/ml，anti-CD28 0.1ug/ml维持。用Ficoll分离液纯化刺激后效应细胞，以无酚红培养液重悬。以5～10uM calcein AM(购自美国Molecular Probe公司)37℃水浴标记对数生长期靶细胞(EL4-VNTR+，EL4-VNTR-)，Hank′s液洗后以无酚红培养液重悬制成标记好的靶细胞。在96孔U底板中按效靶比E/T：80∶1、40∶1、20∶1、10∶1加入梯度稀释效应细胞与标记好的靶细胞。设完全释放组(加50mM硼酸钠，0.1％TritonX-100，PH9.0)与自发释放组(加无酚红培养液)。
孵育6小时后离心将上清转移至新的96孔平底板，荧光测量仪检测上清的荧光值(FI)，激发光为485nm，发射光为538nm。CTL特异杀伤率(％)＝(实验组FI值-自发释放组FI值)/(最大释放组FI值-自发释放组FI值)×100％。
结果显示，经VNTR合成肽体外特异刺激培养6天后，pcDNA3.1-VNTR/Myc-his(+)A质粒免疫的小鼠脾细胞CTL的特异性杀伤率显著高于空质粒对照组(P＜0.01)和生理盐水对照组(P＜0.01)。E/T＝10/1时三组的杀伤率分别为10.0％±2.6％、2.6％±0.2％、1.5％±0.1％，E/T＝20/1时杀伤率分别为14.9％±1.3％、4.0％±0.4％、3.1％±0.3％，E/T＝40/1时杀伤率分别为28.8％±2.6％、7.1％±0.6％、5.9％±0.5％，E/T＝80/1时杀伤率为34.8％±3.1％、9.2％±0.8％、6.1％±0.6％(图3a)。表明pcDNA3.1-VNTR/Myc-his(+)A质粒免疫的小鼠产生了显著的CTL应答。而且这一CTL应答是克隆于表达载体中的重组DNA分子所诱生的。图3b显示：重组质粒诱生的特异性CTL对经VNTR合成肽孵育的靶细胞EL4-VNTR+杀伤作用明显，而对未经VNTR合成肽孵育的靶细胞EL4-VNTR-杀伤较低(P＜0.01)。表明重组质粒诱生的CTL杀伤活性是VNTR特异性的。而事先将MUC1的单克隆抗体VU3C6与靶细胞EL4-VNTR+作用，则可抑制CTL杀伤活性(P＜0.01)，表明VU3C6(识别VNTR上的GVTSAPDTRPAP序列)封闭了靶细胞上的VNTR靶位，从而减少CTL特异性识别靶细胞，使得杀伤作用降低，进一步表明CTL杀伤活性是VNTR特异性的。
pcDNA3.1-VNTR/Myc-his(+)A质粒免疫的小鼠血清抗VNTR抗体等效浓度(2323.5ug/ml±238.3ug/ml)高于空质粒对照组(1895.8ug/ml±532.7ug/ml)和生理盐水对照组(1736.4ug/ml±141.9ug/ml)，差别极为显著(P＜0.01，表1)。表明pcDNA3.1-VNTR/Myc-his(+)A重组质粒中所插入的重组DNA分子免疫小鼠后可诱发宿主产生抗VNTR的抗体应答。
5.疫苗对胰腺癌的免疫保护作用动物实验
将人全长MUC1 cDNA序列转染小鼠胰腺癌细胞株Panc02，筛选出的稳定表达株Panc02-muc为表达人MUC1的小鼠胰腺癌细胞株。
6-8周龄C57BL/6雌鼠，随机分为3组(空表达载体Neo、PBS做对照)，每组15只。肌注接种：先用0.75％戊巴比妥钠120-180μl腹腔小鼠(50μg/g体重)麻醉后，用胰岛素注射器于双侧胫前肌进针，缓慢注入质粒DNA生理盐水溶液，每侧50μg/50ul。初次免疫后每2周加强免疫1次，共2次，方法同前。
第2次加强免疫后1周，于小鼠左前肢腋下皮下接种Panc02-muc 1×106/100μl，另有15只疫苗组小鼠接种Panc02细胞1×106/100μl。作为靶细胞阴性对照。接种后每日观察肿瘤细胞生长情况，测量肿瘤长径(a)及肿瘤(b)一次，按照公式Volume(mm3)＝a×b2/2计算肿瘤体积，观察疫苗对抗肿瘤攻击的保护性作用。
结果显示，C57BL/6小鼠(H-2b)以MUC1 DNA疫苗免疫3次免疫后接种1×106Panc02-muc细胞，肿瘤细胞的生长(疫苗组)显著慢于Neo组及PBS组(图4a)，第24天时MUC1组肿瘤体积(818.75±87.5mm3)显著小于Neo组(1868.8±187.5mm3)及PBS组(1781.3±150mm3)(P＜0.05)；但疫苗组若接种1×106Panc02细胞，肿瘤细胞的生长没有被抑制(图4b)，表明疫苗具有MUC1特异的免疫保护作用。
以肿瘤体积＞1000mm3作为观察终点，结果显示MUC1组小鼠中位生存期为27天，大于Neo组21天及PBS组20天(P＜0.05，)(图4c)，提示MUC1 DNA疫苗免疫后能特异性的预防小鼠受到表达MUC1的小鼠胰腺癌细胞Panc02-muc的攻击。而疫苗组对于不表达MUC1的小鼠胰腺癌细胞Panc02的攻击则没有免疫保护作用，其中位生存期为15天(图4d)。
6.疫苗对胰腺癌的治疗作用动物实验
75只C57BL/6小鼠，左前肢腋下皮下种植胰腺癌细胞悬液Panc02-muc，随机分组5组(MUC1组、MUC1+GM-CSF组、GM-CSF佐剂对照组、空表达载体Neo对照组、PBS对照组)，前两组另外各有15只小鼠接种Panc02细胞做靶细胞阴性对照。肿瘤细胞后第4、9、14天分别肌注接种疫苗100μg/100μl进行治疗。接种后每日观察肿瘤细胞生长情况，测量肿瘤长径(a)及肿瘤(b)一次，按照公式Volume(mm3)＝a×b2/2计算肿瘤体积，观察疫苗的治疗性作用。
结果显示，C57BL/6小鼠(H-2b)接种1×106Panc02-muc细胞后第4、9、14天分别肌注接种疫苗100μg/100μl进行治疗。第25天时，MUC1组、MUC1+GMCSF组小鼠肿瘤生长体积分别为1252.5±150.0mm3、847.5±120.0mm3，显著小于GM-CSF组(1777.5±135.0mm3)、Neo组(2017.5±115.0mm3)及PBS组(2227.5±225.0mm3)(P＜0.05)组(图5a)。以肿瘤体积＞1000mm3作为观察终点，结果显示MUC1组、MUC1+GMCSF组小鼠中位生存期分别为31天、24天，显著长于GM-CSF组、PBS组及Neo组中位生存期21天(图5c)，表明MUC1 DNA疫苗治疗后，诱发出的抗原特异的CTL可以抑制体内已存在的肿瘤细胞Panc02-muc的生长；以GM-CSF为佐剂可以增强疫苗的治疗作用。
而接种不表达MUC1的Panc02细胞的小鼠，不管有无分别GM-CSF为佐剂，疫苗治疗后均未能抑制肿瘤细胞的生长(图5b)，生存期也未延长(图5d)，表明疫苗的治疗作用是MUC1特异的。
7.体外转染杀伤实验
本发明从健康人外周血分离PBMC，在体外以GM-CSF、IL-4诱导并大量扩增出树突状细胞，培养至第5日倒置显微镜下可见树突细胞形态不规则，表面较多的突起结构(图6a)；培养至第7日流式细胞仪进行表型鉴定，树突细胞特异性的表面标志物CD86、HLADR、CD209等明显升高；而CD3/CD8+、CD3/CD4+、CD14+细胞明显减少，DC细胞趋向成熟(图6c、表2)；培养至第5日加入TNFα可促DC细胞成熟，与同种异体T淋巴细胞混和培养，具有极强的刺激增殖作用(图6b)。
培养细胞至第5日，收集培养的DC，采用LipofectamineTM 2000转染疫苗(空表达载体、脂质体做对照)，24小时后荧光显微镜下可以观察到转染了荧光质粒pcDNA3.1-GFP的树突细胞激发绿色荧光(图6d)。同时，转染了疫苗的DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖的作用增强(图6e)。按照10∶1比例，将DC加入同源PBMC共同孵育，诱生出VNTR特异的CD8+CTL。
按照10∶1、40∶1、80∶1的效靶比将效应细胞和靶细胞Capan-2(表达MUC1)分别加入96孔U底板，AsPC-1(不表达MUC1)做靶细胞阴性对照，按照CytoTox 96Non-Radioactive Cytotoxicity Assay(CytoTox 96非放射性细胞毒性分析试剂盒)进行LDH细胞毒杀伤实验。结果显示，疫苗组转染的DC刺激增殖的CTL可以特异性的杀伤表达人MUC1的靶细胞Capan-2(HLA-A2+)，效靶比为80∶1、40∶1、10∶1时，其特异性杀伤率分别为71.47％±9.62％、39.86％±8.41％、19.28％±0.28％；明显高于空表达载体对照组(19.64％±4.24％、6.56％±8.03％、2.49％±4.31％)及脂质体对照组(11.57％±5.12％、1.98％±5.48％、0)(图6f)。由于VU3C6单克隆抗体识别VNTR的GVTSAPDTRPAP表位，与之结合后可以抑制CTL对Capan2细胞的识别和杀伤，效靶比为80∶1、40∶1、10∶1时，CTL特异性杀伤率分别为13.64％±9.38％、9.81％±0.64％、3.29％±4.43％，显著小于CTL对未封闭MUC1表位的Capan2细胞的杀伤效应(图6g)，表明CTL的杀伤是MUC1特异性的。而对于表达人MUC1的靶细胞AsPC-1(HLA-A2-)，疫苗组诱生的的CTL无明显的杀伤效应，效靶比为80∶1、40∶1、10∶1时，CTL特异性杀伤率分别为24.18％±2.63％、8.06％±3.23％、2.86％±3.24％(图6h)，提示该杀伤效应为HLA-A2限制性的。
表1是免疫小鼠血清抗VNTR抗体等效浓度(ug/ml，-x±s，n＝15)。
表2是培养前后流式细胞仪的树突状细胞表型。
表1
    组别    抗体浓度    P值    V组    NS组    D组    2323.5±238.3*#    1736.4±141.9#    1895.8±532.7    *＝0.000，#＝0.002    #＝0.231
*：与NS组比较；#：与D组比较
表2
  培养前    培养后    P值    CD3/CD8    CD3/CD4    CD14    CD86    HLA-DR    CD209  15.06％±6.67％  21.39％±7.47％  17.24％±5.65％  20.37％±9.32％  19.73％±6.97％  0.56％±0.22％  3.11％±2.05％  9.12％±4.99％  1.36％±1.3％  95.94％±4.31％  92.97％±4.56％  62.28％±16.50％    0.000    0.004    0.001    0.000    0.000    0.003