一种SARS冠状病毒诊断基因芯片.pdf

本发明涉及一种SARS冠状病毒诊断基因芯片，属于生物技术领域。本发明的芯片用确定的12个SARS冠状病毒特异的cDNA片段作为检测位点，利用12对PCR引物制备探针DNA，另外利用位于探针位点外侧序列的12对PCR引物作为检测引物，通过PCR扩增待检测样本cDNA，标记后与芯片杂交，根据杂交信号判断样本中是否有SARS冠状病毒。该芯片所用探针制备引物和检测引物也可单独用于PCR检测引物；该芯片也可以用于食品，环境以及检疫中的SARS冠状病毒的检测。本发明具有以下优点：1.减少因个体差异引起的漏检2.检测灵敏度和特异性高；3.消除系统误差和控制检测系统污染等。该技术还可用于食品，环境以及检疫中的SARS冠状病毒的检测。

1、  一种SARS冠状病毒诊断基因芯片，其特征在于该.芯片确定了12个SARS冠状病毒特异的cDNA片段作为检测位点，利用12对PCR引物制备探针DNA，另外利用位于探针位点外侧序列的12对PCR引物作为检测引物，通过PCR扩增待检测样本cDNA，标记后与芯片杂交，根据杂交信号判断样本中是否有SARS冠状病毒。

一种SARS冠状病毒诊断基因芯片
技术领域：
本发明涉及一种SARS冠状病毒诊断基因芯片，属于生物技术领域。
背景技术：
非典型性肺炎即严重呼吸道感染综合症(SARS)是一种传染性非常强的传染性疾病，2003年2-5月的短短3个多月，在全世界范围内广泛流行，造成近8000人感染发病，造成600多人死亡，严重威胁人类健康和生命安全，引起世界卫生组织和各国政府的高度重视。
有效的检测相关病原物是有效控制该疾病流行的基础。由于该病病原物是新的病原物，流行之初无法检测，只能根据临床症状进行判断，导致很多病毒携带者到处流动而传染给其他人。同时有的病人症状与“非典”相似，也被怀疑是“非典”而与真正的“非典”隔离在一起而感染上“非典”。随后应急产生的一些免疫诊断方法和PCR方法都因技术本身的限制，致使检测准确性低。因此一种有效的检测方法的建立显得特别的重要。基因芯片技术是一种新兴的生物技术，它在生物学各领域有广泛的应用前景，临床诊断是其应用领域之一，利用基因芯片诊断SARS病毒可以弥补现有诊断方法的不足。
SARS病毒的病原物经过世界几个国家的科学家地努力，在2个月左右的时间内测定了其核酸序列，发现全长序列29.4Kb，与现有冠状病毒的核酸序列同源性较小(＜10％)。根据已经公布的核酸序列，研制诊断基因芯片成为可能。
发明内容：
本发明的.芯片用12个SARS冠状病毒特异的cDNA片段作为探针，并设计了芯片探针制造的PCR引物和和芯片使用所用的检测引物序列(详见序列表)，按现有技术(本发明人申请的，申请号021280681、02128069X)制造基因芯片和检测应用。该芯片所用探针制备引物和检测引物也可单独用于PCR检测引物；该芯片也可以用于食品，环境以及检疫中的SARS冠状病毒的检测。
本发明的优点：
1.基因芯片诊断由于多位点可以有效地减少因个体差异引起的漏检。
2.本产品的检测灵敏度较PCR方法的检测限降低2-3个数量级，可达10²-10³/ml病毒分子。
3.由于有足够的容量空间，可以设置各种对照，消除系统误差和控制检测系统污染。
4.检测过程中，通过聚乙二醇沉淀，使病毒得以浓缩，提高检测灵敏度。
附图说明：
附图为点阵图。图中I、II、III、IV为阳性对照点，其余编号为检测位点号。
附件包含芯片上的12个检测位点的检测序列(共12条)、探针引物(共24条)和检测引物(共24条)。使用时位点X(X表示1、2、3.....12)检测序列，用位点X探针引物制备探针，用位点X检测引物进行检测。
具体实施方式：
本发明的实施按如下程序进行：
1.利用internet网络搜索SARS冠状病毒核酸序列，并利用NIH网站上的在线工具检出SARS冠状病毒基因组中不同于其它冠状病毒的核酸序列，根据获得的SARS病毒特异序列，设计了12个检测位点，通过扩增标准SARS冠状病毒cDNA获得cDNA片段；
2.克隆PCR扩增的SARS冠状病毒cDNA片段，测序确定克隆的正确性。共获得12个序列正确的克隆，用PCR扩增相应的片段作为芯片制造的探针DNA；
3.按如下工艺制造芯片：
1).用探针制备引物(引物序列见附件probe make primer)进行PCR扩增，克隆得SARS特异cDNA，其产物用乙醇沉淀，1XTE溶解，并用电泳方法定量；
2).定量的PCR产物用3×SSC稀释至0.3ug/ul；
3).用点样仪点样在用L-多聚赖氨酸包被处理的载玻片上，点阵图见附图，用紫外交联法固定DNA在载玻片上。
4.使用时，采用现有的方法(见专利申请号：021280681，02128069X)，但由于不同的用途，取样方法和制备方法也不同。
(1)取样：
1)临床样品：用灭菌的生理盐水约5ml给病人漱口，漱口时仰着脖子，洗上呼吸道约10秒钟，吐出漱口水用50ml离心管收集漱口水；
2)蔬菜及水果：用生理盐水约5ml洗待检测样品的表面，洗下的溶液收集于50ml的离心管中；
3)其他食物，用约5ml生理盐水与待检样品约1-2克，一起搅拌。10000g离心，取上清液于50ml离心管中。
(2).样品处理：上述含病毒的溶液加等体积的1.6mol/L的生理盐水配置的13％聚乙二醇8000，混匀，10000g离心10分钟，去上清，沉淀加入100ul生理盐水悬浮沉淀物；
(3)用常规的Trizol试剂分离RNA，并用常规的一步RT-PCR法进行PCR扩增，检测引物见附件(detection primer)。
(4)按现有的芯片检测专利021280681，02128069X方法检测核酸的存在性。
5.按上述检测程序，对标准样本进行测试100％检测可靠。
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gaacaacatt gcctaaaagg cttctacgca gagggaagca gaggcggcag tcaagcctct    240
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