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1、(10)申请公布号 CN 102670582 A (43)申请公布日 2012.09.19 CN 102670582 A *CN102670582A* (21)申请号 201210101906.3 (22)申请日 2009.08.21 200910184185.5 2009.08.21 A61K 31/352(2006.01) A61P 5/50(2006.01) A61P 3/04(2006.01) (71)申请人 南京大学 地址 210093 江苏省南京市鼓楼区汉口路 22 号 (72)发明人 徐琛 何凤霞 张辰宇 张昊 邓小达 周平 张艳 吴冬冬 李佳 李金波 (74)专利代理机构 上海。
2、一平知识产权代理有限 公司 31266 代理人 赵向辉 雷芳 (54) 发明名称 芒果苷元对 PTP1B 的抑制活性及其应用 (57) 摘要 芒果苷元对 PTP1B 的抑制活性及其应用。本 发明属于生物制药技术领域， 具体涉及一种四羟 基酮芒果苷元 (norathyriol)， 对蛋白酪氨酸 磷酸酶 1B 的抑制活性测定、 改善胰岛素抵抗作用 及在治疗 PTP1B 相关疾病药物中的应用。通过体 外酶抑实验证明， 本发明证实芒果苷元是重组人 源蛋白酪氨酸磷酸酶 1B 的竞争型抑制剂， IC50值 为 9.2M ； 芒果苷元可使 C57BL/6 正常小鼠、 ob/ ob 糖尿病模型小鼠对胰岛素的敏。
3、感性明显改善， 降低实验动物血糖。说明芒果苷元是 PTP1B 的 新型抑制剂， 可作为潜在的先导化合物， 在制备治 疗胰岛素抵抗相关抗糖尿病和肥胖症等代谢综合 征、 肿瘤和其他与 PTP1B 相关疾病的药物中应用。 (62)分案原申请数据 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 3 页 1/1 页 2 1. 一种芒果苷元的用途， 其特征在于， 用于制备蛋白酪氨酸磷酸酶 1B 的抑制剂。 2. 如权利要求 1 所述的用途， 其特征在于， 所述的抑制剂为竞争型抑制。
4、剂。 3. 如权利要求 1 或 2 所述的用途， 其特征在于， 所述芒果苷元还用于提高胰岛素敏感 性， 或用作提高胰岛素敏感性的药物。 4. 如权利要求 1 或 2 所述的用途， 其特征在于， 所述芒果苷元还用于治疗肥胖症， 或用 作治疗肥胖症的药物。 5.如权利要求1或2所述的用途， 其特征在于， 所述芒果苷元还用于治疗PTP1B相关疾 病。 6. 一种芒果苷元的用途， 其特征在于， 用于制备通过抑制 PTP1B 从而治疗肥胖症的药 物。 权 利 要 求 书 CN 102670582 A 2 1/3 页 3 芒果苷元对 PTP1B 的抑制活性及其应用 0001 本申请是申请日为 2009 年。
5、 8 月 21 日、 申请号为 200910184185.5、 发明名称为 “芒 果苷元对 PTP1B 的抑制活性及其应用” 的发明专利申请的分案申请。 技术领域 0002 本发明属于生物制药技术领域， 具体涉及芒果苷元对蛋白酪氨酸磷酸酶 1B(PTP1B) 的抑制活性、 改善胰岛素抵抗作用， 及在制备治疗 II 型糖尿病、 肥胖等代谢综合 征、 肿瘤和其他 PTP1B 相关疾病的药物中的应用。 背景技术 0003 蛋白酪氨酸的磷酸化水平是细胞内信号转导的重要调节因素， 它由蛋白酪氨 酸 激 酶 (Protein tyrosine kinase， PTK) 和 蛋 白 酪 氨 酸 磷 酸 酶 。
6、(Protein tyrosine phosphatase， PTP) 共同调控， PTP1B(Protein tyrosine phosphatase 1B， PTP1B) 属于 PTP 家族， 是胰岛素信号通路中重要的负调控因子并参与瘦素、 多种生长因子、 催乳素、 整合素、 血小板凝集素等的信号转导过程， 与糖尿病、 肥胖的胰岛素抵抗和瘦素抵抗均有密切关系， 与胰岛素抵抗、 肥胖、 血脂代谢紊乱和高血压等 4 个代谢综合征主要危险因素显著相关， 在 代谢综合征的发生、 发展中起重要作用。PTP1B 基因敲除小鼠胰岛素敏感性显著提高， 而且 能维持很好的糖稳态。另外， PTP1B 还能够抑。
7、制肿瘤细胞的转移， 与肿瘤细胞凋亡、 血管生 成有关， 在乳腺和上皮细胞中催乳激素-泌乳刺激素的信号转导中起负调控作用。 PTP1B已 成为治疗 II 型糖尿病、 肥胖症、 乳腺癌等多种疾病新型、 重要的药物靶点， 在防治代谢综合 征、 肿瘤等疾病中起重要作用， 对其抑制剂的研究也已经成为目前的研究热点。 0004 芒 果 苷 元 (norathyriol， NL)，全 称 1， 3， 6， 7- 四 羟 基酮 (1， 3， 6， 7-tetrahydroxyxanthone)， 其化学结构式如下 ： 0005 0006 现代药理研究表明， 芒果苷元具有多种生理作用， 如抗抑郁、 抗炎、 抗高。
8、血压、 抗肿 瘤、 抗氧化及抑制结核杆菌生长等作用， 其中抗炎作用的研究较为深入。 但目前尚未见其抑 制 PTP1B、 提高胰岛素敏感性方面的研究报道。 发明内容 0007 本发明的目的是致力于研究芒果苷元对蛋白酪氨酸磷酸酶 1B 的抑制活性， 为人 们提供一种新的蛋白酪氨酸磷酸酶 1B 抑制剂， 并通过研究芒果苷元对蛋白酪氨酸磷酸酶 说 明 书 CN 102670582 A 3 2/3 页 4 1B 的抑制活性， 进一步扩展芒果苷元的药物用途。 0008 为实现上述目的， 申请人从以下几个方面进行了研究 ： 0009 1、 建立蛋白酪氨酸磷酸酶抑制活性检测的反应体系， 根据PTP1B水解pN。
9、PP的磷酸 基团而产生颜色反应来检测化学小分子对 PTP1B 的抑制活性， 并用来测定芒果苷元抑制活 性包括 IC50值和抑制剂类型。 0010 通过上述体外试验， 申请人发现芒果苷元可显著抑制 PTP1B 活性， 是一种新型 PTP1B 抑制剂， 其抑制类型为竞争性抑制 ； 0011 2、 通过小鼠的体内试验， 申请人发现芒果苷元可显著改善 C57BL/6 正常小鼠和以 胰岛素抵抗为特征的 ob/ob 糖尿病肥胖模型小鼠的胰岛素敏感性， 降低实验动物血糖。 0012 基于上述研究和试验， 申请人首次证实了芒果苷元是活性较好的新型 PTP1B 竞争 性抑制剂， 在体内可增加胰岛素敏感性， 改善。
10、实验动物的高血糖症状， 可以用于制备提高胰 岛素敏感性、 降血糖的药物， 能成为潜在的治疗 II 型糖尿病、 肥胖等代谢综合征、 乳腺癌药 的物， 并可作为潜在的先导化合物进行抗糖尿病、 肥胖等代谢综合征、 肿瘤和其他与 PTP1B 相关疾病的药物进行开发， 并可以借助芯片技术等进一步研究代谢相关的信号通路。 附图说明 0013 图 1 ： 偏矾酸钠对 PTP1B 抑制率曲线图。 0014 测定不同浓度的阳性对照物偏矾酸钠 (NaVO3) 对重组人源蛋白酪氨酸磷酸酶 1B 抑制率， 相对浓度作图， 得到 NaVO3的 IC50为 0.32M。 0015 图 2 ： 芒果苷元对 PTP1B 抑制。
11、率曲线图。 0016 测定不同浓度芒果苷元对重组人源蛋白酪氨酸磷酸酶 1B 抑制率曲线， 相对浓度 作图， 其 IC50为 9.2M。 0017 图 3 ： 芒果苷元对 PTP1B 抑制的双倒数图。 0018 在酶存在的条件下， 固定抑制剂的浓度， 改变底物的浓度， 用 Lineweaver-Burk 法， 以 1/s 为横坐标、 1/V 为纵坐标作图得到五条回归直线， 这五条直线交于 Y 轴， 从而判断 芒果苷元对 PTP1B 的抑制类型为竞争性抑制。 0019 图 4 ： 芒果苷元对正常小鼠 ip. 胰岛素的血糖变化图。 0020 数据用 ANOVA 法进行统计学处理 (n 11)， 其中。
12、各组血糖水平与对照组相比， NL(5、 40mg/kg) 在 30、 60、 90、 120min 四个时间点有显著性差异 *p 0.05。 0021 图 5 ： 芒果苷元对 ob/ob 小鼠 ip. 胰岛素的血糖变化图。 0022 数据用 ANOVA 法进行统计学处理 (n 5)， 其中各组血糖水平与对照组相比， NL(40mg/kg) 在 60、 90、 120min 三个时间点有显著性差异 *p 0.05。 具体实施方式 0023 通过以下实施例进一步详细说明本发明， 但应注意本发明的范围并不受这些实施 例的任何限制。 0024 材料与来源 ： 0025 试剂 ： 芒果苷元 ； 重组人源。
13、 PTP1B(Merck) ； 对硝基苯磷酸二钠 pNPP(Sigma) ； 偏 矾酸钠 (Sigma) ； MOPS(Sigma) ； DTT(Sigma) ； 胰岛素 ( 江苏万邦生化医药股份有限公司 ) ； 说 明 书 CN 102670582 A 4 3/3 页 5 C57BL/6 小鼠 ( 军事医学科学院实验动物中心 )， ob/ob 小鼠 (Jackson Lab)。 0026 器材 ： XFLOUR4 酶标仪 ； 恒温培养箱 ； 强生稳豪血糖仪 0027 实施例 1 芒果苷元对 PTP1B 的抑制活性测定 (IC50值的测定 ) 0028 芒果苷元用少量 DMSO 溶解后用 MO。
14、PS 缓冲液稀释， 取 10l 加入至 100l 反应体 系中 (pH 7.0， 25mM mops， 1mM EDTA， 2mM DTT， 0.1M NaCl)， 使其终浓度分别为 1500、 150、 15、 1.5、 0.15M， 加入底物 pNPP 至 16mM， 加入重组人 PTP1B 5ng 后置于 37反应 30min。 加 10l 1M NaOH 终止反应， 置酶标仪上测定 405nm 波长条件下的吸收值 A， 以偏矾酸钠 (NaVO3) 作为阳性对照， 以不加 PTP1B 为空白对照， 计算抑制率。用抑制率对浓度做图， 得到 芒果苷元 IC50为 9.2M， 偏矾酸钠 IC5。
15、0为 0.32M。 0029 实施例 2 芒果苷元对 PTP1B 的抑制动力学测定 0030 分别配制不同浓度的 pNPP(32、 16、 8、 4、 2mM) 和不同浓度的 NL 溶液 (1.25、 2.5、 5、 10、 20M)。每个 NL 浓度对应 5 组 pNPP 浓度做抑制活性测定， 根据 OD405 的变化求出 V， 对 应的底物浓度为 S， 根据 L-B 方程分别作图。结果表明， 各条直线交于 Y 轴， 故可判断 NL 为 PTP1B 的竞争型抑制剂。 0031 实施例 3 芒果苷元在改善正常小鼠胰岛素敏感性方面的作用 0032 C57BL/6 小鼠随机分为 5 组， 每组 1。
16、1 只， 分别为对照组、 NL 不同剂量给药组 (100、 60、 40、 15mg/kg)。给药组分别灌胃给予不同浓度的 NL( 用 0.5 CMC-Na 水溶液混悬 )， 对 照组灌胃给予 0.5 CMC-Na 水溶液。连续给药 7 天， 末次给药后禁食 12h， 按 1U/kg 腹腔注 射胰岛素， 分别于 0、 15、 30、 60、 90、 120min 取血测量血糖值。 0033 胰岛素耐量实验 (Insulin Tolerance Test， ITT) 实验显示， NL(5、 40mg/kg) 可显著改善 C57BL/6 小鼠胰岛素敏感性， 降低其血糖， 在后四个时间点有显著性差异。
17、 (p 0.05)。 0034 实施例 4 芒果苷元在改善 ob/ob 小鼠胰岛素敏感性方面的作用 0035 ob/ob 小鼠随机分为 2 组， 每组 5 只， 分别为对照组和给药组， 给药组灌胃给予 40mg/kg NL 溶液 ( 用 0.5 CMC-Na 水溶液混悬 )， 对照组灌胃给予 0.5 CMC-Na 水溶液。 连续灌胃 7 天， 末次给药后禁食 12h， 按 1U/kg 腹腔注射胰岛素， 分别在 0、 15、 30、 60、 90、 120min 取血测量血糖值。 0036 ITT 实验显示， 40mg/kg 剂量 NL 可显著改善 ob/ob 小鼠胰岛素敏感性， 降低其高血 糖症状， 在后三个时间点有显著性差异 (p 0.05)。 说 明 书 CN 102670582 A 5 1/3 页 6 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102670582 A 6 2/3 页 7 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102670582 A 7 3/3 页 8 图 5 说 明 书 附 图 CN 102670582 A 8 。