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1、10申请公布号CN104152502A43申请公布日20141119CN104152502A21申请号201410406076422申请日20140818C12P7/6420060171申请人南昌大学地址330031江西省南昌市红谷滩新区学府大道999号72发明人朱雪梅黄楚楚龚斌熊华胡蒋宁喻芸冯越梁媛74专利代理机构南昌新天下专利商标代理有限公司36115代理人施秀瑾54发明名称以专一性脂酶催化的单脂肪酸甘油酯制备SN1,3DAG的方法57摘要以专一性脂酶催化的单脂肪酸甘油酯制备SN1,3DAG的方法，步骤如下（1）按摩尔比为241比例称取反应底物游离脂肪酸、SN13单甘脂并放入反应器中；（2。
2、）按反应底物游离脂肪酸与SN13单甘油酯总质量的20的量，加入脂酶TLIM，密闭反应器，在反应温度50、搅拌转速220转/分钟条件下，反应0596H；（3）对步骤（2）中反应得到的产物通过滤膜过滤方式除去固定化的脂酶，得到SN1,3DAG。本发明避免了大量游离脂肪酸抑制酯酶活性的副反应；产物SN1,3DAG含量高达68；反应速度快，纯度较高；有效减少了反应的步骤以及试剂的使用，大大减少了生产成本。51INTCL权利要求书1页说明书3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书3页10申请公布号CN104152502ACN104152502A1/1页21以专一性脂酶催化。
3、的单脂肪酸甘油酯制备SN1,3DAG的方法，其特征是步骤如下（1）按摩尔比为241比例称取反应底物游离脂肪酸、SN13单甘脂并放入反应器中；（2）按反应底物游离脂肪酸与SN13单甘油酯总质量的20的量，加入脂酶TLIM，密闭反应器，在反应温度50、搅拌转速220转/分钟条件下，反应0596H；（3）对步骤（2）中反应得到的产物通过滤膜过滤方式除去固定化的脂酶，得到SN1,3DAG。权利要求书CN104152502A1/3页3以专一性脂酶催化的单脂肪酸甘油酯制备SN1,3DAG的方法技术领域0001本发明属于食用油技术领域，涉及以无溶剂体系中酶催化合成的SN1,3甘油二酯制备方法。背景技术000。
4、2SN1,3甘油二酯（DIACYLGLYCEROL,DAG）是由一分子甘油与两分子脂肪酸酯化后得到的产物。SN1,3DAG是天然油脂中的微量成分及体内脂肪代谢的内源中间产物。在日常生活中可完全取代食用油脂，不影响口感且能抑制体重的增长，促进体内脂肪减少，防止内脏脂肪堆积，降低人和动物餐后血浆甘油，最重要的是在体内不会产生蓄积作用。因此，成为了近年来油脂开发的主要发展方向之一。SN1,3DAG作为油脂的天然成分，同时也是一种多功能添加剂，在食品、医药、化工等行业有广阔的应用前景。0003目前，制备SN1,3DAG方法主要分为化学法和生物酶法。传统化学法生产SN1,3DAG具有成本低，运行经济，容。
5、易实现规模生产等特点。然而由于反应缺乏专一性，所得产品为SN1,2DAG、1,3DAG的混合物，反应产率低。虽然通过特异的化学反应也可生产结构特殊的SN1,3DAG，但需保护剂，反应步骤繁杂冗长，且需大量的化学试剂或有机溶剂，这显然不符合当今清洁生产、绿色环保的要求。由于脂肪酶具有较强的选择性（脂肪酸专一性、位置专一性、结构专一性、光学异构专一性），生物酶催化法可对产物实现较为精确的控制，并可方便的开发具有特殊结构的产品。与此同时，酶法反应条件温和，所得产品质量好（如色泽、活性等），而且能耗低。另外，由于酶的高度选择性，转化率高，副反应少，产品纯度高，使得反应更有效。具有既可降低纯化费用，又可。
6、减少环境污染等优点。目前，国内外多采用以酯酶催化水解甘油酯法和脂酶催化甘油与游离脂肪酸法进行合成SN1,3DAG，但产率都较低，不利于工业化生产。发明内容0004本发明的目的旨在提供一种以专一性脂酶催化的单脂肪酸甘油酯制备SN1,3DAG的方法，以SN13单甘酯为甘油骨架供体，以游离脂肪酸为酰基供体，建立一种无溶剂体系中酶催化合成SN1,3DAG的制备方法。0005本发明所述的以专一性脂酶催化的单脂肪酸甘油酯制备SN1,3DAG的工艺步骤如下。0006（1）原料准备按摩尔比为241比例称取反应底物游离脂肪酸、SN13单甘脂并放入反应器中。0007（2）脂酶催化的部分酯化换反应按反应底物游离脂肪。
7、酸与SN13单甘油酯总质量的20的量，加入脂酶TLIM（LIPOZYME），密闭反应器，在反应温度50、搅拌转速220转/分钟条件下，反应0596H。0008部分酯化的反应机理如下式所示说明书CN104152502A2/3页4（3）除酶对步骤（2）中反应得到的产物通过滤膜过滤方式除去固定化的脂酶，得到SN1,3DAG。0009本发明产品SN1,3DAG的分析、测试。0010将小瓶、进样瓶、瓶盖和垫片洗净、超声、烘干，做好标签待用，准备好。将上面得到的样品分别与色谱纯正己烷按照1MG样品5ML正己烷的比例配制，装于20ML的小瓶中，密封；将样品加热融化，彻底融化后分别用注射剂取出溶液经045M的。
8、滤膜过滤注入到相应的进样瓶，准备做液相分析；并采用面积归一法进行计算。0011部分甘油酯是油脂加工中的副产物，主要用于乳化剂等食品添加剂，根据甘油酯中脂肪酸的位置，可以分为SN13单甘酯和SN2单甘酯。本发明旨在以SN13单甘酯为甘油骨架供体，以游离脂肪酸为酰基供体，提供建立一种无溶剂体系中酶催化合成的SN1,3DAG制备方法。本发明所制备的SN1,3DAG含量超过68。且发明所制备的SN1,3DAG为淡黄色油状液体，无异味，酸值，过氧化值均符合国家一级食用油标准，亦可用于制作具有抗癌等保健功能的食品。0012本发明的有益效果。0013本发明采用脂酶催化制备SN1,3DAG，选用游离脂肪酸与S。
9、N13单甘酯反应而不是采用甘油三酯水解法和甘油与脂肪酸直接酯化法来制备1,3甘油二酯，避免了大量游离脂肪酸抑制酯酶活性的副反应。0014本发明通过控制反应条件来抑制酰基迁移副反应，采用优化反应时间来综合选择制备SN1,3DAG的较优条件，得到SN1,3DAG含量高达68。且通过SN13单甘酯与脂肪酸在酶催化下的酯交换来制备SN1,3DAG，以SN13单甘酯为原料通过酯交换反应制备SN1,3DAG分别属于甘油解反应的中间步骤，所以反应速度快，纯度也较高。而2013年华南理工大学刘宁博士论文中研究游离磷脂酶LECITASEULTRA催化油酸和甘油直接酯化法合成1,3DAG，考察了有机溶剂和无溶剂体。
10、系的反应效果，对无溶剂体系中的合成工艺进行优化。发现该酶在无溶剂体系中可实现DAG的快速酯化合成，仅15H反应，产物中1,3DAG含量548WT。相比较，本发明在SN1,3DAG的反应得率及纯度上具有优势。0015本发明通过控制反应体系的酰基供体、底物比例和时间来调控酰基迁移反应程度，有效减少了反应的步骤以及实验试剂的使用，为利用专一性脂酶绿色催化合成功能性SN1,3DAG提供了一个成功例子。具体实施方式0016本发明将通过以下实施例作进一步说明。0017实施例。0018分别计算并称重共轭亚油酸及SN13单甘酯，其中共轭亚油酸与SN13单说明书CN104152502A3/3页5甘酯的摩尔比为3。
11、1，共轭亚油酸为84132G、SN13单甘酯为36539G，称20的脂酶TLIM即24134G，放入密闭反应器中，迅速盖上盖子密封，在50下反应4H，搅拌速度为220转/分种，通过滤膜过滤除酶，得到SN1,3DAG。0019实施例2。0020分别计算并称重共轭亚油酸及SN13单甘酯，其中共轭亚油酸与SN13单甘酯的摩尔比为21，共轭亚油酸为56088G、SN13单甘酯为36539G，称20的脂酶TLIM即18525G，放入密闭反应器中，迅速盖上盖子密封，在50下反应2H，搅拌速度为220转/分种，通过滤膜过滤除酶，得到SN1,3DAG。0021实施例3。0022分别计算并称重共轭亚油酸及SN1。
12、3单甘酯，其中共轭亚油酸与SN13单甘酯的摩尔比为31，共轭亚油酸为84132G、SN13单甘酯为36539G，称20的脂酶TLIM即24134G，放入密闭反应器中，迅速盖上盖子密封，在50下反应2H，搅拌速度为220转/分种，通过滤膜过滤除酶，得到SN1,3DAG。0023实施例4。0024分别计算并称重油酸及SN13单甘酯，其中油酸与SN13单甘酯的摩尔比为31，共轭亚油酸为84732G、SN13单甘酯为36539G，称20的脂酶TLIM即24254G，放入密闭反应器中，迅速盖上盖子密封，在50下反应6H，搅拌速度为220转/分种，通过滤膜过滤除酶，得到SN1,3DAG。0025实施例5。0026分别计算并称重共轭亚油酸及SN13单甘酯，其中共轭亚油酸与SN13单甘酯的摩尔比为41，共轭亚油酸为112176G、SN13单甘酯为36539G，称20的脂酶TLIM即29473G，放入密闭反应器中，迅速盖上盖子密封，在50下反应12H，搅拌速度为220转/分种，通过滤膜过滤除酶，得到SN1,3DAG。0027表1实验结果说明书CN104152502A。