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1、(10)申请公布号 CN 102688499 A (43)申请公布日 2012.09.26 CN 102688499 A *CN102688499A* (21)申请号 201210183104.1 (22)申请日 2012.06.05 A61K 47/48(2006.01) A61K 45/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 29/00(2006.01) C08G 81/00(2006.01) C08G 65/48(2006.01) C08H 1/00(2006.01) (71)申请人 中国科学院过程工程研究所 地址 100190 北京市海淀区中关村北二条。
2、 1 号 (72)发明人 张竞 苏志国 刘强 窦婧 马光辉 (74)专利代理机构 北京品源专利代理有限公司 11332 代理人 梁晓霏 (54) 发明名称 白蛋白聚乙二醇药物分子偶联物 (57) 摘要 本发明提供了一种血清白蛋白 - 异端基双官 能团聚乙二醇 - 药物分子的大分子偶联物。该大 分子偶联物由血清白蛋白、 异端基双官能团聚乙 二醇以及药物分子通过化学共价偶联而成。该偶 联物可有效用于提高药物的药理作用和代谢动力 学， 具有更好的药物治疗效果和长循环功能。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求。
3、书 2 页 说明书 5 页 1/2 页 2 1. 一种大分子偶联物， 其特征在于所述大分子偶联物结构如式 I 所示 ： 血清白蛋白异端基双官能团聚乙二醇药物分子 （I） 其中， 所述血清白蛋白和所述药物分子分别与所述异端基双官能团聚乙二醇的两个不 同端基共价偶联 ； 优选地， 所述血清白蛋白为人血清白蛋白。 2. 根据权利要求 1 所述的大分子偶联物， 其特征在于， 所述的异端基双官能团聚乙二 醇结构为 A- 聚乙二醇 -B， 其中 A、 B 分别为能与巯基反应的活性官能团、 能与羰基反应的活 性官能团、 羧基 -COOH、 羟基 -OH 或琥珀酰亚胺酯基且 A 与 B 不相同 ； 其中， 优。
4、选地， 所述能与巯基反应的活性官能团为马来酰亚胺酯或硫代磺酸酯 R 选自甲基、 乙基、 丙基、 苯基和对苯甲基 ； 优选地， 所述能与羰基反应的活性官能团为酰肼氧胺 -O-NH2或氨 基 -NH2。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的大分子偶联物， 其特征在于， 所述异端基双官能团聚 乙二醇与所述血清白蛋白的氨基或者巯基共价偶联， 其中， 优选地， 所述共价偶联的结构 为 -S-S-、 4. 根据权利要求 1 至 3 中任一项所述的大分子偶联物， 其特征在于， 所述异 端基双官能团聚乙二醇与所述药物分子的羰基、 氨基或者巯基共价偶联， 其中， 优 选 地，所 述 共 价 偶 联 的 结 构。
5、 为 -S-S-、 5.根据权利要求1至4中任一项所述的大分子偶联物， 其特征在于， 所述异端基双官能 团聚乙二醇分子的分子量为 10080000Da， 更优选地 100050000Da， 最优选地 2000Da。 6.根据权利要求1至5中任一项所述的大分子偶联物， 其特征在于， 所述药物分子为蛋 白质、 多肽或小分子化学药物分子， 优选地， 所述药物分子包括但不限于粒细胞集落刺激因 子、 促红细胞生成素、 干扰素、 人速激肽、 卵清蛋白抗原肽、 胸腺肽、 奥曲肽、 兰瑞肽、 伐普肽、 地普奥肽、 喜树碱、 紫杉醇、 阿霉素、 鬼臼毒素、 顺铂、 蝶啶及其衍生物。 7. 制备根据权利要求 1 。
6、至 6 中任一项所述的大分子偶联物的方法， 所述方法包括 ： a ： 将所述血清白蛋白和所述药物分子两者中的一种与所述异端基双官能团聚乙二醇 权 利 要 求 书 CN 102688499 A 2 2/2 页 3 的一端共价偶联 ； 以及 b ： 将所述血清白蛋白和所述药物分子两者中的另一种与步骤 a 获得的产物共价偶联。 8. 一种药物组合物， 其特征在于， 所述药物组合物包含根据权利要求 1-6 中任一项所 述的大分子偶联物。 9. 根据权利要求 8 中所述的药物组合物， 其特征在于， 所述药物组合物为临床上可接 受的任一种剂型， 优选地， 所述剂型为口服剂型或可注射剂型。 10. 权利要求。
7、 1-6 中任一项所述的大分子偶联物在用于治疗癌症、 炎症或遗传性疾病 的药物的制备中的用途， 其中优选地所述癌症为乳腺癌、 非小细胞肺癌、 肝癌、 卵巢癌、 胶质 瘤、 头颈部癌。 权 利 要 求 书 CN 102688499 A 3 1/5 页 4 白蛋白聚乙二醇药物分子偶联物 技术领域 0001 本发明涉及医药技术领域， 尤其涉及一种结构为白蛋白异端基双官能团聚乙二 醇药物分子的大分子偶联物。 背景技术 0002 蛋白质、 多肽类生物药由于在各种癌症、 遗传性疾病等疑难病症方面具有显著的 治疗效果， 越来越得到人们的重视。长期以来， 研究者们一直着力于实现其临床应用。但是 由于该类药物的。
8、一大缺陷， 即蛋白质多肽药物的给药难以顺利实现， 其发展受到了限制。 由 于消化系统的破坏， 蛋白质、 多肽类药物口服施用后基本完全失效， 即便是注射施用， 这一 类药物也由于肾脏清除和蛋白水解酶水解的作用， 导致体内半衰期很短， 生物利用度较差。 同时， 这一类药物与普通化学药物在物化性质、 生物学性质和药理药代作用方面存在明显 区别， 它们普遍稳定性较差， 存在免疫原性和抗原性， 易导致人体的各种免疫反应。 因此， 按 照传统的给药方式和频繁的给药频率， 必然会给病人带来极大的不便和痛苦。针对这些问 题， 人们努力寻找各种解决途径， 其中， 对这些药物分子进行大分子修饰已经被证明是一种 行。
9、之有效的解决方法。 0003 目前研究比较多的一类大分子是血清白蛋白。 血清白蛋白是血浆中含量极为丰富 的一种惰性蛋白， 能够结合内源性、 外源性物质， 能够结合大中小尺寸不同的化合物， 也能 同难溶于水和溶于水的物质结合， 具有重要的生理意义和临床意义。药物分子与血清白蛋 白交联可以具备其生物功能， 增大偶联产物的分子量， 延长体内半衰期， 同时减弱或者消除 异体蛋白药物的输入受治疗者体内造成的免疫原性和抗原性， 封闭药物蛋白表面蛋白水解 酶的部分酶切位点， 同时在受治疗者体内易于降解， 不会累积在体内。同时， 在肝细胞上具 有特异性的血清白蛋白受体， 血清白蛋白修饰还可以起到高效给药的作用。
10、， 在有效减少吞 噬细胞对蛋白药物分子进行破坏的同时提高肝细胞对药物的摄入量， 使更多的药物送达肝 脏细胞。同时， 作为血浆蛋白， 血清白蛋白还具有在肿瘤组织附近聚集的性质， 因此可以作 为抗肿瘤药物的靶向载体， 其具体的实体瘤吸收情况受到很多情况的影响， 其中包括 ： 肿瘤 部位的代谢活动加速， 肿瘤部位对大分子物质的渗透性增加， 以及其淋巴腺的分泌功能减 弱。 0004 血清白蛋白对药物分子的修饰作用主要通过化学偶联和融合蛋白两种方式来实 现。其中融合蛋白技术主要是针对蛋白质药物来进行， 通过 DNA 重组技术得到两个基因重 组后的表达产物， 两个原蛋白间通过一段短肽链相连， 从而构建出具。
11、有全新序列的新型目 的蛋白， 例如Human Genome Science公司研发的-2b干扰素和HSA的融合蛋白ZALBINTM、 Glaxo-Smith-Kline 公司研制的胰高血糖素样肽和 HSA 的融合蛋白 Syncria 等。这种技术 由于对蛋白质的序列产生了本质的影响， 因此， 在技术的实施中， 氨基酸种类的选择、 肽链 序列的选择、 连接位点的选择都对蛋白质的结构功能会产生相当大的影响。 很遗憾的是， 迄 今为止， 对于融合蛋白连接肽的选择一直没有可靠的选择标准， 导致目标融合蛋白的活性 影响仍具有相当大的不可预知性， 因此工作难度相当大。 说 明 书 CN 102688499。
12、 A 4 2/5 页 5 0005 相对融合技术而言， 通过化学交联技术将血清白蛋白与药物分子进行偶联则不会 对药物分子尤其是蛋白质多肽类药物分子进行结构上的改变， 对药物分子活性结构域的影 响明显较小。 0006 血清白蛋白分子与药物分子间的化学偶联或者通过血清白蛋白直接与药物分子 耦合反应， 或者通过双官能团的交联试剂来实现。化学小分子药物与血清白蛋白的偶联大 多可采用直接反应的方式实现偶联。例如临床上最早诞生的血清白蛋白偶联物氨甲蝶呤 白蛋白偶联物 （Wunder,A.,Stehle,G.,Schrenk,H.H.,Hartung,G., 等人， International Journa。
13、l of Cancer， 1998,76(6):884-890） 就是通过药物的羧基与 HSA 的赖氨酸残基反应 获得。而蛋白质多肽等大分子与白蛋白分子之间的偶联则需要借助于双官能团偶联剂来 实现连接。例如 Exendin-4 与白蛋白通过顺丁烯二酰亚胺基团 （Christensen,M.,Knop,F. K.Once-Weekly GLP-1， Current Diabetes Reports,2010,10(2):124-132 ； Baggio,L. L.,Huang,Q.L.,Cao,X.M., 等人， Gastroenterology， 134(4):1137-1147） 实现偶联来。
14、制备 长效制剂。 0007 然而， 由于常见的化学交联剂反应端基常常不具备选择性， 例如戊二醛、 己二酰肼 等， 而且这些小分子交联剂由于自身的原因还会导致一定的生理毒性， 不但造成交联产物 不均一， 质量不可控， 并且容易在药用过程中产生较明显的毒副作用。因此， 存在对于提供 更加稳定、 安全且适于医药应用的用血清白蛋白修饰药物分子的方法需求。 发明内容 0008 柔性聚合物分子聚乙二醇通过多个端基的活性衍生及偶联来实现两个大分子交 联的同时， 还具有无毒、 无免疫原性抗原性等优点。并且聚乙二醇在与蛋白质、 多肽或其它 药物分子间形成共价偶联时， 不但可以提高药物水溶性， 显著增大偶联物的表。
15、观分子量， 降 低肾脏清除率， 延长体内半衰期， 还可以达到消除或者降低药物的免疫原性和抗原性， 降低 蛋白水解酶的水解程度的作用。 0009 本发明的目的在于提供一种利用异端基双官能团聚乙二醇将血清白蛋白和粒细 胞集落刺激因子、 干扰素、 促红细胞生成素等药物分子进行交联制备得到的蛋白偶联物， 该 偶联物利用聚乙二醇的共价偶联将血清白蛋白和药物分子两者的优势相结合， 同时还利用 了聚乙二醇的柔性连接和化学修饰的作用， 达到在保留药物治疗作用的同时， 提高药物稳 定性， 延长体内半衰期的目的。 此外， 该偶联物还具有适用范围广泛， 制备工艺简单的优势。 0010 为达此目的， 本发明采用以下技。
16、术方案 ： 0011 在第一方面， 本发明提供了一种大分子偶联物， 其特征在于所述大分子偶联物结 构如式 I 所示 ： 0012 血清白蛋白异端基双官能团聚乙二醇药物分子 （I） 0013 其中， 所述血清白蛋白和所述药物分子分别与所述异端基双官能团聚乙二醇的两 个不同端基共价偶联 ； 0014 优选地， 所述血清白蛋白为人血清白蛋白。 0015 在本发明的大分子偶联物中， 所述的异端基双官能团聚乙二醇结构可以为 A- 聚 乙二醇 -B， 其中 A、 B 分别为能与巯基反应的活性官能团、 能与羰基反应的活性官能团、 羧 说 明 书 CN 102688499 A 5 3/5 页 6 基 -COO。
17、H、 羟基 -OH 或琥珀酰亚胺酯基且 A 与 B 不相同 ； 0016 其中， 优选地， 所述能与巯基反应的活性官能团可以为马来酰亚胺酯或硫代 磺酸酯R 选自甲基、 乙基、 丙基、 苯基和对苯甲基 ； 0017 优选地， 所述能与羰基反应的活性官能团可以为酰肼氧胺 -O-NH2或 氨基 -NH2。 0018 在本发明的大分子偶联物中， 其特征在于， 所述异端基双官能团聚乙二醇可以 与所述血清白蛋白的氨基或者巯基共价偶联， 其中， 优选地， 所述共价偶联的结构可以 为 -S-S-、 0019 在本发明的大分子偶联物中， 所述异端基双官能团聚乙二醇可以与所述 药物分子的羰基、 氨基或者巯基共价偶。
18、联， 其中， 优选地， 所述共价偶联的结构可 以为 -S-S-、 0020 在本发明的大分子偶联物中， 所述异端基双官能团聚乙二醇分子的分子量可以为 10080000Da， 优选地 100050000Da， 更优选地 2000Da。 0021 在本发明的大分子偶联物中， 所述药物分子可以为蛋白质、 多肽或小分子化学药 物分子， 优选地， 所述药物分子可以包括但不限于粒细胞集落刺激因子、 促红细胞生成素、 干扰素、 人速激肽、 卵清蛋白抗原肽、 胸腺肽、 奥曲肽、 兰瑞肽、 伐普肽、 地普奥肽、 喜树碱、 紫 杉醇、 阿霉素、 鬼臼毒素、 顺铂、 蝶啶及其衍生物。 0022 在第二方面， 提供了。
19、制备根据第一方面所述的大分子偶联物的方法， 所述方法包 括 ： 0023 a ： 将所述血清白蛋白和所述药物分子两者中的一种与所述异端基双官能团聚乙 二醇的一端共价偶联 ； 以及 0024 b ： 将所述血清白蛋白和所述药物分子两者中的另一种与步骤 a 获得的产物共价 偶联。 0025 在第三方面， 提供了一种药物组合物， 其特征在于， 所述药物组合物包含根据第一 方面所述的大分子偶联物。 0026 本发明的药物组合物可以为临床上可接受的任一种剂型， 优选地， 所述剂型可以 为口服剂型或可注射剂型。 说 明 书 CN 102688499 A 6 4/5 页 7 0027 在第四方面， 提供了根。
20、据第一方面所述的大分子偶联物在用于治疗癌症、 炎症或 遗传性疾病的药物的制备中的用途， 其中优选地所述癌症为乳腺癌、 非小细胞肺癌、 肝癌、 卵巢癌、 胶质瘤、 头颈部癌。 0028 如本文中所用的，“异端基双官能团聚乙二醇” 是指在聚乙二醇链的两端具有不同 末端官能团的聚乙二醇分子。由于具有了两个不同末端官能团， 异端基双官能团聚乙二醇 可与两种不同的大分子或化合物同时共价连接， 形成偶联物。 0029 发明详述 0030 下面通过实施例对本发明加以进一步的说明， 但下述实施例并不限制本专利范 围。 0031 实施例 1 HSA-PEG-rhG-CSF 的制备 0032 将人血清白蛋白 （H。
21、SA） 溶解于 20mM HAc-NaAc 缓冲液配置成 5mg/mL 的修饰反应 体系， 按照 PEG ： 白蛋白摩尔比 3:1 的投料比将干粉状一端酰肼一端硫代磺酸酯的聚乙二醇 （PTS-PEG- 酰肼） （来自中国专利 201210143694.5） （平均分子量 2000Da） 投入低速搅拌的 反应体系中， 待聚乙二醇溶解完全后， 室温反应 34 小时， 将反应液用凝胶过滤色谱柱进行 分离， 然后将样品用透析袋进行醋酸缓冲液置换， 得到一端为酰肼一端通过二硫键与人血 清白蛋白形成共价偶联结构的聚乙二醇结合物的缓冲液溶液。 0033 将 G-CSF（粒细胞集落刺激因子） 溶于含盐酸胍的碳。
22、酸氢铵水溶液中， 加入 5 倍摩 尔量的高碘酸钠室温反应 20 分钟， 然后加入 1000 倍摩尔量的乙二醇， 继续反应 30 分钟， 将 反应产物用离子交换柱进行分离， 并将接收溶液置换为醋酸缓冲液， 与上一步得到的一端 酰肼一端通过二硫键与人血清白蛋白共价偶联的聚乙二醇结合物缓冲液溶液 （G-CSF 摩尔 量为 HSA-PEG 的 3 倍） 混合， 4反应过夜。将反应液用凝胶过滤色谱进行分离， 凝胶电泳检 测产物分子量为88kDa， 确证为G-CSF-PEG-HSA的偶联产物。 用粒细胞集落刺激因子的依赖 细胞株 （NFS-60） 为靶细胞， 以 MTT 比色法测定产物的活性， 与未偶联的。
23、 G-CSF 相比活性为 39%。 0034 实施例 2 HSA-PEG- 干扰素的制备 0035 - 干扰素 1mg 溶于含 SDS 的 1mL 醋酸缓冲液中， 加入 4mg/mL 的高碘酸钠水溶液 0.1mL， 室温避光反应 10 分钟， 然后加入 0.1mL 乙二醇继续反应 30 分钟， 将反应产物用反相 柱进行分离， 并将接收液置换为醋酸缓冲液， 得到 N 末端氧化为醛基的 - 干扰素。 0036 取 300uL 溶解于醋酸缓冲液的 HSA（1mg/mL） 置于密封管内， 加入 1.5 倍摩尔量的 PTS-PEG- 酰肼 （平均分子量 2000Da） ， 4反应过夜， 然后离子交换色谱。
24、进行分离去除未反 应的HSA和PEG， 将收集的HSA-PEG偶联产物溶液浓缩， 并置换为醋酸缓冲液， 加入3倍摩尔 量的上一步制得的末端为醛基的 - 干扰素， 4反应过夜， 然后再次离子交换色谱进行分 离， 收集得到产物质谱检测分子量为 70.2k， 确证为 HSA-PEG- 干扰素偶联物。用人羊膜 上皮细胞 （WISH 细胞） 为靶细胞， 以 MTT 比色法测定产物的生物活性， 为未偶联 - 干扰素 的 31%。 0037 实施例 3 HSA-PEG- 喜树碱的制备 0038 1.5g 喜树碱在与 1.5 倍摩尔量的丁二酸酐和 2 倍摩尔量的 N- 羟基琥珀酰亚胺在 无水吡啶中 4- 二甲。
25、氨基吡啶催化条件下于 30反应 2 天， 然后蒸干溶剂， 依稀乙醚洗涤过 滤， 将固体产物与 10mL 吡啶于 50反应过夜， 然后蒸干溶剂， 固体产物用氯仿洗涤过滤， 收 说 明 书 CN 102688499 A 7 5/5 页 8 集滤液， 蒸干， 得到产物质谱检测分子量为 448.42， 确证为喜树碱 - 丁二酸酯。 0039 将 150mg 喜树碱 - 丁二酸、 1.5 倍摩尔量的二环己基碳二亚胺和 1.5 倍摩尔量的 N- 羟基琥珀酰亚胺一次加入 50mL 无水二氯己烷， 室温反应过夜， 然后加入 3 倍摩尔量的已 经甲苯共沸回流除水的 PTS-PEG-OH（平均分子量 1000Da。
26、） ， 室温反应 2 天， 然后过滤反应 液， 浓缩滤液， 加入等体积的盐水进行萃取， 合并有机层， 无水硫酸钠干燥， 过滤， 滤液浓缩， 乙醚沉淀， 过滤， 得到浅黄色固体粉末， 质谱检测分子量为 1500Da， 确证为 PEG- 喜树碱偶联 物。 0040 取 300uL 溶解于醋酸缓冲液的 HSA（1mg/mL） 置于密封管内， 加入 1.5 倍摩尔量的 PEG- 喜树碱， 4反应 1 天， 然后离子交换色谱进行分离去除未反应的 HSA 和 PEG- 喜树碱， 得到的产物质谱检测分子量为 68.7kDa， 确证为 HSA-PEG- 喜树碱偶联物。以 Tca8113 细胞 及其裸鼠移植瘤为。
27、靶细胞， 以 MTT 法及流式细胞仪检测其细胞毒性作用， 检测其肿瘤抑制 率可达 69.9%。 0041 实施例 4 HSA-PEG-TM11 的制备 0042 人速激肽 （TM11 肽） 1mg 溶于 1mL 醋酸缓冲液中， 加入 4mg/mL 的高碘酸钠水溶液 0.1mL， 室温避光反应 10 分钟， 然后加入 0.1mL 乙二醇继续反应 30 分钟， 将反应产物用反相 柱进行分离， 并将接收液置换为醋酸缓冲液， 得到的反应产物质谱检测分子量为 1175Da， 确 认为 N 末端氧化为醛基的 TM11 肽。 0043 向上述末端醛基化的 TM11 肽缓冲液溶液中加入 1.5 倍摩尔量的 P。
28、TS-PEG- 酰肼 （平均分子量 1000Da） ， 4反应过夜， 然后离子交换色谱进行分离去除未反应的 TM11 和 PEG， 得到的产物质谱检测平均分子量为 2.3kDa， 确认为 PEG-TM11 偶联物。 0044 将收集的 PEG-TM11 偶联产物溶液浓缩， 并置换为醋酸缓冲液， 加入 2 倍摩尔量的 人血清蛋白 （HSA） ， 4反应过夜， 然后再次离子交换色谱进行分离， 得到产物质谱检测分子 量 69kDa， 确认为 HSA-PEG-TM11 偶联物。 0045 实施例 5 HSA-PEG-SL8 0046 卵清蛋白抗原肽 （SL8 肽） 1mg 溶于 1mL 醋酸缓冲液中，。
29、 加入 4mg/mL 的高碘酸钠水 溶液0.1mL， 室温避光反应10分钟， 然后加入0.1mL乙二醇继续反应30分钟， 将反应产物用 反相柱进行分离， 并将接收液置换为醋酸缓冲液， 得到的反应产物质谱检测分子量为 950， 确认为 N 末端氧化为醛基的 SL8 肽。 0047 向上述末端醛基化的 SL8 肽缓冲液溶液中加入 1.5 倍摩尔量的 PTS-PEG- 酰肼 （平 均分子量50000Da） ， 4反应过夜， 然后离子交换色谱进行分离去除未反应的SL8和PEG， 得 到的产物质谱检测分子量为 51.2kDa， 确认为 PEG-SL8 偶联物。 0048 将收集的PEG-SL8偶联产物溶液浓缩， 并置换为醋酸缓冲液， 加入2倍摩尔量的人 血清蛋白 （HSA） ， 4反应过夜， 然后再次离子交换色谱进行分离， 得到产物凝胶电泳检测分 子量 117.3kDa， 确认为 HSA-PEG-SL8 偶联物。 说 明 书 CN 102688499 A 8 。