《一种季铵化壳聚糖/SIRNA复合粒子及其制备方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种季铵化壳聚糖/SIRNA复合粒子及其制备方法.pdf（10页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 102657880 A (43)申请公布日 2012.09.12 CN 102657880 A *CN102657880A* (21)申请号 201210139195.9 (22)申请日 2012.05.08 A61K 48/00(2006.01) A61K 47/48(2006.01) A61K 49/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人 浙江大学 地址 310027 浙江省杭州市西湖区浙大路 38 号 (72)发明人 马列 刘幸 高长有 (74)专利代理机构 杭州求是专利事务所有限公 司 33200 代理人 韩介梅 (54。
2、) 发明名称 一种季铵化壳聚糖 /siRNA 复合粒子及其制 备方法 (57) 摘要 本发明公开了一种季铵化壳聚糖 /siRNA 复 合粒子及其制备方法。以季铵化壳聚糖上带正电 荷的季铵基团与带负电荷的 siRNA 分子间的静电 相互作用为驱动力， 在水相中以涡旋振荡引发分 子自组装， 并通过调控分子电荷比、 孵化温度、 孵 化时间等参数， 制备了具有尺寸和表面电荷可控 的高生物活性季铵化壳聚糖/siRNA复合粒子。 本 发明以季铵化壳聚糖作为 siRNA 传递载体， 材料 细胞毒性低、 来源广泛、 成本低 ； 复合粒子制备过 程条件温和、 简单易行， 可有效保持 siRNA 的生物 活性。制。
3、备复合粒子所用的 siRNA 可针对目标基 因的特殊设计， 并能被细胞有效摄入并诱发目标 基因的沉默效应， 在癌症治疗、 组织再生修复等领 域具有良好应用前景。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 4 页 1/1 页 2 1.一种季铵化壳聚糖/siRNA复合粒子， 其特征在于由季铵化壳聚糖和siRNA两个组分 按质量比为 0.5:1-50:1、 在水相中通过静电相互作用络合而成。 2.根据权利要求1所述的季铵化壳聚糖/siRNA复合粒子， 其特征在于所说的。
4、季铵化壳 聚糖的季铵化度为 22%60%、 粘均分子量在 5200w、 脱乙酰度在 80% 以上。 3.根据权利要求1所述的季铵化壳聚糖/siRNA复合粒子， 其特征在于所说的siRNA是 特异性针对绿色荧光蛋白基因的 siRNA、 特异性针对 GAPDH 基因的 siRNA、 特异性针对转化 生长因子 1 基因的 siRNA 或特异性针对 I 型胶原基因的 siRNA。 4.制备权利要求1所述的季铵化壳聚糖/siRNA复合粒子的方法， 其特征在于包括以下 步骤 ： （1） 37oC， 搅拌下将焦碳酸二乙酯加入到 Milli-Q 水中， 使焦碳酸二乙酯体积浓度为 0.1%， 在 121 oC、。
5、 0.1MPa 条件下灭菌至少 30min ； （2） 用步骤 （1） 制得的焦碳酸二乙酯水分别配制 12000g/mL 的季铵化壳聚糖溶液 和 100500g/mL 的 siRNA 溶液 ； （3） 将步骤 （2） 的 siRNA 溶液滴加入季铵化壳聚糖溶液中， 涡旋振荡混合均匀， 得混合 液， 涡旋振荡速率大于 2000rpm， siRNA 溶液与季铵化壳聚糖溶液的体积比为 1:11:100 ； （4） 将步骤 （3） 混合液在 4oC60oC 静置孵化 0.52h， 得到季铵化壳聚糖 /siRNA 复合 粒子。 5.根据权利要求4所述的季铵化壳聚糖/siRNA复合粒子的制备方法， 其特征。
6、在于所用 的季铵化壳聚糖的季铵化度为 22%60%、 粘均分子量在 5200w、 脱乙酰度在 80% 以上。 6.根据权利要求书4所述的季铵化壳聚糖/siRNA复合粒子的制备方法， 其特征在于所 用的 siRNA 是特异性针对绿色荧光蛋白基因的 siRNA、 特异性针对 GAPDH 基因的 siRNA、 特 异性针对转化生长因子 1 基因的 siRNA 或特异性针对 I 型胶原基因的 siRNA。 7.根据权利要求4所述的季铵化壳聚糖/siRNA复合粒子的制备方法， 其特征在于步骤 （2） 季铵化壳聚糖溶液的浓度为 3.451000g/mL， siRNA 溶液的浓度为 200400 g/ mL。
7、。 8.根据权利要求4所述的季铵化壳聚糖/siRNA复合粒子的制备方法， 其特征在于步骤 （3） siRNA 溶液与季铵化壳聚糖溶液的体积比为 1:41:58。 权 利 要 求 书 CN 102657880 A 2 1/4 页 3 一种季铵化壳聚糖 /siRNA 复合粒子及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种 siRNA 复合粒子， 尤其涉及利用季铵化壳聚糖作为 siRNA 传递载 体构建的季铵化壳聚糖 /siRNA 复合粒子及其制备方法。 背景技术 0002 RNA 干扰是一种发生于后转录阶段的一种特异性基因沉默现象， 其中与目标基因 序列同源的小干扰 RNA(siRNA) 介导的。
8、 RNA 干扰现象研究最为广泛。随着化学合成 siRNA 技术的发展， RNA 干扰越来越多地应用于诊断和治疗领域。siRNA 是一种由大约二十多个核 苷酸组成的生物大分子， 在体内应用中存在易被酶解、 易被免疫系统清除、 细胞摄入率低等 问题。因此， 选择合适的 siRNA 传递载体， 制备安全、 稳定、 高效的载体 /siRNA 复合粒子具 有重要意义。 0003 目前， 病毒型 siRNA 载体虽然传递效率较高， 但潜在的生物安全性问题制约了其 广泛应用。非病毒型 siRNA 传递载体通常包括阳离子脂质体和阳离子聚合物两大类， 后者 的典型代表为聚乙烯亚胺、 聚赖氨酸、 壳聚糖等。季铵化。
9、壳聚糖是壳聚糖的衍生物， 不仅继 承了壳聚糖生物相容性好、 无刺激性、 无免疫原性、 无热源反应、 来源广泛、 成本低廉等优 点 ； 同时还具有在生理条件下溶解性好、 正电荷密度高等优势。 0004 以阳离子聚合物作为传递载体的 siRNA 复合粒子通常可采用静电络合法、 胶束 法、 聚合物粒子 （微球） 表面固定或包覆法等方式制备。其中， 静电络合法利用阳离子聚合 物和 siRNA 分子间的静电相互作用， 通过两组份间的自组装形成复合粒子 ； 复合粒子中的 siRNA可均匀分布在阳离子聚合物基质中， 过量阳离子聚合物在粒子表面形成正电荷层。 静 电络合法避免了制备过程可能涉及的有机溶剂和超声。
10、处理对 siRNA 结构和生物活性的破 坏 ； 同时， 表面正电荷层既保护 siRNA 免受 RNA 酶的降解， 又有利于复合粒子与细胞膜相互 作用以提高细胞摄入率。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种以季铵化壳聚糖作为 siRNA 传递载体、 具有高活性和高 沉默效率的季铵化壳聚糖 /siRNA 复合粒子及其制备方法。将生物安全性好、 来源广泛、 成 本低廉的季铵化壳聚糖与 siRNA 分子在水相中通过静电相互作用络合， 采用简便快捷的制 备过程得到季铵化壳聚糖 /siRNA 复合粒子。 0006 本发明的季铵化壳聚糖/siRNA复合粒子， 是由季铵化壳聚糖和siRNA两个组分按 质。
11、量比为 0.5:1-50:1， 在水相中通过静电相互作用络合而成。 0007 上述的季铵化壳聚糖的季铵化度为 22%-60%、 粘均分子量在 5-200w、 脱乙酰度 在 80% 以上。上述的 siRNA 是特异性针对绿色荧光蛋白基因的 siRNA（EGFP-siRNA） 、 特异性针对 GAPDH 基因的 siRNA(GAPDH-siRNA)、 特异性针对转化生长因子 1 基因的 siRNA(TGF-1-siRNA) 或特异性针对 I 型胶原基因的 siRNA(Col -siRNA)。 0008 本发明的季铵化壳聚糖 /siRNA 复合粒子的制备方法， 包括以下步骤 ： 说 明 书 CN 1。
12、02657880 A 3 2/4 页 4 （1） 37oC， 搅拌下将焦碳酸二乙酯加入到 Milli-Q 水中， 使焦碳酸二乙酯体积浓度为 0.1%， 在 121 oC、 0.1MPa 条件下灭菌至少 30min ； （2） 用步骤 （1） 制得的焦碳酸二乙酯水分别配制 12000g/mL 的季铵化壳聚糖溶液 和 100500g/mL 的 siRNA 溶液 ； （3） 将步骤 （2） 的 siRNA 溶液滴加入季铵化壳聚糖溶液中， 涡旋振荡混合均匀， 得混合 液， 涡旋振荡速率大于 2000rpm， siRNA 溶液与季铵化壳聚糖溶液的体积比为 1:11:100 ； （4） 将步骤 （3） 混。
13、合液在 4oC60oC 静置孵化 0.52h， 得到季铵化壳聚糖 /siRNA 复 合粒子。 0009 本发明制备过程中， 步骤 （2） 优选季铵化壳聚糖溶液的浓度为 3.451000g/ mL， siRNA 溶液的浓度为 200400g/mL。 0010 本发明制备过程中， 步骤 （3）优选 siRNA 溶液与季铵化壳聚糖溶液的体积比为 1:41:58。 0011 本发明制备过程中， 所用的季铵化壳聚糖的季铵化度为 22%-60%、 粘均分子量在 5-200w、 脱乙酰度在 80% 以上。所用的 siRNA 是特异性针对绿色荧光蛋白基因的 siRNA （EGFP-siRNA） 、 特异性针对。
14、 GAPDH 基因的 siRNA(GAPDH-siRNA)、 特异性针对转化生长因子 1 基因的 siRNA(TGF-1-siRNA) 或特异性针对 I 型胶原基因的 siRNA(Col -siRNA)。 0012 本发明的优点 本发明采用季铵化壳聚糖为 siRNA 传递载体， 该载体具有生物安全性好、 来源广泛、 成本低廉等优点 ； 同时， 季铵化壳聚糖在生理条件下溶解性好、 正电荷密度高， 有利于提高 siRNA 复合粒子的稳定性和传递效率。本发明以季铵化壳聚糖和 siRNA 间的静电络合作用 为驱动力， 制备条件温和、 过程简单 ； 同时可通过对电荷比、 孵化温度、 孵化时间等参数的控 。
15、制， 制备具有不同尺寸和表面电荷、 高生物学活性的 siRNA 复合粒子。通过本发明制备的 siRNA 复合粒子可含有特异性针对各种致病基因的 siRNA， 复合粒子可通过全身给药和局 部给药等方式特异性介导目标基因沉默、 阻断致病基因的表达， 在各类疾病的诊断与癌症 治疗、 组织再生修复治疗以及器官的再生与重建方面具有广泛应用前景。 附图说明 0013 图 1 为不同氮 / 磷 （NP） 比条件制备的季铵化壳聚糖 /siRNA 复合粒子的粒径。 0014 图 2 为不同 NP 比条件制备的季铵化壳聚糖 /siRNA 复合粒子的表面电荷。 0015 图 3 为不同 NP 比条件制备的季铵化壳聚。
16、糖 /siRNA 复合粒子的 siRNA 结合率。 0016 图 4 为不同 NP 比条件制备的季铵化壳聚糖 /siRNA 复合粒子在血清中的稳定性。 0017 图 5 为不同 NP 比条件制备的季铵化壳聚糖 /siRNA 复合粒子被 HEK293 细胞吞噬 的比率。 0018 图 6 为不同 NP 比条件制备的季铵化壳聚糖 /siRNA 复合粒子对 HEK293 细胞 eGFP 表达的沉默性能。 0019 图 7 为季铵化壳聚糖 /siRNA 复合粒子对 HEK293 细胞 eGFP 表达沉默的特异性以 及 siRNA 剂量的影响。 0020 图 8 为季铵化壳聚糖 /siRNA 复合粒子对。
17、人真皮成纤维细胞 TGF-1 表达的沉默 效果。 说 明 书 CN 102657880 A 4 3/4 页 5 具体实施方式 0021 下面结合实施例对本发明作详细说明。 0022 实施例 1 ： 37oC， 搅拌下将焦碳酸二乙酯 （DEPC）加入到 Milli-Q 水中， 使焦碳酸二乙酯体积浓 度为 0.1%， 在 121 oC、 0.1MPa 灭菌 30min。用上述制得的 DEPC 水分别配制 3.45g/mL 、 8.62g/mL 、 17.2g/mL 、 34.5g/mL 、 69g/mL 、 138g/mL 、 345g/mL 的季铵化壳 聚糖 （季铵化度为 32%、 分子量 5w。
18、、 脱乙酰度 85%） 溶液和 200g/mL 的 GAPDH-siRNA 溶液。 将 GAPDH-siRNA 溶液滴加入季铵化壳聚糖溶液中， 涡旋振荡混合均匀， 得混合液， 涡旋振荡 速率 3000rpm， GAPDH-siRNA 溶液与季铵化壳聚糖溶液的体积比为 1:29。将混合液在 37oC 静置孵化 1h， 即制得氮 / 磷 （NP） 比 （季铵化壳聚糖上 N 原子和 GAPDH-siRNA 上 P 原子的摩 尔比） 分别为 1、 2.5、 5、 10、 20、 50、 100 的季铵化壳聚糖 /GAPDH-siRNA 复合粒子。由此， 通过 NP 比的调控、 得到不同尺寸、 不同表面。
19、电荷、 不同结合率的复合粒子。用动态光散射 （DLS） 测量的粒子直径如图 1 所示， 所有复合粒子的直径均在 500nm 以下。Zeta 电位仪测得的表 面电位如图 2 所示， 随着 NP 比的升高， 粒子表面正电荷密度逐渐增大， 至 20mV 左右后达到 饱和。以 20% 聚丙烯酰胺凝胶电泳及 SYBR Gold 染色分析测得的 siRNA 结合率如图 3 所 示， NP 比高于 10 的粒子可达 90% 以上的 siRNA 结合率。 0023 实施例 2 ： 37oC， 搅拌下将焦碳酸二乙酯 （DEPC）加入到 Milli-Q 水中， 使焦碳酸二乙酯体积浓 度为 0.1%， 在 121 。
20、oC、 0.1MPa 灭菌 30min。用上述制得的 DEPC 水分别配制 17.2g/mL 、 34.5g/mL 、 69g/mL 的季铵化壳聚糖 （季铵化度为 60%、 分子量 150w、 脱乙酰度 88%） 溶 液和 400g/mL 的 Col -siRNA 溶液。将 Col -siRNA 溶液滴加入季铵化壳聚糖溶液 中， 涡旋振荡混合均匀， 得混合液， 涡旋振荡速率 3000rpm， Col -siRNA 溶液与季铵化壳 聚糖溶液的体积比为 1:58。将混合液在 25oC 静置孵化 0.5h， 即制得 NP 比分别为 5、 10、 20 的季铵化壳聚糖 /Col -siRNA 复合粒子。
21、。复合粒子在胎牛血清终浓度为 25% 的 DMEM 培 养基中 37oC 孵化后， 经 80oC 水浴 5min 以终止血清活性， 随即用 5mg/mL 肝素水溶液 37oC 孵 化 1h 以充分解离释放复合粒子中的所有 Col -siRNA 分子。经上述处理的样品以 20% 的 聚丙烯酰胺凝胶电泳和 SYBR Gold 染色观察分析， Col -siRNA 余存率如图 4 所示。Col -siRNA复合粒子在血清中可以抵御RNA酶的降解、 具有高度稳定性 ： NP比为10的复合粒 子可有效保护 Col -siRNA 至少 12h ； NP 比为 20 的复合粒子可有效保护 Col -siRN。
22、A 至少 48h。 0024 实施例 3 ： 37oC， 搅拌下将焦碳酸二乙酯 （DEPC） 加入到Milli-Q水中， 使焦碳酸二乙酯体积浓度为 0.1%， 再121 oC、 0.1MPa灭菌30min。 用上述制得的DEPC水分别配制8.62g/mL 、 17.2g/ mL 、 34.5g/mL 、 69g/mL 、 138g/mL 的季铵化壳聚糖 （季铵化度为 22%、 分子量 10w、 脱 乙酰度 82%） 溶液和 200g/mL 的荧光标记的 siRNA 溶液。将 siRNA 溶液滴加入季铵化壳 聚糖溶液中， 涡旋振荡混合均匀， 得混合液， 涡旋振荡速率 3000rpm， siRNA。
23、 溶液与季铵化壳 聚糖溶液的体积比为 1:29。将混合液在 25oC 静置孵化 1h， 即制得 NP 比分别为 2.5、 5、 10、 20、 50 的季铵化壳聚糖 /FAM-siRNA 复合粒子。HEK293 细胞培养 24h 之后， 分别加入 siRNA 说 明 书 CN 102657880 A 5 4/4 页 6 终浓度为 100nM 的各 NP 比复合粒子和裸 siRNA 以及 LipofectamineTM/siRNA 复合粒子 （按 LipofectamineTM产品说明书制备） 。无血清条件共培养 6h 之后， 细胞以胰酶消化收集， 用 流式细胞仪检测 FAM 绿色荧光为阳性的细。
24、胞比率， 见图 5。NP 比大于 5 的季铵化壳聚糖 / FAM-siRNA 复合粒子具有很强的被 HEK293 细胞吞噬的能力， 可有效吞噬粒子的细胞比例高 达 90%。 0025 实施例 4 ： 37oC， 搅拌下将焦碳酸二乙酯 （DEPC） 加入到 Milli-Q 水中， 使焦碳酸二乙酯体积浓度 为 0.1%， 在 121 oC、 0.1MPa 灭菌至少 30min。用上述制得的 DEPC 水分别配制 17.2g/mL 、 34.5g/mL 、 69g/mL 、 138g/mL 的季铵化壳聚糖 （季铵化度为 40%、 分子量 25w、 脱乙酰 度 85%） 溶液和 200g/mL 的 E。
25、GFP-siRNA 溶液。将 EGFP-siRNA 溶液滴加入季铵化壳聚糖溶 液中， 涡旋振荡混合均匀， 得混合液， 涡旋振荡速率 3000rpm， EGFP-siRNA 溶液与季铵化壳 聚糖溶液的体积比为 1:29。将混合液在 37oC 静置孵化 0.5h， 即制得 NP 比分别为 5、 10、 20、 50的季铵化壳聚糖EGFP-siRNA复合粒子。 HEK293细胞培养24h之后， 分别加入EGFP-siRNA 终浓度为 20nM、 40nM、 100nM、 150nM 的各 NP 比复合粒子和对应浓度的裸 EGFP-siRNA、 纯季 铵化壳聚糖溶液、 季铵化壳聚糖 /mis-siRN。
26、A（不特异性针对任何基因的 siRNA） 复合粒子、 LipofectamineTM/EGFP-siRNA 复合粒子 （按 LipofectamineTM产品说明书制备） 。无血清条 件共培养 6h 之后， 更换为新鲜的完全培养基。继续培养 42h 之后， 细胞以胰酶消化收集， 用 流式细胞仪测试 EGFP 荧光强度， 如图 6、 7。NP 比为 10-50 的季铵化壳聚糖 /EGFP-siRNA 复 合粒子可使得 HEK293 细胞 EGFP 的表达下降 40%-60% ； 且这种基因沉默效应是特异性的， 并 具有剂量依赖性。 0026 实施例 5 ： 37oC， 搅拌下将焦碳酸二乙酯 （D。
27、EPC） 加入到 Milli-Q 水中， 使焦碳酸二乙酯体积浓度 为 0.1%， 在 121 oC、 0.1MPa 灭菌至少 30min。用上述制得的 DEPC 水分别配制 500g/mL 、 1000g/mL 的季铵化壳聚糖 （季铵化度为 40%、 分子量 25w、 脱乙酰度 85%） 溶液和 400g/ mL 的 TGF-1-siRNA 溶液。将 TGF-1-siRNA 溶液滴加入季铵化壳聚糖溶液中， 涡旋振荡 混合均匀， 得混合液， 涡旋振荡速率 3000rpm， TGF-1-siRNA 溶液与季铵化壳聚糖溶液的 体积比为 1:4。将混合液在 37oC 静置孵化 0.5h， 即制得 NP。
28、 比分别为 10、 20 的季铵化壳聚 糖 /TGF-1-siRNA 复合粒子。人真皮成纤维细胞培养 24h 之后， 分别加入 siRNA 终浓度为 50nM 的各 NP 比复合粒子和对应浓度的裸 TGF-1-siRNA、 季铵化壳聚糖 /mis-siRNA （不特 异性针对任何基因的 siRNA， NP 比为 10） 复合粒子、 LipofectamineTM/TGF-1-siRNA 复合 粒子 （按 LipofectamineTM产品说明书制备） 。无血清条件共培养 6h 之后， 更换为新鲜的完 全培养基。继续培养 42h 之后， 细胞裂解并用聚合酶链式反应技术测定 TGF-1 的 mRNA 水 平如图 8。季铵化壳聚糖 /TGF-1-siRNA 复合粒子对人真皮成纤维细胞转化生长因子 1 的表达具有特异性沉默效果。 说 明 书 CN 102657880 A 6 1/4 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102657880 A 7 2/4 页 8 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102657880 A 8 3/4 页 9 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 102657880 A 9 4/4 页 10 图 7 图 8 说 明 书 附 图 CN 102657880 A 10 。