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1、10申请公布号CN104152400A43申请公布日20141119CN104152400A21申请号201410401158X22申请日20140815C12N5/07120100171申请人中国农业科学院特产研究所地址130112吉林省长春市净月开发区聚业大街4899号72发明人李春义王文英孙红梅74专利代理机构北京爱普纳杰专利代理事务所特殊普通合伙11419代理人何自刚王玉松54发明名称一种鹿骨膜条件培养液的制备方法及应用57摘要本发明公开了一种鹿骨膜条件培养液的制备方法及应用，属于细胞组织培养技术领域。本发明所提供的方法是将鹿骨膜组织切片后置于插入皿中，向插入皿中加入培养基培养，培养后。
2、收集培养液，过滤后获得条件培养液；所述插入皿由上室和下室组成，培养时插入皿放入多孔培养板中。本发明所提供的方法能够使鹿骨膜组织在离体培养条件下分泌活性物质，进而收集、分析所分泌的活性物质，解决了离体培养不能为组织提供立体的培养环境、培养过程中二氧化碳浓度很难控制以及不能随时收集条件培养液的难题，同时本发明的方法还有效提高培养组织的成活率，并缩短了组织的培养时间，且能够随时收集条件培养液。51INTCL权利要求书1页说明书4页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页附图2页10申请公布号CN104152400ACN104152400A1/1页21一种鹿骨膜。
3、条件培养液的制备方法，其特征在于，将鹿骨膜组织切片后置于插入皿中，向插入皿中加入培养液培养，培养后收集培养液，过滤后获得条件培养液；所述插入皿底部由04M孔径的涤纶树脂制成，培养时放入多孔细胞培养板中，将培养空间分为上室和下室，上室和下室之间有培养液联通。2权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤如下1利用动物组织切割器将活体采集的鹿骨膜组织切割成薄片，获得骨膜组织切片；2将步骤1所得的骨膜组织切片，放入用鼠尾胶原或I型胶原包被的插入皿中，再将插入皿放到多孔培养板的孔中；3向插入皿和培养板中加入液体培养液培养，培养完成后收集培养液；4用滤膜过滤步骤3所得培养液，获得条件培养液。3权利要求2所述。
4、方法，其特征在于，步骤1所述骨膜组织切片，长26MM，宽152MM，厚0217MM。4权利要求2所述方法，其特征在于，步骤2所述骨膜组织切片放入插入皿，是将10100片骨膜组织切片放入到用鼠尾胶原或型胶原包好的插入皿中；所述插入皿底部由孔径为04M的涤纶树脂制成，放入培养板后，将培养空间分为上室和下室，且上室和下室之间有培养液联通；所述多孔培养板，培养孔的数量为24，12，或6个。5权利要求2所述方法，其特征在于，步骤3所述液体培养液为神经培养液，具体组成为NEUROBASALMEDIUM加入2的B27SUPPLEMENT再加1的抗生素。6权利要求2所述方法，其特征在于，步骤3所述培养，培养温。
5、度为37，CO2浓度为5，饱和湿度，培养时间为24D。7权利要求2所述方法，其特征在于，步骤4所述滤膜过滤，是利用022M的滤膜进行过滤。8权利要求2所述方法，其特征在于，具体步骤如下1利用动物组织切割器将活体采取的鹿骨膜组织切割成长26MM，宽152MM，厚0217MM的薄片，获得骨膜组织切片；2将10100片步骤1所得的骨膜组织切片，放入包被好的插入皿中，再将插入皿放到多孔培养板的孔中；3向插入皿中加入神经培养液，于37、5CO2浓度，饱和湿度的条件下培养24D，培养完成后收集培养液；4利用022M的滤膜过滤步骤3所得培养液，获得鹿骨膜组织条件培养液。9权利要求18所述方法，用于制备鹿骨膜。
6、组织条件培养液。权利要求书CN104152400A1/4页3一种鹿骨膜条件培养液的制备方法及应用技术领域0001本发明涉及一种鹿骨膜条件培养液的制备方法及应用，属于细胞组织培养技术领域。背景技术0002鹿茸是目前所知的唯一能够完全再生的复杂哺乳动物器官，其再生包括软骨、骨、皮肤、血管和神经的再生。其中对神经再生的研究发现鹿茸神经的再生和快速生长主要由角柄骨膜来源的生物分子的刺激实现的。而要想分析这些角柄骨膜来源的生物分子，必须建立一个离体的培养体系。0003在细胞培养过程中，细胞可能会分泌活性物质到培养液中，这种培养过某种细胞或组织以后，含有细胞或组织分泌物的培养液就叫做条件培养液。目前对细胞。
7、条件培养液的研究较多。由于组织培养的复杂性，对组织条件培养液的制备体系很少，尤其是骨膜组织条件培养液的制备技术尚未见报导。0004但细胞条件培养液只能反映离体条件下，单个细胞分泌活性物质的情况，而活体条件下，细胞的任何活动都离不开细胞间质，所以单纯的细胞条件培养液并不能反映组织中细胞与其间质相互作用的情况下，分泌活性物质的情况。现有技术中组织条件培养液的制备方法多是利用三角瓶，再向三角瓶中充满二氧化碳气体进行密封培养。这种培养不能为组织提供立体的培养环境，而且培养过程中二氧化碳浓度很难控制，培养过程中不能随时收集条件培养液。发明内容0005为解决上述问题，本发明提供了一种鹿骨膜条件培养液的制备。
8、方法，所采取的技术方案如下0006本发明的目的在于提供一种鹿骨膜条件培养液的制备方法，该方法是将鹿骨膜组织切片后置于插入皿中，向插入皿中加入培养基培养，培养后收集培养液，过滤后获得条件培养液；0007所述插入皿底部由孔径为04M的涤纶树脂材料制成，培养时插入皿放入多孔培养板中，这样就将培养空间分成了上室和下室，且上室和下室之间有培养液的沟通0008所述制备方法的步骤如下00091利用动物组织切割器将活体采集的鹿骨膜组织切割成薄片，获得骨膜组织切片；00102将步骤1所得的骨膜组织切片放入包被好的插入皿中，再将插入皿放到多孔培养板的孔中；00113向插入皿和培养板中加入液体培养基培养，培养完成后。
9、收集培养液；00124用滤膜过滤步骤3所得培养液，获得条件培养液。0013步骤1所述骨膜组织切片，长26MM，宽152MM，厚0217MM。说明书CN104152400A2/4页40014步骤2所述骨膜组织放入包被好的插入皿，是将10100片骨膜组织切片放入到用鼠尾胶原或I型胶原包被的插入皿中；所述插入皿将培养空间分为上室和下室，上室和下室通过04M孔径的涤纶树脂膜联通；所述多孔培养板，培养孔的数量可以为24，12，或6个。0015步骤3所述液体培养液为神经培养液，具体组成为NEUROBASALMEDIUMGIBCO加入2B27SUPPLEMENTLIFETECHNOLOGIES再加入1抗生素。
10、GIBCO。0016步骤3所述培养，培养温度为37，CO2浓度为5，湿度为饱和湿度，培养时间为24D。0017步骤4所述滤膜过滤，是利用022M的滤膜进行过滤。0018所述方法的具体步骤如下00191利用动物组织切割器将活体采集的鹿骨膜组织切割成长26MM，宽152MM，厚0217MM的薄片，获得骨膜组织切片；00202将10100片步骤1所得的骨膜组织切片，放入用鼠尾胶原包被的插入皿中，再将插入皿放到多孔培养板的孔中；00213向插入皿和培养板中加入神经培养液，于37，CO2浓度为5，湿度为饱和湿度的条件下培养24D，培养完成后收集培养液；00224利用022M的滤膜过滤步骤3所得培养液，获。
11、得鹿茸骨膜组织条件培养液。0023所述方法用于制备鹿茸骨膜组织条件培养液。0024本发明所取得的有益效果如下00251本发明所提供的方法能够使鹿骨膜组织在离体培养条件下分泌活性物质，进而收集、分析所分泌的活性物质，解决了活体条件下很难分离、分析某些组织所分泌的含量极少的，分子很小的而又起到很关键作用的活性物质的难题。00262本发明所提供的方法能够有效提高培养组织的成活率，并缩短组织的培养时间。00273本发明所提供的方法可以实现随时收集条件培养液和更换新鲜培养液，操作十分方便。附图说明0028图1为本发明所用动物组织切割器；0029A为切割台；B为切割器，由20个左右的刀片平行放置，每两个刀。
12、片中间用07MM厚的隔板间隔开；C为装卸扳手。0030图2为本发明所用插入皿和多孔细胞培养板；0031A，为与24孔细胞培养板结合使用的插入皿，其底部为孔径04UM的涤纶树脂膜。使插入皿和细胞培养板间有液体的联通；B，为与6孔细胞培养板结合使用的插入皿，其底部为孔径04UM的涤纶树脂膜，插入皿和细胞培养板间有液体的联通。0032图3为实施例14条件培养液促使SKNSH细胞向神经元分化的结果；0033A，实施例1；B，实施例2；C，实施例3；D，实施例4。0034图4为实施例14条件培养液促进大鼠背根神经节轴突向外生长的结果；0035A，实施例1；B，实施例2；C，实施例3；D，实施例4。说明书。
13、CN104152400A3/4页50036图5为实施例14条件培养液促进大鼠背根神经节的神经元轴突生长的结果；0037A，实施例1；B，实施例2；C，实施例3；D，实施例4。具体实施方式0038下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。0039实施例10040本发明提供了一种利用三角瓶培养鹿角柄骨膜组织制备条件培养液的方法，步骤如下00411利用动物组织切割器图1将活体采集的鹿骨膜组织切割成长6MM，宽2MM，厚17MM的薄片，获得骨膜组织切片；00422将20片步骤1所得的骨膜组织切片，放入三角瓶中。00433向三角瓶中加入神经培养液，充入饱和浓度的CO2浓度，塞紧三。
14、角瓶，放到培养箱中培养4D，培养完成后收集培养液；00444利用022M的滤膜过滤步骤3所得培养液，获得鹿茸骨膜组织条件培养液。0045实施例20046本发明提供了一种鹿生茸区骨膜组织条件培养液的制备方法，步骤如下00471利用动物组织切割器将活体采集的鹿生茸区骨膜组织切割成长3MM，宽2MM，厚07MM的薄片，获得骨膜组织切片；00482将15片步骤1所得的骨膜组织切片均匀地放入用鼠尾胶原包被好的插入皿中，再将插入皿放到24孔培养板图2A的孔中；00493向插入皿和24孔培养板中，即培养的上室和下室中分别加入神经培养液，于37、CO2浓度5，饱和湿度的条件下培养3D，培养完成后收集培养液；0。
15、0504利用022M的滤膜过滤步骤3所得培养液，获得鹿茸骨膜组织条件培养液。80保存备用。0051实施例30052本发明提供了一种鹿角柄骨膜组织条件培养液的制备方法，步骤如下00531利用动物组织切割器将活体采集的鹿角柄骨膜组织切割成长3MM，宽2MM，厚07MM的薄片，获得骨膜组织切片；00542将50片步骤1所得的骨膜组织切片，放入用鼠尾胶原包被好的插入皿中，再将插入皿放到6孔培养板的孔中；00553向插入皿和6孔培养板图2B中加入神经培养液，于37、CO2浓度5，饱和湿度的条件下培养3D，培养完成后收集培养液；00564利用022M的滤膜过滤步骤3所得培养液，获得鹿茸骨膜组织条件培养液。。
16、0057实施例40058本发明提供了一种鹿生茸区骨膜组织条件培养液的制备方法，步骤如下00591利用动物组织切割器将活体采集的鹿生茸区骨膜组织切割成长3MM，宽2MM，厚07MM的薄片，获得骨膜组织切片；00602将60片步骤1所得的骨膜组织切片，放入用型胶原包被好的插入皿中，再将插入皿放到6孔培养板的孔中；说明书CN104152400A4/4页600613向插入皿和6孔培养板中加入神经培养液，于37、CO2浓度5，饱和湿度的条件下培养3D，培养完成后收集培养液；00624利用022M的滤膜过滤步骤3所得培养液，获得鹿茸骨膜组织条件培养液。0063实施例50064本实施例对实施例14所制备的条。
17、件培养液进行活性检测0065以下实验为利用本发明的实施例14所获得的条件培养液分别培养SKNSH细胞、大鼠15日龄胚胎背根神经节以及背根神经节神经元，结果如图35所示。其中图3为实施例14条件培养液促使SKNSH细胞向神经元分化的实验结果；图4为实施例14条件培养液促进大鼠背根神经节轴突向外生长的实验结果；图5为实施例14条件培养液促进大鼠背根神经节的神经元轴突生长的实验结果。从以上图中可以看出，利用本发明制备的角柄骨膜组织条件培养液中含有角柄骨膜组织分泌的生物活性分子，能够促进神经生长。表1为实施例14所制备条件培养液的效果。0066表1实施例14所制备条件培养液的效果0067实施例1实施例2实施例3实施例4活性物质分泌量小大大大组织存活率较低高高高0068培养时间57D24D24D24D0069从表1中可以看出，利用本发明所提供的方法所制备的条件培养液，在活性物质分泌量和组织存活率方面均好于三角瓶培养方法，培养时间也明显缩短。0070虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。说明书CN104152400A1/2页7图1图2图3说明书附图CN104152400A2/2页8图4图5说明书附图CN104152400A。