非功能性P2XSUB7/SUB受体的抗体,癌症及其它疾病的诊断和治疗.pdf

本发明涉及广泛的疾病及病症，包括癌症。本发明提供了检测这种疾病或病症的探针。所述探针能区分功能性P2X7受体和非功能性P2X7受体。所述探针可以以各种方式达到此目的，其中之一是检测三磷酸腺苷(ATP)与受体结合的变化。本发明还提供了一种使用所述探针检测疾病或病症的方法。本发明还包括使用抗体或能产生所述抗体的表位对疾病或病症的治疗，所述抗体能区分功能性和非功能性P2X7受体并与非功能性受体结合。本发明还包括治疗方法，药物组合物及所述探针和抗体的应用。

权利要求书
1.  分离的P2X7受体：
-其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与图1所示序列具有同源性，
-其中分离的P2X7受体的氨基酸序列包含对应图1所示的脯氨酸210的脯氨酸，所述脯氨酸呈顺式构象。

2.  权利要求1的受体，其中所述受体是啮齿类受体。

3.  权利要求2的受体，其中所述受体是小鼠受体、大鼠受体或兔受体。

4.  分离的P2X7受体，其具有图1所示的氨基酸序列，其中位于位置210的脯氨酸呈顺式构象。

5.  权利要求1的受体；或
具有所述受体的片段的氨基酸序列的肽，所述序列包含呈顺式构象的位置210的脯氨酸
在制备用于预防或治疗疾病或病症的疫苗中的用途。

6.  用于预防或治疗疾病或病症的疫苗，其包含
-权利要求1的P2X7受体；或
-具有所述受体的片段的氨基酸序列的肽，所述序列包含呈顺式构象的位置210的脯氨酸。

7.  权利要求6的疫苗，其中所述受体或肽偶联于载体。

8.  权利要求7的疫苗，其中所述载体是白喉毒素。

9.  权利要求6-8之一的疫苗，还包含佐剂。

10.  权利要求9的疫苗，其中所述佐剂包含QUILL A/DEAEDextran/Montanide。

11.  权利要求6-11之一的疫苗在制备用于治疗或预防对象中的疾病或病症的组合物中的用途。

12.  权利要求11的用途，其中所述疾病或病症是癌症。

13.  权利要求12的用途，其中所述癌症选自前列腺癌，乳腺癌，皮肤癌，肺癌，子宫颈癌，子宫癌，胃癌，食管癌，膀胱癌，结肠癌，阴道癌，卵巢癌，血癌，以及淋巴瘤组成的组。

14.  绵羊，兔，小鼠或大鼠的抗体，其结合具有图1所示的氨基酸序列并且其中在位置210的脯氨酸呈顺式构象的P2X7受体的细胞外结构域，并且所述抗体不结合所述P2X7受体具有图1所示的氨基酸序列并且其中在位置210的脯氨酸呈反式构象的P2X7受体的细胞外结构域。

15.  下述抗体在制备用于给予皮肤从而预防或治疗疾病或病症的组合物中的用途，其中所述抗体结合具有图1所示的氨基酸序列并且其中在位置210的脯氨酸呈顺式构象的P2X7受体的细胞外结构域，并且所述抗体不结合所述P2X7受体具有图1所示的氨基酸序列并且其中在位置210的脯氨酸呈反式构象的P2X7受体的细胞外结构域。

16.  组合物，其包含这样的抗体，其中所述抗体结合具有图1所示的氨基酸序列并且其中在位置210的脯氨酸呈顺式构象的P2X7受体的细胞外结构域，并且所述抗体不结合所述P2X7受体具有图1所示的氨基酸序列并且其中在位置210的脯氨酸呈反式构象的P2X7受体的细胞外结构域，并且所述组合物为给予皮肤的形式。

17.  权利要求16的组合物，其中所述抗体是绵羊抗体。

18.  权利要求16或17的组合物，还包括用于辅助所述抗体穿透皮肤的化合物。

19.  权利要求16-18之一的组合物，还包括用于湿润皮肤的化合物。

20.  权利要求19的组合物，其中所述用于湿润皮肤的化合物是二甲硅油。

21.  权利要求16-20之一的组合物，其中所述组合物配制成乳膏，洗液，油膏，凝胶，气溶胶或喷剂的形式。

22.  权利要求16-21的组合物在制备用于治疗或预防对象中的疾病或病症的药物中的用途。

23.  权利要求22的用途，其中所述疾病或病症是皮肤癌。

24.  权利要求23的用途，其中所述皮肤癌选自基底细胞癌，鳞状上皮细胞癌，黑素瘤和发育异常痣。

25.  下述抗体在制备适合通过体内成像技术来检测疾病或病症的试剂中的用途，其中所述抗体结合具有图1所示的氨基酸序列并且其中在位置210的脯氨酸呈顺式构象的P2X7受体的细胞外结构域，并且所述抗体不结合所述P2X7受体具有图1所示的氨基酸序列并且其中在位置210的脯氨酸呈反式构象的P2X7受体的细胞外结构域。

26.  权利要求25的用途，其中所述体内成像技术是正电子发射断层扫描。

27.  下述抗体在制备用于通过将对象的细胞或组织与该抗体接触并确定所述细胞或组织是否与该抗体结合来确定所述对象是否患有疾病或病症的组合物中的用途，其中所述抗体结合具有图1所示的氨基酸序列并且其中在位置210的脯氨酸呈顺式构象的P2X7受体的细胞外结构域，并且所述抗体不结合所述P2X7受体具有图1所示的氨基酸序列并且其中在位置210的脯氨酸呈反式构象的P2X7受体的细胞外结构域。

28.  权利要求27的用途，其中所述对象的细胞或组织在体内与所述抗体接触。

29.  权利要求27或28的用途，其中所述疾病或病症是癌症。

30.  权利要求29的用途，其中所述癌症选自前列腺癌，乳腺癌，皮肤癌，肺癌，子宫颈癌，子宫癌，胃癌，食管癌，膀胱癌，结肠癌，阴道癌，卵巢癌，血癌，以及淋巴瘤组成的组。

说明书非功能性P2X7受体的抗体，癌症及其它疾病的诊断和治疗
本申请为于2002年9月3日提交的发明名称为“非功能性P2X7受体的抗体，癌症及其它疾病的诊断和治疗”的02821433.1号中国发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及疾病包括癌症的诊断和治疗。本发明涉及的疾病类型包括源自上皮细胞的癌症和恶性淋巴瘤。本发明还涉及其它病症，如肿瘤前状态(preneoplastic states)，肠易激综合征(irritable bowelsyndrome)及病毒感染和其它感染。非常可能的是本发明还可应用于其它疾病和病症。

背景
三磷酸腺苷(ATP)可以激活配体门控性嘌呤受体(ligand-gatedpurinergic receptors)，已知称为P2X受体。已经鉴别了受体亚型P2X1至P2X7。已知不同的P2X受体亚型存在于许多细胞中，包括上皮细胞和白细胞，包括淋巴细胞，胸腺细胞，巨噬细胞和树突细胞。
P2X受体能透过钙离子以及一些其它阳离子，如钾和钠离子。钙离子通过P2X受体流入细胞可与细胞死亡相关。
现确认P2X7亚型参与许多细胞类型的编程性细胞死亡。在存在ATP的情况中，在细胞表面表达的P2X7受体能在一秒钟内打开通过细胞膜的钙离子通道。持续暴露于ATP可以导致在几秒钟至几十秒钟内形成大孔，其使得细胞内涌进过量钙离子，诱导编程性细胞死亡。
已知人和大鼠P2X7受体的氨基酸序列，例如从美国专利No.6,133,434(Buell et al)中获知。也见本发明图1所示。
在例如上皮癌细胞的情况中，暴露于ATP一般不导致编程性细胞死亡。已经发现这种细胞表达不能形成孔的P2X7受体。认为这些受体是非功能性受体。
在人类癌细胞系如前列腺PC3和乳腺MCF7以及在动物细胞系包括啮齿动物杂交瘤中，呈非功能性构象的P2X7受体在细胞表面发现。
恶性淋巴瘤患者的B细胞表达非功能性P2X7受体。淋巴瘤从逃脱溶胞破坏的恶性克隆中产生。这个过程导致恶性B淋巴细胞的进行性积聚并因此导致淋巴结病和/或脾肿大。
发明概述
在第一个方面，本发明提供了一种检测疾病或病症的探针，所述探针适合区分功能性P2X7受体和非功能性P2X7受体。优选地，所述探针通过检测三磷酸腺苷(ATP)与受体结合的变化，或者通过检测在P2X7受体中孔形成所必需的一或多个蛋白质的结合的变化而区分功能性和非功能性P2X7受体。在另一个实施方案中，所述探针检测在无结合的ATP情况中暴露的P2X7受体的一或多个部分。这种受体部分可包括一个P2X7单体。
本发明还提供了一种检测疾病或病症的方法，所述方法包括以下步骤：使用本发明的探针区分功能性P2X7受体和非功能性P2X7受体，提供受体表达谱，并将该受体表达谱与受体正常表达谱相对比。可以检测到其中的变化，例如上述就所述探针本身所描述的变化。
所述探针可以是天然或人工的。优选地，所述探针是一种抗体，其可以是多克隆抗体，单克隆抗体，重组抗体，人源化抗体，人抗体或其合适的片段。所述抗体优选针对位于ATP结合位点邻近的胞外结构域中的一个表位。在人P2X7受体情况中，所述探针优选适合区分功能性受体和非功能性受体，所述功能性受体具有一种序列，其中在第210氨基酸位的脯氨酸呈反式构象，所述非功能性受体具有一种序列，其中在第210氨基酸位的脯氨酸呈顺式构象，其使局部蛋白质结构明显改变。
所述探针可使用本领域技术人员易于获得的任何适当方法制备。
在本发明范围内，所述探针通过检测在ATP结合位点出现的其它构象变化而可以区分功能性和非功能性受体。例如，所检测的变化可以在除上述脯氨酸之外的一个氨基酸中。这种氨基酸例如是Pro199，当其呈顺式构象时明显改变局部蛋白质结构。再例如所检测到的变化也可以是在一些其它方面中的变化。
所述探针还可以适合检测功能状态未改变的P2X7受体的其它区域。没有结合ATP的单体亚单位的构象可以使用所述探针检测，因为所选择的表位可特异性检测只有当ATP未结合时才可及的受体表面的一个区域的形状。所述探针可检测一或多个蛋白质的结合中的变化，所述蛋白质如孔形成所必需的附属蛋白质或其它蛋白质。这种蛋白质非限制性例子为层粘连蛋白，整联蛋白，β-肌动蛋白，α-辅肌动蛋白和超绒毛蛋白。
在本发明中，可以使用P2X7受体亚型特异性抗体特异性检测或结合非功能性P2X7受体，所述P2X7受体在形成肿瘤前组织，非常早期肿瘤组织，晚期肿瘤组织的一部分的细胞中或细胞上表达或者在表达非功能性P2X7受体的任何肿瘤细胞上表达。因此，P2X7受体即使可以在细胞膜中正常表达或者可以部分作为通道，但是只有当其处于关门(close-gated)或非功能性构象时才可被检测或结合。
另外，没有结合的ATP的单体亚单位的构象也可以用抗体检测，因为所选择的表位特异性检测只有当ATP未结合时才可及的表面的一个区域的形状。
在本发明中，非功能性P2X7受体可以使用针对一种经历从功能性受体中存在的结构进行构象变化的表位的抗体进行检测或结合。已经发现非功能性受体的氨基酸序列可以与功能性受体的氨基酸序列相同，以便受体中构象变化的原因与受体与ATP的相互作用相关。如上所述，ATP分子作为受体激动剂，由此当ATP与受体结合时，其能打开细胞膜的供钙离子流入的通道。非功能性因此通过缺乏ATP激动剂与受体的适当结合而导致，原因可包括ATP产生不足或者降解率增加而导致的ATP局部可利用性不足。如果ATP与受体的结合被阻断，则受体构象被改变。这可以通过使用特异性设计的与受ATP结合影响的蛋白质区域结合的抗体而检测。
在人P2X7受体的情况中，参与构象变化的特异性序列可包括Pro210，其经历一个构象变化，在不存在结合的ATP情况下从反式转变为顺式。因此，在人受体的情况下，用于产生一种抗体的一个合适的表位序列可包含Pro210，而且可以从这个残基的任一侧延伸至诱导抗体应答所必需的适当程度。非限制性例子包括从Gly200延伸至Cys216的一个节段。另外，可以使用来自其它哺乳动物如大鼠的同源节段，其与人体组织交叉反应。例如，可以使用大鼠中相同的Gly200至Cys216节段，尽管与人序列相比在大鼠序列中有两个氨基酸取代(例如参见美国专利No.6,133,434)。
在非人类受体的情况中，可以通过适当的实验确定特异性序列。
对本发明的非功能性P2X7受体进行检测可以示出一种分布模式，其中功能性受体(及因此的正常细胞)可基本保持未标记。然而，P2X7受体的非功能性构象可以最初在肿瘤前非常早的阶段的细胞核和细胞质中检测到。例如在上皮细胞癌的情况中，使用本发明的方法可以在通过活检组织的苏木精和伊红(H&E)染色玻片检测的癌症正常病理表现出现之前几年检测到前肿瘤形成。因此，可以比目前的检测方法更早地检测癌症，如前列腺癌，皮肤癌和乳腺癌，由此具有可以早期治疗的优势。
可通过本发明的探针和方法检测的疾病或病症的全部范围还未确定。然而，确信这些疾病或病症包括上皮细胞癌，如前列腺癌，乳腺癌，皮肤癌，肺癌，子宫颈癌，子宫癌，胃癌，食管癌，膀胱癌，结肠癌和阴道癌，以及包括恶性淋巴瘤在内的血癌，肠易激综合征及病毒如HIV或其它病原微生物如结核分枝杆菌所致的感染。感染可直接通过抑制功能性所需的辅助因子或者通过正调节抑制上皮或其它细胞上的P2X7功能的辅助因子而引起非功能性受体表达，由此使感染的细胞不易受编程性细胞死亡的破坏。
除非特别指出，在此所用术语“疾病或病症(disease andcondition)”是指包括在前述段落中所述的所有这些特异性疾病和病症。
在肠易激综合征(IBS)的情况中，发现在具有这种病症的患者中，在上皮之下的基质中存在的分布广泛的淋巴细胞中正常表达P2X7受体的肠道粘膜变成正调节的。在受累患者中，这种提高的表达可以在十二指肠至直肠粘膜中观测到。该提高的表达可以在分离的区域中发现，或者在更极端的情况中在小肠全长上均普遍提高。
在受累及最小的情况中，总P2X7受体是正调节的，但这些全部是功能性的而且不侵入上皮层。在更严重的情况中，总P2X7受体表达更高，大多数受影响的肠道区域呈现非功能性的受体。这些例如可以位于盲肠粘膜，并可以侵入上皮层。最严重的情况是其中总P2X7受体表达进一步提高，而且大多数受体是非功能性的，其上皮细胞侵入增加。
如已经所揭示的，P2X7受体的非功能性是由于缺乏ATP激动剂与受体的适当结合所致。原因可包括ATP产量不足或者由于外-ATPase酶促降解ATP增加所致ATP局部可利用性不足。如果ATP与受体的结合被破坏，则受体构象如所揭示样改变，这可以使用本发明探针检测。然而，检测总P2X7受体分布最好通过使用一个表位而实现，所述表位是未受ATP结合影响的P2X7受体的胞外结构域的其它区域的表位。探针能通过检测功能性和非功能性构象共有的表位而检测功能状态未改变的P2X7受体的区域，所述表位如Val65—Lys81。
本发明包括使用一或两种P2X7亚型特异性抗体以特异性区分总P2X7分布及在肠道粘膜中表达的非功能性受体的比例。因此一起使用的这两种抗体既可以检测总受体数也可以检测只存在于关门的或非功能性构象中的那些受体通道。第一种抗体适合检测总P2X7受体表达。包含或附于本发明抗体的探针可以提供第二种抗体以检测IBS，不仅区分功能性和非功能性P2X7受体，而且还可以检测受体功能状态未改变的其它区域。所述抗体可以单独或者一起使用。优选地，所述抗体组合使用。
检测与非功能性P2X7受体分离的所有P2X7受体能确定病症的严重程度。非功能性P2X7受体在胃肠道粘膜中的表达以正常细胞基本保持未标记的模式出现。之后，P2X7的非功能性构象首先在上皮下的基质中检测到，从轻微综合征情况中分离的片状分布直至在胃肠道全长广泛表达同时伴有非功能性受体侵入上皮层的分离的片状分布。
本发明还提供了一种诊断肠易激综合征的方法，所述方法包括检测细胞和/或组织的P2X7受体表达谱，并将该表达谱与正常细胞和/或组织的预定表达谱相对比。优选地，P2X7受体表达谱的检测包括使用一或多种抗体。另外，优选这种抗体与本发明的探针不同，其不检测ATP与P2X7受体结合的变化。这种抗体的制备对本领域技术人员而言是显而易见的。
本发明还包括一或多种抗体在诊断肠易激综合征中的应用。
这种病症的治疗性处理在下文结合本发明的第三方面加以论述。
诊断剂可以应用标准免疫组织化学方法在标准显微术中使用。诊断剂也可以在体内使用。
使用本发明探针和方法的诊断可以使用原位成像技术进行，以检测在机体组织中的分布。另外，可以使用标准显微术，聚焦显微术及荧光激活的细胞淘选。可以使用测试淋巴，前列腺，乳腺，皮肤，肺，子宫，膀胱，子宫颈，胃，食管及相似活检组织的正常免疫组织化学方法，及乳腺和其它组织的细针抽吸物及细胞涂片如检测宫颈癌获取的那些涂片。
针对体内诊断，优选探针是无动物成分的人抗体或结构域。所述抗体优选用短半衰期的放射性标记物标记，所述放射性标记物可通过筛选方法如正电子发射断层扫描(PET扫描仪)检测。这种成像可检测在机体任何部位聚集的标记抗体，因此发出存在与任一肿瘤相关的非功能性受体的信号。理想地，这种测试应只在检测原始癌症之后进行，及为检测继发癌症的目的而进行，或者在通过血液检查(见以下所述)已经检测到可能存在一或多种肿瘤的一般筛选之后进行。
本发明的探针和方法可用于提供一种血液检查，以检测非功能性P2X7受体并因此的癌症或癌前病症。例如，荧光标记抗体(单克隆或多克隆抗体)形式的探针可用于对患者血细胞组分进行流式细胞计量术，以检测与各种门控性白细胞包括T淋巴细胞，B淋巴细胞或巨噬细胞上的非功能性受体的结合。
在另一种形式的血液检查中，所述探针优选采用附于试剂盒中提供的基质的标记抗体形式，使得可以通过存在固定化抗体与阳性白细胞结合的生色反应而进行检测。这种试剂盒可以适于医学从业者使用。
在一个相似的血液检查中，本发明的抗体探针可用作一种诊断工具，以筛选也许不具有癌症但其正常细胞杀伤途径由于缺乏一或多种白细胞上的P2X7功能而被抑制的患者。这种患者可在巨噬细胞上表达非功能性受体，表明那些巨噬细胞杀伤感染的细胞(如结核分枝杆菌，或者其它感染因子包括疟疾和HIV等微生物感染的细胞)的能力被抑制。这种生物体优先在其正常细胞杀伤途径由于缺乏一或多种白细胞上的P2X7功能而被抑制的患者体内增殖。
其它方法也可以与本发明的探针和方法一起使用。
本发明提供了一种治疗疾病或病症的抗体，所述抗体适于区分功能性P2X7受体和非功能性P2X7受体，及适于只结合非功能性受体。优选地，所述抗体通过检测三磷酸腺苷(ATP)与受体的结合中的变化或者通过检测P2X7受体中孔形成所必需的一或多种蛋白质的结合中的变化而区分功能性和非功能性受体，而且所述抗体适于只结合非功能性受体。在另一个实施方案中，所述抗体通过检测在没有结合的ATP的情况中暴露的受体的一部分而区分功能性和非功能性受体。
治疗疾病或病症的抗体可以与用作诊断疾病或病症的探针的抗体相同。这种抗体可例如用于局部治疗皮肤癌。针对系统性治疗癌症，所述抗体或其活性片段应是人抗体或人抗体结构域，以使非所希望的免疫应答副作用降至最低。
本发明的抗体可用于治疗哺乳动物包括人的疾病或病症。所述疾病或病症的实例已经结合本发明的探针在上文示出。
本发明还提供了一种表位，其能引起本发明第二方面所述抗体产生。所述表位优选包含Pro210并涵盖Gly200—Cys216(在人受体P2X7序列中)这一节段。所述表位应优选在C末端附着一Cys残基(Cys216)，其通过化学交联剂马来酰亚氨基己酰基-N-羟基琥珀酰亚胺(MCS)与白喉毒素交联，以便所附着的表位肽采用的构象具有一种稳定的顺式构型。
这种特异性肽构象有意呈递给具有一或多种疾病或病症的人或动物，尤其是患有上皮细胞癌如前列腺癌，乳腺癌，皮肤癌，肺癌，子宫颈癌，子宫癌，胃癌，食管癌，膀胱癌，结肠癌和阴道癌，以及恶性淋巴瘤，肠易激综合征及病毒如HIV或其它病原微生物结核分枝杆菌感染的患者。所述患者优选对所应用的缀合表位产生免疫应答，并因此产生识别受影响的细胞表面上存在的非功能性P2X7受体的抗体，所述抗体与所述受体结合并给合适的免疫细胞发信号，以破坏该复合的细胞。引发细胞死亡的其它细胞也可以受影响。
应理解本发明不限于上述序列，而且还包括改变的序列和载体及交联剂，它们相似地产生一种特异性应答，优选只针对非功能性P2X7受体，优选忽视在细胞表面上表达的所有功能性受体并因此避免副作用。
本发明在第二方面还提供了本发明的抗体在治疗患者所患疾病或病症中作为治疗载体的应用，其通过定向在细胞表面上表达的异常或非功能性P2X7受体而调节编程性细胞死亡，同时表达正常(功能性)受体的所有细胞未受影响。本发明还涵盖了本发明的表位引起抗体产生的应用，如上所述。
本发明还提供了一种药物组合物，以治疗或预防患者所患疾病或病症，所述组合物包含药物有效量的抗体，或者引起产生这种量的抗体的表位，其能调节在细胞表面上有异常或非功能性P2X7受体表达的细胞编程性死亡。
所述抗体或表位的药物有效量根据患者及疾病或病症的性质而发生变化。这些变量可由本领域技术人员确定。
本发明的药物组合物可以与一种药物可接受的载体联合施用，所述载体可以是本领域已知的或者在后文所述的并适于指定用处的任何载体。除了载体之外，本发明的药物组合物可包括其它成分，例如包括染料，防腐剂，缓冲剂和抗氧化剂。
本发明的药物组合物可采取任何希望的形式，并可以例如以软膏剂，乳油(cream)，溶液，悬浮液，粉末，片剂，胶囊，栓剂或阴道栓剂形式施用。
本发明的药物组合物可以以任何适当方式施用，包括口服，非肠道，静脉内，肌内，皮下或局部施用。
本发明还提供了一种治疗或预防患者所患疾病或病症的方法，所述方法包括为患者施用本发明的药物组合物。
本发明还提供了本发明的药物组合物在治疗或预防患者所患疾病或病症中的应用。
本领域技术人员意识到本发明的药物组合物的使用模式可根据最佳作用效果而加以改变。可能必需考虑疾病或病症的性质以及严重程度。
本发明的第三方面针对ATPases(酶)的表达，其控制供给P2X7受体的ATP供应，例如在恶性淋巴瘤患者的B细胞中。白细胞上P2X7受体的通道开放通过由外ATPase(ecto-ATPases)和外ATP二磷酸水解酶(外ATPDases)对ATP激动剂的快速水解而终止。这些酶调节众多的依赖于ATP的生理学过程。淋巴细胞上ATPase和ATPDase活性的底物特异性表明在所述淋巴细胞表面上存在一种以上类型，包括CD39。一或多种这些ATPases或ATPDases的增殖可限制控制P2X7孔形成所需的ATP供应，及随后的调节B细胞数目所需的细胞编程性死亡。
相似地，据信在IBS的情况中，ATPases的增殖可使激动剂ATP与P2X7受体的适当结合减少。
因此，在此第三方面中，本发明提供了一种治疗或预防患者所患疾病或病症的制剂，所述制剂包含适合调节在患者细胞或组织中控制ATP供给于P2X7受体的ATPase表达的一或多种物质。本发明还提供了一种治疗或预防患者所患疾病或病症的方法，所述方法包括为患者施用一种制剂，所述制剂包含适合调节在患者细胞或组织中控制ATP供给于P2X7受体的ATPase表达的一或多种物质。
这类ATPase例如是CD39或CD73。
这种物质可采取ATP类似物形式，优选不可水解并特异于P2X7的物质，或者抑制局部ATPases作用的另一种物质，所述ATPases使P2X7结合位点可利用的ATP耗竭。所述制剂可以是特异性针对非功能性P2X7受体的人抗体形式。
一种物质如ATP类似物可与P2X7结合并使其保持开放孔构型，因此使孔呈现一种功能性状态，使大和小阳离子均能通透。以这种方式，这种合成激动剂的应用可恢复受体功能，同时控制P2X7作为钙离子通道的作用所提供给细胞的生长优势。
所述疾病或病症优选恶性淋巴瘤或IBS，但本发明还扩展到其它疾病或病症，包括其它上皮细胞或血液癌症或者病毒和其它病原体感染。
在恶性淋巴瘤的情况中，ATPases控制对P2X7受体的ATP局部供应，以降低与P2X7受体结合可利用的ATP的浓度，并由此使所述受体失活导致编程性B细胞死亡明显降低。在恶性淋巴瘤中，这些ATPases可以在B细胞表面上特异性表达并表现为正调节。优选地，特异性ATPase抑制剂的应用可用于调节P2X7受体上ATP的可利用性，由此调节编程性B细胞死亡。
为治疗恶性淋巴瘤，所述物质可包括一种不可水解的P2X7激动剂形式的合成激动剂，其能阻断ATPases或ATPDases。
关于肠易激综合征，施用本发明的制剂意在恢复可能通过在粘膜受影响区域之下的肌层的过度活性而耗竭的受体功能。本发明的制剂可对粘膜直接起作用以除去这些非功能性受体，从而恢复局部正常的胃肠道分泌机制。治疗性处理目的在于恢复ATP局部供应于非功能性受体，以便恢复正常受体功能。控制受体功能的结果包括恢复对胃肠道分泌和蠕动的正常控制。这可以通过肠道应用或系统补给合成的P2X7特异性激动剂，优选不可由ATPases水解的P2X7特异性激动剂，通过系统应用非功能性P2X7受体的抗体，优选小型人特异性抗体，以除去非功能性受体，只留下功能性受体而实现。
如果在平滑肌中的蠕动异常与结合正常P2X7受体所需的ATP的局部可利用性耗竭相关，则治疗可包括恢复激动剂的这种天然供应，这通过应用暂时限制肠道活动的治疗而限制平滑肌摄取或利用ATP而进行。
本发明还提供了治疗局部或病症的一种药物组合物，所述组合物包含药物有效量的适合调节控制ATP供给于P2X7受体的ATPases(酶)表达的一或多种物质。
本发明在其所有方面中均扩展至这种相似应用，其可以应用在其它医学条件下，例如异常P2X7受体是病毒感染的结果，其中所述病毒在感染的细胞中通过正调节非功能性P2X7受体而被保护，或者其中这种受体在正常细胞条件下是正调节的。
本发明还提供了治疗肠易激综合征的一种方法，所述方法包括为患者施用一种上述药物组合物。
本发明还提供了这种药物组合物在治疗肠易激综合征中的应用。
上述一或多种药物有效制剂的使用模式可根据最佳作用效果而改变。
另外，本发明提供了治疗肠易激综合征的一种方法，所述方法包括施用适合恢复P2X7受体功能的一种组合物。所述受体功能通过粘膜受影响区域之下的肌层的过度活性而被耗竭。所述组合物可以与上述本发明制剂中包括的物质相同。
另一方面，本发明提供了一种区分不同的蛋白质构象的方法，通过使用能引起抗体产生的一个表位或者抗体自身以从与具有选择的构象的蛋白质所有成员的结合中实现特异性药物学结果(主动以及被动免疫)。一个这样的实例是呈导致vCJD病症构象的朊病毒蛋白。这种异常形式的蛋白质可以由特异性抗体或引起所述抗体产生(优选人抗体，并降低大小以达到最佳药物学作用)的表位定向。

附图简述
图1示出人P2X7受体的氨基酸序列(现有技术)。序列第65—81位及第200—216位残基被特别标示并在以下提及。
发明详述
为产生特异于非功能性P2X7的抗体，所用表位为图1所示序列第200—216位残基，含有第216位的Cys。
为产生无判别力的P2X7的抗体，所用表位为图1所示序列的第65—81位残基，其中加入一个N末端Cys。这种抗体不能检测所述受体是否是非功能性的，但设计用于检测所有受体以便功能性受体的比例可以通过对比分别使用两种抗体获得的染色而确定。
这些表位上的Cys残基通过马来酰亚氨基己酰基-N-羟基琥珀酰亚胺(MCS)交联剂与白喉毒素(DT)载体偶联，每个DT载体附着10个表位肽，以保持构象稳定性并提供一种较大的抗原性结构。这些缀合的表位用作抗原，注射入一些动物物种中(绵羊，兔和小鼠)以通常的方式产生特异于所述表位的抗体。
现有技术已经充分揭示了产生抗体的方法，通过在特定的时期将抗原/佐剂混合物注射入动物体内而进行。产生抗体的特异性实例如下所述：
实施例1：绵羊抗P2X7抗体
将500μg缀合物(大约100μg P2X7表位)在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释为0.8ml，并用1.2mL的Freund′s完全佐剂乳化。将绵羊在多个部位经皮下和肌内注射抗原/佐剂乳状液。8周后，将所述绵羊在多个部位再次注射相同量的用Freund′s不完全佐剂乳化的缀合物。4周后重复进行此操作并将动物经颈静脉取血样。测试收集的血清的抗体特异性。然后将该绵羊以8周间隔定期注射并取血样，以提供含有特异性抗体的血清集合。
将其它绵羊用等剂量的缀合抗原经与上述相似的方案但使用不同佐剂进行注射。在这些动物中，将0.7ml稀释的抗原与0.1ml的QuillA/DEAE Dextran溶液(2.5mg Quill A+25mg DEAE Dextran/mLPBS)和1.2mL的ISA 50V Montanide混合。将该乳状液在多个部位经皮下和肌内注射。使用这种佐剂产生的抗体产生与使用Freund′s佐剂产生的那些抗体相同的特异性。
实施例2：兔抗P2X7抗体
使用与在绵羊中进行的实验相同的两种佐剂及相同的注射方案在兔中产生抗体，唯一不同之处是使用300μg的缀合物进行注射。所产生的抗体与在绵羊中产生的那些抗体具有相同的特异性，可易于区别用于产生这些抗体的表位。
实施例3：小鼠抗P2X7抗体
在小鼠中针对缀合的表位及非功能性P2X7表位的未缀合的表位(其能区分不能形成孔并因此不能导致编程性死亡的受体)产生抗体。
在这些实验中，所用佐剂是QAJGEN Pty有限公司的产品ImmunEasyTM，其含有免疫刺激性产物CpG DNA(ColeyPharmaceutical Group公司的商标)。
将5μg表位或缀合的表位在70μL PBS和30μL ImmunEasyTM佐剂中稀释。将小鼠在多个部位进行皮下和肌内注射。两周后重复此方案并在再一个两周后再次重复。在第三次注射后8天将小鼠放血取血样。通过这种方法在小鼠中产生的抗体能区分不同的P2X7表位，而且P2X7非功能性表位的抗体示出与在绵羊和兔中产生的抗体相同的结果。
如以上实施例所示，P2X7受体的各种表位的抗体可以在不同物种中及使用不同的佐剂一致产生。特别地，可以常规产生P2X7受体的一个鉴别非功能性状态受体的表位的抗体，此非功能性状态受体在正常条件下不能形成孔并且不能进行其编程性死亡功能。
实施例4：
检测非功能性P2X7的抗体通过所述抗体与表达具有已知功能的P2X7(人)的细胞的结合而测试，这通过摄取溴化乙锭或铷的能力而表明。这些P2X7蛋白质通道可以在碱基对1513突变，由此该通道不能形成编程性死亡孔。在恶性B淋巴细胞上表达的这些及相似的非功能性P2X7受体在流式细胞计量术和标准免疫组织化学中也结合所述抗体，而表达正常功能性P2X7的细胞(能以大流量摄取钙，溴化乙锭和铷)不能结合所述抗体，因为所选择的检测非功能性受体的表位在功能性受体中不可利用。在非功能性受体中Pro210采用一种顺式构象，而且已经明确这个构象在用于产生抗体的缀合表位中是稳定的。Pro210在示出是功能性的受体中是反式构象。这是ATP(三磷酸腺苷)与P2X7受体结合的结果。当ATP被结合时，在紧邻ATP结合位点的一个节段上的Pro210采用一种反式构象。
这通过使用定点诱变将Pro210改变为固定呈反式构象的Ala而加以证实，发现这种突变蛋白有完全功能而且不能与产生的抗体结合以检测非功能性受体。
实施例5
在表达P2X7的标记的巨噬细胞中进行实验以进一步确认抗体检测非功能性受体的特异性。巨噬细胞使用P2X7通用抗体结合P2X7受体的抗体，但不结合非功能性P2X7的抗体，直至它们暴露于癌细胞如小鼠杂交瘤细胞。巨噬细胞与杂交瘤细胞之间的接触诱导非功能性P2X7在巨噬细胞上的表达，这通过非功能性P2X7的抗体以及通用的P2X7抗体检测。
测试从恶性淋巴瘤患者中提取的巨噬细胞和B淋巴细胞，所有这些细胞均结合通用的P2X7的抗体以及非功能性P2X7受体的抗体，证实P2X7在所有检测的癌细胞中均是非功能性的，由功能性P2X7形成的编程性细胞死亡孔不能形成，并因此不能诱导癌细胞编程性细胞死亡。
来自人体所有上皮细胞癌如前列腺癌，乳腺癌，肠癌，皮肤癌，胃癌，子宫颈癌及其它癌以及恶性淋巴瘤，慢性淋巴细胞性白血病及脑肿瘤的所有这些癌细胞，以及在所测试的其它哺乳动物中的相同肿瘤包括在狗中的乳腺癌和前列腺癌及在猫中的皮肤癌以及所有小鼠杂交瘤细胞和小鼠纤维肉瘤细胞，均表达相同的非功能性P2X7。在选择的表位中人，大鼠，猫，狗和小鼠之间的序列相似性足以在上述情况中进行阳性鉴别。这示出在这些哺乳动物中癌症的机制是相同的，因为所有癌细胞均表达非功能性P2X7受体，所述受体不能形成编程性细胞死亡孔，所述孔当激活时通常杀死细胞。以这种方式，癌细胞成为无限增殖的，编程性细胞死亡程序被关闭。
实施例6
为进一步证实癌细胞如受影响的B淋巴细胞不能通过P2X7功能诱导编程性细胞死亡，将含有非功能性P2X7受体的白血病患者的B细胞与5mM ATP温育培养2小时。结果是所有非功能性受体由于过量的ATP而迫使开放并诱导杀死受影响的细胞的编程性细胞死亡。
实施例7
为进一步证实抗体选择性结合癌细胞，将基底细胞癌(BCC)患者的皮肤用非功能性P2X7受体的抗体处理，所述抗体悬浮在惰性乳油基质中并应用于皮肤损害部位和周围(见以下实施例10)。在1周内每日局部应用所述抗体，所有BCC痕迹均消失，同时示出对周围皮肤无作用，因为正常皮肤没有所述受体。
诊断应用
在此举例描述在动物中使用特异的非功能性P2X7抗体及证实本发明的探针和方法在诊断大多数人和其它动物癌症中的一般应用。
在人和动物如猫和狗的前列腺组织中，当本发明的抗体用于诊断时，在不存在癌症或癌前损害的情况中无标记获得。然而，本发明的诊断方法能揭示通过H&E染色尚不可检测到伴随的形态学改变时的肿瘤性转化的最初迹象。
在这个阶段，必需染色首先在上皮细胞核中出现的受体单位。它们在疾病晚期迁移至细胞质中，在前列腺中发挥场效应，从而减少确定肿瘤的存在所需要活检的组织。在疾病晚期中，染色变得更限于顶部上皮。
相似地，人及其它哺乳动物如猫和狗的其它上皮细胞癌如乳腺癌，肺癌，结肠癌和皮肤癌，可以用边缘检测，因为在这些其它组织中不再有明显的场效应。
在这些其它组织如乳腺癌和子宫颈癌组织中见到相同的阶段发育，在胞质染色之前有核染色，而正常组织不染色。在乳腺组织中受影响的乳腺管和乳腺小叶易于检测，因为甚至在正常形态学提示没有癌症的情况下，乳腺中个别受影响的乳腺管系内的局部场效应也可被检测。相邻的未受影响的乳腺管表现为未染色。相似地，直接引流含有肿瘤的组织的受影响的淋巴结，通过受影响的淋巴细胞的场效应示出肿瘤迹象。因此，在没有任何转移的细胞播散至淋巴结时即可以检测岗哨淋巴结。
皮肤癌如基底细胞癌，鳞状上皮细胞癌和发育异常痣以及恶性黑素瘤示出在角质细胞和黑素细胞层中非功能性受体及通道成分(单体)的阳性染色，且具有清晰边缘，在所述清晰边缘之外的正常皮肤在表皮和深处的真皮内均无标记。
所有测试的哺乳动物癌细胞系如人前列腺(PC3)和乳腺(MCF7)及啮齿动物杂交瘤在细胞表面上非功能性受体均呈阳性，由此在这些癌细胞中编程性细胞死亡被抑制。这种诊断的一般应用通过小鼠杂交瘤细胞上的相同标记而示出受体在人之外其它类型动物中的遍在性。正常人B淋巴细胞示出功能性P2X7受体在细胞表面上表达，因此当需要时能够进行编程性细胞死亡，而恶性淋巴瘤患者的B淋巴细胞示出非功能性P2X7受体在细胞表面表达，因此减少编程性细胞死亡。
治疗应用
在试图进行编程性细胞死亡的癌细胞表面上表达这种明显遍在的P2X7非功能性构象子可用于治疗人和其它哺乳动物中的大多数癌症。实施例如下：
实施例8
将小鼠杂交瘤细胞在存在和不存在亲和纯化的非功能性P2X7的抗体的巨噬细胞基质中生长。细胞计数表明4天后，与纯化的正常IgG一起温育的细胞从1×104生长至7×104个，而与非功能性P2X7抗体一起温育的细胞计数仅为1.5×104个。
实施例9
这个实施例示出针对非功能性P2X7受体的表位产生的抗体在体内抑制肿瘤形成。
如上所示，在绵羊中针对非功能性P2X7表位产生的抗体能识别在小鼠杂交瘤细胞表面上的这一非功能性P2X7编程性细胞死亡受体。将这种抗体加入杂交瘤细胞培养物中延迟细胞的生长。小鼠杂交瘤细胞当注入制备的近亲杂交的小鼠品系中时导致肿瘤形成。
在这个实验中，将3组(10只/组)Balb-c雌性小鼠各接受以下处理：
第1组：将10只小鼠均在第1天腹膜内(IP)注射于0.5ml细胞培养基中的1×106个杂交瘤细胞。在第2天和第3天，它们接受腹膜内注射0.5ml细胞培养基。
第2组：将10只动物均在第1天腹膜内(IP)注射于含有1mg纯化的绵羊IgG的0.5ml细胞培养基中的1×106个杂交瘤细胞。在第2天和第3天，为它们注射含有1mg纯化的绵羊IgG的0.5ml细胞培养基。
第3组：将10只小鼠均在第1天腹膜内(IP)注射于含有1mg纯化的绵羊抗P2X7非功能性表位IgG的0.5ml细胞培养基中的1×106个杂交瘤细胞。在第2天和第3天，它们接受另一次注射含有1mg纯化的绵羊抗P2X7IgG的0.5ml细胞培养基。
将所有组的小鼠在第11天均处死，并检测肿瘤的存在情况。切除肿瘤并称重。
结果如下：
 组观察每只小鼠平均肿瘤重量(±SD)(g)           1：对照110只小鼠中有9只发现肿瘤3.98±1.12：对照210只小鼠均发现肿瘤2.93±0.93：实验组10只小鼠中有9只发现肿瘤1.13±0.4
方差分析示出各组之间肿瘤重量有显著差异(概率P<0.01)。用抗P2X7非功能性抗体处理的实验组与两个对照组有显著差异(P<0.01)。即用P2X7非功能性表位的抗体进行处理在实验动物中显著降低肿瘤量。
实施例10
以放置7天的液体或者悬浮于二甲硅油乳油基质中的形式，将特异性亲和纯化的抗体(明显改良特异性)应用于3个人基底细胞癌(BCC)中。在处理之后无BCC损害迹象可检测到，而对照皮肤完全不受影响，因为没有蛋白质靶位。
实施例11
将基底细胞癌(BCC)和鳞状上皮细胞癌(SCC)(原发肿瘤和继发肿瘤)形式的皮肤损害，包括复发的肿瘤和发育异常痣，在进一步的实验中使用在二甲硅油乳油基质或渗透性乳油基质中混合的纯化的抗体，亲和纯化或未亲和纯化的IgG治疗。因为在正常皮肤中没有非功能性受体，因此在任何类型的正常皮肤中检测到无副作用。所有类型的癌症均应答抗体的存在，这种应答通过在每日应用两次而在36小时至1周的期间内癌症消失而表现出。在直至12个月的时间内无复发。被治疗的肿瘤的大小从无凸起边界的3mm直径至5cm直径并最多4mm厚。共34个经组织学证实的肿瘤在1周的治疗期内成功消除。
据信对患者的应用一般包括产生人单克隆抗体(如herceptin)，由此内部癌症可以与局部应用同样有效地治疗。在细胞如淋巴细胞表面表达的所有正常的功能性P2X7需要保持不受抗体存在的影响以避免副作用。抗体因此应只结合在试图但不能引发编程性细胞死亡的细胞表面上表达的蛋白质。因此所有定向的细胞只是那些试图通过编程性细胞死亡杀死其自身的细胞，包括癌细胞。这些细胞尤其癌细胞上的P2X7受体是非功能性或ATP耗竭的状态。
主动免疫
主动免疫也可以用于治疗目的。在这种情况中，人或其它哺乳动物需要针对一个或多个特异性表位被免疫接种，所述表位的构象是模拟仅由在细胞表面上其非功能性(ATP耗竭的)形态的受体所采取的构象。应避免存在于功能性受体中的包括部分暴露表位形态的受体构象柔性。例如表位Gly200-Cys216的顺式构型在使用之前应通过适当方式固定。关于这一概念有一进一步的证据，即观察到用于产生抗体的许多动物包括小鼠，兔和绵羊已经不是无免疫应答的。这些动物无一再发生任何肿瘤。
在此例证了一个特异性实施例：
实施例12
方案：基于小鼠肿瘤模型进行实验。使用40只10周龄的雌性近亲交配的Balb C小鼠，分为2组，每组20只，第1组为实验组，第2组为对照组。
第1天：将第1组中20只实验动物注射0.1mg经MCS交联剂与白喉毒素缀合的肽表位(hP2X7序列200-216)。其包含大约0.02mg肽表位。将肽缀合物用QUILL A/DEAE Dextran/Montanide ISA 50V佐剂混合物乳化并在多个皮下和肌内注射部位注射0.1ml。
将对照组即第2组的20只小鼠在多个皮下和肌内注射部位注射无肽缀合物的0.1ml佐剂混合物。
第8天：将20只第1组小鼠注射0.01mg经MCS交联剂与白喉毒素缀合的肽表位(hP2X7序列200-216)(含有大约0.002mg的肽表位)。所述肽包含于磷酸盐缓冲盐水溶液中并根据方案与商购的CpGDNA佐剂ImmunEasy(得自Qiagen)混合。在每只小鼠的多个皮下和肌内注射部位注射0.1mL肽缀合物/佐剂溶液。
将20只第2组小鼠注射相似的磷酸盐缓冲盐水/CpG DNA佐剂混合物。这是在每只小鼠的多个皮下和肌内注射部位注射0.1ml所述混合物。
第26天：将20只第1组小鼠注射0.025mg经MCS交联剂与白喉毒素缀合的肽表位(hP2X7序列200-216)(含有大约0.005mg肽表位)，其包含于磷酸盐缓冲盐水溶液中并与Qiagen CpG DNA佐剂ImmunEasy混合。再次将0.1mL的混合物在多个皮下和肌内注射部位注射入每只小鼠中。对照组如在第8天所述进行注射。
第29天：所有小鼠均在一个皮下部位接受于0.1ml组织培养基中的肿瘤细胞注射，所述部位位于颈背部。所用的肿瘤细胞是由澳大利亚墨尔本的Walter and Eliza Hall Institute提供的小鼠纤维肉瘤细胞系，细胞系名称为WEHI 164。
将所述细胞以两种浓度注射入实验组小鼠和对照组小鼠中。将每组再分为两组。每个实验组和对照组的10只小鼠接受160000个细胞/小鼠，每组的另10只小鼠接受320000个细胞/小鼠。
将这个细胞系的细胞预先测试其细胞表面上非功能性P2X7表位的存在情况。这通过使用在绵羊中产生的特异性识别受体的非功能性形式的抗体进行。
第38天：将所有小鼠均处死并收集血液以分析非功能性P2X7表位的抗体。将所有小鼠均称重并切除肿瘤及称重。
结果
 组对照        160000个细胞实验        160000个细胞对照        320000个细胞实验        320000个细胞n10101010平均肿瘤重量(mg)        5992701147750SD307108633363SEM9734200115
对结果进行方差分析示出在对照组和治疗组之间及在低和高剂量组之间存在有统计学意义的差异(P＝0.0003)。较低剂量组示出较大差异，因为较低的肿瘤荷载对小鼠免疫系统的能力的作用较小。
ATP类似物
在以下培养实验中示出使用一种合成的激动剂有效结合P2X7孔上ATP结合位点，并使所述孔进入功能状态从而恢复受体功能以及控制P2X7提供给细胞的生长优势的效力。从CLL患者中收集的肿瘤B细胞与从正常患者收集的相似数目的相似细胞混合，用2.5mM的ATP处理4小时，没有肿瘤细胞保持下来，只剩正常细胞。在体内不适合使用ATP或者更具选择性的P2X7激动剂苯甲酰，苯甲酰ATP。因此，可以设计一种选择性ATP类似物以在受影响的细胞类型中恢复编程性细胞死亡过程，所述ATP类似物能以比ATP或BzATP更高的结合亲和性选择性结合P2X7。
工业实用性
本发明所有方面均可应用于人和动物医药和健康领域，具有能早期精确诊断疾病并有效治疗的潜力，在许多情况中其远比现有技术中利用的那些药物的侵害和伤害力低下。