同种异体脱钙骨基质材料纳米DBM的制备方法.pdf

本发明涉及生物材料技术领域，是一种骨移植用同种异体脱钙骨基质材料纳米DBM的制备方法。其步骤为：1)采用改良Urist法按常规将新鲜同种异体骨制成DBM骨块；2)将DBM骨块置于液氮冷冻粉碎机预粉碎，得DBM粉末；3)制备纳米DBM：将DBM粉末置于超细研磨粉碎机内，加入适量蒸馏水，在17℃～25℃下进行充分研磨，将研磨后所得的匀浆进行高速离心，弃上清，得纳米DBM，塑形、干燥后消毒备用。本发明制备方法简便，以同种异体骨为原料，取材容易；因为本方法制得的DBM为纳米结构，其作为骨移植替代材料，生物相容性好，可作为如骨形态发生蛋白等外源性促进骨再生生长因子的良好载体，具有良好的促进骨再生能力。

权利要求书
1.  一种同种异体脱钙骨基质材料纳米DBM的制备方法，步骤如下：
1)采用改良Urist法按常规将新鲜同种异体骨制成DBM骨块；
2)将DBM骨块置于液氮冷冻粉碎机预粉碎，得DBM粉末；
3)制备纳米DBM：将DBM粉末置于超细研磨粉碎机内，加入适量蒸馏水，温度保持在17℃～25℃，转速由800r/min升至1200r/min，充分研磨后将匀浆进行高速离心，弃上清液，得纳米DBM，干燥、分装、密封、消毒即可。

2.  按权利要求1所述的脱钙骨基质材料纳米DBM的制备方法，其特征在于用超细研磨粉碎机研磨时，转速和研磨时间依次为：①800r/min，5min；②1000r/min，10min；③1200r/min，10min；④1200r/min，15min×10次。

3.  权利要求1或2所述方法制得的纳米DBM在制备骨移植替代物中的应用。

说明书同种异体脱钙骨基质材料纳米DBM的制备方法
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，是一种骨移植用同种异体脱钙骨基质材料纳米DBM的制备方法。
背景技术
骨移植手术是临床中仅次于输血的常见组织移植术，各种原因造成的骨缺损的修复是骨科医生所需要面对的一个难题。另外，随着对疾病认识程度的加深外科技术的发展，脊柱外科、神经外科等对骨移植的需求也越来越大。
近10年来，骨移植替代物的研究是脊柱外科领域的热点之一。目前应用的骨移植替代材料主要有自体骨、异体骨和合成材料三类。理想的骨移植物应具备以下三个基本特点：1、含有骨诱导因子，可诱导多能干细胞向成骨细胞分化；2、含有骨传导基质，有利于骨修复过程中血管的长入，提供三维的立体骨架可引导骨修复朝一定的方向进行；3、含有骨生成细胞，有利于骨生成。自体骨因同时具备上述特点而至今仍是植骨融合的金标准，但是存在供骨量有限、延长手术时间、增加患者创伤以及供骨区长期麻木、疼痛等缺陷。合成性材料主要为羟基磷灰石(Hydroxyapatite HA)、磷酸三钙(TricalciumPhosphate TCP)、硫酸钙(Calcium Sulfate CS)、聚乳酸(Polylactic acid PLA)或这些材料的复合物。人工合成材料与自体骨、异体骨相比具有无毒、易于灭菌以及取用量无限制等优势，但其最大的缺陷是不具备骨诱导因子和骨生成细胞，仅具有骨传导性，易碎、剪切力小、抗骨折性能差。异体骨移植的优势在于良好的骨传导性，经过特定方法处理还可以保留骨诱导性，但其免疫排斥反应始终未得到根本解决，且可能导致细菌或病毒感染。
有一种由同种异体骨经特殊处理后制成的脱钙骨基质(DemineralizedBone Matrix，DBM)，采用改良Urist法制备，步骤为：
1.取材：将新鲜同种异体骨剔除骨膜和所有软组织并劈成骨块，刮除骨髓，用无菌净化水冲洗干净，置无水乙醇脱水、乙醚脱脂，通风干燥后置-80℃冰箱冻干备用。
2.脱脂：将上述骨块依次浸泡于无水乙醇、乙醚脱脂后，用蒸馏水反复冲洗去尽乙醚和溶解的油脂；
3.脱钙：以0.6N盐酸浸泡72小时，浸泡过程中不断搅拌，每12小时更换盐酸溶液一次，使所有的骨组织充分脱钙；用蒸馏水冲洗并蒸馏水浸泡过夜；充分去除骨块内的盐酸；将骨块依次浸泡于无水乙醇、乙醚脱脂后，置通风处自然挥发残余乙醚；
4.干燥、消毒：将上述骨块置37℃恒温干燥箱内干燥，三次称量恒重后将其分装密封；再用Co60照射消毒，照射剂量为20KGy。即为DBM骨块。
[详见Reddi AH，Huggins C.Biochemical sequences in the transformation ofnormal fibroblasts in adolescent rats.Proc Natl Acad Sci USA，1972，69：1601-1605.]
DBM同时具有骨诱导和骨传导作用，且具有天然骨的组成成分，可以作为许多生长因子的天然载体，具有良好的生物学特性，因此在植骨融合术中的应用得到深入研究。但DBM作为骨移植替代物还存在如下不足：1.分批处理时存在骨诱导和骨传导性能差异；2.虽然DBM的抗原性较弱，但在少数受体内会表现出严重的免疫排斥反应而最终导致骨移植的失败；3.生物力学性能较差，不适合用于需要承受重力和其他应力的部位。这使得DBM的使用范围大大减小。
近年来纳米技术的突破性进展，对生物医学产生了巨大影响。纳米技术可大大改善生物材料的表面特性和内部结构，使生物材料的生物学性能大大提高，将纳米技术应用于骨移植材料的研究已成为这一领域的研究热点。但至今未见运用纳米技术制成同种异体纳米脱钙骨基质材料(简称纳米DBM)成功用于骨移植的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种成骨诱导性及传导性好、抗原性低、可随意塑形的同种异体骨移植替代材料纳米DBM的制备方法。
本发明纳米DBM的制备方法，是在改良Urist法制备同种异体DBM骨块的基础上，进一步在液氮内超细研磨。步骤如下：
1)制备DBM骨块：采用改良Urist法按常规制备同种异体DBM骨块；
2)制备DBM粉末：将上述DBM骨块置于液氮冷冻粉碎机，在液氮的液面保持在稍高于研磨球的情况下进行预粉碎，得DBM粉末；
3)制备纳米DBM：将上述DBM粉末置于超细研磨粉碎机内，加入适量蒸馏水，在17℃～25℃下进行研磨，转速由800r/min升至1200r/min，充分研磨后将匀浆进行高速离心，弃上清液，得纳米DBM。
本发明方法制得的纳米DBM呈灰白色，经电镜检测，粒径为50～100nm，表面稍粗糙，有不规则纳米沟槽。纳米DBM质地均匀、坚韧，有一定延展性，可任意塑形。将其塑形为所需形状和大小的骨移植物后置37℃恒温干燥，密封包装，用Co60照射消毒后备用。
动物实验表明，鉴于纳米材料的特性，本发明制备方法制得的纳米DBM具有良好的生物相容性和植骨融合效果，是一种良好的骨移植替代材料。
采用本发明制备的纳米DBM在以下方面显著改善了DBM性能：
1)纳米DBM可按需要随意塑形，塑形干燥后所得任意形状的纳米DBM能满足临床上不同部位特殊形状的植骨需求；
2)应用纳米技术构建DBM，可大大减少因DBM自身脱钙所带来的生物力学下降的后果，更能满足临床上植骨的力学要求；
3)纳米DBM表面的不规则的纳米沟槽，对成骨细胞在其表面黏附生长及基质分泌有更显著的促进作用；
4)纳米DBM有更良好的生物相容性，无毒、无刺激，不引起免疫排斥反应。
本发明制备方法简便，以同种异体骨为原料，取材容易，可满足临床需要；所制得的纳米DBM可随意塑形，其作为骨移植替代材料使用方便；具有纳米结构的DBM材料，生物相容性好，不引起免疫排斥反应，从而解决了临床骨移植替代材料骨融合效果不佳的难题；其可作为如骨形态发生蛋白等外源性促进骨再生生长因子的良好载体，具有良好的促进骨再生能力。
具体实施方式
现结合实施例对本发明作详细描述。
实施例1：制备兔纳米DBM
1、采用改良Urist法制备兔DBM骨块，步骤如下：
1)取材：新西兰家兔1只(第二军医大学动物实验中心提供，下同)，按常规取新鲜兔骨100g，剔除骨膜和所有软组织并劈成骨块，刮除骨髓后用无菌净化水反复冲洗，置无水乙醇脱水2h，乙醚脱脂1h，通风处过夜干燥后，将骨块置-80℃冰箱冻干备用；
2)制备DBM骨块：
(1)脱脂：
依次将上述骨块浸泡于100ml无水乙醇2小时，去乙醇；加乙醚100ml浸泡12小时，去乙醚；用蒸馏水冲洗3次，去尽乙醚和溶解的油脂；
(2)脱钙：
将脱脂后的骨块以0.6N盐酸100ml浸泡72小时，浸泡过程中不断搅拌，每12小时更换盐酸溶液一次，以保证所有的骨组织充分脱钙；将骨块取出后用蒸馏水冲洗5次，再用蒸馏水浸泡过夜，以充分去除骨块内的盐酸；
(3)脱水、干燥、消毒：
将上述骨块依次置于无水乙醇100ml浸泡2小时，去除乙醇，置于乙醚100ml浸泡1小时，去乙醚，将其置于通风处自然挥发残余乙醚；再将其置37℃恒温干燥箱内干燥，三次称量恒重，得DBM骨块24g，将其分装密封，再按常规用Co60照射消毒后备用。
3)制备DBM粉末：
将上述DBM骨块与进口钢质研磨球一同放入液氮冷冻球磨粉碎机的容器内。将液氮充入容器内直至液面稍高于研磨球，以800RPM进行研磨2小时，同时保持液氮液面始终稍高于研磨球，得DBM粉末备用。
2、制备纳米DBM：
将上述DBM粉末置于超细研磨粉碎机(MICROS)内，加入适量蒸馏水进一步研磨粉碎，转速和研磨时间依次为：①800r/min，5min；②1000r/min，10min；③1200r/min，10min；④1200r/min，15min×10次；MICROS初始研磨温度为17℃，工作中最高温度为25℃，研磨时由循环水进行冷却降温。研磨结束后将匀浆进行高速离心(7500r/min)，取得纳米DBM沉淀，电镜扫描放大1000～20000倍，可见纳米DBM直径为50～100nm，表面略粗糙，有不规则纳米沟槽。将沉淀塑形成长条形后置于37℃恒温干燥箱进行干燥，使用Co60照射消毒备用。
实施例2：制备小鼠纳米DBM
小鼠20只(第二军医大学动物实验中心提供，下同)，雌雄不限，体重25～30g。按常规取骨50g，采用改良Urist法制备同种异体DBM骨块并制成纳米DBM，方法同实施例1，得纳米DBM 12g。
纳米DBM生物相容性实验
1.急性毒性实验
1)制备小鼠纳米DBM浸提液：
将实施例2制备的条状纳米DBM放入无菌生理盐水中，在37℃恒温水浴箱中持续浸泡120h(材料重量与浸提介质容量的比例为0.1g/ml)，得浸提液。
2)动物实验：
取健康成年小鼠10只，雌雄不限，体重25～30g，随机分为实验组和对照组，每组5只，实验组腹腔内注射浸提液(50ml/kg体重)，对照组腹腔内注射生理盐水(50ml/kg)。实验前后均用市售饲料饲养，观察注射后24、48、72h小鼠的精神状态、反应灵敏度、活动量、进食量、体重变化。结果见表1。
表4纳米DBM急性毒性实验结果

由表1可见，实验组5只小鼠，均未死亡，无瘫痪、呼吸抑制等反应，进食、活动、反应等一般情况良好，体重无明显变化，与对照组相比无明显差异，说明纳米DBM无毒。
2.热原实验
1)制备兔纳米DBM浸提液：用实施例1制备的条状兔纳米DBM制备浸提液，方法同急性毒性实验。
2)动物实验：
取新西兰家兔3只，雌雄不限，体重2.3～2.7kg，测纳米DBM浸提液注射前后体温。
注射前体温测试：用电子体温计测家兔肛温，每小时检测1次，连续4次，体温在38.6℃～39.1℃，且最大温差≤0.4℃，符合要求，正常饲养至第7天，再次测肛温2次，两次的间隔时间为1小时，取6次体温的平均值为正常体温。
注射后体温测试：第7天测体温后，分别从家兔耳缘静脉推注预热至37℃的DBM浸提液，注射剂量为每公斤体重10ml(10ml/kg)，饲养条件同前，于注射后前3小时内每小时测肛温1次，共3次，以3次中最高的一次体温减去正常体温，为该家兔的体温升高度数。结果见表2。
表5纳米DBM热原实验结果

由表2可见，家兔体温升高在0.21～0.35℃，根据中国卫生部“生物材料和医疗器材生物学评价技术要求”，符合热原检测规定，说明纳米DBM无致热作用。
3.溶血试验
1)制备稀释兔血：
静脉抽取新西兰家兔血5ml，加2％草酸钾0.25ml抗凝，吸出4ml加至0.9％生理盐水5ml中进行稀释，即为稀释兔血；
2)溶血实验：
实验组：取条状纳米DBM材料1份约5g，浸泡于含有10ml生理盐水的试管内，37℃水温中维持30min，然后加入0.2ml稀释兔血，缓慢混合，置37℃水浴60min；
阴性对照组：取3只试管，每只试管中加10ml生理盐水，再加入0.2ml稀释兔血，置37℃水浴60min；
阳性对照组：取3只试管，每只试管中加10ml蒸馏水，再加0.2ml稀释兔血，轻轻振动，使之完全溶血，置37℃水浴60min；
将上述各组的试管分别以2000r/min离心5分钟，取上清，再用分光光度计于波长545nm测吸光度，阴性和阳性对照组各取3只试管测得的平均值。
溶血程度按以下公式计算：溶血程度＝(实验组吸光度-阴性对照组吸光度)/(阳性对照组吸光度-阴性对照组吸光度)×100％。结果见表3。
表6纳米DBM体外溶血试验结果

由表3可见，纳米DBM浸提液对体外新鲜兔血溶血率为3.76％，在允许范围内(3％～5％)，说明纳米DBM无溶血作用。
纳米DBM的植骨融合效果实验
1.模型制作
取新西兰家兔18只，雌雄不限，体重2.5～3.0kg，随机分成纳米DBM组、DBM组、自体骨组3组，每组6只。麻醉前家兔禁食、禁水12小时，所有动物手术操作过程相同。用氯胺酮肌肉注射麻醉，剂量为每公斤体重50mg(以下用50mg/kg表示)。将家兔俯卧位固定于兔板上，术区常规剃毛、消毒铺无菌单，肌肉注射160万单位青霉素。按常规腰椎后正中纵向依次切开皮肤、皮下组织，沿棘突骨膜下向两侧剥离椎旁肌，显露双侧椎板和关节突关节。将椎板、小关节和横突表面去皮质准备植骨床，三组分别植入纳米DBM1g、DBM 1g、自体骨1g，逐层缝合切口。伤口不包扎。术后肌肉注射青霉素80万单位/日，连续3天。
手术前后所有家兔均单独分笼，允许自由活动，市售兔饲料喂养。
2.影像学观察
术后2周、4周、8周、12周分别按常规拍摄腰椎正、侧位X片及腰椎CT平扫。结果如下：
术后2周，纳米DBM、DBM、自体骨三组X片均见植骨区高密度影，CT扫描见植骨区高信号影，成骨量少，植骨块与椎板有明显间隙，尚未融合。三组无明显差异。
术后4周，X片显示纳米DBM、DBM和自体骨3组植骨区密度均较2周时增高，CT扫描见植骨区有部分成骨，植骨块与椎板间隙较模糊，但纳米DBM组较DBM组及自体骨组成骨量稍多。
术后12周，X片可见纳米DBM、DBM及自体骨三组均取得骨性融合，但纳米DBM组与其它两组相比，融合骨块大、质地均匀、密度高。说明纳米DBM融合效果更好。
3.组织学观察
术后4周、12周时，每组各随机抽取3只家兔，心脏内空气注射处死，切取椎板、关节突关节、横突和新形成的骨块制作标本，脱钙切片后进行HE染色。显微镜下观察结果表明，术后4周时，纳米DBM组和自体骨组可见新生骨和纤维骨痂形成，DBM组仅见纤维骨痂形成。12周时三组均达到骨性连接，但纳米DBM组新生骨中较其他两组具有更多的骨细胞。
结果表明，本发明制备的纳米DBM材料有良好的生物相容性和植骨融合效果，是一种更理想的骨移植替代材料。