检测鹅细小病毒抗体的重组原核表达检测抗原及制备方法 (一)技术领域
本发明涉及的是一种基因工程制品的制备方法，具体地说是一种检测鹅细小病毒抗体的GPV-VP3基因重组原核表达检测抗原蛋白以及它的制备方法。
(二)背景技术
鹅细小病毒(Goose parvovirus，GPV)是鹅细小病毒感染(俗称小鹅瘟或Derzsy’s病)的病原。该病是养鹅业危害最大的传染病之一，感染鹅的死亡率在90-100％。自1956年发现本病以来，在全世界各养鹅国家和地区均有发生，造成巨大的经济损失。
过去对鹅细小病毒血清抗体的检测主要应用琼脂扩散试验及琼脂扩散抑制试验，这两种方法都是利用全病毒作为抗原进行检测，其不足一是在操作过程中不可避免造成散毒；二是检测灵敏度不高。
(三)发明内容
本发明的目的在于提供一种检测鹅细小病毒抗体时无散毒危险、稳定性好、灵敏度高、可实现工业化生产、成本低的检测鹅细小病毒抗体的原核表达检测抗原及其制备方法。
本发明的目的是这样实现的：
本发明的产品是一种鹅细小病毒衣壳蛋白VP3主要保护性基因重组原核表达蛋白，VP3基因含有1605个碱基，编码535个氨基酸残基，在原核表达时VP3基因与融合表达载体上的GST前导肽得到融合表达，融合蛋白地分子量大小为85KU。
其氨基酸序列共534个氨基酸残基：
MAEGGGGAMGDSSGGADGVGNASGNWHCDSQWMGNTVITKTTRTWVLPSYNNHIYKAITSGTSQDANVQYAGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNHWGIRPKSLKFKIFNVQVKEVTTQDQTKTIANNLTSTIQVFTDDEHQLPYVLGSATEGTMPPFPSDVYALPQYGYCTMHTNQNGARFNDRSAFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFTFDFEEVPFHSMFAHSQDLDRLMNPLVDQYLWNFNEVDSSRNAQFKKAVKGAYSTMGRNWLPGPKFLDQRVRAYAGGTDNYANWNIWSNGNKVNLKDRQYLLQPGPVSATHTEGEASSIPAQNILGIAKDPYRSGSTTAGISDIMVTEEQEVAPTNGVGWKPYGRTVTDKQNTTTAPKSSDLEVLGALPGMVWQNRDIYLQGPIWAKIPKTDGKFHPSPNLGGFGLHNPPPQVFIKNTPVPADPPVEYVHQKWNSYITQYSTGQCTVEMVWELRKENSKRWNPEIQFTSNFSNRTSIMFAPNETGGYVEDRLIGTRYLTQNL
本发明的产品是采用这样的方法来制作的：
(1)、设计扩增GPV-VP3基因的特异性引物；
(2)、通过PCR扩增获得VP3基因片段；
(3)、对VP3基因进行克隆、测序鉴定；
(4)、将VP3基因定向亚克隆至pGEX-6p-1原核表达载体；
(5)、VP3基因在大肠杆菌的诱导表达；
将重组表达质粒pGEX-6p-1-VP3转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS，进行诱导表达；
(6)、VP3基因表达蛋白的亲合层析纯化
①待纯化样的制备
离心收集表达细菌：离取沉淀，用PBS洗涤3次，沉淀用PBS溶液重悬起；
裂解菌体获取上清可溶性蛋白与包涵体沉淀：加入溶菌酶至终浓度为1％，然后进行超声处理，以4℃，10000g离心10min，取上清并加入1％的Trition X-100及DTT至终浓度为1mmol/L后于-20℃保存，沉淀即为包涵体；
包涵体的裂解及可溶性蛋白的回收：包涵体用包涵体洗涤液以洗涤2次，重悬沉淀，加入包涵体裂解液重悬，4℃处理2h，再超声处理20S，离心，除去不溶性沉淀，取上清即为可溶性包涵体蛋白；
②表达蛋白的纯化前复性
在包涵体溶解上清中立即加入终浓度为2％的Trition X-100，加入9倍体积的复性缓冲液，用0.01mol/L PBS透析48h，每12h更换一次透析液，取出复性的包涵体蛋白液，经聚乙醇-8000进行浓缩，加入2％的Trition X-100后，于-20℃保存备于纯化；
VP3基因表达蛋白的亲合层析纯化包括：
①用20ml PBS冲洗柱子；
②用6ml PBS+1％ Trition X-100进行平衡凝胶层；
③往柱内加样，每次加2ml样，加样后于27℃温箱中感作30min，然后才弃掉流出液，释放的速率要求1滴/30秒；
④用10ml PBS缓冲液冲洗柱子4次，以充分洗去大肠杆菌菌体杂蛋白，保证产品的纯度；
⑤用10ml洗脱液冲洗结合物，按1-2ml量于洁净Eppendorf管内收集洗脱液；
⑥纯化柱的再生与保存：用5倍于胶层体积的高盐溶液液洗2次，用5倍于胶层体积的20％乙醇洗2次，于4℃保存。
本发明GPV-VP3基因重组原核表达检测抗原，是利用基因工程技术，鹅细小病毒(GPV)主要抗原性基因VP3完整基因片段(自ATG至TAA)进行克隆的基础上，将其与原核表达载体pGEX-6p-1(是一种带有GST前导肽的融合表达载体)连接，成功转化大肠杆菌BL21表达系统进行诱导、表达的基因工程产品。该蛋白的表达形式是VP3/GST融合蛋白，表达的融合蛋白的分子量为85KU，将产品设计为融合表达一是考虑便于纯化，二是能增加表达蛋白的免疫原性。该基因编码蛋白是非糖基化蛋白，因此，经原核表达系统表达后的产品经Western blot、Dot-ELISA进行鉴定后均表明具有与天然蛋白相似的免疫反应活性。
采用本发明的方法生产的产品可用于：
①本产品可作为检测鹅细小病毒抗体的间接-ELISA及Dot-ELISA方法的检测抗原。
②可作为预防鹅细小病毒感染的基因工程亚单位疫苗。
本发明的产品优点体现在：
①由于该检测抗原是VP3基因重组原核表达蛋白，并非全病毒，因此应用该检测抗原进行检测时绝无散毒危险。
②作为ELISA抗原检测鹅细小病毒抗体，其检测灵敏度高，特异性强，无交叉反应。
③生产工艺先进、性能稳定，生产成本低，产品付加值高，适合工厂化生产，市场应用前景广。
(四)具体实施方案
1)设计扩增GPV-VP3基因的特异性引物；
2)通过PCR扩增获得VP3基因片段；
3)对VP3基因进行克隆、测序鉴定；
4)将VP3基因定向亚克隆至pGEX-6p-1原核表达载体；
5)VP3基因在大肠杆菌的诱导表达：
将重组表达质粒pGEX-6p-1-VP3转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS，进行诱导表达。
6)VP3基因表达蛋白的亲合层析纯化
(1)待纯化样的制备
离心收集表达细菌：离心取沉淀，用PBS(1mol/L，pH7.4)洗涤3次。将细菌沉淀用PBS溶液重悬起。
裂解菌体获取上清可溶性蛋白与包涵体沉淀：加入溶菌酶至终浓度为1％(1mg/ml)，然后进行超声处理，超声处理必须于冰浴条件下进行。离心取上清(即为可溶性蛋白)并加入1％的Trition X-100及1mmol/L的DTT至终浓度为1mmol/L后于-20℃保存，以备纯化。沉淀即为包涵体。
包涵体的裂解及可溶性蛋白的回收：获得的不溶性包涵体沉淀部分用包涵体洗涤液(30％蔗糖，100mol/L NaCl，50mmol/LTris，pH8.0，1％ Trition X-100)洗涤2次，重悬沉淀，加入包涵体裂解液(1.5％(m/v)N-十二烷基肌氨酸钠，25mmol/L三乙醇胺，1mmol/L EDTA，pH8.0)重悬，4℃处理2h，再超声处理20S，以12000r/m，4℃离心20min，除去不溶性沉淀，取上清即为可溶性包涵体蛋白。可溶性上清按上述方法处理。
(2)表达蛋白的纯化前复性
在包涵体溶解上清中立即加入终浓度为2％的Trition X-100，加入9倍体积的复性缓冲液(0.8mmol/L氧化型谷胱苷肽GSSH，2mmol/L还原型谷胱苷肽GSH，2mmol/L EDTA，20mmol/L Tris，pH8.5)，用0.01mol/LPBS(pH7.4)透析48h，每12h更换一次透析液。取出复性的包涵体蛋白液，经聚乙醇-8000进行浓缩，加入2％的Trition X-100后，于-20℃保存备于纯化。
(3)表达蛋白的亲合层析纯化流程
①用20ml PBS冲洗柱子，以洗去保存液；
②用6ml PBS+1％ Trition X-100进行平衡凝胶层；
③往柱内加样，加样时可用小滤器(0.22μm孔径)过滤上样，每次上样2ml，并在27℃条件下感作30min后缓慢弃掉流出液，释放流出液的速率为1滴/15秒。
④用10ml PBS缓冲液冲洗柱子2次；
⑤用10ml洗脱液冲洗结合物，按1-2ml量于洁净Eppendorf管内收集洗脱液；
⑥纯化柱的再生与保存：用高盐再生液(1mol/L PBS+3molo/L NaCl)洗涤凝胶2次可以再生利用。为了长期保存，用5倍于胶层体积的PBS液洗2次，用5倍于胶层体积的20％乙醇洗2次，于4℃保存。
(4)表达蛋白含量的测定
采用紫外线吸收法定量蛋白质。将待检样品适当稀释后，同时测定该蛋白质溶液在λ260nm和λ280nm处的OD值，同时用稀释液作为空白对照，按下列公式计算蛋白含量：
(1.46×A280 0.74×A260)×稀释倍数＝(mg)/ml蛋白含量
VP3/GST纯化蛋白的质量浓度为≥5.0mg/ml。