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1、10申请公布号CN104220873A43申请公布日20141217CN104220873A21申请号201380019199622申请日2013021161/597,29820120210USG01N33/48200601B01D59/4420060171申请人儿童医疗中心公司地址美国马萨诸塞州申请人哈佛大学的校长及成员们72发明人EM奥戴J利伯曼G瓦格纳74专利代理机构北京市柳沈律师事务所11105代理人张文辉54发明名称基于NMR的代谢物筛选平台57摘要描述了使人们能够特异性测量特定分子在相对较少的细胞例如原代细胞中的代谢产物的方法。该方法牵涉任选与标记底物例如通过13C，15N，或31。
2、P标记一起预先加载细胞。该方法容许不同表型的细胞中差异生成的代谢物的容易鉴定。用于无偏爱的多维NMR筛选和NMR筛选的快速且有效分析的新方法鉴定不同细胞或组织类型中的差异表达的代谢物。对差异表达的代谢物的分析可以呈现可以对其设计小分子治疗剂的独特的可用药靶物。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日2014100986PCT国际申请的申请数据PCT/US2013/0256282013021187PCT国际申请的公布数据WO2013/120099EN2013081551INTCL权利要求书3页说明书20页序列表3页附图25页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书3页说明。
3、书20页序列表3页附图25页10申请公布号CN104220873ACN104220873A1/3页21一种用于在样品中监测给定类型细胞内的底物代谢的方法，该方法包括A用底物将第一样品的给定类型细胞培养足够的时间段，使得容许所述底物代谢分解成底物代谢物，其中任选地用核磁共振NMR稳定同位素标记所述底物的至少一部分；B从步骤A的细胞收获所述底物代谢物以获得底物代谢物的第二样品；并C对步骤B的所述第二样品实施多维NMR以测定代谢底物的共振谱RESONANCESPECTRUM，其中所述共振谱代表所述底物的代谢物，且其中所述多维NMR包含下列任一种技术光谱宽度折叠SPECTRALWIDTHFOLDING。
4、，随机相取样RANDOMPHASESAMPLING，非均匀取样NONUNIFORMSAMPLING，和增强动态范围数据重建的数据扩展DATAEXTENSIONFORENHANCEDDYNAMICRANGEDATARECONSTRUCTION。2权利要求1的方法，其中所述多维NMR包含任何组合的下列任何两种技术光谱宽度折叠，随机相取样，非均匀取样，和增强动态范围数据重建的数据扩展。3权利要求1的方法，其中所述多维NMR包含任何组合的下列任何三种技术光谱宽度折叠，随机相取样，非均匀取样，和增强动态范围数据重建的数据扩展。4权利要求1的方法，其中所述多维NMR包含下列所有四种技术光谱宽度折叠，随机相。
5、取样，非均匀取样，和增强动态范围数据重建的数据扩展。5权利要求1的方法，其中用稳定同位素标记所述底物，并且所述多维NMR包含任何组合的下列任何两种技术光谱宽度折叠，随机相取样，非均匀取样，和增强动态范围数据重建的数据扩展。6权利要求1的方法，其中用稳定同位素标记所述底物，并且所述多维NMR包含非均匀取样和增强动态范围数据重建的数据扩展。7权利要求1的方法，其中用稳定同位素标记所述底物，并且所述多维NMR包含随机相取样，非均匀取样，和增强动态范围数据重建的数据扩展。8权利要求1的方法，其中用稳定同位素标记所述底物，并且所述多维NMR包含所有下列四种技术光谱宽度折叠，随机相取样，非均匀取样，和增强。
6、动态范围数据重建的数据扩展。9权利要求1的方法，其中没有将存在于所述样品中的所述底物代谢物与所述样品中的其他分子分开。10权利要求1至9中任一项的方法，其中在与经NMR标记的底物一起加载细胞前将细胞群体内的底物浓度降低一段时间。11权利要求1至9中任一项的方法，其中使用为所述底物定制的NMR脉冲程序或过滤技术或两者测定经标记的底物的代谢物的共振。12权利要求1至9中任一项的方法，其中所述细胞群体内的细胞数目小于2X106。13权利要求1至9中任一项的方法，其中所述细胞群体是原代细胞群体。14一种用于鉴定第一细胞群体和第二细胞群体之间的差异表达的底物代谢物的方法，该方法包括A任选地，与经核磁共振。
7、NMR稳定同位素标记的底物一起加载第一和第二细胞群体；B将步骤A的所述第一和第二细胞群体培养足够的时间段，使得容许所述底物向底物代谢物的代谢分解；权利要求书CN104220873A2/3页3C从步骤B的所述第一和第二群体细胞收获所述底物代谢物以从所述第一和第二细胞群体中每种获得底物代谢物的样品；D对所述第一和第二细胞群体中每种的步骤C的样品实施多维NMR以测定所述第一细胞群体和所述第二细胞群体的代谢底物的共振谱，其中所述共振谱代表所述底物的代谢物；并E比较所述第一细胞群体的共振谱与所述第二细胞群体的共振谱以测定哪些共振是差异表达的，其中差异表达的共振提供代表差异表达的代谢物的共振标记。15权利。
8、要求14的方法，其中所述多维NMR包含下列任一种技术光谱宽度折叠，随机相取样，非均匀取样，和增强动态范围数据重建的数据扩展。16权利要求14的方法，其中所述多维NMR包含任何组合的下列任何两种技术光谱宽度折叠，随机相取样，非均匀取样，和增强动态范围数据重建的数据扩展。17权利要求14的方法，其中所述多维NMR包含任何组合的下列任何三种技术光谱宽度折叠，随机相取样，非均匀取样，和增强动态范围数据重建的数据扩展。18权利要求14的方法，其中所述多维NMR包含下列所有四种技术光谱宽度折叠，随机相取样，非均匀取样，和增强动态范围数据重建的数据扩展。19权利要求14的方法，其中用稳定同位素标记所述底物，。
9、并且所述多维NMR包含任何组合的下列任何两种技术光谱宽度折叠，随机相取样，非均匀取样，和增强动态范围数据重建的数据扩展。20权利要求14的方法，其中用稳定同位素标记所述底物，并且所述多维NMR包含非均匀取样和增强动态范围数据重建的数据扩展。21权利要求14的方法，其中用稳定同位素标记所述底物，并且所述多维NMR包含随机相取样，非均匀取样，和增强动态范围数据重建的数据扩展。22权利要求14的方法，其中用稳定同位素标记所述底物，并且所述多维NMR包含所有下列四种技术光谱宽度折叠，随机相取样，非均匀取样，和增强动态范围数据重建的数据扩展。23权利要求14的方法，其中没有将存在于所述样品中的所述底物代。
10、谢物与所述样品中的其他分子分开。24权利要求1423中任一项的方法，其中在与经NMR稳定同位素标记的底物一起加载细胞前将每个细胞群体内的底物浓度降低一段时间。25权利要求1423中任一项的方法，其中使用下列任一种或多种测定经标记底物的代谢物的共振定制NMR绝热脉冲程序，定制采集技术CUSTOMACQUISITIONTECHNIQUE，和定制NMR分析和过滤程序。26权利要求1423中任一项的方法，其中每个细胞群体内的细胞数目小于2X106。27权利要求1423中任一项的方法，其中所述第一细胞群体和第二细胞群体是原代细胞群体。28权利要求1423中任一项的方法，其中所述第一细胞群体和第二细胞群体。
11、之每种中的细胞群体是异质细胞群体，或是同质细胞群体。29权利要求1423中任一项的方法，其进一步包括比较步骤E的共振标记与已知共振标记的数据库以测定所述共振标记代表的分子结构，由此测定所述第一和第二细胞群体权利要求书CN104220873A3/3页4之间差异表达的底物代谢物。30权利要求1423中任一项的方法，其进一步包括鉴定底物代谢物生成中牵涉的生物合成途径，并鉴定途径中可以被靶向以调控所述代谢物的差异表达，由此调控细胞表型的蛋白质/酶。31权利要求1423中任一项的方法，其中所述第一细胞群体和所述第二细胞群体是同基因群体。32权利要求1423中任一项的方法，其中所述第一细胞群体和所述第二细。
12、胞群体具有不同表型。33权利要求1423中任一项的方法，其中所述第一细胞群体是对照细胞群体，且所述第二细胞群体已经与测试化合物或药剂接触。34权利要求1423中任一项的方法，其中使用所述方法鉴定在特定细胞类型中活性过度或活性不足的代谢途径。35权利要求1423中任一项的方法，其中所述方法进一步包括抑制或过表达所述第二细胞群体中的基因，并且使用所述方法鉴定在细胞中过表达或抑制基因的代谢结果。36一种用于治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括对有此需要的受试者施用N酰基神经氨酸胞苷酰基CITIDYLYL转移酶CMAS抑制剂，或N乙酰神经氨酸合酶NANS抑制剂，或降低N乙酰神经氨酸表达的分子。37权利。
13、要求36的方法，其中所述抑制剂选自下组小分子，核糖核酸，脱氧核糖核酸，蛋白质，肽，和抗体。38权利要求36的方法，其中所述抑制剂是酶。权利要求书CN104220873A1/20页5基于NMR的代谢物筛选平台0001关于联邦资助研究的声明0002本发明在国家健康研究所授予的R21AI087431下在政府帮助下进行。政府具有本发明的某些权利。发明领域0003本发明涉及基于NMR的筛选平台。0004发明背景0005细胞的代谢输出是限定该细胞类型的功能性基因组，转录物组和蛋白质组网络的总和。代谢物组学是代谢物组中的代谢物水平及其由于刺激物而随时间变化的全面且同时的系统性测定。虽然其它领域可以提供关于例。
14、如给定基因，MRNA或蛋白质的拷贝数的信息；但是牵涉代谢物的化学过程的此研究提供了所有异常基因，RNA，和/或蛋白质的下游总和。此“代谢指纹”代表特定细胞类型中所有运行或非运行途径的瞬象。0006已经使用几种分析方法，包括质谱术，层析，和NMR分光术来量化细胞代谢物。质谱术和层析两者需要较小的样品量，并且可以容易适合于高通量分析；然而，这两种方法都通常牵涉至少一个若不是几个纯化步骤。此外，在大多数情况中，要检查的代谢物必须推理预选择。非靶向质谱术UNTARGETEDMASSSPECTROMETRY方法是可能的，但是需要几轮纯化和进一步鉴定方法。另外，不是所有代谢物，包括核苷酸类类似物和脂质是容。
15、易可电离的，因此不能通过质谱术检测。此外，源自质谱术的片段化样式不总是适合于区别诸如具有相等质量，但不同结构的糖等分子，因此限制分析。0007发明概述0008本文中描述了一种快速的，无偏爱的，超高分辨率，定量NMR筛选平台，其利用任何组合的下列任一种，两种，三种，四种，或所有五种技术底物的稳定同位素标记，光谱宽度折叠，随机相取样，非均匀取样，和增强动态范围数据重建的数据扩展，以产生定制的“NMR代谢物阵列”，其中将给定细胞样品的所有已知代谢物的共振分类，并用于简化统计学分析的比较。这是第一次组合所有这些技术来提供稳健的，有效的且高通量的NMR代谢物筛选方案。步骤的组合容许水溶性和基于脂质的代谢。
16、物两者的全局的，无偏爱的，超高的分辨率。另外，本文中描述的新颖“NMR代谢物阵列”程序提供了以简化方式分析较大的复杂NMR数据集的新方式。该新平台同时容许差异表达的代谢物的快速鉴定，特定代谢物的量化，和分析给定前体的代谢流量的能力。0009新方法使人们能够特异性追踪特定分子在相对较少的细胞例如约2002000万个细胞中的代谢分解。该方法牵涉与经标记前体底物例如用13C，或15N，或31P标记一起预先加载细胞，并使用多维NMR。该方法不需要在分析前纯化感兴趣的各个代谢物，所述分析容许具有不同特性的细胞中差别生成的代谢物的全局，无偏爱鉴定。0010正常和疾病状态细胞中差异表达的代谢物的鉴定可以是临。
17、床上的一种有力的工具。用于监测来自表型上不同的细胞的代谢物的差异表达的新方法特别可用于鉴定可以用于调控表型的治疗性靶物。这包括存在于代谢物的生物合成途径中的靶物，或代谢物自身。说明书CN104220873A2/20页6此外，鉴定差异表达的代谢物可以用于区别正常对疾病状态的细胞。因此，它们具有充当与其关联的表型的生物标志物的潜力，使本文中描述的方法可用于鉴定诊断标志物，例如用于诊断疾病的标志物。0011另外，本文中描述了我们鉴定N乙酰神经氨酸NANA作为乳腺癌肿瘤启动细胞的新颖生物标志物，并且监测其表达可以用于诊断和检测乳腺癌。另外，显示了CMASNANA生物合成中的一种酶的蛋白质水平在乳腺肿瘤。
18、启动细胞中显著过表达。在此工作前，尚未探索CMAS在肿瘤启动和转移中的作用。在本文中，我们提供了如下的证据，即CMAS表达对于肿瘤形成和迁移是绝对重要的，且CMAS是乳腺癌的一种新颖的真正靶标。0012对个别患者的细胞分析应用此方法还会为用于患者护理的“个人化医学”方法提供基础。0013因而，本公开内容描述了用于监测细胞群体，例如原代细胞群体，组织细胞群体，或培养细胞例如永生化细胞内的给定底物前体的代谢的方法。描述了使用本文中描述的方法鉴定具有不同表型的两种或更多种细胞群体间的差异表达代谢物。还描述了用于鉴定潜在的治疗靶物和诊断标志物的方法。0014一般而言，在第一个方面，公开内容特征在于在样。
19、品中监测给定类型细胞内的底物代谢的新方法。该新方法包括A用底物将第一样品的给定类型细胞培养足够的时间段，使得容许所述底物代谢分解成底物代谢物，其中任选地用核磁共振NMR稳定同位素标记所述底物的至少一部分；B从步骤A的细胞收获所述底物代谢物以获得底物代谢物的第二样品；并C对步骤B的所述第二样品实施多维NMR以测定代谢底物的共振谱RESONANCESPECTRUM，其中所述共振谱代表所述底物的代谢物，且其中所述多维NMR包含下列任一种技术光谱宽度折叠SPECTRALWIDTHFOLDING，随机相取样RANDOMPHASESAMPLING，非均匀取样NONUNIFORMSAMPLING，和增强动态。
20、范围数据重建的数据扩展DATAEXTENSIONFORENHANCEDDYNAMICRANGEDATARECONSTRUCTION。0015在另一个方面，公开内容特征在于用于鉴定第一细胞群体和第二细胞群体之间的差异表达的底物代谢物的方法。这些方法包括A任选地，与核磁共振NMR稳定同位素标记底物一起加载第一和第二细胞群体；B将步骤A的所述第一和第二细胞群体培养足够的时间段，使得容许所述底物向底物代谢物的代谢分解；C从步骤B的所述第一和第二群体细胞收获所述底物代谢物以从所述第一和第二细胞群体中每种获得底物代谢物的样品；D对所述第一和第二细胞群体中每种的步骤C的样品实施多维NMR以测定所述第一细胞群。
21、体和所述第二细胞群体的代谢底物的共振谱，其中所述共振谱代表所述底物的代谢物；并E比较所述第一细胞群体的共振谱与所述第二细胞群体的共振谱以测定哪些共振是差异表达的，其中差异表达的共振提供代表差异表达的代谢物的共振标记。0016在这些方法之任一种中，多维NMR可以包括任何组合的下列任两种，三种，或所有四种技术光谱宽度折叠，随机相取样，非均匀取样，和增强动态范围数据重建的数据扩展。在这些方法之任一种中，底物可以用NMR稳定同位素标记，且多维NMR可以包括任何组合的下列任两种，三种，或所有四种技术光谱宽度折叠，随机相取样，非均匀取样，和增强动态范围数据重建的数据扩展。0017在这些方法的一些实施方案中。
22、，没有将存在于所述样品中的所述底物代谢物与所述样品中的其他分子分开。在一些实施方案中，在与NMR标记底物一起加载细胞前将细胞说明书CN104220873A3/20页7群体内的底物浓度降低一段时间，并使用为所述底物定制的NMR脉冲程序或过滤技术或两者测定经标记的底物的代谢物的共振。细胞群体内的细胞数目可以小于2X106，并且细胞群体可以是原代细胞群体。0018这些方法之任一种可以进一步包括比较步骤E的共振标记与已知共振标记的数据库以测定所述共振标记代表的分子结构，由此测定所述第一和第二细胞群体之间差异表达的底物代谢物。0019在某些实施方案中，所述方法可以进一步包括鉴定底物代谢物生成中牵涉的生物。
23、合成途径，并鉴定途径中可以被靶向以调控所述代谢物的差异表达，由此调控细胞表型的蛋白质/酶。在一些实施方案中，所述第一细胞群体和所述第二细胞群体是同基因群体和/或所述第一细胞群体和所述第二细胞群体具有不同表型。在一些实施方案中，所述第一细胞群体是对照细胞群体，且所述第二细胞群体已经与测试化合物或药剂接触。可以使用所述方法鉴定在特定细胞类型中活性过度或活性不足的代谢途径。所述方法可以进一步包括抑制或过表达所述第二细胞群体中的基因，并且使用所述方法鉴定在细胞中过表达或抑制基因的代谢结果。0020在另一个方面，公开内容的特征在于用于治疗受试者中的癌症的方法。该方法基于使用本文中描述的新平台方法测定的结。
24、果。治疗癌症的方法包括对有此需要的受试者施用有效量的N酰基神经氨酸胞苷酰基CITIDYLYL转移酶CMAS抑制剂，N乙酰神经氨酸合酶NANS抑制剂，或降低N乙酰神经氨酸表达的分子。例如，抑制剂可以是酶或者可以选自下组小分子，核糖核酸，脱氧核糖核酸，蛋白质，肽，和抗体。0021如本文中使用的，术语“同基因的”指从相同组织类型任何组织，例如相同器官、皮肤、膀胱、肝、心脏等的组织及从相同生物体类型例如人，或动物，或鱼分离的相同遗传背景的细胞任何细胞类型，例如上皮细胞，或脂肪细胞，或干细胞，或肌肉细胞等。0022如本文中使用的，术语“代谢物”指代谢的中间体或终产物。“代谢物”具有包括对酶的能源，结构，。
25、信号传导，刺激，和抑制影响的功能。代谢物还可以自身具有催化活性。代谢物可以是底物酶反应的终产物。0023如本文中使用的，术语“代谢前体”指参与化学反应的化合物。该术语意图包括作为得到终产物的酶促反应的起始化合物或中间体化合物的化合物。0024术语“底物”指酶对其起作用并且导致底物转化成一种或多种终产物的分子或化合物。终产物从酶的活性位点释放。0025术语“酶”指在其活性位点中接受底物，并且将底物转化成一种或多种终产物，随后该终产物从活性位点释放的分子。0026如本文中使用的，术语“原代细胞”或“原代组织”指从正常个体或具有获得性或遗传性疾病的个体的活组织直接采集并且为了在体外生长而建立的细胞或。
26、组织。0027术语“转移”指癌症从其作为原发性肿瘤出现的地方扩散到身体的远离位置及新建立的肿瘤自身的过程，所述新建立的肿瘤又称为“转移性肿瘤”，其可以源自许多原发性肿瘤类型，包括但不限于前列腺，结肠，肺，乳腺，骨，和肝起源的。例如，当从原发性肿瘤脱落的肿瘤细胞粘着血管内皮，穿透到周围组织中，并且在与原发性肿瘤分开的部位生长，从而形成独立肿瘤时形成转移。0028术语“癌症”指具有自主生长能力的细胞。例子包括具有以快速增值细胞生长为说明书CN104220873A4/20页8特征的异常状态或状况的细胞。该术语意图包括癌性生长，例如肿瘤例如实体瘤；致癌性过程，转移性组织，和恶性转化细胞，组织，或器官，。
27、与侵入性的组织病理学类型或阶段无关。还包括各种器官系统，诸如呼吸，心血管，肾，生殖，血液学，神经学，肝，胃肠，和内分泌系统的恶性；及腺癌，其包括恶性，诸如大多数结肠癌，肾细胞癌，前列腺癌和/或睾丸肿瘤，非小细胞肺癌，小肠癌，和食管癌。“天然发生的”癌症包括不是通过将癌细胞植入受试者中凭实验诱导的任何癌症，并且包括例如自发发生的癌症，通过将患者暴露于致癌物引起的癌症，源自转基因癌基因的插入或肿瘤抑制基因的敲除的癌症，和由感染例如病毒感染引起的癌症。术语“癌”是本领域公认的，并且指上皮或内分泌组织的恶性。该术语还包括癌肉瘤，其包括由癌瘤性和肉瘤组织构成的恶性肿瘤。“腺癌”指源自腺组织或其中肿瘤细胞。
28、形成可认识的腺结构的癌症。0029如本文中使用的，术语“治疗”或“处理”指为了赋予治疗效果，例如为了治愈，减缓，改变，影响，改善，或减少病症，其症状，或素因，对受试者施用一种或多种本文中描述的化合物，该受试者具有用此类化合物可治疗的病症，和/或此类病症的症状，和/或此类病症的素因。0030如本文中使用的，术语“有效量”指对治疗的患者赋予治疗效果需要的活性化合物的量。有效剂量会随治疗疾病的类型，施用路径，赋形剂使用，和与其它治疗性处理的共使用的可能性而变化，如本领域技术人员认可的。0031治疗性化合物的剂量，毒性，和治疗功效可以在细胞培养物或实验动物中通过标准药学规程例如用于测定LD50对50群。
29、体致死的剂量和ED50在50群体中治疗有效的剂量测定。毒性和治疗效果之间的剂量比率是治疗指数，并且其可以以比率LD50/ED50表示。展现出高治疗指数的化合物是优选的。虽然可以使用展现出毒性副作用的化合物，应当注意设计投递系统，其将此类化合物靶向到受累组织的部位，以使对未感染细胞的潜在损伤最小化，由此降低副作用。0032除非另有规定，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中所描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可以用于实施或测试本发明，下文描述了合适的方法和材料。本文中提及的所有出版物，专利申请，专利，或其它参考文献通过提及完整收录。。
30、在冲突的情况中，应当以本说明书包括定义为准。另外，材料，方法和例子仅仅是例示性，而非意图为限制性的。0033本发明的其它特征和优点从以下详细描述及从权利要求书看会是显而易见的。0034附图简述0035图1是流程图，其汇总了本文中描述的基于NMR的代谢物筛选平台的关键步骤。0036图2AF详述了NMR方法中的采集和处理的每个步骤，所述NMR方法容许快速的，无偏爱的，超高分辨率代谢物序型分析PROLING。图2A2D证明了光谱宽度SW折叠策略，其中将SW从220PM降低至90PPM导致分辨率升高25倍。图2E汇总了非均匀取样NUS策略，其容许时间缩短40中分辨率升高4倍或分辨率升高8倍。图2F显示。
31、了使用正向最大熵重建FORWARDMAXIMUMENTROPYRECONSTRUCTION处理的NUS13C1HHSQC谱左侧和在重建中包括将分辨率提高2倍的数据扩展步骤后的相同NUS13C1HHSQC谱右侧。0037图3A和3B分别是展示来自相同P53缺陷小鼠肺肿瘤的水溶性3A和基于脂质说明书CN104220873A5/20页9的3B代谢物的全代谢覆盖的13C1HHSQC谱。0038图4是流程图，其汇总了用于创建用于快速分析的NMR阵列的定制NMR分析程序。0039图5AC是来自2000万个未标记的5A，13C谷氨酰胺温育的5B和13C葡萄糖温育的5C乳腺肿瘤启动细胞的水溶性代谢物的一组13。
32、C1HHSQC共振谱。0040图6突出显示了本文中描述的NMR阵列中可得到的信息。使用图5AC中的未标记的，谷氨酰胺，和葡萄糖谱，创建主查找MASTERLOOKUP以为所有可能共振代谢物产生代谢物ID，并将这些在X轴上列出。Y轴显示每个条件下每个共振的相对强度，突出显示差别的葡萄糖和谷氨酰胺衍生的代谢物。0041图7AB是乳腺肿瘤启动BPLER细胞图7A和恶性较小的同基因HMLER细胞图7B中的水溶性葡萄糖衍生代谢物的13C1HHSQC共振谱的代表性例子。0042图7C汇总了BPLER和HMLER13C1HHSQC共振谱的NMR阵列，显示了所有可能的代谢物共振X轴的强度Y轴在每个细胞类型中如何。
33、变化。BPLER和HMLER细胞起源于相同正常乳腺组织，并且培养成两种细胞类型，即化学成分确定的WIT培养基中培养的BPEC乳腺原代上皮细胞和MEGM培养基中培养的HMEC人乳腺上皮细胞。将BPEC和HMEC细胞用HTERTL，SV40早期区E，和HRASR转化以产生BPLER和HMLER细胞。0043图7D是NMR阵列预测为仅具有BPLER共振的区域中BPLER红色和HMLER蓝色13C1HHSQC谱覆盖的区域的图像放大。0044图8AC汇总了用于确认BPLERNMR阵列中过表达的差异表达的代谢物是N乙酰神经氨酸NANA的各种方法。图8A是纯NANA的13C1HHSQC。图8B显示了定制NM。
34、RHCN氢碳氮实验的结果，其确认BPLER细胞具有差异表达的共振，与NANA具有相似的连接性。图8C显示了M/S结果，其使用液相层析质谱法多反应监测LC/MSMRM直接测量HMLER左侧和BPLER右侧细胞中的NANA，其中报告的数目是NANA峰下的面积。0045图9是罗丹明标记的麦芽凝集素WGA免疫荧光显微术的显微镜照片的一系列表示，其分别显示HMLER上排和BPLER细胞下排中的NANA表达。WGA特异性结合NANA。0046图10是示意图，其描绘了将葡萄糖转化成NANA的酶促步骤，其中N乙酰神经氨酸合酶NANS和N酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶CMAS是关键的酶。0047图11是柱形图，其显。
35、示了通过经由SIRNA下调CMAS，NANS，和PLKI对增殖的影响，对HMLER和BPLER细胞的存活力。0048图12AC是一系列图像，其提供了NANA对BPLER和HMLER细胞的细胞迁移的影响的概述。图12A和12B各是一系列免疫组织化学图像，其分别在HMLER和BPLER细胞中显示了在缺乏NANS和CMAS的情况下对细胞迁移的抑制和用NANA对迁移的挽救。图12C是柱形图，其量化在缺乏NANS和CMAS的情况中迁移细胞的数目及在添加NANS后的随后迁移。0049图13AB是柱形图，其描绘了HMLER和BPLER细胞中CMAS和CMYC的定量PCRMRNA水平13A和对NANS和CMA。
36、S表达的WESTERN印迹分析13B。0050图14A和14B是CMAS表达对细胞迁移影响的免疫组织化学图像。图14A是过表达CMAS后HMLER细胞迁移的一系列免疫组织化学图像。图14B是BPLER细胞和稳定CMAS敲低BPLER细胞BPLERSHCMAS1的一系列免疫组织化学图像。0051图15AB汇总了测定CMAS水平对体内肿瘤启动和转移的影响的策略。图15A显示说明书CN104220873A6/20页10了免疫方案，且图15B显示了在注射500,000个BPLER左侧或500,000个BPLERSHCMAS1细胞的NOD/SCIN小鼠中后每天的肿瘤体积生长。0052图16A,16B,1。
37、6C和16D分别是CMAS基于NANA结构的合成的基于底物的CMAS抑制剂的酶机制和免疫组织化学分析，其显示了用合成的氟NANA抑制剂抑制细胞迁移。0053图17A和17C是2R,3R,4S4胍基3丙1烯2基氨基21R,2R1,2,3三羟基丙基3,4二氢2H吡喃6羧酸其是扎那米韦ZANAMIVIR，以瑞乐砂RELENZA销售图17A和乙基3R,4R,5S5氨基4乙酰氨基3戊烷3基氧基环己1烯1羧酸酯其是奥司他韦OSELTAMIVIR，以达菲TAMIFLU销售图17C的化学结构。0054图17B和17D显示了瑞乐砂对BPLER细胞迁移17D和对照17B的影响的免疫组织化学分析。这两种药物都是神经。
38、氨酸苷酶抑制剂。0055图18A和18B是显示了在存在和缺乏神经氨酸苷酶的情况中HMLER和BPLER细胞中NANA表达的免疫荧光显微术图像18A和在存在和缺乏神经氨酸苷酶的情况中HMLER和BPLER细胞迁移的免疫组织化学图像18B。0056发明详述0057本公开内容描述了新颖的方法，该方法提供了相对于已知NMR数据采集的多个方面的益处，并且容许快速的，无偏爱的，全局的，定量超高分辨率NMR数据采集和定制NMR分析，其利用新颖的办法进行。本公开内容描述了新的NMR筛选方法，其可以用于鉴定，追踪，和表征特定分子的代谢分解及用于分析对于给定细胞类型至关重要的细胞代谢物组学。本文中描述的方法绕过已。
39、知NMR方案呈现的障碍，即实施数据采集必需的样品大小降低，消除对要分析的代谢物的纯化的需要，多维NMR需要的实验时间缩短及获得代谢物鉴定必需的高分辨率。该方法需要相对较少的细胞2002000万个，其容许该方法用于研究来自原代细胞和组织，而非仅来自细胞培养基的代谢物。另外，公开的方法不需要在分析前从其它细胞代谢物纯化个别感兴趣代谢物。此外，新方法容许显现给定前体在任何细胞类型中的特定代谢命运，因此提供利用本文中也描述的新数据分析方法对不同细胞类型中差别生成的代谢物的简化鉴定。0058为了突出显示新平台方法的能力和宽度，本公开内容描述了鉴定与恶性较小的同基因系HMLER相比高度攻击性的三重阴性乳腺。
40、癌肿瘤启动BPLER细胞中的差异表达的代谢物。本领域中公知的是，癌细胞依靠消耗葡萄糖而生长。葡萄糖代谢物N乙酰基神经氨酸NANA在本文中已经鉴定为在乳腺癌肿瘤启动BPLER细胞中差异表达即升高的表达。生成代谢物的生物合成途径也已经得到鉴定，并且用于将代谢物合成需要的蛋白质/酶鉴定为途径内调控升高的肿瘤启动和转移潜力的表型的候选靶物。0059另外，将生成关键酶NANS和CMAS的基因沉默的敲低实验的结果证明了降低这些酶的正常功能以生成NANA并将其附着于蛋白质对BPLER细胞的增殖没有影响，但是大大降低其迁移。另一方面，相同酶在HMLER细胞中受迫的过表达提高其迁移。在BPLER细胞中稳定敲低C。
41、MAS完全阻止小鼠中的肿瘤形成。因此，新方法成功用于鉴定对致肿瘤性重要的代谢物例如NANA并且证明NANA和NANA合成中涉及的蛋白质可以充当治疗性干预的靶物以降低乳腺肿瘤形成和肿瘤启动细胞的转移。另外，NANS和CMAS确认为用于在体外和在体内抑制肿瘤启动和转移的靶物。因此，这些酶的小分子和其它抑制剂是现在的候选治说明书CN104220873A107/20页11疗剂，其可以用于特异性靶向乳腺肿瘤启动细胞。此外，差异表达的代谢物例如NANA也可以充当与其关联的表型的生物标志物，容许本文中描述的方法用于鉴定新的候选诊断标志物。0060通用方法0061一般地，用于监测给定细胞类型内给定前体分子即底。
42、物的代谢物的本文中所述新方法包括下列步骤A任选地，与经标记的底物，例如经13C标记的底物一起加载细胞群体，B将步骤A的细胞培养足够的时间段，使得容许底物代谢分解成底物代谢物例如根据实验问题，通常为5分钟至24小时；C从细胞中收获底物代谢物以获得底物代谢物的样品，例如底物代谢物的水溶性样品和基于脂质的代谢物的有机样品；并D对步骤C的样品实施多维NMR以测定代谢底物的共振谱，其中共振代表底物代谢物的共振。下文更为详细描述了如何实施多维NMR。0062在这些方法中，可以使用各种底物和各种稳定的自旋1/2核同位素标记那些底物。例如，葡萄糖，谷氨酰胺，脂肪酸，氨基酸，丙酮酸盐，药物化合物，和其它分子可以。
43、用作底物，并且可以使用稳定同位素，诸如13C,15N,29SI,31P等标记底物。任何组织，原代细胞或培养的细胞系可以用于分析，诸如癌细胞，肌肉细胞，脂肪细胞，内皮细胞，上皮细胞，神经元细胞，心脏细胞，等等。一般地，会想要测试与特定疾病或病症有关的细胞，诸如癌细胞，以及来自健康受试者的相同细胞类型，以提供差异代谢分析。还可以测试具有单一基因突变的细胞即突变体细胞对野生型或用药物处理或不处理的细胞，或与前体一起温育多个时间的相同细胞。每份样品的细胞群体可以是同质细胞群体。在备选的实施方案中，每份样品的细胞群体可以是异质细胞群体例如源自组织样品。虽然本文中描述的方法中可以使用任何细胞数目，在多个实。
44、施方案中，每个细胞群体内的细胞数目可以小于1X108，小于8X107，小于7X107，小于6X107，小于5X107，小于25X107，或小于20X107，或细胞数目的范围可以为约1X106至1X108个细胞，或1X106至5X107，或1X106至25X107，或1X106至20X107。0063用于加载细胞的方法是本领域技术人员公知的，例如可以将经标记的底物添加至细胞培养基一段时间例如5分钟至24小时，或者可以通过转染例如脂质体或磷酸钙，转导例如经标记底物的病毒投递或注入例如对肿瘤的直接注射加载。在一个实施方案中，对受试者施用经标记的前体，例如口服，表面，胃肠外，或静脉内。在一些实施方案中。
45、，对动物饲料添加经标记的底物。0064在多个实施方案中，在添加含有经标记的底物的培养基前，将细胞与缺乏任何底物形式，例如缺乏未标记或标记的形式的底物的细胞培养基一起温育。可以将细胞在此培养基中温育几分钟至几小时，基本上使细胞对该底物饥饿。这有助于降低后来分析中的背景。然后，将细胞与仅含有经标记的底物的细胞培养基一起温育例如5分钟至24小时。可以使用任何浓度的底物。在多个实施方案中，浓度范围为1NG/ML至1MG/ML。熟练技术人员可以通过测试多个浓度范围容易地测定使用的最佳浓度。在温育后，将细胞短暂清洗，并立即收获以分离代谢物。为了收获代谢物，可以实施简单的氯仿提取以获得有机层中存在的代谢物的。
46、水溶性样品或非水溶性样品。不需要额外的纯化。0065几种核磁共振NMR技术可以在本发明的方法，优选多维NMR中使用。例如，可以使用异核单量子相关HETERONUCLEARSINGLEQUANTUMCORRELATION,HSQC分光术，HSQC说明书CN104220873A118/20页12的变型，和其它多维NMR技术。用于实施多维NMR例如2DNMR和/或13C1HHSQCNMR的方法是本领域技术人员公知的。0066可以使用NMR脉冲程序其可以定制用于底物测定经标记底物的代谢物的共振谱。一般地，NMR使用静态的，同质的外部磁场来极化NMR样品。此次场通常称作“B0”场，并且它定义用于NMR系。
47、统的参照轴。如下在B0场的方向磁化NMR样品，即将样品在B0场中放置一段时间例如几分钟，并且容许样品达到热平衡状态。次B0场也通常定义样品中的自旋1/2核种类的共振频率。例如，更强的一次场一般提高核自旋的共振频率。核自旋以其相应的共振频率在B0场周围“旋进”。在大多数NMR系统中，核自旋具有射频RF范围中的共振频率。0067在NMR实验中，通过以核自旋共振频率应用时间变化磁场操作NMR样品中的核自旋。在一些例子中例如用于低翻转角FLIPANGLE脉冲，高强度射频RF脉冲提供核自旋的快速的精确控制。高强度RF脉冲具有较短的脉冲时间的益处，其降低脉冲期间发生的脱散量。在一些例子中例如用于高翻转角脉。
48、冲，高强度RF脉冲提供较小的精度，例如这是由于感兴趣的频率范围里不均匀功率输出，由于RF场中的空间不均匀性，或者由于其他考虑。0068在一些实施方案中，绝热脉冲可以对核自旋提供更精确的控制。绝热脉冲通常具有较低的强度，并且需要较长的脉冲时间。在一些情况中，绝热脉冲用于较大的翻转角脉冲例如180度翻转角以在感兴趣的整个频率范围里提供更一致的翻转角。绝热脉冲通常是实施的成形脉冲意味着它们具有时间变化功率谱，其可以在特定的翻转角，特定的频率范围等方面参数化。0069在多个实施方案中，新的NMR方法包括使用下列任何一项或多项方法和技术来提高分析速度和/或分辨率，或两者I稳定同位素标记，II折叠谱宽度和。
49、混淆ALIASING峰，III随机相取样IV非均匀取样，和V数据扩展。在一些实施方案中，方法包括任何组合的这些中的至少两种或三种方法。在一些实施方案中，方法包括所有5种方法。下文表1汇总了每个步骤对NMR采集和数据分辨率的影响。下文更为详细描述了这些步骤。0070表10071说明书CN104220873A129/20页130072稳定同位素标记0073传统2DNMR代谢物序型分析依赖于13C天然丰度，其以11存在。因此，为了根本上观察任何信号，获得大量的样品平均2亿个细胞。这将检测限于培养的细胞系，并且仅检测最丰富的代谢物。为了降低需要的材料量并且观察具有更宽浓度范围的代谢物，对样品例如细胞，组织或肿瘤直接补充经13C标记的前体使用葡萄糖，谷氨酰胺，丙酮酸盐和氨基酸，但是其他底物和其它同位素也是可能的。在理论上，这应当将样品负荷降低约99。若例如1MM代谢物需要2亿个细胞以用13C天然丰度检测，则使用标记物来查看相同强度仅会需要200万个细胞。在我们的方法中包括此步骤将样品需要降低至在一些质谱术M/S方法方面类似的样品需要。非靶向性M/S需要至少100万个细胞，并且接着进行几轮层析纯化和检测。我们的方法需要较少的细胞数目并且无需纯化。0074折叠谱宽度和混淆峰0075在将原子置于强磁场B0时，该分子中的电子在应用磁场的方向上旋进。此旋进在原子核产生小的磁场。因此，核处的。