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1、(10)申请公布号 CN 103302307 A (43)申请公布日 2013.09.18 CN 103302307 A *CN103302307A* (21)申请号 201310255655.9 (22)申请日 2013.06.25 B22F 9/24(2006.01) A01C 1/00(2006.01) G01N 21/78(2006.01) G01N 21/31(2006.01) (71)申请人 通化师范学院 地址 134001 吉林省通化市东昌区育才路 950 号 (72)发明人 夏广清 董丽红 朱俊义 章亚男 (74)专利代理机构 通化旺维专利商标事务所有 限公司 22205 代理。
2、人 王伟 (54) 发明名称 一种银纳米粒子的制备方法及其促进黄瓜种 子萌发、 幼苗生长发育的方法 (57) 摘要 本发明属于纳米材料制备和性能研究技术领 域， 即银纳米粒子的制备方法及其促进黄瓜种子 萌发、 幼苗生长发育的方法。 其步骤如下 ： 取AgNO3 水溶液， 加入 PVP， 待 PVP 完全溶解后加入与 AgNO3 水溶液等体积的具有还原性的氨基酸水溶液， 当 反应体系的颜色逐渐变为褐色且光学透明时， 纳 米粒子已经生成并且尺寸较小， 离心处理， 所得上 层清液重新收集回初始反应容器， 在离心管底部 得到的沉淀储存于去离子水， 获得 Ag 纳米粒子溶 液。 采用氨基酸作为还原剂制备。
3、银纳米粒子， 具有 良好的生物相容性。采用了 PVP 作为分散剂防止 纳米粒子的聚集。 整个制备对反应条件要求不高， 易于实现规模化生产和所提供的纳米粒子有望应 用到农业生产中。 (51)Int.Cl. 权利要求书 3 页 说明书 9 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书3页 说明书9页 (10)申请公布号 CN 103302307 A CN 103302307 A *CN103302307A* 1/3 页 2 1. 一种银纳米粒子的制备方法， 其特征在于步骤如下 ： 取 AgNO3水溶液， 加入聚乙烯吡咯烷酮， 待聚乙烯吡咯烷酮完全溶解后加入与 AgNO。
4、3水 溶液等体积的具有还原性的氨基酸水溶液， 当反应体系的颜色逐渐变为褐色且光学透明 时， 纳米粒子已经生成并且尺寸较小， 离心处理， 所得上层清液重新收集回初始反应容器， 在离心管底部得到的沉淀储存于去离子水， 获得 Ag 纳米粒子溶液。 2. 按照权利要求 1 所述的纳米粒子的制备方法， 其特征在于步骤如下 ： （1） 温度 15 25条件下， 分别配置浓度为 0.05 0.2 molL-1 的 AgNO3水溶液和 浓度 0.05 0.2 molL-1具有还原性的氨基酸 ； （2） 量取 5 20 mL 的 AgNO3水溶液， 加入 0.05 0.2 g 的聚乙烯吡咯烷酮， 保证 PVP 。
5、浓度在 5 20 mgmL-1范围内 ； 待聚乙烯吡咯烷酮在搅拌下完全溶解后， 加入与 AgNO3水 溶液等体积的具有还原性的氨基酸水溶液， 停止搅拌让反应体系处于静置状态 ； 所述的具 有还原性的氨基酸是指 - 氨基丙酸、 组氨酸、 酪氨酸、 色氨酸或半胱氨酸中的任一种 ； （3） 当反应体系的颜色逐渐变为褐色且光学透明时， 纳米粒子已经生成并且尺寸较小， 离心处理， 所得上层清液重新收集回初始反应容器， 在离心管底部得到的沉淀储存于去离 子水中待用 ； （4） 所收集的离心上层清液在放置过程中会继续反应并再次达到褐色且光学透明状 态， 然后采用与步骤 （3） 相同的方法再次实现纳米粒子与反。
6、应母液的分离 ； 此步骤可以反 复进行多次直至离心上层液不再有反应进行为止 ； （5） 将历次分离所得的分散到去离子水中的沉淀集中起来， 并定容至反应初始时所采 用的 AgNO3水溶液的体积， 即可获得浓度为 0.05 0.2 molL-1的 Ag 纳米粒子溶液。 3. 按权利要求 2 所述的纳米粒子的制备方法， 其特征在于离心处理是在离心机 10000 rpm 条件下进行 10 分钟离心。 4. 按权利要求 2 所述的纳米粒子的制备方法， 其特征在于通过稀释获得浓度分别为 100、 200、 300、 400 或 500molL-1的 Ag 纳米粒子溶液。 5. 一种利用权利要求 2 或 4。
7、 所述的银纳米粒子促进种子萌发的方法， 其特征在于步骤 如下 ： （1） 选择饱满、 大小均一的黄瓜种子用蒸馏水冲洗干净、 吸水备用 ； 将冲洗干净的黄瓜 种子分组， 用不同质量浓度的银纳米粒子溶液处理， 于室温下浸泡12 h ； 其中用蒸馏水处理 作为对照 ； 每一处理设置三次重复 ； （2） 将浸泡好的黄瓜种子置于培养皿中培养， 培养皿底部依次铺上脱脂棉和滤纸， 并洒 上水浸湿滤纸， 于恒温箱 271下培养 ； 每天观察记录种子的萌发情况， 并拍照记录 ； （3） 黄瓜种子培养 24 h、 48 h、 72 h 时， 统计种子的发芽个数， 测量芽的长度 ； 以计算其 发芽势、 发芽率 ； 。
8、结果表明， 银纳米粒子处理可以促进黄瓜种子的萌发。 6. 按照权利要求 5 所述的银纳米粒子促进种子萌发的方法， 其特征在于 ： （1） 选择饱满、 大小均一的黄瓜种子 300 粒， 用蒸馏水冲洗干净， 用吸水纸吸干备用 ； 将 冲洗干净的黄瓜种子分为 6 组， 每组 50 粒， 分别放入 6 个培养皿中并编号， 再用质量浓度分 别为 0、 100、 200、 300、 400、 500molL-1的银纳米粒子溶液处理， 于室温下浸泡 12 h ； 其中 用蒸馏水处理作为对照 ； 每一处理设置三次重复 ； 权 利 要 求 书 CN 103302307 A 2 2/3 页 3 （2） 将浸泡好的。
9、黄瓜种子置于培养皿中培养， 培养皿底部依次铺上脱脂棉和滤纸， 并洒 上水浸湿滤纸， 于恒温箱 271下培养 ； 每天观察记录种子的萌发情况， 并拍照记录 ； （3） 黄瓜种子培养 24 h、 48 h、 72 h 时， 统计种子的发芽个数， 测量芽的长度 ； 以计算其 发芽势、 发芽率 ； 结果表明， 银纳米粒子处理可以促进黄瓜种子的萌发， 并在银纳米粒子溶液浓度为 300 mol/L 处理条件下， 黄瓜种子的发芽势及发芽率最好。 7. 一种利用权利要求 6 所述的银纳米粒子促进种子萌发的方法过程中物质代谢变化 影响的检测方法， 其特征在于步骤如下 ： （1） 银纳米粒子处理对黄瓜种子萌发过程。
10、中含水量的检测 ： 从各组中各取出 20 粒萌 发后的种子， 称鲜重 W1， 然后将其分别放在鼓风干燥箱中烘干再称重 W2 ； 或 （2） 银纳米粒子处理对黄瓜种子萌发过程中蛋白质含量的检测 ： 取萌发种子 0.2 g， 用 5 mL 蒸馏水冰浴研磨成匀浆， 移入离心管中， 4下 12000 rpm 离心 15 min， 所得上清 液即为可溶性蛋白液， 取蛋白提取液 1.0 mL， 放入具塞试管中， 每个样品重复两次， 加入 5 mL G-250 溶液， 充分混合， 放置 2 min 后在 595 nm 下比色， 测定吸光度， 通过标准曲线查得 蛋白质含量 ； 或 （3） 银纳米粒子处理对黄瓜。
11、种子萌发过程中过氧化物酶酶活性的检测 ： 取萌发种 子 0.5 g， 用 10 mL lmol.L-1， pH8.0 Tris 冰浴研磨成匀浆， 移入离心管中， 于超低温离心机 中4下1500 rpm离心15 min， 所得上清液即为酶提取液， 取酶提取液1.0 mL， 放入具塞试 管中， 每个样品重复两次， 加入2 mL联苯胺醋酸醋酸钠缓冲液， 再置于2832， 水浴中 保温35 min ； 测定时， 加入l mL 0.1mol. L-1H2O2， 立即摇匀， 并转入比色杯中， 在470 nm 下比色， 测定吸光度， 从加入 H2O2时起计时， 每 15s 读数一次， ， 计算酶活性 ； 或。
12、 （4） 银纳米粒子处理对黄瓜种子萌发过程中可溶性总糖含量的检测 ： 可溶性总糖的提取 ： 取萌发种子0.5 g,加入510 mL蒸馏水， 充分研磨， 转入刻度试 管中， 塑料薄膜封口， 于沸水中提取 30 min， 共 2 次， 提取液过滤入 25 mL 容量瓶， 反复冲洗 试管及残渣， 定容至刻度 ； 可溶性总糖的测定 ： 取 0.5 mL 样品液于试管中， 重复 2 次， 加蒸馏水 1.5 mL， 向试管中 加1 mL 9%苯酚溶液， 摇匀， 加入5 mL浓硫酸， 比色液总体积为8 mL， 在恒温下放置30 min ； 显色， 在 485 nm 波长比色测定 ； 或 （5） 银纳米粒子处。
13、理对黄瓜种子萌发过程中总淀粉酶及 - 淀粉酶活力的检测 ： 采 用 3， 5- 二硝基水杨酸比色法 ； 提取方法同步骤 （3） 中过氧化物酶 ； 精确吸取步骤 （3） 提取 酶液10 mL至两支干净的试管中， 于40水浴中提取l h， 其间不断的搅动， 保温结束后， 过 滤于25 mL试管中， 并用40温水淋洗滤渣， 冷却后定容至刻度， 于70恒温水浴中保温15 min， 以钝化 p- 淀粉酶， 获得 - 淀粉酶粗提液 ； 酶液贮存于 4下备用 ； 精确吸取 2 mL 酶液至干净试管中， 将一支立即放入沸水浴中煮沸 15 min， 冷却到室温 作为对照处理 ； 然后向其他试管分别加入 l ml。
14、 1% 可溶性淀粉溶液， 摇匀， 于 37恒温水浴 中保温 20 min; 保温结束后， 立即将两支试管转入沸水浴中煮 15 min， 停止反应 ； 分别从各 试管中取出 l mL 淀粉酶水解液， 移入相应编号的空试管中， 加 2 mL DNS 试剂， 沸水浴中反 应 5 min， 冷却， 加蒸馏水 7 mL， 以先经水浴反应 15 min 的处理为对照， 在 520 nm 处测定吸 光值。 权 利 要 求 书 CN 103302307 A 3 3/3 页 4 8. 按照权利要求 2 所述的纳米粒子的制备方法， 其特征在于步骤如下 ： （1） 在环境温度 15条件下， 量取 20 mL， 0.。
15、1 molL-1的 AgNO3水溶液， 在搅拌状态下 加入 0.2 g PVP 粉末并继续搅拌至完全溶解 ； 量取 20 mL， 0.1 molL-1的 - 氨基丙酸水 溶液在搅拌下加入以上溶液， 然后停止搅拌， 静置反应体系 ； （2） 静置 10 分钟后， 反应体系逐渐转变为深褐色光学透明溶液， 立刻将此溶液用高速 离心机在 1000rpm/min 的转速下离心分离 10 分钟， 将浅黄色的上层液倒回反应容器， 在离 心管底部可得尺寸在 20 纳米的银纳米粒子 ； （3） 第一次离心分离所得的上层液静置 30 分钟再次转化为深褐色光学透明溶液， 采用 与步骤 （2） 相同的步骤再次进行分离。
16、并再次获得尺寸在 20 纳米的银纳米粒子 ； （4） 第二次离心分离所得的上层液静置 1 小时再次转化为深褐色光学透明溶液， 采用 与步骤 （2） 相同的步骤再次进行分离并再次获得尺寸在 20 纳米的银纳米粒子 ； （5） 第三次离心分离所得的上层液静置 12 小时再次转化为深褐色光学透明溶液， 采用 与步骤 （2） 相同的步骤再次进行分离并再次获得尺寸在 20 纳米的银纳米粒子 ； （6） 第四次离心分离所得的上层液静置 72 小时使之完全反应， 采用与步骤 （2） 相同的 步骤再次进行分离并再次获得尺寸在 20 纳米的银纳米粒子 ； （7） 将历次分离所得的沉淀分散到20 mL的去离子水中。
17、即可获得浓度为0.1 mol L-1的 Ag 纳米粒子溶液， 在此基础上可通过稀释获得浓度分别为 100、 200、 300、 400、 500mol L-1 的 Ag 纳米粒子溶液。 9. 按照权利要求 5 所述的银纳米粒子促进种子萌发的方法， 其特征在于步骤如下 ： （1） 选择饱满、 大小均一的黄瓜种子 300 粒， 用蒸馏水冲洗干净， 用吸水纸吸干备用 ； 将 冲洗干净的黄瓜种子分为 6 组， 每组 50 粒， 分别放入 6 个培养皿中并编号， 再用浓度分别为 0、 100、 200、 300、 400、 500molL-1的银纳米粒子溶液处理， 于室温下浸泡 12 h ； 其中用蒸 。
18、馏水处理作为对照 ； 每一处理设置三次重复 ； （2） 将浸泡好的黄瓜种子置于培养皿中培养， 培养皿底部依次铺上脱脂棉和滤纸， 并 洒上水以浸湿滤纸宜， 于恒温箱 271下培养 ； 每天观察记录种子的萌发情况， 并拍照记 录 ； （3） 黄瓜种子培养 24 h、 48 h、 72 h 时， 统计种子的发芽个数， 测量芽的长度 ； 以计算其 发芽势、 发芽率， 结果表明， 银纳米粒子处理可以促进黄瓜种子的萌发， 并在300 mol/L处 理条件下， 黄瓜种子的发芽势及发芽率较好。 权 利 要 求 书 CN 103302307 A 4 1/9 页 5 一种银纳米粒子的制备方法及其促进黄瓜种子萌发、。
19、 幼苗 生长发育的方法 技术领域 0001 本发明属于纳米材料制备和性能研究技术领域， 即银纳米粒子的制备方法及其促 进黄瓜种子萌发、 幼苗生长发育的方法。 背景技术 0002 在过去的近二十年间， 纳米科学和纳米技术受到了广泛的关注并得到了飞速的发 展。在各种各样的纳米材料中， 银纳米粒子一直是一个研究热点。这是因为银纳米粒子不 仅具有一般纳米粒子所具有的小尺寸效应、 表面效应、 量子尺寸效应和宏观量子隧道效应 等性质， 作为贵金属的一员， 它具有独特的光、 电、 催化性质， 可广泛用作催化剂、 电池电极、 低温导热和导电材料等。另外， 银纳米粒子还有一个非常受关注的特性就是具有强大的杀 菌。
20、抑菌作用， 普通的抗生素一般一种只能杀灭 6 种病原体， 而银纳米粒子可以在数分钟内 杀死 650 多种细菌， 这是因为银纳米粒子可以直接进入菌体与氧代谢酶结合， 使菌体窒息 而死， 也正因为这样一个独特的作用机制， 使得银纳米粒子具有了广谱的抗菌性能。 而且由 于纳米银属于非抗菌素杀菌剂， 使得细菌无法产生耐药性， 能够有效避免因耐药性而导致 的反复发作久治不愈。而且银纳米粒子的安全性是国际医学界公认的， 因为微量银元素本 来就是人体必须的重要元素之一， 纳米银离子不带电荷， 不会与人体内多种生物活性物质 结合而沉积， 在毛孔中吸附并杀灭细菌， 并会从体内完全排出， 不会产生毒副作用。我国的。
21、 本草纲目 中记载 ： 生银， 无毒。美国公共卫生局 1990 年 关于银毒性的调查报告 中说 明 ： 银对人体无明显毒副作用 ； 纳米银是局部用药， 银含量少， 是最安全的用药方式。经试 验考察发现小鼠在口服最大耐受量 925mg/kg， 即相当于临床使用剂量的 4625 倍时， 无任何 毒性反应， 在兔的皮肤刺激实验中， 也没有发现任何刺激反应。 另外， 银纳米粒子还能够促 进伤口的愈合、 细胞的生长及受损细胞的修复。 因此纳米银是最新一代的天然抗菌剂， 各种 纳米银产品已渗入到人们生活的方方面面， 诸如净水滤材、 抗菌涂料、 卫生用品系列、 抗菌 纤维布系列、 各类清洁剂系列、 新型抗菌。
22、敷剂系列等等。 0003 近几年的研究表明， 纳米材料不仅能够对动物 （包括人类） 的生命活动产生影响， 对植物的生理活动也有明显的作用。 纳米材料在农业领域的保鲜、 肥料增效、 动物遗传育种 和饲料开发等已经开始应用。例如， 美国阿肯色大学的研究人员将西红柿种子暴露在碳纳 米管环境下， 结果发现， 这些种子发芽速度要比普通种子快一倍， 而且刚出芽的幼苗重量也 要比普通幼苗重很多。他们认为碳纳米管可以 “穿透” 种子坚硬的外壳， 从而大大提高种子 的吸水能力。 再如， 有研究表明纳米二氧化钛能够促进藏茵陈和油菜种子的萌发， 碳纳米管 还能够干旱胁迫下促进大豆种子的萌发和生长等。 0004 虽然。
23、人们倾注了大量的精力在银纳米粒子的性能研究上， 但基本都停留在器件制 备和抗菌应用领域， 对植物的影响情况以及作用机理却没有人进行研究。 另外， 应用于生物 领域的银纳米粒子的制备过程也必须是生物相容性的， 以避免由于制备而引入有毒物质影 响了银纳米粒子的应用。 说 明 书 CN 103302307 A 5 2/9 页 6 0005 本发明提出了一种绿色、 无毒制备生物相容性银纳米粒子的方法， 该方法低耗环 保， 所得纳米粒子尺寸均匀， 易于实现批量生产。将此法所得的银纳米粒子对植物的种子 （模型种子为黄瓜） 进行处理后， 种子萌发速度明显高于对照组， 而且幼苗也明显较对照组 粗壮。虽然纳米技。
24、术在作物浸种中的应用已有一些研究， 但有关银纳米对黄瓜种子萌发的 影响尚未见相关报道。 发明内容 0006 本发明的目的是提供一种绿色、 无毒、 制备尺寸均匀、 生物相容性良好的银纳米粒 子的制备方法。 0007 本发明的另一目的是提供一种利用这些银纳米粒子促进黄瓜种子萌发、 幼苗生长 发育的方法。 0008 本发明的方案是 ： 一种银纳米粒子的制备方法， 其特征在于步骤如下 ： 取 AgNO3水溶液， 加入聚乙烯吡咯烷酮， 待聚乙烯吡咯烷酮完全溶解后加入与 AgNO3水 溶液等体积的具有还原性的氨基酸水溶液， 当反应体系的颜色逐渐变为褐色且光学透明 时， 纳米粒子已经生成并且尺寸较小， 离心。
25、处理， 所得上层清液重新收集回初始反应容器， 在离心管底部得到的沉淀储存于去离子水， 获得 Ag 纳米粒子溶液。 0009 具体是， 纳米粒子的制备方法， 其特征在于步骤如下 ： （1） 温度 15 25条件下， 分别配置浓度为 0.05 0.2 molL-1的 AgNO3水溶液和 浓度 0.05 0.2 mol L-1的具有还原性的氨基酸水溶液。此浓度范围制备出来的 Ag 纳米 粒子在 20-30 nm， 尺寸均匀， 分散度较好， 浓度再低或者再高都会使得纳米粒子的尺寸范围 扩大， 不够均匀。 虽然还有其他还原剂， 如硼氢化钠、 水合肼等可以使用， 但这些还原剂都不 同程度的存在毒性， 使得。
26、纳米粒子的生物相容性降低。具有还原性的氨基酸优选为 - 氨 基丙酸。而 - 氨基丙酸是一种氨基酸， 本身就是生物相容的， 制备出来的纳米粒子也自然 具有的良好的生物相容性， 有利于进行与动植物相关的实验研究。所述的具有还原性的氨 基酸是指 - 氨基丙酸、 组氨酸、 酪氨酸、 色氨酸或半胱氨酸中的任一种。 0010 （2） 量取 5 20 mL 的 AgNO3水溶液 （体积可根据实际需要量来确定， 需要的多 则多量取， 工业化生产可以按比例扩大） ， 加入 0.05 0.2 g 的聚乙烯吡咯烷酮 （以下简称 为 PVP） ， 聚乙烯吡咯烷酮的用量根据反应物的实际用量来确定） ， 保证 PVP 浓。
27、度在 5 20 mgmL-1范围内 ； 一般 0.001 mol 的 AgNO3使用 0.05-0.2 g 的聚乙烯吡咯烷酮为宜 ； 待聚 乙烯吡咯烷酮在搅拌下完全溶解后， 加入与 AgNO3水溶液等体积的具有还原性的氨基酸水 溶液， 停止搅拌让反应体系处于静置状态 ； PVP 也是一种生物相容性的大分子， 本发明中采 用 PVP 来稳定 Ag 纳米粒子的目的是保证粒子的生物相容性， 没有生物毒性。所述的具有还 原性的氨基酸是指 - 氨基丙酸、 组氨酸、 酪氨酸、 色氨酸或半胱氨酸中的任一种。 0011 （3） 当反应体系的颜色逐渐变为褐色且光学透明时 （具体所需时间与反应进行时 所处的环境温。
28、度有关） ， 纳米粒子已经生成并且尺寸较小， 离心处理， 所得上层清液重新收 集回初始反应容器， 在离心管底部得到的沉淀储存于去离子水中待用。 0012 （4） 所收集的离心上层清液在放置过程中会继续反应并再次达到褐色且光学透明 状态， 然后采用与步骤 （3） 相同的方法再次实现纳米粒子与反应母液的分离 ； 此步骤可以 反复进行多次直至离心上层液不再有反应进行 （变为褐色） 为止。 说 明 书 CN 103302307 A 6 3/9 页 7 0013 （5） 将历次分离所得的分散到去离子水中的沉淀集中起来， 并定容至反应初始时 所采用的 AgNO3水溶液的体积， 即可获得浓度为 0.05 0。
29、.2 molL-1的 Ag 纳米粒子溶液 （此时 Ag 纳米粒子的浓度与所采用的 AgNO3水溶液的初始浓度相同） 。 0014 所述的聚乙烯吡咯烷酮浓度为 5 20 mgmL-1。PVP 的浓度太低， 起不到分散 和稳定纳米粒子的作用， 用量太多， 一是达到饱和之后不能再溶解， 二是整个体系的粘度上 升， 后期离心处理较为麻烦， 另外采用过多的 PVP 也不会进一步影响纳米粒子的最终尺寸， 反而造成浪费。 0015 所述的离心处理是在离心机 10000 rpm 条件下进行 10 分钟左右离心 （如 8 15 分钟） 。离心时间小于 8 分钟， 不能够把全部的纳米粒子离心出来， 超过 15 分。
30、钟便是对仪器 和能源的浪费。另外， 离心转数太低， 不能实现纳米粒子的完全分离， 太高也没有必要。 0016 通过稀释获得浓度分别为 100、 200、 300、 400 或 500 molL-1的 Ag 纳米粒子溶 液。 0017 银纳米粒子促进种子萌发的方法， 其特征在于步骤如下 ： （1） 选择饱满、 大小均一的黄瓜种子用蒸馏水冲洗干净、 吸水备用 ； 将冲洗干净的黄瓜 种子分组， 用不同质量浓度的银纳米粒子溶液处理， 于室温下浸泡12 h ； 其中用蒸馏水处理 作为对照 ； 每一处理设置三次重复。 0018 （2） 将浸泡好的黄瓜种子置于培养皿中培养， 培养皿底部依次铺上脱脂棉和滤纸，。
31、 并洒上水浸湿滤纸， 于恒温箱 271下培养 ； 每天观察记录种子的萌发情况， 并拍照记 录。 0019 （3） 黄瓜种子培养 24 h、 48 h、 72 h 时， 统计种子的发芽个数， 测量芽的长度 ； 以计 算其发芽势、 发芽率。 0020 结果表明， 银纳米粒子处理可以促进黄瓜种子的萌发。 0021 具体是， 银纳米粒子促进种子萌发的方法， 其特征在于 ： （1） 选择饱满、 大小均一的黄瓜种子 300 粒， 用蒸馏水冲洗干净， 用吸水纸吸干备用 ； 将 冲洗干净的黄瓜种子分为 6 组， 每组 50 粒， 分别放入 6 个培养皿中并编号， 再用质量浓度分 别为 0、 100、 200、。
32、 300、 400、 500 mol/L 的银纳米粒子溶液处理， 于室温下浸泡 12 h ； 其中 用蒸馏水处理作为对照 ； 每一处理设置三次重复。 0022 （2） 将浸泡好的黄瓜种子置于培养皿中培养， 培养皿底部依次铺上脱脂棉和滤纸， 并洒上水浸湿滤纸， 于恒温箱 271下培养 ； 每天观察记录种子的萌发情况， 并拍照记 录。 0023 （3） 黄瓜种子培养 24 h、 48 h、 72 h 时， 统计种子的发芽个数， 测量芽的长度 ； 以计 算其发芽势、 发芽率。 0024 结果表明， 银纳米粒子处理可以促进黄瓜种子的萌发， 并在银纳米粒子溶液浓度 为 300 mol/L 处理条件下， 。
33、黄瓜种子的发芽势及发芽率最好。 0025 银纳米粒子促进种子萌发的方法过程中物质代谢变化影响的检测方法， 其特征在 于步骤如下 ： （1） 银纳米粒子处理对黄瓜种子萌发过程中含水量的检测 ： 从各组中各取出 20 粒萌 发后的种子， 称鲜重 W1， 然后将其分别放在鼓风干燥箱中烘干再称重 W2 ； 或 （2） 银纳米粒子处理对黄瓜种子萌发过程中蛋白质含量的检测 ： 取萌发种子 0.2 说 明 书 CN 103302307 A 7 4/9 页 8 g， 用 5 mL 蒸馏水冰浴研磨成匀浆， 移入离心管中， 4下 12000 rpm 离心 15 min， 所得上清 液即为可溶性蛋白液， 取蛋白提取。
34、液 1.0 mL， 放入具塞试管中， 每个样品重复两次， 加入 5 mL G-250 溶液， 充分混合， 放置 2 min 后在 595 nm 下比色， 测定吸光度， 通过标准曲线查得 蛋白质含量。 0026 或 （3） 银纳米粒子处理对黄瓜种子萌发过程中过氧化物酶 （POD） 酶活性的检测 ： 取萌发种子 0.5 g， 用 10 mL lmol.L-1， pH8.0 Tris 冰浴研磨成匀浆， 移入离心管中， 于超低 温离心机中 4下 1500 rpm 离心 15 min， 所得上清液即为酶提取液， 取酶提取液 1.0 mL， 放入具塞试管中， 每个样品重复两次， 加入 2 mL 联苯胺醋酸。
35、醋酸钠缓冲液， 再置于 28 32， 水浴中保温 3 5 min ； 测定时， 加入 l mL 0.1mol. L-1H2O2， 立即摇匀， 并转入比色杯 中， 在 470 nm 下比色， 测定吸光度， 从加入 H2O2时起计时， 每 15s 读数一次， ， 计算酶活性。 0027 或 （4） 银纳米粒子处理对黄瓜种子萌发过程中可溶性总糖含量的检测 ： 可溶性总糖的提取 ： 取萌发种子0.5 g,加入510 mL蒸馏水， 充分研磨， 转入刻度试 管中， 塑料薄膜封口， 于沸水中提取 30 min， 共 2 次， 提取液过滤入 25 mL 容量瓶， 反复冲洗 试管及残渣， 定容至刻度。 0028。
36、 可溶性总糖的测定 ： 取 0.5 mL 样品液于试管中， 重复 2 次， 加蒸馏水 1.5 mL， 向试 管中加 1 mL 9% 苯酚溶液， 摇匀， 加入 5 mL 浓硫酸， 比色液总体积为 8 mL， 在恒温下放置 30 min ； 显色， 在 485 nm 波长比色测定。 0029 或 （5） 银纳米粒子处理对黄瓜种子萌发过程中总淀粉酶及 - 淀粉酶活力的检 测 ： 采用 3， 5- 二硝基水杨酸比色法 (DNS)。提取方法同步骤 （3） 中过氧化物酶 ； 精确吸取 步骤 （3） 提取酶液 10 mL 至两支干净的试管中， 于 40水浴中提取 l h， 其间不断的搅动， 保温结束后， 过。
37、滤于 25 mL 试管中， 并用 40温水淋洗滤渣， 冷却后定容至刻度， 于 70恒 温水浴中保温15 min， 以钝化p-淀粉酶， 获得-淀粉酶粗提液 ； 酶液贮存于4下备用。 0030 精确吸取 2 mL 酶液至干净试管中， 将一支立即放入沸水浴中煮沸 15 min， 冷却到 室温作为对照处理 ； 然后向其他试管分别加入 l ml 1% 可溶性淀粉溶液， 摇匀， 于 37恒温 水浴中保温 20 min; 保温结束后， 立即将两支试管转入沸水浴中煮 15 min， 停止反应 ； 分别 从各试管中取出 l mL 淀粉酶水解液， 移入相应编号的空试管中， 加 2 mL DNS 试剂， 沸水浴 中。
38、反应 5 min， 冷却， 加蒸馏水 7 mL， 以先经水浴反应 15 min 的处理为对照， 在 520 nm 处测 定吸光值。 0031 与已有技术相比本发明具有如下优点 ： 1. 采用了氨基丙酸作为还原剂制备银纳米粒子。 由于氨基丙酸是一种氨基酸， 本身就 是一种生物分子， 因此具有良好的生物相容性。另外在制备过程中氨基丙酸的还原速率较 之于常用的硼氢化钠等强还原剂更为温和， 容易实现分阶段控制。 0032 2. 采用了PVP作为分散剂防止纳米粒子的聚集。 PVP本身也是一种生物相容性良 好的高聚物， 经常被应用到护肤品甚至是食品当中。 0033 3. 整个制备对反应条件要求不高， 也不。
39、需要特殊的仪器设备， 因此更易于实现规 模化生产。 0034 4. 考察银纳米粒子对种子萌发和植物生长的影响的研究工作尚属首次， 对研究 银纳米粒子在植物学应用方面具有一定的指导意义。 0035 5. 实验结果表明用银纳米粒子处理过的种子相对于对照组来说更容易萌发， 植 说 明 书 CN 103302307 A 8 5/9 页 9 株更加粗壮， 根系更加发达， 特别值得一提的是抗虫害能力增强， 说明本发明所提供的纳米 粒子有望应用到农业生产中。 0036 下面将结合实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。 0037 0038 0039 0040 具体实施方式 0041 实施例 1 （1） 在。
40、环境温度 15条件下， 量取 20 mL， 0.1 molL-1的 AgNO3水溶液， 在搅拌状态下 加入 0.2 g PVP 粉末并继续搅拌至完全溶解。量取 20 mL， 0.1 mol L-1的 - 氨基丙酸水 溶液在搅拌下加入以上溶液， 然后停止搅拌， 静置反应体系。 0042 （2） 静置 10 分钟后， 反应体系逐渐转变为深褐色光学透明溶液， 说明此时已经有 小尺寸的纳米粒子形成。 立刻将此溶液用高速离心机在1000rpm/min的转速下离心分离10 分钟， 将浅黄色的上层液倒回反应容器， 在离心管底部可得尺寸在 20 纳米左右的银纳米粒 子。 0043 （3） 第一次离心分离所得的。
41、上层液静置 30 分钟左右再次转化为深褐色光学透明 溶液， 采用与步骤 （2） 相同的步骤再次进行分离并再次获得尺寸在 20 纳米左右的银纳米粒 子。 0044 （4） 第二次离心分离所得的上层液静置 1 小时左右再次转化为深褐色光学透明溶 液， 采用与步骤 （2） 相同的步骤再次进行分离并再次获得尺寸在 20 纳米左右的银纳米粒 子。 0045 （5） 第三次离心分离所得的上层液静置 12 小时左右再次转化为深褐色光学透明 溶液， 采用与步骤 （2） 相同的步骤再次进行分离并再次获得尺寸在 20 纳米左右的银纳米粒 子。 0046 （6） 第四次次离心分离所得的上层液静置 72 小时左右使之。
42、完全反应， 采用与步骤 （2） 相同的步骤再次进行分离并再次获得尺寸在 20 纳米左右的银纳米粒子。 0047 （7）将历次分离所得的沉淀分散到 20 mL 的去离子水中即可获得浓度为 0.1 molL-1的 Ag 纳米粒子溶液， 在此基础上可通过稀释获得浓度分别为 100、 200、 300、 400、 500 mol/L 的 Ag 纳米粒子溶液。 0048 （8） 选择饱满、 大小均一的黄瓜种子 300 粒， 用蒸馏水冲洗干净， 用吸水纸吸干备 用。将冲洗干净的黄瓜种子分为 6 组， 每组 50 粒， 分别放入 6 个培养皿中并编号， 再用浓度 分别为 0、 100、 200、 300、 。
43、400、 500 mol/L 的银纳米粒子溶液处理， 于室温下浸泡 12 h。其 中用蒸馏水处理作为对照。每一处理设置三次重复。 0049 （9） 将浸泡好的黄瓜种子置于培养皿中培养， 培养皿底部依次铺上脱脂棉和滤纸， 并洒上适量的水 ( 以浸湿滤纸宜 )， 于恒温箱 271下培养。培养期间检查培养皿中的水 份是否充足， 给予一定的补充。每天观察记录种子的萌发情况， 并拍照记录。 0050 （10） 黄瓜种子培养 24 h、 48 h、 72 h 时， 统计种子的发芽个数 （以突破种皮为准） ， 说 明 书 CN 103302307 A 9 6/9 页 10 测量芽的长度。以计算其发芽势、 发。
44、芽率， 结果表明， 银纳米粒子处理可以促进黄瓜种子的 萌发， 并在 300 mol/L 处理条件下， 黄瓜种子的发芽势及发芽率最好 （较好） 。 0051 （11） 分别取以清水及最佳浓度 （300mol/L） 的银纳米粒子水溶液处理的萌发后 的黄瓜种子， 播种于营养钵内， 每个营养钵播 3 粒种子， 定期观察幼苗生长情况， 待黄瓜长 出 4 片真叶时， 采用卷尺测量黄瓜的株高， 用游标卡尺测量黄瓜茎粗 ； 用硫酸纸称重法测量 黄瓜叶面积， 采用烘干法测量黄瓜叶片相对含水量和植株的干物质含量。 0052 本例中 - 氨基丙酸可用组氨酸、 酪氨酸、 色氨酸或半胱氨酸中的任一种代替。 0053 实。
45、施例 2 （1） 在环境温度 15条件下， 量取 20 mL， 0.1 molL-1的 AgNO3水溶液， 在搅拌状态下 加入 0.1 g PVP 粉末并继续搅拌至完全溶解。量取 20 mL， 0.1 mol L-1的 - 氨基丙酸水 溶液在搅拌下加入以上溶液， 然后停止搅拌， 静置反应体系。 0054 （2） 静置 10 分钟后， 反应体系逐渐转变为深褐色光学透明溶液， 说明此时已经有 小尺寸的纳米粒子形成。 立刻将此溶液用高速离心机在1000rpm/min的转速下离心分离10 分钟， 将浅黄色的上层液倒回反应容器， 在离心管底部可得尺寸在 20 纳米左右的银纳米粒 子。 0055 （3） 。
46、第一次离心分离所得的上层液静置 30 分钟左右再次转化为深褐色光学透明 溶液， 采用与步骤 （2） 相同的步骤再次进行分离并再次获得尺寸在 20 纳米左右的银纳米粒 子。 0056 （4） 第二次离心分离所得的上层液静置 1 小时左右再次转化为深褐色光学透明溶 液， 采用与步骤 （2） 相同的步骤再次进行分离并再次获得尺寸在 20 纳米左右的银纳米粒 子。 0057 （5） 第三次离心分离所得的上层液静置 12 小时左右再次转化为深褐色光学透明 溶液， 采用与步骤 （2） 相同的步骤再次进行分离并再次获得尺寸在 20 纳米左右的银纳米粒 子。 0058 （6） 第四次次离心分离所得的上层液静置。
47、 72 小时左右使之完全反应， 采用与步骤 （2） 相同的步骤再次进行分离并再次获得尺寸在 20 纳米左右的银纳米粒子。 0059 （7）将历次分离所得的沉淀分散到 20 mL 的去离子水中即可获得浓度为 0.1 molL-1的 Ag 纳米粒子溶液， 在此基础上可通过稀释获得浓度分别为 100、 200、 300、 400、 500 mol/L 的 Ag 纳米粒子溶液。 0060 （8） 选择饱满、 大小均一的黄瓜种子 300 粒， 用蒸馏水冲洗干净， 用吸水纸吸干备 用。将冲洗干净的黄瓜种子分为 6 组， 每组 50 粒， 分别放入 6 个培养皿中并编号， 再用浓度 分别为 0、 100、 。
48、200、 300、 400、 500 mol/L 的银纳米粒子溶液处理， 于室温下浸泡 12 h。其 中用蒸馏水处理作为对照。每一处理设置三次重复。上述 - 氨基丙酸可用组氨酸、 酪氨 酸、 色氨酸或半胱氨酸中的任一种代替。 0061 （9） 将浸泡好的黄瓜种子置于培养皿中培养， 培养皿底部依次铺上脱脂棉和滤纸， 并洒上适量的水 ( 以浸湿滤纸宜 )， 于恒温箱 271下培养。培养期间检查培养皿中的水 份是否充足， 给予一定的补充。每天观察记录种子的萌发情况， 并拍照记录。 0062 （10） 黄瓜种子培养 24 h、 48 h、 72 h 时， 统计种子的发芽个数 （以突破种皮为准） ， 测。
49、量芽的长度。以计算其发芽势、 发芽率， 结果表明， 银纳米粒子处理可以促进黄瓜种子的 说 明 书 CN 103302307 A 10 7/9 页 11 萌发， 并在 300 mol/L 处理条件下， 黄瓜种子的发芽势及发芽率最好。 0063 （11） 从各组中各取出 20 粒萌发后的种子， 称鲜重 W1， 然后将其分别放在鼓风干燥 箱中烘干再称重 W2， 然后计算出银纳米粒子处理对黄瓜种子萌发过程中含水量的影响。 0064 （12） 取萌发种子 0.2 g， 用 5 mL 蒸馏水冰浴研磨成匀浆， 移入离心管中， 4下 12000 rpm 离心 15 min， 所得上清液即为可溶性蛋白液， 取蛋白提取液 1.0 mL， 放入具塞试 管中(每个样品重复两。