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1、10申请公布号CN104244938A43申请公布日20141224CN104244938A21申请号201380018462X22申请日20130325CNCMI386520071115CNCMI39142008020512162370620120330EPA61K31/19200601A23L1/00200601A61P1/16200601A61K35/00200601C12R1/0020060171申请人雀巢产品技术援助有限公司地址瑞士沃韦72发明人FJ阿尔塞维拉B布尔其T比特勒S杜布克斯F法塔PA盖伊N帕日SAD莱兹74专利代理机构北京市中咨律师事务所11247代理人陈润杰黄革生54发。
2、明名称4氧代2戊烯酸和肝脏病症57摘要本发明一般涉及具有健康益处的组合物。特别而言，本发明涉及治疗或预防肝脏病症。本发明的主题是用于治疗或预防肝脏病症的包含4氧代2戊烯酸的组合物。本发明的另一主题是用于治疗或预防与肝脏中的II期酶活性不足有关的病症、包含4氧代2戊烯酸的组合物。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日2014093086PCT国际申请的申请数据PCT/EP2013/0562722013032587PCT国际申请的公布数据WO2013/144085EN2013100383生物保藏信息51INTCL权利要求书1页说明书16页附图7页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利。
3、申请权利要求书1页说明书16页附图7页10申请公布号CN104244938ACN104244938A1/1页21用于治疗或预防肝脏病症的包含4氧代2戊烯酸的组合物，其中所述组合物不用作药剂。2根据权利要求1使用的组合物，其中所述肝脏病症选自下组肝炎；肝纤维化；胆汁郁积性肝脏疾病；炎症性肝损伤；生物异源物质毒性，包括药物诱导的肝脏毒性和乙醇介导的肝脏毒性；肝性脑病；脂肪肝脏疾病；缺血再灌注肝损伤；肝衰竭；1型遗传性酪氨酸血症；肝细胞癌，包括由肝炎、黄曲毒素和化学毒素诱导的那些；环境敏感性、药物不耐受性、慢性疲劳综合征和纤维肌痛，归因于过量负载的毒素进入I期且II期途径低效；肝脏的病理性解毒及其组。
4、合。3根据权利要求1使用的组合物，其中所述病症与肝脏中的II期酶活性不足有关。4根据权利要求1使用的组合物，其中所述II期酶选自下组血红素氧合酶1、NADPH脱氢酶醌1、谷胱甘肽还原酶、谷氨酸半胱氨酸连接酶、谷胱甘肽S转移酶、UDP葡萄醛酸基转移酶及其组合。5根据前述权利要求中一项使用的组合物，其向肝脏中的I期酶的活性增加和/或肝脏中的II期酶的活性减少的对象施用。6根据前述权利要求中一项使用的组合物，其向需要肝脏解毒的对象施用。7根据前述权利要求中一项使用的组合物，其向过重和/或患有2型糖尿病的对象施用。8根据前述权利要求中一项使用的组合物，其中4氧代2戊烯酸获自天然来源。9根据前述权利要求。
5、中一项使用的组合物，其中4氧代2戊烯酸可获自短双岐杆菌CNCMI3865或短双岐杆菌ATCC15700。10根据权利要求9使用的组合物，其中所述短双岐杆菌CNCMI3865或短双岐杆菌ATCC15700在约60180、优选在约80160进行热处理。11根据前述权利要求中一项使用的组合物，其包含至少1MG/KG组合物、优选至少10MG/KG组合物、例如50MG至50G/KG组合物的量的4氧代2戊烯酸。12根据前述权利要求中一项使用的组合物，其以对应于2G至20MG4氧代2戊烯酸/KG体重、优选20G至2MG4氧代2戊烯酸/KG体重、例如40G至1MG4氧代2戊烯酸/KG体重的日剂量施用。13根据。
6、前述权利要求中一项使用的组合物，其口服或肠内施用。14根据前述权利要求中一项使用的组合物，其向人、宠物或家畜施用。15根据前述权利要求中一项使用的组合物，其中所述组合物选自下组食品组合物、食品添加剂、营养品、饮料、营养配方、管饲配方、在乳或水中重构的粉状组合物、和宠物食品组合物。权利要求书CN104244938A1/16页34氧代2戊烯酸和肝脏病症0001描述0002本发明一般涉及具有健康益处的组合物。特别而言，本发明涉及治疗或预防肝脏病症。本发明的主题是用于治疗或预防肝脏病症的包含4氧代2戊烯酸的组合物。本发明的另一主题是用于治疗或预防与肝脏中的II相酶活性不足有关的病症的包含4氧代2戊烯酸。
7、的组合物。0003肝脏是体内的最大器官。其充当体内化学工厂，执行很多生命机能从调控化学物质在体内的水平到生产制备血凝块的物质。由于其在如此多的体内过程中的关键作用，与肝脏功能相关的病症是不健康的主要原因。根据BRITISHLIVERTRUST，肝脏疾病是在英格兰和威尔士中排在心脏、癌症、中风和呼吸疾病后的第五大“杀手”HTTP/WWWBRITISHLIVERTRUSTORGUK，于2011年11月1日检索。由于人们可在70肝脏损伤下存活，所以存在来自肝脏疾病的患病率的巨大负担和来自肝相关的不健康的巨大的经济和人成本。0004肝脏是负责异源性物质的生物转化和随后的解毒的主要器官。异源性物质是存在。
8、于体内但通常不被产生或不预期存在于其中的化学物质。术语异源性物质还是指以高于平常浓度存在的物质。为了在尿液中排泄亲脂性异源性物质，它们必须被制成水溶性的。亲脂性化合物至水溶性化合物的生物转化通常在体内以两个阶段发生官能化，然后缀合。官能化使用氧以形成反应性位点并且被称为I期解毒。缀合导致将水溶性基团添加至反应性位点并且被称为II期解毒。存在许多催化II期解毒的酶，例如血红素氧合酶1、NADPH脱氢酶醌1、谷胱甘肽还原酶、谷氨酸半胱氨酸连接酶、谷胱甘肽S转移酶和UDP葡萄醛酸基转移酶。因为肝脏的解毒中的主要作用，故肝脏中这些II期酶的活性特别重要。0005用于治疗肝脏病症的现有治疗性干预是非常有。
9、限的。当病因可被鉴定时，那么去除该病因在预防和/或治疗中起重要作用。例如，当该病症归因于过度酒精消耗或肥胖时，那么戒酒或适当的生活方式和饮食变化是重要的。同样应建议人们采取预防措施以避免被病毒性肝炎感染。0006氧化应激和炎症在肝脏疾病的发病机理中起关键作用，故已提出靶向这些疾病的化合物用于治疗或预防肝脏病症。例如，已显示奥替普拉4甲基52吡嗪基3二硫杂环戊二烯硫酮DITHIOLETHIONE使小鼠肝脏免遭萘基异硫氰酸酯ANIT诱导的胆汁郁积以及降低大鼠中黄曲毒素诱导的肝癌发生。合成三萜系化合物2氰基3,12二氧代齐墩果1,9二烯28酸CDDO可与相应的甲基CDDOME和咪唑CDDOIM酯CD。
10、KLAASSEN等人,TOXICOLOGYANDAPPLIEDPHARMACOLOGY,244,57652010一起产生保肝作用。然而，这些化合物还可以产生不希望的作用；例如，奥替普拉的临床试验已显示显著副作用YZHANG等人,MOLECULARCANCERTHERAPEUTICS3,8858932004。因此具有可用于治疗或预防肝脏病症且没有现有技术中所述那些组合物的缺点的另外组合物将是可取的。特别而言，发现其活性成分从天然来源获得的有效组合物是高度可取的。0007因此，本发明的目的是改良技术状态，特别而言是提供可用于治疗或预防肝脏病症的替代组合物。发明人惊讶地看到，可由独立权利要求的主题实。
11、现本发明的目的。从属说明书CN104244938A2/16页4权利要求进一步开发本发明的理念。0008因此，本发明提供用于治疗或预防肝脏病症的包含4氧代2戊烯酸的组合物。0009本发明还提供4氧代2戊烯酸在制备用于治疗或预防肝脏病症的组合物中的用途。0010在本发明的范围内的“治疗”是指减少、抑制、减轻或改善。00114氧代2戊烯酸具有CAS号4743822和下列式00120013发明人惊讶地发现4氧代2戊烯酸激活NRF2。NRF2核因子红细胞源性2样2是细胞中抗氧化剂响应的主要调控因子。NRF2在肝脏中的显著性是公认的，因为无NRF2的小鼠的肝脏比野生型小鼠更易受各种氧化/亲电子应激诱导的病。
12、理学影响CDKLAASSEN等人,TOXICOLOGYANDAPPLIEDPHARMACOLOGY,244,57652010。转录因子NRF2在细胞的细胞溶质中发现并且结合于抑制剂KEAP1。当结合于KEAP1时，NRF2还被蛋白酶体快速降解，因此其基底浓度低。在氧化应激发生时，从KEAP1释放NRF2。NRF2浓度增加并且其易位到细胞核中。其刺激编码解毒酶的基因和抗氧化剂蛋白的表达，从而增加对氧化应激和亲电子剂的抗性。0014反应性氧种类和氧化应激在发展肝病中起重要的作用YPWANG等人,WORLDCHINESEJOURNALOFDIGESTOLOGY,18,190719112010。已知肝。
13、脏中NRF2的激活治疗或预防肝脏病症。例如，ALEKSUNESLMALEKSUNES等人,TOXICOLOGICPATHOLOGY,35,4594732007和KLAASSENCDKLAASSEN等人,TOXICOLOGYANDAPPLIEDPHARMACOLOGY,244,57652010的现有综述已将NRF2激活与病症的治疗相关联。包括胆汁郁积性肝脏疾病、炎症性肝损伤、扑热息痛肝脏毒性、黄曲毒素诱导的癌、化学物质诱导的癌发生、乙醇介导的肝脏毒性、肝纤维化、肝细胞细胞凋亡和重金属毒性，以及预防高脂肪饮食诱导的体重、脂肪质量和肝脂质蓄积的增加。0015NRF2的激活可通过药理学方法来实现。例如。
14、奥替普拉、CDDO、CDDOME和CDDOIM上文论述的导致经由NRF2激活的保肝作用CDKLAASSEN等人,TOXICOLOGYANDAPPLIEDPHARMACOLOGY,244,57652010。0016已描述存在于食物中的NRF2激活化合物。这些化合物包括姜黄素姜黄的一种主要组分US2009/0042980；于葡萄中发现的白藜芦醇CHENCY等人,BIOCHEMBIOPHYSRESCOMMUN2005年6月17日；33149931000；于花椰菜中发现的莱服硫烷FELBARBRY等人,JOURNALOFMEDICALPLANTSRESEARCH,5,473484,2011；于苹果中发。
15、现的槲皮素TANIGAWAS等人,FREERADICBIOLMED2007年6月1日；42111690703和于大豆和咖啡中发现的染料木黄酮；于羽衣甘蓝KALE中发现的山柰酚KAEMPFEROL；于草莓和覆盆子RASPBERRY中发现的鞣花酸ELLAGICACID；以及绿茶中发现的表儿茶素类黄酮BHJJUURLINK,CANADIANJOURNALOFPHARMACOLOGY,79,2662822001。如同激活NRF2，已均报道它们诱导II期酶。然而，NRF2激活化合物以低水平存在于这些食物中，故将需要大量天然来源物质提取显著量的NRF2激活化合物。姜黄素、白藜芦醇、莱服硫烷和槲皮素的非常低。
16、的水溶解度影响其生物利说明书CN104244938A3/16页5用度。因此，仍需要鉴定激活NRF2的其它化合物，特别而言可从天然来源以显著量获得的化合物和具有良好的水溶解度的化合物。0017已知NRF2介导II期酶的诱导。因此，发明人调查了4氧代2戊烯酸是否刺激编码II期酶的基因在肝脏中的表达。发明人发现4氧代2戊烯酸激活在肝脏细胞肝细胞中下列II期酶的基因表达血红素氧合酶1、NADPH脱氢酶醌1、谷胱甘肽还原酶、谷氨酸半胱氨酸连接酶、谷胱甘肽S转移酶和UDP葡萄醛酸基转移酶。0018肝脏中II期酶的活性不足已与如环境敏感性、药物不耐受性、肝脏的病理学解毒、慢性疲劳综合征和纤维肌痛的病症相关。。
17、包含4氧代2戊烯酸的组合物提供治疗这些病症的方法。0019已显示核转录因子BNFB的抑制预防急性和慢性肝损伤PMURIEL,JOURNALOFAPPLIEDTOXICOLOGY,29,911002009。NFB是慢性免疫响应和炎症性疾病中的关键转录因子PJBARNES等人,THENEWENGLANDJOURNALOFMEDICINE,336,106610781997。NFB被多种刺激物激活，包括细胞因子、蛋白激酶C活化剂、病毒、免疫刺激物和尤其是反应性氧种类FLUFT,CURRENTHYPERTENSIONREPORTS,3,61672001。NFB由REL蛋白的同二聚体和异二聚体组成。NFB。
18、的主要反式激活形式由P65和P50异二聚体组成。NFKB的激活涉及通过特异性IB激酶使抑制性蛋白IB磷酸化和随后蛋白质降解。游离NFB传入细胞核，在那里它结合于在炎症中涉及的许多基因的启动子区中的B位点。0020已鉴定NFB抑制剂，如糖皮质激素ADCOCK等人,AMERICANJOURNALPHYSIOLOGYCELLPHYSIOLOGY,268,C331C3381995，但是当全身给予时糖皮质激素具有内分泌和代谢副作用。也已报道肝素抑制NFBWO200119376，但是其具有潜在副作用，导致肝素诱导的血小板减少。0021发明人调查了4氧代2戊烯酸是否抑制NFB激活。使用暴露于促炎症性应激LP。
19、S和RHTNF的人结肠细胞和人单核细胞/巨噬细胞，他们发现4氧代2戊烯酸抑制NFB激活。0022发明人惊讶地发现4氧代2戊烯酸可由天然来源获得，例如获自一些经过热处理的细菌株。例如，当在90加热6小时时短双岐杆菌CNCMI3865和短双岐杆菌ATCC15700TM的细菌制品均产生4氧代2戊烯酸。发现在离心并过滤经过热处理的细菌制品后，4氧代2戊烯酸存在于可溶性部分中。0023短双岐杆菌CNCMI3865于2007年11月15日保藏于COLLECTIONNATIONALEDECULTURESDEMICROORGANISMESCNCM,INSTITUTPASTEUR,25RUEDUDOCTEURR。
20、OUX,F75724PARISCEDEX15,FRANCE。0024短双岐杆菌ATCC15700TM可商业获得，例如以ATCC15700的商标获自美国典型培养物保藏中心AMERICANTYPECULTURECOLLECTIONATCC,MANASSAS,VIRGINIA,USA。0025因此，本发明部分涉及用于治疗或预防肝脏病症的包含4氧代2戊烯酸的组合物，其中组合物不用作药剂。药剂是在药房中制备或分发且在医学治疗中使用的药物或药品于2012年07月17检索。本发明可以是用于治疗或预防肝脏病症的包含4氧代2戊烯酸的食品组合物。肝脏病症可选自下组肝炎；肝纤维化；胆汁郁积性肝脏疾病；炎症性肝损伤；。
21、生物异源物质毒性，包说明书CN104244938A4/16页6括药物诱导的肝脏毒性和乙醇介导的肝脏毒性；肝性脑病；脂肪肝脏疾病；缺血再灌注肝损伤；肝衰竭；1型遗传性酪氨酸血症；肝细胞癌，包括由肝炎、黄曲毒素和化学毒素诱导的那些；环境敏感性、药物不耐受性、慢性疲劳综合征和纤维肌痛，归因于过量负载毒素进入I期和低效II期途径；肝脏的病理学解毒及其组合。这些病症均具有氧化应激组分并且可通过肝脏中的NRF2激活常常与NFB抑制组合来治疗。例如，包含4氧代2戊烯酸的组合物可用于治疗或预防可通过肝脏中NRF2激活治疗的病症。0026肝炎是肝脏的炎症。一组被称为肝炎病毒的病毒引起全世界大多数情况的肝炎，但是。
22、其还可以归因于毒素、其它感染和自身免疫性疾病。0027肝纤维化是指坚韧的纤维癜痕组织在肝脏中的蓄积并且是对肝脏的炎症或直接毒性损害的一个结果。0028胆汁郁积是一种其中胆汁不能从肝脏流向十二指肠的疾患。其可作为很多药物的副作用获得。已显示NRF2活化剂可用于治疗胆汁郁积性肝脏疾病，这不仅通过降低由胆酸积聚引起的氧化应激，而且通过调节BSEP胆汁盐流出泵蛋白来动员和分泌毒性胆酸。0029肝细胞死亡可触发炎症性响应。这种炎症性响应的关键是促进反应性氧种类ROS形成。炎症是固有免疫响应于微生物感染和组织创伤的关键部分。然而，过度炎症性响应可导致炎症性肝损伤。0030许多化合物可证实对肝有毒性并且导致。
23、肝脏病症。此类肝脏毒素的实例包括脂多糖；药物如扑热息痛对乙酰氨基酚合成代谢类固醇、一些抗生素和糖皮质激素；乙醇；溴苯；四氯化碳；硫代乙酰胺；呋塞米；鬼笔环肽；砷；五氯苯酚PCB；吡唑；马来酸二乙酯；百草枯PARAQUAT；秋水仙碱；和过量的所谓的“重金属”如铁、锰、铝、汞、镉、铍和砷。0031肝性脑病是通常由肝移除的毒性物质在血流中蓄积造成的意识模糊、改变意识水平或昏迷的发生。0032脂肪肝脏疾病是其中甘油三酯脂肪的大液泡经由脂肪变性的过程于肝细胞中蓄积肝脏脂质蓄积的疾患。尽管具有多种原因，但是脂肪肝可被认为是在世界范围内在过度饮酒的人和肥胖的人具有或没有胰岛素抗性的作用中发生的单一疾病。脂肪。
24、的蓄积还可以伴有肝的进展性炎症。取决于酒精的贡献，脂肪肝可被称为酒精或非酒精脂肪肝脏疾病或酒精或非酒精脂肪变性。0033再灌注损伤是在缺血或缺氧的时期后在血液供给返回组织时造成的组织损伤。缺血再灌注肝损伤在许多临床环境中发生，包括肝手术、移植、和随后流体复苏的出血性休克，导致显著性患病率和死亡率。其特征在于伴有内源性抗氧化剂耗竭的显著性氧化应激。0034肝细胞癌也称为恶性肝细胞瘤是最常见类型的肝癌。大多数情况的肝细胞癌继发于病毒感染或肝硬化。肝细胞癌可以通过暴露于黄曲毒素而造成，黄曲毒素是遍及经济发展中国家的人类食物供给的普遍存在的污染物。黄曲毒素暴露使肝癌在被肝炎乙型病毒慢性感染的人中的风险。
25、成倍数增加。肝细胞癌还可以被化学毒素如除草剂、氯乙烯和砷所诱导。尽管化学癌发生是多因子的时，但是氧化应激是用于细胞转化的关键组分。0035肝衰竭是肝不能执行其正常合成和代谢功能作为正常生理学的部分。00361型酪氨酸血症，也称为肝肾酪氨酸血症，由缺少延胡索酰乙酰乙酸水解酶而造成。0037肝脏的病理性解毒是指一种其中I期和II解毒途径未处于平衡且I期相对于II说明书CN104244938A5/16页7期增加的疾患。环境敏感性、药物不耐受性、慢性疲劳综合征和纤维肌痛可归因于过量负载的毒素进入I期且II期途径低效。环境敏感性或多发性化学敏感性是由于人们不能耐受环境化学物质或一类生物异源化学物质而造成。
26、的慢性复发疾病。慢性疲劳综合征是一种或一组明显使人衰弱的医学病症，通常由持续疲劳伴有其它具体症状至少6个月而定义的病症，并非归因于持续劳累，并非通过休息来显著缓解，也不是由其它医学疾患引起。该病症还可以被称为肌痛性脑脊髓炎MYALGICENCEPHALOMYELITIS、病毒后疲劳综合征或慢性疲劳免疫机能紊乱综合征。纤维肌痛是特征在于慢性广泛疼痛和触诱发痛一种对压力强烈且痛苦的响应的医学病症。提供用于治疗或预防上文所述所有肝脏病症的组合物是有利的。0038本发明提供用于治疗或预防与肝脏中II期酶活性不足相关的病症、包含4氧代2戊烯酸的组合物。在本发明的范围内的“II期酶活性不足”包括活性不足以。
27、实现或保持II期解毒途径的正常健康的运行；活性不足以正确地平衡或补偿I期解毒途径的被干扰水平；和/或活性不足以通过处理异源性物质、包括药物、前药和毒素来控制、减少或预防慢性疾病。0039II期酶可选自下组血红素氧合酶1、NADPH脱氢酶醌1、谷胱甘肽还原酶、谷氨酸半胱氨酸连接酶、谷胱甘肽S转移酶、UDP葡萄醛酸基转移酶及其组合。能够治疗或预防与这些II期酶的活性不足相关的病症是有利的。0040血红素HEME氧合酶或血红素HAEM氧合酶是催化血红素降解的酶。这产生胆绿素、铁和一氧化碳。有三种已知血红素氧合酶同工型。血红素氧合酶1HO1是响应于如氧化应激、低氧、重金属和细胞因子的应激的可诱导同工型。
28、。NADPH脱氢酶醌1NQO1是胞质黄素蛋白。其催化内源性和生物异源化学物质的两个电子还原性代谢和解毒以及通过清除超氧化物来防御胞内氧化应激。谷胱甘肽还原酶GSR是还原谷胱甘肽二硫化物为谷胱甘肽的酶，其是重要的细胞抗氧化剂。谷氨酸半胱氨酸连接酶GCL是谷胱甘肽生物合成途径的第一酶。GCL执行在谷胱甘肽合成中的限速步骤。GCL是由两种蛋白质组成的异二聚体酶具有所有催化性质的谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚单位GCLC，和增加GCLC的催化效率的谷氨酸半胱氨酸连接酶调节剂亚单位GCLM。谷胱甘肽S转移酶GST家族的酶由很多胞质、线粒体和微粒体蛋白质组成。GST酶催化化学物质和亲电子种类与谷胱甘肽的缀合。。
29、这些缀合物随后被降解为巯基尿酸盐MERCAPTURATES并从体内排泄。UDP葡萄醛酸基转移酶UGT催化生物异源和内源性化学物质与葡糖醛酸II期解毒途径的主要部分的缀合。0041有利的是，可以向肝脏中I期酶的活性增加和/或肝脏中II期酶活性减少的对象施用本发明的组合物。I期酶和II期酶的活性应通常处于平衡，其中I期酶产生II期酶缀合并去除的反应性中间体。I期酶的活性增加且II期酶的活性没有相应增加、或II期酶的活性减少将破坏这个平衡并且产生较高水平的反应性中间体，后者可对DNA、RNA和蛋白质产生损伤。I期酶活性增加可例如由来自香烟烟雾的多环烃和来自在高温炙烤的肉的芳基胺引起。这些诱导CYP1。
30、A1和CYP1A2酶，导致I期活性大幅增加且II期酶未受或受极少诱导。抑制II期酶的常用机制是耗竭必要的辅因子。在人类中，硫酸化尤其易受由于受损的辅因子状态造成的抑制。硫酸储备必须通过饮食摄入含硫氨基酸或无机硫酸盐来保持。I期和II期酶活性之间的失衡可通过施用激活II期酶途径的组合物来弥补。说明书CN104244938A6/16页80042肝脏中的毒性负载增加可通过简单压制该系统并竞争解毒酶活性而导致解毒抑制。如果I期和II解毒途径变得过度负载，则毒素将在体内累积。这些毒素中的很多种是脂溶性的并且变得掺入体内的脂肪部分，它们可在体内存在数年。脑和内分泌腺是脂肪器官并且是脂溶性毒素蓄积的常见位点。
31、。这可产生脑功能障碍的症状和激素失调。因此，有利的是，本发明还提供向需要肝解毒的对象施用的包含4氧代2戊烯酸的组合物。0043过重或肥胖是熟知的病症，目前在我们社会中是个很大的负担。“过重”对于成年人被定义为具有体重指数BMI介于25至30之间。“体重指数”计算为重量以KG计除以身高以米计的比率的平方。0044“肥胖症”是一种其中在贮存于动物、特别是人和其它哺乳动物脂肪组织中的天然能量储备增加至与某些健康状况或增加的死亡率相关的点的疾患。“肥胖”对于成年人被定义为具有大于30的BMI。0045脂肪肝脏疾病作为与人口中的肥胖症和2型糖尿病的发病率增加相关的慢性肝脏疾病的最重要病因出现。非脂肪组织。
32、具有有限的供三酰甘油储存的容量，并且在营养过度的情况下，过量脂质蓄积，确定高水平的饱和脂肪酸，其可触发细胞功能障碍和/或细胞死亡，即为一种称为脂毒性的响应。该现象涉及反应性氧种类水平的升高。尤其，这种氧化还原失衡的特征在于谷胱甘肽显著耗竭LAVIDEL等人,TRENDSINMOLECULARMEDICINE,12,5555582006。谷胱甘肽的形成通过激活II期酶来促成，并且已知NRF2活化剂减少高脂肪饮食诱导的肝脏脂质蓄积增加SSHIN等人,EUROPEANJOURNALOFPHARMACOLOGY620,1381442009。因此，有利的是，本发明还提供向过重和/或患有2型糖尿病的对象施。
33、用的包含4氧代2戊烯酸的组合物。0046在本发明中，4氧代2戊烯酸是可获得的，例如获自天然来源。很多人关心在工业上由化工原料合成的材料的安全性，尤其在将摄入这些材料的情况下，并且优选获自天然来源的材料。0047令人惊讶的是，发明人发现，一些菌株提供4氧代2戊烯酸的天然来源。特别而言，发明人已发现4氧代2戊烯酸可获自短双岐杆菌CNCMI3865或短双岐杆菌ATCC15700TM短双岐杆菌的模式株。将细菌用作4氧代2戊烯酸的来源是尤其有利的，因为例如通过使用生物反应器可以生产大量4氧代2戊烯酸。因此，在本发明中4氧代2戊烯酸可以获得，例如获自短双岐杆菌CNCMI3865或短双岐杆菌ATCC1570。
34、0TM。0048该细菌可以在商业生产过程中在约60180、优选在约80160、例如在约110150进行热处理。发明人发现，在这些温度的热处理在可接受的时间内提供令人满意的4氧代2戊烯酸收率。不希望受理论束缚，应理解，热处理的温度越高4氧代2戊烯酸形成速率增加，而且使其降解速率增加。因此，这些温度在4氧代2戊烯酸的形成速率与其降解之间给出良好平衡。0049包含4氧代2戊烯酸的典型组合物可以包含至少1MG/KG组合物的量的4氧代2戊烯酸。一般而言，如果组合物包含至少10MG/KG组合物、例如在50MG至50G/KG组合物之间的量的4氧代2戊烯酸，则是优选的。0050待施用的最佳量的4氧代2戊烯酸可。
35、以由熟练技术人员容易地确定。0051在治疗性应用中，以足以至少部分治愈或阻止病症和/或其并发症的症状的量施用组合物。足以完成此的量被定义为“治疗性有效剂量”。对于此目的有效的量将取决于本说明书CN104244938A7/16页9领域技术人员已知的许多因素，如病症的严重性以及患者的重量和一般状况。在预防性应用中，向易受特定病症影响或另外处于特定病症风险的患者施用足以至少部分减少发展病症的风险的量的根据本发明的组合物。此类量被定义为“预防性有效剂量”。而且，精确量取决于许多患者特异性因素如患者的健康状况和重量。0052在本发明的框架中，4氧代2戊烯酸可以以治疗性有效剂量和/或以预防性有效剂量施用。。
36、本发明的组合物可以以对应于2G至20MG4氧代2戊烯酸/KG体重、优选20G至2MG4氧代2戊烯酸/KG体重、例如40G至1MG4氧代2戊烯酸/KG体重的日剂量施用。0053肝脏病症可影响动物和人，例如肝炎是动物中的常见肝脏疾病。猫中最常见肝脏病症之一是猫肝脏脂质沉积症，也称为猫脂肪肝综合征。小玩具狗也可易受肝脏脂质沉积症影响。脂肪肝脏疾病还常见于例如奶牛和小鸡的家畜中。以与人类似的方法，存在很多可损害动物肝脏的毒素，包括药物如扑热息痛、阿司匹林、合成代谢类固醇、化学疗法药物、一些抗生素、糖皮质激素、麻醉剂、寄生虫防治药物和保泰松。物种之间存在代谢机制的差异，导致对一些肝脏病症的特定易感性。例。
37、如，因为猫缺少II期酶葡萄醛酸基转移酶，所以它们缀合化合物如吗啡和苯酚的能力受到影响。狗对糖皮质激素药物特别敏感并且将在多剂疗法后在肝脏中形成典型的病变。0054因此，提供向人、宠物或家畜施用的组合物是有利的。在伴侣动物的情况下，此类治疗改良动物的整体生活质量，改良主人满意度并且改良主人与伴侣动物之间的联系。本发明的实施方案提供向人、宠物或家畜施用的组合物。0055组合物的性质并不特别受限。其可以是用于口服或肠道施用的组合物。组合物可以是例如选自下组食品组合物、食品添加剂、营养品NUTRACEUTICAL、饮料、营养配方、管饲配方、在乳或水中重构的粉状组合物、和宠物食品组合物。0056根据本发。
38、明的食品组合物具有不同特征，例如乳、酸奶、奶酪、发酵乳、乳基发酵产品、冰淇淋、基于谷物的产品或发酵的基于谷物的产品、乳基粉末、冷冻的或耐贮藏的饮料、糖果、动物饲料，特别对于家畜。0057食品组合物还可以进一步包含蛋白源、碳水化合物源、脂质源、矿物源和/或维生素源。蛋白质、碳水化合物、脂质、矿物和/或维生素的存在可具有数种优势。这些化合物通常促成最终产品的味道和口感。它们还为身体提供当其受肝脏病症影响时可急需的营养物。它们还允许将本发明的组合物配制成完整营养配方，以使无需另外的营养。0058溶于水中的化合物具有以多种方式、包括作为溶液口服来方便施用的优势。包含4氧代2戊烯酸的组合物可以是水基的，。
39、例如组合物可以包含溶解于水中的4氧代2戊烯酸。0059本领域技术人员应理解，他们可自由地组合本文公开的本发明的所有特征。特别而言，可以组合对于本发明的不同实施方案所述的特征。本发明的另外的优势和特征根据下列附图和非限制性实例是明显的。0060图1示出短双岐杆菌ATCC15700TM的粗制品OD50，在90加热6小时的标准化荧光素酶活性。结果在Y轴上被表示成技术上一式三份的平均SD。X轴值为样品的最终稀释度。0061图2示出短双岐杆菌CNCMI3865的粗制品OD50，在90加热6小时的标准说明书CN104244938A8/16页10化荧光素酶活性。结果在Y轴上被表示成技术上一式三份的平均SD。。
40、X轴值为样品的最终稀释度。0062图3示出用0至200M的剂量范围的4氧代2戊烯酸温育的AREC32细胞的NRF2诱导倍数棒和细胞活力百分比线。NRF2倍数诱导为在4氧代2戊烯酸存在下AREC32细胞的荧光素酶活性RLU与未暴露细胞的基底荧光素酶活性之间的比率。通过ATP定量测量的细胞活力表示为对照未治疗细胞的相对百分比。结果被表示为技术上一式三份的平均SD并且代表四个独立实验。0063图4示出用25至50V/V的剂量范围的短双岐杆菌CNCMI3865的“纯制品”温育的AREC32细胞的NRF2诱导倍数棒和细胞活力百分比线。其它细节如图3所示。0064图5示出与一定剂量范围的4氧代2戊烯酸温育。
41、24H的肝细胞中II期酶的基因的MRNA表达谱。结果代表以技术上一式两份执行的两个实验并且表示为平均SD。0065图6示出通过用LPS刺激的HT29克隆34细胞的上清液中测量SEAP实心棒和IL8条纹棒的产生而估算的NFB活性。细胞活力用线示出。将细胞暴露于一定剂量范围的4氧代2戊烯酸。结果被表示为两个以技术上一式三份执行的独立实验的平均SD。0066图7示出在一定剂量范围的4氧代2戊烯酸存在下LPS刺激24H的05G/MLTHP1蓝细胞的NFB活性棒和细胞活力线。结果被表示为两个以技术上一式三份执行的独立实验的平均SD。0067图8示出溶解于水中的4氧代2戊烯酸标准品的典型色谱图。较高的SR。
42、M与M/Z11369的跃迁反应相关联，而较低的SRM对应于M/Z11341的跃迁反应。保留时间以分钟X轴表示。信号强度Y轴以CPS表示。0068图9示出使用HPLCESIMS/MS、在90以圆形表示、120以三角形表示和140以正方形表示加热2、15、30和60分钟的短双岐杆菌CNCMI3865OD40的粗制品中的4氧代2戊烯酸定量。0069实施例1通过4氧代2戊烯酸和细菌部分的NRF2激活0070NRF2报告基因测定0071使用NRF2报告基因测定测量NRF2的激活。该测定基于来自CRX生物科学DUNDEE,SCOTLAND的AREC32细胞系，一种在ARE控制下含有荧光素酶基因构建体的稳定。
43、转染MCF7乳腺癌的细胞系。荧光素酶是消化荧光素并且产生荧光的酶。抗氧化分子如叔丁基氢醌TBHQ经由结合于ARE的NRF2激活而诱导荧光素酶转录。荧光素酶活性使用荧光素酶试剂盒形式PROMEGAMADISON,WI来确定。荧光素酶活性与NRF2激活成比例。0072通过细菌部分的NRF2激活0073使用三种细菌株来调查通过微生物的NRF2激活短双岐杆菌CNCMI3865NCC2950、短双岐杆菌CNCMI3914NCC466和短双岐杆菌ATCC15700TMNCC2791。短双岐杆菌CNCMI3914于2008年2月5日保藏于COLLECTIONNATIONALEDECULTURESDEMICR。
44、OORGANISMESCNCM,INSTITUTPASTEUR,25RUEDUDOCTEURROUX,F75724PARISCEDEX15,FRANCE。0074对于各株，将10ML含有005半胱氨酸的MRS琼脂用20L甘油储液接种并在说明书CN104244938A109/16页1137在厌氧条件中温育过夜以形成预培养物。然后通过用预培养物接种10ML含有005半胱氨酸的MRS制备另外的培养物最终OD600调节为01。将培养物在37在厌氧条件中温育16小时以形成P2培养物。将200ML含有005半胱氨酸的MRS用P2培养物接种最终OD600调节为01且将瓶在37在厌氧条件中温育16小时。007。
45、5测量OD600，将培养物以3300G离心10MIN且将细菌沉淀物用冷1XPBS磷酸盐缓冲液盐水洗涤两次且用1XPBS标准化至OD50。0076对于各细菌株，用两种方法获得细菌部分；“粗制品”和“纯制品”。0077如下获得细菌“粗制品”。将5MLOD50细菌制品在90于加热块来自TECHNE,STAFFORDSHIRE,UNITEDKINGDOM的DRIBLOCKDB3加热块中加热6小时。将经过加热的细菌制品在4以3300G离心10MIN，将上清液使用022M注射器滤器过滤且在4贮藏直至进一步分析。0078如下获得细菌“纯制品”。将5MLOD50细菌制品在4以3300G离心10MIN且将细菌沉。
46、淀物用5ML水重悬浮。在冷藏室中使用迷你珠敲打MBB装置破坏细菌细胞6个循环，以最大速度各90秒，每个循环之间停顿10MIN。将经破坏的细胞在4以3300G离心1H，将沉淀物用5ML1XPBS重悬浮并且于加热块中在90加热6小时。将经过加热的制品在4以3300G离心10MIN。将上清液使用022M注射器滤器过滤并在4储存直至进一步分析。0079通过使用斑点法铺板来确定“OD50悬液”的活菌计数，并使用具有下列设置的卤素水分分析仪METLERTOLEDO,GREIFENSEE,SWITZERLAND确定干重干燥温度为160且激活步阶干燥。0080为了确定NRF2激活，将样品在AREC32细胞于9。
47、6孔板中接种中使用10个独立稀释1/2、1/4、1/6、1/10、1/15、1/20、1/25、1/30、1/40和1/50测试且于5CO2/空气孵育箱中在37温育24小时。使用荧光素酶和来自PROMEGA的CELLTITERGLO试剂盒确定荧光素酶活性和细胞活力ATP测量。0081对于每次运行，用所有板中仅细胞的荧光素酶活性的平均值将所有孔的以相对光单位RLU测量的荧光素酶活性标准化。在测试的所有样品中，发现标准化程序不影响数据，这种观察允许不同运行中测量的样品的比较。0082对于每个样品，如下计算NRF2激活00831NRF2倍数诱导00840085NRF2倍数诱导对于筛选目的是非常有用的。
48、。然而，NRF2倍数诱导仅仅是定性测量，因为该计算不考虑样品稀释。00862每个样品的荧光素酶含量0087说明书CN104244938A1110/16页120088“每个样品的荧光素酶含量”还反映NRF2激活，但可区分两个以类似NRF2倍数诱导激活NRF2的样品，因为该计算考虑样品稀释。0089每个样品的荧光素酶含量通过反映NRF2激活分子的量而允许NRF2激活的半定量。0090表A标准化荧光素酶活性和短双岐杆菌ATCC15700TM的粗制品OD50，在90加热6小时的“每个样品的荧光素酶含量”的计算00910092每个样品的荧光素酶含量937E5X2187E60093科学符号94E5等于94。
49、X1050094表B标准化荧光素酶活性和短双岐杆菌CNCMI3865的粗制品OD50，在90加热6小时的“每个样品的荧光素酶含量”的计算00950096每个样品的荧光素酶含量104E06X25260E070097如表A和B中图示，两个粗制品短双岐杆菌ATCC15700TM和短双岐杆菌CNCMI3865具有类似的最大NRF2诱导，但是具有不同荧光素酶含量/样品值。每个样品的荧光素酶含量值的差异反映它们相应的NRF2激活模式参见图1和2。0098相比之下，短双岐杆菌CNCMI3914并未显著地激活NRF2，参见比较表C。0099表C来自三种不同短双岐杆菌株粗制品的比较结果说明书CN104244938A1211/16页1301000101表D来自三种不同短双岐杆菌株纯制品的比较结果010201030104通过4氧代2戊烯酸的NRF2激活0105将4氧代2戊烯酸ALFAAESAR参考号L02185在NRF2报告基因测定中测试。将不同剂量的4氧代2戊烯酸应用于AREC32细胞上24小时，然后如上所述定量荧光素酶活性。还使用细胞TITERGLO试剂盒ATP定量测量细胞活力。0106如图3中所示，发现4氧代2戊烯酸分子以剂量依赖性方式。