一种荧光分子及其制备方法和应用 【技术领域】
本发明属于荧光共振能量转移系统，涉及一种能和曙红Y形成能量转移体系的荧光分子。
背景技术
荧光共振能量转移是指在两个不同的荧光基团中，如果一个荧光基团(供体Donor)的发射光谱与另一个基团(受体Acceptor)的吸收光谱有一定的重叠，当这两个荧光基团间的距离合适时，就可观察到荧光能量由供体向受体转移的现象，即以前一种基团的激发波长激发时，可观察到后一个基团发射的荧光。简单地说，就是在供体基团的激发状态下由一对偶极子介导的能量从供体向受体转移的过程，此过程没有光子的参与，所以是非辐射的。给予体分子被激发后，当接受体分子与给予体分子相距一定距离，且给予体和接受体的基态及第一电子激发态两者的振动能级间的能量差相互适应时，处于激发态的给予体将把一部分或全部能量转移给接受体，使接受体被激发，在整个能量转移过程中，不涉及光子的发射和重新吸收。如果接受体荧光量子产率为零，则发生能量转移荧光熄灭；如果接受体也是一种荧光发射体，则呈现出接受体的荧光，并造成次级荧光光谱的红移。
这种能量转移体系可以用于生物分子和微环境的分析检测、发光元件信号放大、发光二极管、光电池敏化等领域(参见：(1)Hangauer，M.J.；Bertozzi，C.R.Angew.Chem.Int.Ed.2008，47，2394.(2)Serin，J.；Schultze，X.；Adronov，A.；Fréchet，J.M.J.Macromolecules.2002，35，5396.(3)Minard-Basquin，C.；Weil，T.；Hohne r，A.；Radler，J.O.；Mullen，K.J.Am.Chem.Soc.2003，125，5832.(4)Wu，H.W.；Liu，X.P.；Jiang，J.H.；Shen，G.L.；Yu，R.Q.Chinese J.Chem.2009，27，1543.)。尤其是分子间能量转移体系，由于给体和受体选择范围广、体系组成方便灵活而成为目前研究热点之一。
曙红Y色泽鲜艳、荧光强烈、荧光量子产率高，常作为荧光标记染料用于分析检测领域。已报道的曙红Y能量转移体系多数是使曙红Y荧光猝灭(参见：Aumanena，J.；Lehtovuori，V.；Wernerb，N.；Richardt，G.；Heyst，J.V.；，F.；Korppi-Tommola，J.Chem.Phys.Lett.2006，433，75.)，很少报道通过能量转移使曙红Y荧光增强，Hahn等用萘、丹酰、曙红Y等多种荧光团通过树枝状聚丙烯亚胺和树枝状聚醚构成一个复杂的能量转移体系，合适的激发波长可以使其他荧光团荧光猝灭而只观察到曙红Y的荧光(参见：Hahn，U.；Gorka，M.；，F.；Vicinelli，V.；Ceroni，P.；Maestri，M.；Balzani，V.Angew.Chem.2002，114，19，3747.)。如果能通过能量转移增强曙红Y的荧光，则可以敏化检测结果。
技术方案
本发明目的是提供一种荧光分子。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种荧光分子(NCBNT)，所述荧光分子为6-{2-[4，6-二-(2-萘氧基)-[1，3，5]三嗪基-2-氨基]-乙基氨基}-2-丁基-苯并[de]异喹啉-1，3-二酮(6-{2-[4，6-Bis-(naphthalen-2-yloxy)-[1，3，5]triazin-2-ylamino]-ethylamino}-2-butyl-benzo[de]isoquinoline-1，3-dione)，所述荧光分子的化学结构式如下所示：
制备上述技术方案中所述荧光分子的方法包括以下步骤：
(1)将N-正丁基-4-(2′-氨基)乙基氨基-1，8-萘酰亚胺(EBNP)和2-氯-4，6-二(2-萘氧基)-1，3，5-三嗪(CNTA)溶于溶剂中，搅拌均匀；然后在60～100℃反应至少24h；
(2)除去溶剂后干燥，然后纯化得到所述荧光分子；
所述溶剂选自：四氢呋喃、乙腈、二氧六环或N，N-二甲基甲酰胺；优选的技术方案中，当反应温度在70℃以下时，所述溶剂选自：四氢呋喃、乙腈、二氧六环或N，N-二甲基甲酰胺；当反应温度在70℃以上时，所述溶剂选自：二氧六环或N，N-二甲基甲酰胺；进一步的优选技术方案中，因为二氧六环对反应物原料的溶解性最好，而且可以使反应后处理最简单，所以，溶剂为二氧六环。
反应过程如下所示：
上述技术方案中，N-正丁基-4-(2′-氨基)乙基氨基-1，8-萘酰亚胺(EBNP)的制备方法参见：Elbert，J.E.；Paulsen，S.；Robinson，L.；Elzey，S.；Klein，K.J.Photochem.Photobiol.A：Chem.，2005，169，9；2-氯-4，6-二(2-萘氧基)-1，3，5-三嗪(CNTA)的制备方法参见：刘小红，林休休，徐冬梅，张可达.化学研究与应用，2007，19，273。
优选的技术方案中，N-正丁基-4-(2′-氨基)乙基氨基-1，8-萘酰亚胺(EBNP)和2-氯-4，6-二(2-萘氧基)-1，3，5-三嗪(CNTA)的摩尔比为1.1～1.3∶1；反应温度为75～85℃，反应时间为40～50h。
上述技术方案中所述荧光分子可以和曙红Y组成一个有效的荧光共振能量转移体系，并且以所述荧光分子NCBNT为给体，以曙红Y分子为受体，NCBNT能在DMF溶液中与曙红Y进行有效的能量转移，使曙红Y的荧光增强10.1倍，因此，NCBNT在该能量转移体系中具有光采集和光放大的作用；因此，本发明同时要求保护由NCBNT和曙红Y构成的荧光共振能量转移体系。
在分析检测体系中应用上述荧光共振能量转移体系时，曙红Y的用量、浓度本领域技术人员根据现有技术自行选择，同时，所述荧光分子与曙红Y的摩尔比为0.04∶1～2∶1，优选的技术方案中，所述荧光分子与曙红Y的摩尔比为0.5∶1～1.2∶1；进一步优选的技术方案中，所述荧光分子与曙红Y的摩尔比为1∶1。
由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
本发明利用三聚氯氰分子中3个氯原子的反应活性和反应可控性，将2个2-萘酚和1个1，8-萘酰亚胺组合成一个新的荧光分子NCBNT，该荧光分子合成步骤简单，条件温和，收率较高，可以和曙红Y构成荧光共振能量转移体系，将吸收的能量转移给曙红Y，使曙红Y的荧光增强10.1倍，可用于敏化以曙红Y作为荧光标记染料的分析检测体系。
【附图说明】
图1、实施例十一中不同浓度NCBNT的荧光光谱；
图2、实施例十一中不同浓度曙红Y的荧光光谱；
图3、实施例十二中不同浓度NCBNT与曙红Y混合溶液的荧光光谱；
图4、实施例十三中EBNP、曙红Y及其混合溶液的荧光光谱；
图5、实施例中所得产物的化学结构式。
【具体实施方式】
实施例一：
按照摩尔比，n(EBNP)∶n(CNTA)＝1∶1，将反应物溶于溶剂二六氧环中，室温搅拌30min，后升温至80℃反应48h。趁热除去溶剂，得到深黄色固体，真空烘干。后用V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)＝1∶1为洗脱剂经硅胶柱色谱纯化，得到产物NCBNT。产率80.3％(产率的计算方法为：按照理论产率为100％，以不过量的反应物的量为标准，计算得到最大的理论产量，然后以实际得到的产物地质量比上理论产量)。
实施例二：
按照摩尔比，n(EBNP)∶n(CNTA)＝1.2∶1，将反应物溶于溶剂二六氧环中，室温搅拌30min，后升温至80℃反应48h。趁热除去溶剂，得到深黄色固体，真空烘干。后用V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)＝1∶1为洗脱剂经硅胶柱色谱纯化，得到产物NCBNT。产率82.3％。
实施例三：
按照摩尔比，n(EBNP)∶n(CNTA)＝1.3∶1，将反应物溶于溶剂二六氧环中，室温搅拌30min，后升温至80℃反应48h。趁热除去溶剂，得到深黄色固体，真空烘干。后用V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)＝1∶1为洗脱剂经硅胶柱色谱纯化，得到产物NCBNT。产率75.4％。
实施例四：
按照摩尔比，n(EBNP)∶n(CNTA)＝1.2∶1，将反应物溶于溶剂二六氧环中，室温搅拌30min，后升温至60℃反应48h。趁热除去溶剂，得到深黄色固体，真空烘干。后用V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)＝1∶1为洗脱剂经硅胶柱色谱纯化，得到产物NCBNT。产率71.1％。
实施例五：
按照摩尔比，n(EBNP)∶n(CNTA)＝1.2∶1，将反应物溶于溶剂二六氧环中，室温搅拌30min，后升温至70℃反应48h。趁热除去溶剂，得到深黄色固体，真空烘干。后用V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)＝1∶1为洗脱剂经硅胶柱色谱纯化，得到产物NCBNT。产率76.4％。
实施例六：
按照摩尔比，n(EBNP)∶n(CNTA)＝1.2∶1，将反应物溶于溶剂二六氧环中，室温搅拌30min，后升温至100℃反应48h。趁热除去溶剂，得到深黄色固体，真空烘干。后用V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)＝1∶1为洗脱剂经硅胶柱色谱纯化，得到产物NCBNT。产率75.3％。
实施例七：
按照摩尔比，n(EBNP)∶n(CNTA)＝1.2∶1，将反应物溶于溶剂二六氧环中，室温搅拌30min，后升温至80℃反应24h。趁热除去溶剂，得到深黄色固体，真空烘干。后用V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)＝1∶1为洗脱剂经硅胶柱色谱纯化，得到产物NCBNT。产率72.5％。
实施例八：
按照摩尔比，n(EBNP)∶n(CNTA)＝1.2∶1，将反应物溶于溶剂二六氧环中，室温搅拌30min，后升温至80℃反应36h。趁热除去溶剂，得到深黄色固体，真空烘干。后用V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)＝1∶1为洗脱剂经硅胶柱色谱纯化，得到产物NCBNT。产率78.0％。
实施例九：
按照摩尔比，n(EBNP)∶n(CNTA)＝1.2∶1，将反应物溶于溶剂二六氧环中，室温搅拌30min，后升温至80℃反应56h。趁热除去溶剂，得到深黄色固体，真空烘干。后用V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)＝1∶1为洗脱剂经硅胶柱色谱纯化，得到产物NCBNT。产率67.8％。
实施例十：
对实施例一至九所得产物进行分析检测，证明所得产物为荧光分子6-{2-[4，6-二-(2-萘氧基)-[1，3，5]三嗪基-2-氨基]-乙基氨基}-2-丁基-苯并[de]异喹啉-1，3-二酮(6-{2-[4，6-Bis-(naphthalen-2-yloxy)-[1，3，5]triazin-2-ylamino]-ethylamino}-2-butyl-benzo[de]isoquinoline-1，3-dione)，化学式参见附图5，具体结果如下：
产物测试数据：m.p.218.7-220.7℃；UV-vis(DMF)最大吸收波长λmax：435nm(摩尔吸光系数ε＝1.34×104L·mol-1·cm-1)，最大发射波长λFL：521nm；1H NMR(DMSO-d6，300MHz)δ：0.85～0.94(t，3H)，1.26～1.36(m，2H)，1.52～1.63(m，2H，)，3.42～3.52(t，4H)，3.96～4.05(t，2H)，6.72～6.76(d，1H)，7.32～7.42(m，2H)，7.44～7.56(m，2H)，7.62～7.77(m，4H)，7.82～7.97(t，4H)，8.10～8.16(d，1H)，8.27～8.34(d，1H)，8.39～8.45(d，1H)，8.53～8.58(d，1H)。IR(KBr)v：3324cm-1处是-NH-的伸缩振动，2955，2870cm-1处是亚甲基的伸缩振动。1676cm-1是酰胺中羰基(C＝O)的伸缩振动。1646、1585、1545cm-1为萘环的C＝C环的伸缩振动。质谱：m/z 674.0为NCBNT的分子离子峰。Anal.Calcd.For C41H34N6O4：C 73.00，H 5.04，N 12.46；foundC 72.46，H 5.16，N 12.16。
实施例十一
测定了不同浓度NCBNT和曙红Y的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液的荧光光谱(见图1和图2)。
由图1(溶剂：DMF，浓度(10-5mol/L)：0.1，0.5，1.0，5.0，10，50，激发波长：435nm，荧光仪：FLS 920型荧光分光光度计)可见，随NCBNT浓度的增加，荧光发射峰位置基本不变，荧光强度先增强后减弱；当NCBNT浓度为1×10-5～5.0×10-5mol/L时，荧光强度较强。由图2(溶剂：DMF，浓度(10-5mol/L)：0.1，0.5，1.0，5.0，10.0，激发波长：515nm，荧光仪：FLS 920型荧光分光光度计)可见，随曙红Y浓度的增加，荧光发射峰显著红移，从555nm处红移至574nm；荧光强度也呈现先增强后减弱的变化，在曙红Y浓度为1.0×10-5mol/L附近，荧光强度较强。
实施例十二
固定曙红Y浓度为2.5×10-5mol/L，研究不同浓度NCBNT对曙红Y荧光光谱的影响，结果发现在NCBNT浓度为0.1×10-5～5.0×10-5mol/L(NCBNT与曙红Y的摩尔比对应为0.04～2)范围内，NCBNT的加入使得曙红Y的荧光强度增强，而最大发射波长不变。其中NCBNT浓度为0.5×10-5～3.0×10-5mol/L(NCBNT与曙红Y的摩尔比对应为0.5～1.2)时NCBNT与曙红Y混合溶液的荧光光谱见图3(溶剂：DMF，浓度(10-5mol/L)：NCBNT：0.5，1.0，2.0，2.5，3.0，曙红Y：2.5，激发波长：435nm，荧光仪：Fluoromax-4荧光光谱仪)。
由图3可以看出在NCBNT浓度为0.5×10-5～3.0×10-5mol/L范围内，NCBNT的加入使得曙红Y566nm的荧光强度显著增强，而最大发射波长不变。当NCBNT的浓度为2.5×10-5mol/L(NCBNT与曙红Y的摩尔比对应为1.0)时，曙红Y566nm的荧光强度与相同条件曙红Y自身的荧光强度相比，增强了10.1倍。说明NCBNT和曙红Y之间发生了有效的能量转移，其转移效率为86.8％。剩余的13.2％的能量以NCBNT自身荧光的形式释放，对应图3中521nm处的发射峰。
实施例十三
用EBNP的激发波长激发EBNP和曙红Y的混合溶液，能检测到曙红Y567nm处的发射光谱，当EBNP和曙红Y的浓度均为2.5×10-5mol/L时，曙红Y567nm的荧光强度与相同条件曙红Y自身的荧光强度相比，增强了4.5倍，如图4(溶剂：DMF，浓度(10-5mol/L)：EBNP：2.5，曙红Y：2.5，激发波长：442nm，荧光仪：Fluoromax-4荧光光谱仪)。CNTA本身不发射荧光，也不能增强曙红Y的荧光。而当CNTA和EBNP组合成NCBNT时，则能使曙红Y的荧光增强10.1倍，说明通过三聚氯氰将CNTA和EBNP组合到一起得到的NCBNT起到了光采集和光放大的作用。