癌细胞的检测方法.pdf

一种癌细胞的检测方法，包括如下步骤：使含有被检细胞的含末梢血试样与标记用物质在体外接触，使所述标记用物质摄入到所述被检细胞内而对所述被检细胞进行标记、以及从所述被检细胞中检测出由所述标记用物质标记的程度强于含末梢血试样中的正常细胞的标记程度的细胞作为癌细胞。

1.  一种癌细胞的检测方法，包括如下步骤：
使含有被检细胞的含末梢血试样与标记用物质在体外接触，
使所述标记用物质摄入到所述被检细胞内而对所述被检细胞进行标记，以及
从所述被检细胞中检测出由所述标记用物质标记的程度强于含末梢血试样中的正常细胞的标记程度的细胞作为癌细胞，
所述标记用物质为选自由标记化的糖和标记化的氨基酸组成的组中的至少一种物质。

2.  如权利要求1所述的检测方法，其中，所述标记用物质为用荧光物质标记的物质或荧光物质的前体物质，所述检测得到由所述荧光物质标记的所述被检细胞的荧光强度。

3.  如权利要求1所述的检测方法，其中，所述标记用物质为用荧光物质标记的物质或荧光物质的前体物质，所述检测得到选自由由所述荧光物质标记的所述被检细胞的平均荧光强度和总荧光强度组成的组中的至少一种荧光强度。

4.  如权利要求1所述的检测方法，其中，所述检测还基于由所述荧光物质标记的所述被检细胞的大小来进行。

5.  如权利要求1所述的检测方法，其中，所述标记用物质为所述标记化的糖，所述标记化的糖为标记化的单糖。

6.  如权利要求1所述的检测方法，其中，所述标记用物质为所述标记化的糖，所述标记化的糖为荧光标记的葡萄糖衍生物。

7.  如权利要求1所述的检测方法，其中，所述标记用物质为标记 化的氨基酸，所述氨基酸为选自由天然氨基酸和非天然氨基酸组成的组中的至少一种氨基酸。

8.  如权利要求1所述的检测方法，其中，所述标记用物质为标记化的氨基酸，所述氨基酸为选自由中性氨基酸和酸性氨基酸组成的组中的至少一种氨基酸。

9.  如权利要求1所述的检测方法，其中，含有所述被检细胞的所述含末梢血试样进行了溶血处理。

10.  如权利要求1～9中任一项所述的检测方法，其中，包括使细胞种类识别用抗体与含有所述被检细胞的所述含末梢血试样在体外接触的步骤。

11.  如权利要求10所述的检测方法，其中，所述细胞种类识别用抗体为选自由抗CD45抗体和抗CD34抗体组成的组中的至少一种抗体。

12.  如权利要求1所述的检测方法，其中，在铁离子和还原剂存在下使含有所述被检细胞的所述含末梢血试样与所述标记用物质在体外接触。

13.  如权利要求1所述的检测方法，其中，在选自由诱导胞吞作用的物质和具有细胞膜蛋白质稳定化作用的离子组成的组中的至少一种物质存在下使含有所述被检细胞的所述含末梢血试样与所述标记用物质在体外接触。

14.  如权利要求1所述的检测方法，其中，使用浓度为0.1μM～100mM的所述标记用物质使含有所述被检细胞的所述含末梢血试样与所述标记用物质在体外接触。

15.  如权利要求1所述的检测方法，其中，在1℃～42℃的条件下使所述标记用物质摄入到所述被检细胞内而进行标记。

16.  如权利要求1所述的检测方法，其中，用1分钟～5小时使所述标记用物质摄入到所述被检细胞内而进行标记。

17.  一种癌细胞检测用试剂盒，其含有标记用物质以及选自由细胞种类识别用抗体和清洗液组成的组中的至少一种物质，所述标记用物质为选自由标记化的糖和标记化的氨基酸组成的组中的至少一种物质。

癌细胞的检测方法
本申请是申请日为2011年12月22日、申请号为201180061918.1(国际申请号为PCT/JP2011/079912)、发明名称为“癌细胞的检测方法”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及癌细胞的检测方法。
背景技术
日本专利第3834326号公报中公开了使用免疫微珠回收癌细胞后用抗体进行免疫染色等来检测的方法。日本特开2001-41959号公报中公开了通过使固定有特异性地结合癌细胞的配体的载体与含有癌细胞的液体接触而对载体上结合的癌细胞进行标记来检测癌细胞的方法。此外，还有利用细胞的大小与正常细胞分离后通过免疫染色进行检测的方法、通过密度梯度离心分离后进行免疫染色的方法等。另外，作为血液中含有的癌细胞的检测方法，例如，日本专利第3867968号公报中公开了使用腺病毒感染癌细胞使其表达荧光蛋白质而进行检测的方法。
发明内容
发明所要解决的问题
但是，对于日本专利第3834326号公报中记载的技术和其他使用免疫染色的方法而言，如果不表达抗原则无法进行检测，即使是检测时也需要预先确定靶抗原，并且只能检测带有该标靶的细胞。对于日本特开2001-41959号公报中公开的技术那样利用固定有特异性地结合癌细胞的配体的载体的方法而言，需要预先制备这样的载体。另外，对于日本专利第3867968号公报中记载的技术而言，为了感染病毒而 需要进行培养，在荧光测定之前需要约24小时的时间。
因此，本发明的目的在于提供能够在短时间内简便地检测末梢血中的癌细胞的癌细胞检测方法。
用于解决问题的手段
本发明如下所述。
[1]一种癌细胞的检测方法，包括如下步骤：使含有被检细胞的含末梢血试样与标记用物质在体外接触，使所述标记用物质摄入到所述被检细胞内而对所述被检细胞进行标记、以及从所述被检细胞中检测出由所述标记用物质标记的程度强于含末梢血试样中的正常细胞的标记程度的细胞作为癌细胞。
[2]如[1]所述的检测方法，其中，所述标记用物质为用荧光物质标记的物质或荧光物质的前体物质，所述检测得到由所述荧光物质标记的所述被检细胞的荧光强度。
[3]如[1]或[2]所述的检测方法，其中，所述标记用物质为用荧光物质标记的物质或荧光物质的前体物质，所述检测得到选自由由所述荧光物质标记的所述被检细胞的平均荧光强度和总荧光强度组成的组中的至少一种荧光强度。
[4]如[1]～[3]中任一项所述的检测方法，其中，所述检测还基于由所述荧光物质标记的所述被检细胞的大小来进行。
[5]如[1]～[4]中任一项所述的检测方法，其中，所述标记用物质为选自由标记化的糖、标记化的氨基酸和摄入到细胞内后代谢成原卟啉9的物质组成的组中的至少一种物质。
[6]如[1]～[5]中任一项所述的检测方法，其中，所述标记用物质为标记化的糖和标记化的氨基酸。
[7]如[1]～[6]中任一项所述的检测方法，其中，所述标记用物质为所述标记化的糖，所述标记化的糖为标记化的单糖。
[8]如[1]～[7]中任一项所述的检测方法，其中，所述标记用物质为所述标记化的糖，所述标记化的糖为荧光标记的葡萄糖衍生物。
[9]如[1]～[8]中任一项所述的检测方法，其中，所述标记用物质为标记化的氨基酸，所述氨基酸为选自由天然氨基酸和非天然氨基酸组成的组中的至少一种氨基酸。
[10]如[1]～[9]中任一项所述的检测方法，其中，所述标记用物质为标记化的氨基酸，所述氨基酸为选自由中性氨基酸和酸性氨基酸组成的组中的至少一种氨基酸。
[11]如[1]～[10]中任一项所述的检测方法，其中，所述标记用物质为摄入到细胞内后代谢成原卟啉9的物质，所述物质为选自由氨基乙酰丙酸及其衍生物组成的组中的至少一种物质。
[12]如[1]～[11]中任一项所述的检测方法，其中，所述标记用物质为摄入到细胞内后代谢成原卟啉9的物质，所述物质为氨基乙酰丙酸及其衍生物，所述氨基乙酰丙酸及其衍生物为选自由它们的盐、它们的酯和它们的酯的盐组成的组中的至少一种物质。
[13]如[1]～[12]中任一项所述的检测方法，其中，含有所述被检细胞的所述含末梢血试样进行了溶血处理。
[14]如[1]～[13]中任一项所述的检测方法，其中，包括使细胞种类识别用抗体与含有所述被检细胞的所述含末梢血试样在体外接触的步骤。
[15]如[14]所述的检测方法，其中，所述细胞种类识别用抗体为选自由抗CD45抗体和抗CD34抗体组成的组中的至少一种抗体。
[16]如[1]～[15]中任一项所述的检测方法，其中，在铁离子和还原剂存在下使含有所述被检细胞的所述含末梢血试样与所述标记用物质在体外接触。
[17]如[1]～[16]中任一项所述的检测方法，其中，在选自由诱导胞吞作用的物质和具有细胞膜蛋白质稳定化作用的离子组成的组中的至少一种物质存在下使含有所述被检细胞的所述含末梢血试样与所述标记用物质在体外接触。
[18]如[1]～[17]中任一项所述的检测方法，其中，使用浓度为0.1μM～100mM的所述标记用物质使含有所述被检细胞的所述含末梢血试样与所述标记用物质在体外接触。
[19]如[1]～[18]中任一项所述的检测方法，其中，在1℃～42℃的条件下使所述标记用物质摄入到所述被检细胞内而进行标记。
[20]如[1]～[19]中任一项所述的检测方法，其中，用1分钟～5小时使所述标记用物质摄入到所述被检细胞内而进行标记。
[21]一种癌细胞检测用试剂盒，其含有标记用物质以及选自由细胞种类识别用抗体和清洗液组成的组中的至少一种物质。
发明效果
根据本发明，能够提供能在短时间内简便地检测末梢血中的癌细胞的癌细胞检测方法。
附图说明
图1是表示本发明的图像处理的内容的流程图。
图2是表示本发明的图像处理的另一例的内容的流程图。
图3是表示本发明的图像处理的另一例的内容的流程图。
图4是本发明的实施例的癌细胞系与血细胞的混合液(试样1)的荧光显微镜照片图像(相位差观察)。
图5是本发明的实施例的摄入2-NBDG后的试样1的荧光显微镜照片图像(荧光观察)。
图6是本发明的实施例的抗EpCAM抗体染色后的试样1的荧光显微镜照片图像(荧光观察)。
图7是表示本发明的实施例的氨基乙酰丙酸的反应性的图。
图8是表示本发明的实施例的氨基乙酰丙酸的反应性的图。
图9是表示本发明的实施例的氨基乙酰丙酸的反应性的图。
具体实施方式
本发明的癌细胞检测方法包括如下步骤：使含有被检细胞的含末梢血试样与标记用物质在体外接触、使上述标记用物质摄入到上述被检细胞内而对上述被检细胞进行标记、以及从上述被检细胞中检测出由上述标记用物质标记的程度强于含末梢血试样中的正常细胞的标记 程度的细胞作为癌细胞。
本发明的癌细胞检测方法中，在体外使标记用物质摄入到末梢血细胞中的被检细胞内，并检测出标记程度强于正常细胞的标记程度的细胞作为癌细胞。一般而言，癌细胞的代谢速度比正常细胞的代谢速度快，因此标记用物质的摄入量比正常细胞的摄入量多。另外，癌细胞具有不同于正常细胞的代谢途径，因此标记程度在癌细胞与正常细胞之间存在差异。
因此，根据本发明，无论有无癌细胞的表面抗原，并且不需要准备特殊的载体，能够基于由标记用物质标记的程度在短时间内简便地判断末梢血细胞中的被检细胞是癌细胞还是正常细胞。
本说明书中，“步骤”这一术语不仅包含独立的步骤，而且即使在无法与其他步骤明确区别的情况下，如果能实现本步骤的预期作用，则也包含在本术语中。
另外，本说明书中，使用“～”表示的数值范围表示分别包含“～”前后记载的数值作为最小值和最大值的范围。
另外，本说明书中，对于组合物中的各成分的量而言，在组合物中存在多种与各成分相当的物质的情况下，如果没有特别说明，则表示组合物中存在的该多种物质的总量。
本说明书中，假阳性是指癌细胞的检测时检测到癌细胞以外的细胞。
本发明中，“含末梢血试样”是指含有末梢血试样的试样。
以下，对本发明进行说明。
本发明的癌细胞检测方法包括如下步骤：使含有被检细胞的含末梢血试样与标记用物质在体外接触(以下也称为“接触步骤”)；使上述标记用物质摄入到上述被检细胞内(以下也称为“摄入步骤”)；根据需要使其代谢而对上述被检细胞进行标记(以下也称为“标记步骤”)；以及从上述被检细胞中检测出由上述标记用物质标记的程度强于含末梢血试样中的正常细胞的标记程度的细胞作为癌细胞(以下也称为“检测步骤”)。
由此，能够基于由标记用物质标记的程度在短时间内简便地判断含有末梢血试样的含末梢血试样中有无癌细胞的。
被检细胞为在末梢血中循环的细胞群。被检细胞中的癌细胞一般也称为循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell，CTC)，推测为转移性高的癌，但不限定于此。
本发明中，作为检测对象的癌细胞只要是末梢血中可能存在的癌细胞则没有特别限制。作为这样的癌，可以列举：脑肿瘤、神经胶质瘤、垂体腺瘤、听神经鞘瘤、视网膜母细胞瘤、葡萄膜恶性黑色素瘤、上咽癌、中咽癌、下咽癌、喉癌、肺癌、胸腺瘤、间皮瘤、乳腺癌、胃癌、食道癌、大肠癌、肝细胞癌、胆管癌、胆囊癌、胰腺癌、胰腺内分泌肿瘤、阴茎癌、肾盂/输尿管癌、肾细胞癌、睾丸肿瘤、前列腺癌、膀胱癌、外阴癌、子宫颈癌、子宫体癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、阴道癌、卵巢癌、卵巢胚细胞肿瘤、皮肤癌、表皮内癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、恶性黑色素瘤、蕈样肉芽肿、恶性骨肿瘤、软组织肉瘤、遗传性肿瘤、家族性肿瘤、原因不明癌、急性骨髄性白血病、急性淋巴性白血病、骨髓增生异常综合征、慢性骨髄性白血病/慢性骨髄增殖性疾病、成人T细胞白血病淋巴瘤、慢性淋巴性白血病、小细胞性淋巴瘤、多发性骨髓瘤等，但不限定于此。
本发明中的标记用物质只要是在摄入到癌细胞内后、在后述的检测步骤中使摄入该标记用物质后的该癌细胞能够被识别的物质即可。
作为上述标记用物质，只要是检测时能够识别的物质即可，可以是从摄入到癌细胞内之前就能够识别的物质(例如，用荧光物质标记的物质)和在摄入到癌细胞内之后能够识别的物质(例如，荧光物质的前体物质)中的任何一种物质。
作为从摄入到癌细胞内之前就能够识别的物质，可以列举例如：由公知的标记物质标记的糖(标记化的糖)、氨基酸(标记化的氨基酸)、核酸(标记化的核酸)、乙酸(标记化的乙酸)、胆碱(标记化的胆碱)、叶酸(标记化的叶酸)等。
另外，作为在摄入到癌细胞内之后能够识别的物质，可以列举例如摄入细胞内后代谢成原卟啉9的物质。
另外，从扩大作为本发明的检测方法的对象的癌细胞的种类和提高检测灵敏度的观点出发，可以组合使用上述标记化的糖和标记化的氨基酸作为标记用物质。
本发明中的标记化的糖只要是通过后述的方法将摄入到细胞内后能够用作成为细胞能量来源的营养素的糖进行标记而得到的糖即可。
作为上述糖，可以列举单糖、二糖或由约3个～约10个糖单元构成的寡糖等。另外，为了作为成为细胞能量来源的营养素、经常摄入并且以短时间的培养即可进行充分量的摄入，上述糖可以为单糖。单糖以外的糖可以修饰成能够摄入细胞内的形态。作为上述糖的例示，可以列举例如：葡萄糖、脱氧葡萄糖、葡糖胺、半乳糖、甘露糖、果糖、阿拉伯糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖等。另外，从例如向细胞内的摄入等观点出发，可以列举葡萄糖。
上述糖的标记只要是本领域中普遍使用的标记则没有特别限制，通常，可以使用用于标记生物物质的标记物质。作为这样的标记物质，可以列举催化显色反应的酶、荧光物质、放射性同位素、生物素等，在显微镜下的检测中优选酶、荧光物质或化学发光物质。这些标记中，优选利用荧光物质的标记。通过采用利用荧光物质的标记，能够基于例如荧光强度简便地进行检测。
作为荧光物质，可以列举：Alexa Fluor色素、绿色荧光蛋白(GFP)等荧光蛋白、异硫氰酸荧光素(FITC)等荧光素衍生物、罗丹明、藻红素(PE)、藻蓝素(PC)、Cy色素、德克萨斯红、别藻蓝素(APC)、量子点、氨甲基香豆素乙酸酯(AMCA)、Marina Blue、Cascade Blue、Cascade Yellow、Pacific Blue、SPRD、四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)、R110、mClB、CellTracker色素、CFSE、JC-1、PKH、DCFH-DA、DHR、FDA、钙黄绿素AM、硝基苯并二唑(NBD)基、二甲氨基磺酰基苯并二唑(DBD)基、苯并吖啶(Bacd)、吖啶(Acd)、丹磺酰(Dns)、7-二甲氨基香豆素-4-乙酸(DMACA)、5-((2-氨基乙基)氨基)萘-1-磺酸(EDANS)、萘(Nap)、蒽(Ant)、原卟啉9等荧光色素，但不限定于此。
作为荧光物质的前体物质，可以列举例如后述的摄入细胞内后生成原卟啉9的物质。
作为化学发光物质，可以列举鲁米诺、异鲁米诺、吖啶衍生物、洛芬碱、光泽精、过氧草酸酯等。
另外，作为上述酶的底物，可以使用二氨基联苯胺等。
在使用生物素作为标记物质的情况下，可以通过使其进一步与结合有亲和素的酶或荧光物质结合来进行检测。利用这些标记物质的标记化可以通过常规方法进行。
作为标记物质，可以使用例如具有N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基作为荧光发色团的标记物质。
作为标记化的糖，从例如向被检细胞内摄入的摄入效率等观点出发，可以使用荧光标记的葡萄糖或葡萄糖衍生物。另外，从例如稳定进行癌细胞的检测等观点出发，可以使用具有N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基作为荧光发色团的D-葡萄糖衍生物作为标记化的糖。
作为这样的D-葡萄糖衍生物，可以列举例如：2-[N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基]-2-脱氧-D-葡萄糖(2-NBDG，Yamada K.et al.,J.Biol.Chem.275:22278-22283,2000)、6-[N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基]-6-脱氧-D-葡萄糖(6-NBDG，Speizer L.et al.,Biochim.Biophys.Acta815:75-84,1985))等。
上述标记化的糖可以单独使用，也可以组合使用两种以上。
本发明中的标记化的氨基酸中，氨基酸可以是天然氨基酸和非天然氨基酸中的任何一种氨基酸。
作为上述天然氨基酸，可以列举：丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、蛋氨酸(Met)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)等中性氨基酸、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)等酸性氨基酸、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)等碱性氨基酸。
作为上述非天然氨基酸，只要是经由与上述天然氨基酸同样的氨基酸转运体转运到细胞内的氨基酸衍生物即可。作为上述非天然氨基 酸，可以列举例如：α-氨基环丁烷羧酸(ACBC)、α-氨基环戊烷羧酸(ACPC)、α-氨基异丁酸(AIB)等，但不限定于此。
与天然氨基酸同样，上述非天然氨基酸可以根据其化学性质分类为中性氨基酸、酸性氨基酸或碱性氨基酸，可以根据其分类与天然氨基酸同样地作为本发明的氨基酸使用。
从降低假阳性等观点出发，可以使用选自由中性氨基酸和酸性氨基酸组成的组中的氨基酸作为上述氨基酸。
另外，从提高阳性率等观点出发，可以使用选自由中性氨基酸和碱性氨基酸组成的组中的氨基酸作为上述氨基酸。
另外，从降低假阳性和提高阳性率等观点出发，可以使用选自由中性氨基酸组成的组中的氨基酸作为上述氨基酸。
上述氨基酸利用与上述标记化的糖同样的标记物质进行标记即可。从向被检细胞内摄入的摄入效率等观点出发，可以优选由苯并吖啶(Bacd)、吖啶(Acd)、7-二甲氨基香豆素-4-乙酸(DMACA)、5-((2-氨基乙基)氨基)萘-1-磺酸(EDANS)、萘(Nap)、蒽(Ant)标记，但不限定于此。
上述标记化的氨基酸可以单独使用，也可以组合使用两种以上。
作为本发明中的荧光物质的前体物质，可以列举例如“摄入细胞内后生成原卟啉9的物质”，作为“摄入细胞内后生成原卟啉9的物质”，可以列举例如氨基乙酰丙酸(5-氨基-4-氧代-戊酸)或其衍生物。另外，本说明书中，将“摄入细胞内后生成原卟啉9的物质”也称为“氨基乙酰丙酸及其衍生物”。
作为上述氨基乙酰丙酸及其衍生物，可以列举氨基乙酰丙酸及其 衍生物、氨基乙酰丙酸及其衍生物的盐、氨基乙酰丙酸及其衍生物的酯以及氨基乙酰丙酸的酯及其衍生物的酯的盐。
具体而言，可以列举：氨基乙酰丙酸、氨基乙酰丙酸甲酯、氨基乙酰丙酸乙酯、氨基乙酰丙酸丙酯、氨基乙酰丙酸己酯、氨基乙酰丙酸庚酯、氨基乙酰丙酸辛酯等氨基乙酰丙酸及其衍生物，可以列举：氨基乙酰丙酸甲酯、氨基乙酰丙酸乙酯、氨基乙酰丙酸丙酯、氨基乙酰丙酸己酯、氨基乙酰丙酸庚酯、氨基乙酰丙酸辛酯等氨基乙酰丙酸及其衍生物的酯，或者可以列举：它们的盐酸盐、磺酸盐、酯磷酸盐、酯磺酸盐、磷酸盐、硝酸盐、硫酸盐等氨基乙酰丙酸及其衍生物的盐、以及氨基乙酰丙酸的酯及其衍生物的酯的盐。
作为市售品，可以列举例如：コスモ·バイオ株式会社的氨基乙酰丙酸(商品名，5-氨基乙酰丙酸盐酸盐)、东京化成工业株式会社的氨基乙酰丙酸甲酯(商品名，5-氨基乙酰丙酸甲酯盐酸盐)等，但不限定于此。
另外，上述标记用物质可以单独使用上述标记化的糖、标记化的氨基酸或摄入细胞内后代谢成原卟啉9的物质，也可以组合使用两种以上的上述物质。
上述标记用物质可以组合使用上述标记化的糖和标记化的氨基酸。通过组合使用上述标记化的糖和标记化的氨基酸，减小受到据推测因癌细胞的种类而异的标记化的糖或标记化的氨基酸的摄入速度的影响的可能性。由此，使癌细胞的检测变得简便。另外，能够检测各种种类的癌细胞。
另外，从检测方法的简便化的观点出发，可以列举标记化的糖的标记所用的标记物质与标记化的氨基酸的标记所用的标记物质为具有同等荧光特性的标记物质的情况。作为具有同等荧光特性的标记物质的组合，只要是最大吸收波长之差为75nm以内且最大荧光波长之差为 150nm以内的组合即可，可以列举：硝基苯并二唑(NBD)基与苯并吖啶(Bacd)的组合、NBD基与异硫氰酸荧光素(FITC)的组合、NBD基与具有同样荧光特性的Alexa Fluor色素的组合、NBD基与绿色荧光蛋白(GFP)的组合、NBD基与钙黄绿素AM的组合、NBD基与FDA的组合、NBD基与具有同样荧光特性的量子点的组合、NBD基与具有同样荧光特性的CellTracker色素的组合、NBD基与A43的组合、NBD基与Fam的组合、Bacd基与FITC的组合、Bacd基与具有同样荧光特性的AlexaFluor色素的组合、Bacd基与GFP的组合、Bacd基与钙黄绿素AM的组合、Bacd基与具有同样荧光特性的量子点的组合、Bacd基与具有同样荧光特性的CellTracker色素的组合、Bacd基与A43的组合、Bacd基与Fam的组合、FITC与具有同样荧光特性的Alexa Fluor色素的组合、FITC与GFP的组合、FITC与钙黄绿素AM的组合、FITC与具有同样荧光特性的量子点的组合、FITC与具有同样荧光特性的CellTracker色素的组合、FITC与A43的组合、FITC与Fam的组合、GFP与具有同样荧光特性的Alexa Fluor色素的组合、钙黄绿素AM与具有同样荧光特性的Alexa Fluor色素的组合、A43与具有同样荧光特性的Alexa Fluor色素的组合、Fam与具有同样荧光特性的Alexa Fluor色素的组合、Pacific Blue与Cascade Blue的组合、Pacific Blue与Hoc的组合、Pacific Blue与具有同样荧光特性的Alexa Fluor色素的组合、Pacific Blue与具有同样荧光特性的量子点的组合、藻红素(PE)与四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)的组合、PE与具有同样荧光特性的Cy色素的组合、PE与具有同样荧光特性的Alexa Fluor色素的组合、PE与具有同样荧光特性的量子点的组合、PE与具有同样荧光特性的CellTracker色素的组合、PE与罗丹明的组合、PE与Tmr的组合、TRITC与罗丹明的组合、TRITC与Tmr的组合、TRITC与具有同样荧光特性的Cy色素的组合、TRITC与具有同样荧光特性的Alexa Fluor色素的组合、TRITC与具有同样荧光特性的量子点的组合、TRITC与具有同样荧光特性的CellTracker色素的组合、罗丹明与Tmr的组合、罗丹明与具有同样荧光特性的CellTracker色素的组合、罗丹明与具有同样荧光特性的量子点的组合、罗丹明与具有同样荧光特性的Cy色素的组合、 Tmr与具有同样荧光特性的CellTracker色素的组合、Tmr与具有同样荧光特性的量子点的组合、Tmr与具有同样荧光特性的Cy色素的组合、别藻蓝素(APC)与具有同样荧光特性的Alexa Fluor色素的组合、APC与具有同样荧光特性的量子点的组合、APC与具有同样荧光特性的CellTracker色素的组合、APC与具有同样荧光特性的Cy色素的组合、氨甲基香豆素乙酸酯(AMCA)与具有同样荧光特性的Alexa Fluor色素的组合、AMCA与具有同样荧光特性的量子点的组合、AMCA与具有同样荧光特性的Cy色素的组合、具有同样荧光特性的Alexa Fluor色素与量子点的组合、具有同样荧光特性的Alexa Fluor色素与CellTracker色素的组合、具有同样荧光特性的量子点与CellTracker色素的组合等组合，但不限定于此。
另外，从例如使后述的检测步骤简便化等观点出发，可以列举标记化的糖的标记所用的标记物质与标记化的氨基酸的标记所用的标记物质为同一标记物质的情况。
本发明中的检查对象末梢血试样相当于从被检体采集的血液。作为被检体，没有特别限制，除了可以是人以外，还可以是猿等灵长类、小鼠或大鼠等啮齿类、猪、牛或马等家畜动物、狗、猫或兔等宠物动物。
上述末梢血试样只要是通过通常的采集方法从静脉血采集的末梢血试样即可。为了调节末梢血试样的密度，可以利用适当的稀释液稀释至预定浓度。作为能够用于稀释上述末梢血的末梢血试样用稀释液，优选渗透压接近细胞的渗透压的稀释液，只要是通常使用的稀释液则没有特别限制，可以列举例如：生理盐水、磷酸缓冲液(PBS)、Tris-盐酸缓冲液、柠檬酸-磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液等。作为上述末梢血试样用稀释液的pH，一般为pH5～pH9的范围即可。
另外，对于上述末梢血试样而言，可以在与上述标记用物质接触 之前为了提高癌细胞密度而进行浓缩。作为浓缩的方法，使用通常采用的方法例如离心分离、过滤器分离即可。这种情况下，能够将作为检查对象的试样制备成癌细胞密度更高的试样。
另外，上述末梢血试样可以是在上述接触步骤之前进行了溶血处理的试样。通过对末梢血试样进行溶血处理，能够将占血细胞成分的大部分的红细胞除去。由此，能够降低因红细胞的存在而引起的假阳性率，从而能够实现癌细胞检测的简便化和检测灵敏度的提高。
作为上述溶血处理，可以使用公知的方法。例如，可以使用溶血剂对预先经过血细胞分离而得到的血细胞级分进行处理。使用溶血剂对血细胞级分进行处理的条件根据溶血剂的种类而不同，本领域技术人员可以适当选择。
作为上述溶血剂，可以使用公知的溶血剂，可以列举例如：氯化铵、氯化钠、草酸铵、皂甙、月桂基硫酸钠(SDS)等表面活性剂，其他市售的溶血剂例如イムノプレップ(贝克曼库尔特公司)、イムノライズ(贝克曼库尔特公司)、BD FACS(注册商标)、溶血素(BD公司)等。另外，从例如上述被检细胞的上述标记用物质的摄入效率、标记化的效率等观点出发，可以使用氯化铵、皂甙、溶血力弱的市售溶血剂作为溶血剂。
作为上述溶血剂的量，可以列举例如以使上述溶血剂的浓度(终浓度)为0.01质量％～10质量％的方式添加到上述末梢血试样中等。另外，从例如降低假阳性率等观点出发，作为溶血剂的量，可以优选设定为以终浓度计为0.05质量％～5质量％的范围。另外，从例如降低假阳性率和使癌细胞的检测简便化等观点出发，作为溶血剂的量，可以更优选设定为以终浓度计为0.1质量％～1质量％的范围。
上述接触步骤中，关于上述含末梢血试样与上述标记用物质的接触没有特别限制，通常，将预定浓度的上述标记用物质添加到含末梢 血试样中即可(以下也称为“添加步骤”)。
例如，以使上述标记用物质的浓度(终浓度)为0.1μM～100mM的方式添加到上述含末梢血试样中即可。例如，优选以使上述标记用物质的浓度(终浓度)为0.3μM～75mM的方式添加到上述含末梢血试样中即可。例如，更优选以使上述标记用物质的浓度(终浓度)为1μM～50mM的方式添加到上述含末梢血试样中即可。
在上述标记用物质为上述标记化的糖的情况下，从例如癌细胞的检测灵敏度等观点出发，可以使用浓度(终浓度)为0.01mM～100mM的上述标记化的糖。另外，从癌细胞的检测灵敏度和抑制假阳性率等观点出发，可以优选使用浓度(终浓度)为0.05mM～75mM的上述标记化的糖。另外，从癌细胞的检测灵敏度和抑制假阳性率等观点出发，可以更优选使用浓度(终浓度)为0.1mM～50mM的上述标记化的糖。
在上述标记用物质为上述标记化的氨基酸的情况下，从例如癌细胞的检测灵敏度等观点出发，可以使用浓度(终浓度)为0.1μM～100mM的上述标记化的氨基酸。另外，从癌细胞的检测灵敏度和抑制假阳性率等观点出发，可以优选使用浓度(终浓度)为0.5μM～50mM的上述标记化的氨基酸。另外，从癌细胞的检测灵敏度和抑制假阳性率等观点出发，可以更优选使用浓度(终浓度)为1μM～10mM的上述标记化的氨基酸。
在上述标记用物质为氨基乙酰丙酸及其衍生物的情况下，从例如癌细胞的检测灵敏度等观点出发，可以使用浓度(终浓度)为0.01mM～100mM的上述氨基乙酰丙酸及其衍生物。另外，从癌细胞的检测灵敏度和抑制假阳性率等观点出发，可以优选使用浓度(终浓度)为0.05mM～50mM的上述氨基乙酰丙酸及其衍生物。另外，从癌细胞的检测灵敏度和抑制假阳性率等观点出发，可以更优选使用浓度(终浓度)为0.1mM～10mM的上述氨基乙酰丙酸及其衍生物。
在上述标记用物质组合使用上述标记化的糖和上述标记化的氨基酸的情况下，从例如癌细胞的检测灵敏度等观点出发，可以使用浓度(终浓度)为0.1μM～100mM的上述标记化的糖和上述标记化的氨基酸。另外，从癌细胞的检测灵敏度和抑制假阳性率等观点出发，可以优选使用浓度(终浓度)为0.3μM～75mM的上述标记化的糖和上述标记化的氨基酸。另外，从癌细胞的检测灵敏度和抑制假阳性率等观点出发，可以更优选使用浓度(终浓度)为1μM～50mM的上述标记化的糖和上述标记化的氨基酸。
上述添加步骤中，可以使细胞种类识别用抗体与含有上述被检细胞的上述含末梢血试样在体外接触。
通过使细胞种类识别用抗体与含有上述被检细胞的上述含末梢血试样接触，能够个别地标记并识别末梢血试样中存在的各种种类的细胞。由此，能够实现例如假阳性率的降低和癌细胞检测的简便化等。
上述细胞种类识别用抗体利用上述标记化的糖中说明过的标记物质进行标记即可。
作为上述细胞种类识别用抗体，只要是能够个别地标记并识别末梢血细胞中存在的各种种类的细胞的细胞种类识别用抗体即可，可以列举例如用于降低假阳性率的上述细胞种类识别用抗体、用于使癌细胞的检测简便化的上述细胞种类识别用抗体等。
作为用于降低假阳性率的上述细胞种类识别用抗体，只要是识别血细胞级分中含有的癌细胞以外的细胞的抗体，则可以使用任何一种抗体。可以列举例如抗CD45抗体、抗CD34抗体、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD14抗体、抗CD20抗体、抗CD36抗体、抗CD41抗体、抗CD309抗体等。从例如总括性识别难以利用溶血剂除去的白细 胞、血管内皮细胞、血管内皮前体细胞、未分化白细胞、造血系统细胞等观点出发，可以使用选自由抗CD45抗体和抗CD34抗体组成的组中的至少一种抗体作为用于上述降低假阳性率的上述细胞种类识别用抗体。
作为用于使癌细胞的检测简便化的上述细胞种类识别用抗体，只要是已知特异性识别各种癌细胞的抗体，则可以使用任何一种抗体。可以列举例如：抗细胞角蛋白(CK)抗体、抗上皮细胞粘附分子(EpCAM)抗体、抗癌胚抗原(CEA)抗体、抗前列腺特异抗原(PSA)抗体、抗粘蛋白(MUC)抗体、抗p53抗体、抗唾液酸化路易斯X抗体、抗MAGE(Melanoma-associated antigen，黑色素瘤相关抗原)抗体、抗MMP(Matrix metalloproteinase，基质金属蛋白酶)抗体、抗甲胎蛋白(AFP)抗体、抗表皮生长因子受体(EGFR)抗体、抗表皮生长因子受体(EGFR)抗体、抗表皮生长因子受体(EGFR)抗体、抗HER2抗体、抗HER3抗体、抗叶酸受体抗体、抗TROP-2抗体、抗c-kit抗体、抗c-met抗体、抗CA-125抗体、抗CA-19抗体、抗E-钙粘蛋白抗体、抗N-钙粘蛋白抗体、抗雌激素受体(ER)抗体、抗热休克蛋白(HSP)抗体、抗胰岛素样生长因子受体(IGFR)抗体、抗Ki-67抗体、抗存活素抗体、抗波形蛋白抗体、抗端粒酶逆转录酶(TERT)抗体等。从例如能够广泛检测癌细胞的观点出发，可以使用选自由抗细胞角蛋白(CK)抗体、抗上皮细胞粘附分子(EpCAM)抗体、抗波形蛋白抗体和抗N-钙粘蛋白抗体组成的组中的至少一种抗体作为用于使癌细胞的检测简便化的上述细胞种类识别用抗体。
上述细胞种类识别用抗体可以单独使用，也可以组合使用两种以上。
在上述标记用物质为上述氨基乙酰丙酸及其衍生物的情况下，可以在铁离子和还原剂存在下进行上述接触步骤。
通过在铁离子和还原剂存在下进行上述靶细胞与上述氨基乙酰丙酸及其衍生物的上述接触步骤，使铁离子在还原剂作用下以二价的状态稳定化，因此，在正常细胞中，使暂时生成的原卟啉9快速地代谢掉，因此推测能够抑制假阳性。
作为上述还原剂，可以列举例如：抗坏血酸、抗坏血酸硬脂酸酯、生育酚、卵磷脂、儿茶素、柠檬酸、草酸、葡萄糖、谷胱甘肽、异抗坏血酸、二丁基羟基甲苯(BHT)、丁基羟基茴香醚等。从能够在水溶液中使铁离子稳定地维持于二价的状态、还原力强且细胞毒性低的观点出发，可以优选使用抗坏血酸、异抗坏血酸、儿茶素、柠檬酸等。另外，可以更优选使用抗坏血酸等。
这种情况下，铁离子的浓度为0.01mM～100mM即可，抗坏血酸的浓度为0.01mM～100mM即可。
另外，从例如抑制假阳性率等观点出发，优选铁离子可以使用二价铁离子，该二价铁离子的浓度为0.05mM～50mM即可，抗坏血酸的浓度为0.05mM～50mM即可。另外，从例如抑制假阳性率等观点出发，更优选铁离子可以使用二价铁离子，该二价铁离子的浓度为0.1mM～10mM即可，抗坏血酸的浓度为0.1mM～10mM即可。
在上述标记用物质为上述氨基乙酰丙酸及其衍生物的情况下，可以在选自由诱导胞吞作用的物质和具有细胞膜蛋白质稳定化作用的离子组成的组中的至少一种物质存在下进行上述接触步骤。
通过在选自由上述诱导胞吞作用的物质和上述具有细胞膜蛋白质稳定化作用的离子组成的组中的至少一种物质存在下进行上述靶细胞与上述氨基乙酰丙酸及其衍生物的上述接触步骤，推测氨基乙酰丙酸及其衍生物向靶细胞中的摄入得到促进。另外，在使用氨基乙酰丙酸及其衍生物的情况下，为进行检测步骤需要将它们转变成原卟啉9，可 以使上述靶细胞与上述氨基乙酰丙酸及其衍生物接触并且进行温育。这样，氨基乙酰丙酸的摄入得到促进，由此能够缩短氨基乙酰丙酸及其衍生物与靶细胞的接触(温育)时间，从而使氨基乙酰丙酸及其衍生物的反应性提高。
上述诱导胞吞作用的物质为促进物质向细胞中摄入的物质，可以列举例如两亲性肽、阳离子性脂质、胆固醇、中性磷脂、中性脂质等。
作为市售品，可以列举例如：GeneTools公司的两亲性肽(商品名Endo-Porter)、GeneTools公司的两亲性肽(商品名Endo-Porter Aqueous)、英杰公司的阳离子性脂质(商品名Lipofectin Reagent)、英杰公司的阳离子性脂质(商品名Lipofectamine2000Reagent)、罗氏公司的阳离子性脂质(商品名DOTAP Liposomal Transfection Reagent)等，但不限定于此。
作为上述诱导胞吞作用的物质的浓度，可以以使上述诱导胞吞作用的物质的终浓度为0.1μM～20mM的方式添加到上述接触前的细胞悬浊液中。另外，从例如提高氨基乙酰丙酸向被检细胞中摄入的摄入效率等观点出发，作为上述诱导胞吞作用的物质的浓度(终浓度)，可以优选添加1μM～10mM。另外，从例如提高氨基乙酰丙酸向被检细胞中摄入的摄入效率等观点出发，作为上述诱导胞吞作用的物质的浓度(终浓度)，可以更优选添加5μM～2mM。
上述具有细胞膜蛋白质稳定化作用的离子为能够使细胞膜蛋白质上存在的细胞粘附因子的结构稳定化或者能够使ATP分解酶那样的细胞内外的物质的转运体保持活化状态的物质。
作为上述具有细胞膜蛋白质稳定化作用的离子，可以列举Mg离子、Ca离子。
作为上述Mg离子的浓度，可以以使上述Mg离子的终浓度为 0.1mM～10mM的方式添加到上述接触前的细胞悬浊液中。另外，从例如提高氨基乙酰丙酸及其衍生物向被检细胞中摄入的摄入效率等观点出发，作为上述Mg离子的浓度(终浓度)，可以优选添加0.15mM～5mM。另外，从例如提高氨基乙酰丙酸及其衍生物向被检细胞中摄入的摄入效率等观点出发，作为上述Mg离子的浓度(终浓度)，可以更优选添加0.25mM～1mM。
作为上述Ca离子的浓度，可以以使上述Ca离子的终浓度为0.1mM～10mM的方式添加到上述接触前的细胞悬浊液中。另外，从例如提高氨基乙酰丙酸及其衍生物向被检细胞中摄入的摄入效率等观点出发，作为上述Ca离子的浓度(终浓度)，可以优选添加0.25mM～5mM。另外，从例如提高氨基乙酰丙酸及其衍生物向被检细胞中摄入的摄入效率等观点出发，作为上述Ca离子的浓度(终浓度)，可以更优选添加0.5mM～2mM。
上述诱导胞吞作用的物质和上述具有细胞膜蛋白质稳定化作用的离子可以单独使用，也可以组合使用两种以上。从例如使被检细胞的细胞膜稳定化等观点出发，可以组合使用上述Mg离子与上述Ca离子。
标记步骤中，使上述标记用物质摄入到上述含末梢血试样中的上述被检细胞中而对其进行标记。对于上述标记用物质的摄入而言，只要维持上述标记用物质与上述被检细胞的接触状态即可。在此，作为接触状态下的温度条件，只要是使上述被检细胞进行上述标记用物质的摄入从而能够利用上述标记用物质进行标记的条件即可。对于这样的温度条件而言，可以在例如1℃～42℃的条件下进行。
在上述标记用物质为上述标记化的糖的情况下，从例如癌细胞的检测灵敏度等观点出发，可以在1℃～42℃的温度下进行上述摄入步骤和上述标记步骤。另外，从例如提高癌细胞的检测灵敏度和抑制假阳性率等观点出发，可以优选在2℃～40℃的温度下进行上述摄入步骤和 上述标记步骤。另外，从例如提高癌细胞的检测灵敏度和抑制假阳性率等观点出发，可以更优选在4℃～37℃的温度下进行上述摄入步骤和上述标记步骤。
在上述标记用物质为上述标记化的氨基酸的情况下，从例如癌细胞的检测灵敏度等观点出发，可以在1℃～42℃的温度下进行上述摄入步骤和上述标记步骤。另外，从例如提高癌细胞的检测灵敏度和抑制假阳性率等观点出发，可以优选在2℃～40℃的温度下进行上述摄入步骤和上述标记步骤。另外，从例如提高癌细胞的检测灵敏度和抑制假阳性率等观点出发，可以更优选在4℃～37℃的温度下进行上述摄入步骤和上述标记步骤。
在上述标记用物质为上述氨基乙酰丙酸及其衍生物的情况下，从例如癌细胞的检测灵敏度等观点出发，可以在30℃～42℃的温度下进行上述摄入步骤和上述标记步骤。另外，从例如提高癌细胞的检测灵敏度和抑制假阳性率等观点出发，可以优选在33℃～42℃的温度下进行上述摄入步骤和上述标记步骤。另外，从例如提高癌细胞的检测灵敏度和抑制假阳性率等观点出发，可以更优选在35℃～40℃的温度下进行上述摄入步骤和上述标记步骤。
在上述标记用物质组合使用上述标记化的糖和上述标记化的氨基酸的情况下，从例如癌细胞的检测灵敏度等观点出发，可以在1℃～42℃的温度下进行上述摄入步骤和上述标记步骤。另外，从例如提高癌细胞的检测灵敏度和抑制假阳性率等观点出发，可以优选在2℃～40℃的温度下进行上述摄入步骤和上述标记步骤。另外，从例如提高癌细胞的检测灵敏度和抑制假阳性率等观点出发，可以更优选在4℃～37℃的温度下进行上述摄入步骤和上述标记步骤。
作为接触时间，只要为能够使上述被检细胞进行上述标记用物质的摄入并根据需要在细胞内代谢从而使正常细胞由标记用物质标记的 程度与癌细胞由标记用物质标记的程度产生差异的程度即可，例如，可以使接触时间为1分钟～5小时。另外，从例如提高癌细胞的检测灵敏度和抑制假阳性率等观点出发，可以优选使接触时间为2分钟～120分钟。另外，从例如提高癌细胞的检测灵敏度和抑制假阳性率等观点出发，可以更优选使接触时间为3分钟～90分钟。
在上述标记用物质为上述标记化的糖的情况下，从例如癌细胞的检测灵敏度等观点出发，可以使接触时间为1分钟～2小时。另外，从例如提高癌细胞的检测灵敏度和抑制假阳性率等观点出发，可以优选使接触时间为2分钟～60分钟。另外，从例如提高癌细胞的检测灵敏度和抑制假阳性率等观点出发，可以更优选使接触时间为3分钟～30分钟。
在上述标记用物质为上述标记化的氨基酸的情况下，从例如癌细胞的检测灵敏度等观点出发，可以使接触时间为1分钟～2小时。另外，从例如提高癌细胞的检测灵敏度和抑制假阳性率等观点出发，可以优选使接触时间为2分钟～60分钟。另外，从例如提高癌细胞的检测灵敏度和抑制假阳性率等观点出发，可以更优选使接触时间为3分钟～30分钟。
在上述标记用物质为上述氨基乙酰丙酸及其衍生物的情况下，从例如癌细胞的检测灵敏度等观点出发，可以使接触时间为10分钟～5小时。另外，从例如提高癌细胞的检测灵敏度和抑制假阳性率等观点出发，可以优选使接触时间为15分钟～120分钟。另外，从例如提高癌细胞的检测灵敏度和抑制假阳性率等观点出发，可以更优选使接触时间为30分钟～90分钟。另外，上述标记用物质为上述氨基乙酰丙酸及其衍生物时的“接触时间”需要为能够使上述被检细胞进行上述标记用物质的摄入且能够在细胞内代谢从而使正常细胞由标记用物质标记的程度与癌细胞由标记用物质标记的程度产生差异的程度。
在上述标记用物质组合使用上述标记化的糖和上述标记化的氨基 酸的情况下，从例如癌细胞的检测灵敏度等观点出发，可以使接触时间为1分钟～2小时。另外，从例如提高癌细胞的检测灵敏度和抑制假阳性率等观点出发，可以优选使接触时间为2分钟～60分钟。另外，从例如提高癌细胞的检测灵敏度和抑制假阳性率等观点出发，可以更优选使接触时间为3分钟～30分钟。
在上述标记用物质为上述标记化的糖的情况下，可以使标记化的糖的终浓度为0.01mM～100mM，接触时间为1分钟～2小时，接触温度为1℃～42℃。另外，从例如癌细胞的检测灵敏度等观点出发，可以优选使标记化的糖的终浓度为0.05mM～75mM，接触时间为2分钟～60分钟，接触温度为2℃～40℃。另外，从例如癌细胞的检测灵敏度等观点出发，可以更优选使上述标记化的糖的终浓度为0.1mM～50mM，接触时间为3分钟～30分钟，接触温度为4℃～37℃。
在上述标记用物质为上述标记化的氨基酸的情况下，可以使上述标记化的氨基酸的终浓度为0.1μM～100mM，接触时间为1分钟～2小时，接触温度为1℃～42℃。另外，从例如癌细胞的检测灵敏度等观点出发，可以优选使上述标记化的氨基酸的终浓度为0.5mM～50mM，接触时间为2分钟～60分钟，接触温度为2℃～40℃。另外，从例如癌细胞的检测灵敏度等观点出发，可以更优选使上述标记化的氨基酸的终浓度为1μM～10mM，接触时间为3分钟～30分钟，接触温度为4℃～37℃。
在上述标记用物质为上述氨基乙酰丙酸及其衍生物的情况下，可以使氨基乙酰丙酸及其衍生物的终浓度为0.01mM～100mM，接触时间为10分钟～5小时，接触温度为30℃～42℃。另外，从例如癌细胞的检测灵敏度等观点出发，可以优选使氨基乙酰丙酸及其衍生物的终浓度为0.05mM～50mM，接触时间为15分钟～120分钟，接触温度为33℃～42℃。另外，从例如癌细胞的检测灵敏度等观点出发，可以更优选使氨基乙酰丙酸及其衍生物的终浓度为0.1mM～10mM，接触时间为30分钟～90分钟，接触温度为35℃～40℃。
在上述标记用物质组合使用上述标记化的糖和上述标记化的氨基酸的情况下，可以使上述标记化的糖和上述标记化的氨基酸的终浓度为0.1μM～100mM，接触时间为1分钟～2小时，接触温度为1℃～42℃。另外，从例如癌细胞的检测灵敏度等观点出发，可以优选使上述标记化的糖和标记化的氨基酸的终浓度为0.5μM～75mM，接触时间为2分钟～60分钟，接触温度为2℃～40℃。另外，从例如癌细胞的检测灵敏度等观点出发，可以更优选使上述标记化的糖和标记化的氨基酸的终浓度为1μM～50mM，接触时间为3分钟～30分钟，接触温度为4℃～37℃。
检测步骤中，从被检细胞中检测出由上述标记用物质标记的程度强于正常细胞的标记程度的细胞作为癌细胞。
一般认为癌细胞的代谢速度为被检细胞中的正常细胞的3倍～8倍，因此上述标记用物质的摄入量也多于正常细胞。另外，癌细胞具有不同于正常细胞的代谢途径，因此癌细胞的标记程度不同于正常细胞的标记程度。因此，检测步骤中，将这种由上述标记用物质标记的程度强于正常细胞的标记程度的细胞与正常细胞识别开，将其检测为癌细胞。由此可知末梢血细胞中是否存在癌细胞。
由上述标记用物质标记的程度采用与上述标记用物质中的标记物质的种类相应的标记的程度即可。例如，在上述标记物质为酶的情况下，可以添加针对该酶的底物使其反应，并将所产生的发色的程度作为由上述标记用物质标记的程度。另外，在上述标记物质为上述荧光物质的情况下，可以使上述标记用物质摄入到上述被检细胞内，根据需要对在细胞内代谢后的试样照射激发光，将所产生的荧光的强度作为由上述标记用物质标记的程度。
在此，基于发色程度或荧光强度的癌细胞的检测可以通过目视观 察来进行，也可以通过各自测定吸光度或荧光强度而得到的测定值来进行。
本发明的检测方法中，检测出由上述标记用物质标记的程度强于正常细胞的标记程度的细胞作为癌细胞。从可靠地检测癌细胞的观点出发，细胞的检测可以为由上述荧光物质标记的上述被检细胞的荧光强度的检测。
另外，从癌细胞的检测精度的观点出发，上述细胞的检测可以为由上述荧光物质标记的上述被检细胞的平均荧光强度的检测和上述荧光物质的总荧光强度的检测中的至少一种检测。
从简便地除去噪声或除去血小板的观点出发，可以在上述细胞的检测的基础上，基于由上述荧光物质标记的上述被检细胞的大小实施上述细胞的检测。具体而言，可以通过提取出由上述标记用物质标记的光点的集合的直径大于例如1μm～10μm的光点作为目标来实施检测，可以优选通过提取出由上述标记用物质标记的光点的集合的直径大于2μm～9μm的光点作为目标来实施检测，可以更优选通过提取出由上述标记用物质标记的光点的集合的直径大于3μm～8.5μm的光点作为目标来实施检测。
本发明的检测方法中，在使用上述标记化的糖作为上述标记用物质的情况下，可以检测出上述标记用物质的摄入量多于正常细胞的细胞作为癌细胞。为了可靠地检测癌细胞，对于细胞的检测而言，优选检测出上述标记化的糖的摄入量比正常细胞至少多2倍的细胞作为癌细胞，更优选检测出上述标记化的糖的摄入量比正常细胞至少多3倍的细胞作为癌细胞，进一步优选检测出上述标记化的糖的摄入量比正常细胞至少多5倍的细胞作为癌细胞。
末梢血中的正常细胞由上述标记用物质标记的程度可以以健全被 检体的末梢血中通常可能存在的细胞为基准。另外，在同一条件下由上述标记用物质标记的程度已经通过文献等公知的情况下，可以应用该文献值。
作为末梢血中的正常细胞，是指健全被检体的末梢血中通常可能存在且未癌化的细胞，可以列举例如：红细胞、白细胞(淋巴细胞、单核细胞、粒细胞)、血小板、血管内皮细胞、血管内皮前体细胞、未分化白细胞、未分化红细胞、造血干细胞等。对于这些细胞种类而言，如果是正常细胞，则由上述标记用物质标记的程度观察不到大的差异，因此可以选择任何一个细胞种类作为正常细胞。例如，可以将白细胞的标记程度作为正常细胞的标记程度。
本发明的癌细胞的检测方法可以包括对检测到的癌细胞进行分离的步骤。由此，能够提供例如用于进一步研究检测到的癌细胞的状态、种类等的试样。
作为分离检测到的癌细胞的方法，可以选择与上述标记用物质的种类相应的分离方法，也可以选择不拘泥于上述标记用物质的种类的分离方法。作为与上述标记用物质的种类相应的分离方法，例如，在上述标记用物质用荧光物质标记的情况下，可以应用细胞分选仪等基于荧光强度对细胞进行分离的本领域中已知的方法。另外，作为不拘泥于上述标记用物质的种类的分离方法，可以应用基于细胞的大小、形态的分离方法。
如上所述，本发明的癌检测方法中，能够高效地检测末梢血试样中的癌细胞。另外，上述癌检测方法中，能够以良好的灵敏度检测末梢血试样中的癌细胞，例如，可以在癌细胞密度为0.01个/mL～10000个/mL的试样中适当地检测出癌细胞，优选在癌细胞密度为0.05个/mL～5000个/mL的试样中适当地检测出癌细胞，更优选在癌细胞密度为0.1个/mL～1000个/mL的试样中适当地检测出癌细胞。
本发明的癌细胞的检测方法可以利用图像分析装置来执行。图像分析装置可以由CPU、存储有用于实现后述的图像分析处理例程的程序的ROM、暂时存储数据的RAM和包含HDD等存储装置的计算机构成。
在此，对应用本发明的图像分析装置的作用进行说明。对含有被检细胞的含末梢血试样的同一视野拍摄荧光图像和亮视野图像时，在图像分析装置中执行图1、图2和图3所示的图像分析处理例程。
在步骤100中，获取所拍摄的荧光图像和亮视野图像。接着，在步骤102中，从上述步骤100中获取的荧光图像中提取出荧光强度(亮度值)为预先确定的阈值Pth以上的像素(光点)。本步骤为用于从荧光图像中除去噪声的处理，对于阈值Pth，根据亮度值的范围等预先确定适合用于除去噪声的值。作为阈值Pth，例如可以以荧光强度为100～3000、优选150～2500、更优选180～2200的值进行设定。
接着，在步骤104中，将使上述步骤102中提取出的相邻的光点相互结合而成且为预定大小以上的光点的集合作为目标提取出来。另外，对提取出的各目标赋予用于识别各目标的识别编号。是否为预定大小可以通过例如光点的集合的直径是否为预先确定的阈值Rth以上来进行判定。阈值Rth可以考虑图像的倍率并基于该光点的集合所表示的细胞的大小来确定，例如，可以设定为与1μm～10μm、优选2μm～9μm、更优选3μm～8.5μm相对应的图像上的长度。另外，不限于使用光点的集合的直径的情况，也可以通过光点的集合中包含的全部像素数是否为预定数以上来判定是否为预定大小以上。
接着，在步骤106中，用上述步骤104中提取出的各目标中包含的各像素的荧光强度之和除以各目标中包含的像素数，算出平均荧光强度。
接着，在步骤108中，基于上述步骤106中算出的各目标的平均荧光强度，设定用于检测癌细胞的检测阈值α。作为检测阈值α，例如可以设定各目标的平均荧光强度的平均值、最小值等，例如可以设定为100～3000，优选设定为150～2500，更优选设定为180～2200。
接着，在步骤110中，检测出平均荧光强度为上述步骤108中设定的检测阈值α以上的目标作为癌细胞，并且计数其数量。
接着，在步骤112中，计数上述步骤100中获取的亮视野图像内的全部细胞数。
接着，在步骤114中，基于上述步骤110中计数的作为癌细胞提取出的目标数和上述步骤112中计数的全部细胞数，算出癌细胞阳性率或血细胞阴性率，从而结束图像分析处理例程。
另外，在上述步骤108中，对计算各目标的平均荧光强度的情况进行了说明，但也可以计算各目标中包含的各像素的荧光强度之和即总荧光强度。
在此，将在仅使用癌细胞和仅使用健全被检体的含末梢血试样的情况下、即从亮视野图像中提取出的全部细胞均为癌细胞或健全被检体的含末梢血试样的情况下通过上述的图像分析处理算出的癌细胞阳性率和血细胞阴性率的结果的一例示于表1中。
另外，作为不设定上述步骤108中进行的用于检测癌细胞的检测阈值α的方法，执行图2所示的图像分析处理例程。
在步骤200中，获取所拍摄的荧光图像和亮视野图像。接着，在步骤202中，从上述步骤200中获取的荧光图像中提取出荧光强度(亮 度值)为预先确定的阈值Pth以上的像素(光点)。本步骤为用于从荧光图像中除去噪声的处理，对于阈值Pth，根据亮度值的范围等预先确定适合用于除去噪声的值。作为阈值Pth，例如可以以荧光强度为100～2000、优选150～1500、更优选180～1000的值进行设定。
接着，在步骤204中，将使上述步骤202中提取出的相邻的光点相互结合而成且为预定大小以上的光点的集合作为目标提取出来。另外，对提取出的各目标赋予用于识别各目标的识别编号。是否为预定大小可以通过例如光点的集合的直径是否为预先确定的阈值Rth以上来进行判定。阈值Rth可以考虑图像的倍率并基于该光点的集合所表示的细胞的大小来确定，例如，可以设定为与1μm～10μm、优选2μm～9μm、更优选3μm～8.5μm相对应的图像上的长度。另外，不限于使用光点的集合的直径的情况，也可以通过光点的集合中包含的全部像素数是否为预定数以上来判定是否为预定大小以上。
接着，在步骤206中，检测出光点的集合的直径为上述步骤204中设定的直径的目标作为癌细胞，并且计数其数量。
接着，在步骤208中，计数上述步骤200中获取的亮视野图像内的全部细胞数。
接着，在步骤210中，基于上述步骤206中计数的作为癌细胞提取出的目标数和上述步骤208中计数的全部细胞数，算出癌细胞阳性率或血细胞阴性率，从而结束图像分析处理例程。
另外，作为不设定上述步骤108中进行的用于检测癌细胞的检测阈值α而使用细胞种类识别用抗体的方法，执行图3所示的图像分析处理例程。
在步骤300中，获取所拍摄的亮视野图像、使用标记用物质而得 到的荧光图像、使用细胞种类识别用抗体(用于识别假阳性)而得到的荧光图像和使用细胞种类识别用抗体(用于检测癌细胞)而得到的荧光图像。接着，在步骤302中，从使用上述步骤300中获取的标记用物质而得到的荧光图像中提取出荧光强度(亮度值)为预先确定的阈值Pth以上的像素(光点)。本步骤为用于从荧光图像中除去噪声的处理，对于阈值Pth，根据亮度值的范围等预先确定适合用于除去噪声的值。作为阈值Pth，例如可以以荧光强度为100～2000、优选150～1500、更优选180～1000的值进行设定。
接着，在步骤304中，将使上述步骤302中提取出的相邻的光点相互结合而成且为预定大小以上的光点的集合作为目标提取出来。是否为预定大小可以通过例如光点的集合的直径是否为预先确定的阈值Rth以上来进行判定。阈值Rth可以考虑图像的倍率并基于该光点的集合所表示的细胞的大小来确定，例如，可以设定为与1μm～10μm、优选2μm～9μm、更优选3μm～8.5μm相对应的图像上的长度。另外，不限于使用光点的集合的直径的情况，也可以通过光点的集合中包含的全部像素数是否为预定数以上来判定是否为预定大小以上。
接着，在步骤306中，使使用上述标记用物质而得到的荧光图像与使用细胞种类识别用抗体(用于识别假阳性)而得到的荧光图像重合，将步骤304中设定的目标中在任何一个荧光图像中均具有荧光的细胞作为假阳性细胞从阳性细胞中排除。接着，在步骤308中，使使用上述标记用物质而得到的荧光图像与使用细胞种类识别用抗体(用于检测癌细胞)而得到的荧光图像重合，将步骤304中设定的目标中在任何一个荧光图像中均具有荧光的细胞作为阳性细胞进行计数。接着，在步骤310中，使使用上述标记用物质而得到的荧光图像、使用细胞种类识别用抗体(用于检测癌细胞)而得到的荧光图像和使用细胞种类识别用抗体(用于识别假阳性)而得到的荧光图像重合，将仅在使用上述标记用物质而得到的荧光图像中具有荧光的细胞作为假阳性细胞进行计数。接着，在步骤312中，使使用细胞种类识别用抗体(用于识别假阳 性)而得到的荧光图像与使用细胞种类识别用抗体(用于检测癌细胞)而得到的荧光图像重合，将仅在细胞种类识别用抗体(用于检测癌细胞)中具有荧光的细胞作为癌细胞总数进行计数。
接着，在步骤314中，基于上述步骤300中获取的亮视野图像内的全部细胞数和上述步骤310中计数的假阳性细胞数、上述步骤308中计数的阳性细胞数、上述步骤312中计数的癌细胞总数，算出癌细胞阳性率或血细胞假阳性率，从而结束图像分析处理例程。
[表1]
反应条件有溶血处理，10μMH-Ala(2-Bacd)-OH，30分钟，37℃
癌细胞数据(前列腺癌细胞系)

血细胞数据(新鲜血)

反应条件有溶血处理，10mM2-NBDG，5分钟，23℃
癌细胞数据(纤维肉瘤细胞系)

血细胞数据(新鲜血)

如表1所示，可知在使用平均荧光强度和总荧光强度中的任何一种荧光强度的情况下，均能够高精度地检测癌细胞。但是，在使用总荧光强度的情况下，所提取的目标的大小对误差的影响有时变大。例如，由于拍摄荧光图像时的曝光时间变长，因此拍摄中的焦点未对准会对大小产生影响。在使用平均荧光强度的情况下，这种由大小引起的误差的影响小，因此能够更高精度地检测癌细胞。
另外，上述中，对预先在图像分析装置中安装有用于执行图像分 析处理例程的程序的情况进行了说明，但也可以预先将该程序存储在CD-ROM盘、DVD盘、光磁盘或IC卡等中，在执行图像分析处理时从这些存储介质中读取程序来执行图像分析处理。此外，还可以从与网络连接的服务器等下载该程序。另外，也可以利用半导体集成电路(例如，ASIC(Application Specific Integrated Circuit，专用集成电路)等)来实现上述图像分析装置。
本发明的癌细胞检测试剂盒除了含有上述标记用物质以外，可以进一步含有清洗液、本发明的癌细胞的检测方法中需要的溶血剂、上述末梢血试样用稀释液、其他试剂类。
作为其他试剂类的例子，包括：用于提高抗体的特异性的物质例如各种受体的阻滞剂；用于抑制假阳性的物质例如铁离子；用于提高铁离子的稳定性的物质例如还原剂；用于提高细胞膜蛋白质的稳定性的物质例如Mg离子、Ca离子；以及促进物质向细胞中摄入的物质例如诱导胞吞作用的物质；等。
另外，本发明的癌细胞检测试剂盒包含上述标记用物质和记载有基于由上述标记用物质标记的程度对癌细胞进行检测的方法的操作说明书。
根据本癌细胞检测试剂盒，能够在短时间内简便地检测末梢血试样中的癌细胞。作为本试剂盒中的操作说明书中记载的检测癌细胞的方法，上述癌细胞检测方法中记载的事项全部适用。
实施例
以下，利用实施例详细地说明本发明。但是，本发明不受这些实施例的任何限定。另外，如果没有特别说明，“份”为质量基准。
[实施例1]
依照常规方法，利用离心分离法从健全人的静脉血中分离血清试样和沉淀物，从血清试样中回收白细胞层和一部分红细胞层，再次悬浊于PBS中，制备白细胞试样和红细胞试样。
使用αMEM培养基(英杰公司，添加有10容量％的FBS、2mM L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)，在37℃、5容量％CO₂浓度的环境下对由DSファーマバイオメディカル公司购入的乳癌细胞系MCF-7进行培养。在即将进行试验之前，使用含有0.25％胰蛋白酶的EDTA回收细胞，用PBS清洗后，制备癌细胞系试样。
依照表2的记载向癌细胞系、血细胞(白细胞和红细胞)或它们的混合物各300μL(4×10⁵个细胞/mL)中添加30μL10mM的2-[N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基]-2-脱氧-D-葡萄糖(以下记作2-NBDG)(和光纯药公司)而制备试样1～7，在37℃下温育40分钟。另外，向不添加2-NBDG的试样中添加等量的PBS。
温育后，对各试样进行2000rpm×5分钟(日立公司)的离心分离，回收细胞后，添加10μL抗EpCAM抗体-PE(R&D系统公司)并在冷暗处静置30分钟。
30分钟后，使用1000μL的PBS清洗，进行2000rpm×5分钟的离心，依照常规方法回收各细胞。
将回收的细胞再次悬浊于50μL的PBS中，全部转移到96孔板中，制备观察用的试样。
使用荧光显微镜(尼康公司)观察各观察用的试样，通过目视确认2-NBDG的摄入量。另外，同样地观察抗EpCAM抗体-PE的染色图像，确认癌细胞。将试样1的观察结果分别示于图4～图6中。
表2

另外，上述表2中、试样2～试样7是用于否定由于所谓的实验中的技术上的理由使癌细胞的检测程度出现差异的可能性的对照组。具体而言，试样2是用于保证能够通过标记化的糖类识别癌细胞的对照组(否定因血细胞的存在而抑制摄入的可能性)。试样3是用于确认血细胞未由抗EpCAM抗体染色的对照组。试样4是用于否定将血细胞与癌细胞混合的操作对血细胞摄入标记化的糖类的情况产生影响的可能性的对照组。试样5是用于确认癌细胞由EpCAM抗体染色的对照组。试样6和试样7是用于否定在血细胞的混合存在下将癌细胞进行双重标记所产生的影响的可能性的对照组。通过这些对照组中的对照实验，否定了由于所谓的技术上的理由使癌细胞的检测程度出现差异的可能性(数据未图示)。
由图4～图6的对比观察可以确认，使癌细胞系与血细胞混合存在的试样1中，混合存在有由2-NBDG标记的细胞和未由2-NBDG标记的细胞(参考图4和图5)，并且，由2-NBDG标记的细胞是由抗EpCAM抗体染色的细胞(参考图6)。因此，通过使用2-NBDG，以荧光图像的形式明确地观察到混合试样中的癌细胞系。
另一方面，白细胞在荧光显微镜视野下可稍微观察到，但远远弱 于癌细胞的荧光图像，荧光强度为一半以下。红细胞几乎没有活性，因此，完全未观察到荧光图像。
因此，在血液细胞与癌细胞混合存在的末梢血试样中，基于荧光标记的糖向细胞内摄入的摄入量，能够在短时间内简便地确认癌细胞系的有无。
[实施例2]
<血细胞的制备>
使用真空采血管(装有EDTA·2K)由人体进行采血。依照HetaSep(STEMCELL公司)的附带资料进行血细胞分离。
<癌细胞的制备>
依照常规方法，利用胰蛋白酶(英杰公司)回收培养后的人纤维肉瘤细胞系(HT1080，DSファーマバイオメディカル公司)。另外，对于作为悬浮细胞系的人胃癌细胞系(SNU-1，ATCC)，不进行胰蛋白酶处理而直接回收。将回收的癌细胞的细胞悬浊液离心，除去上清。用杜尔贝科PBS(-)(ニッスイ公司)再次悬浊，离心后再次除去上清。
在进行溶血处理的情况下，依照氯化铵(STEMCELL公司)的附带资料，使用氯化铵对以上述方式回收的血细胞级分进行溶血处理。
<染色>
依照常规方法，使用血细胞计数板计数各细胞的细胞数，将试样分配成10⁵个～10⁶个细胞的试样(细胞悬浊液)。离心除去上清后，添加用杜尔贝科PBS(-)溶解的2-NBDG(和光纯药公司，表3或表4中记载的终浓度)，使细胞充分悬浊。以表3或表4中记载的温度和时间进行反应(培养)。反应后，添加杜尔贝科PBS(-)，离心并除去上清。使用杜尔贝科PBS(-)再次悬浊，离心并再次除去上清。将使用杜尔贝科PBS(-)再次悬浊、离心并再次除去上清的步骤进行2～3次，对细胞进行充分 清洗。使用杜尔贝科PBS(-)再次悬浊，调节浓度后滴加到384孔板中。将微孔板离心，使细胞落到孔底面上。使用荧光显微镜(尼康公司)进行拍摄。使用荧光滤片组：B-2A(尼康公司)。B-2A的波长如下。EX(激发波长)475±15nm、DM505nm以上、BA(荧光波长)520nm以上。
使用图像分析软件(产品名NIS-Elements，尼康公司)对获取的图像进行分析，评价细胞的荧光强度。
将结果示于表3和表4中。表3使用进行了上述溶血处理的末梢血试样，表4使用未进行溶血处理的末梢血试样。
[表3]

[表4]

由该结果表明，在使用2-NBDG作为标记用物质的情况下，2-NBDG的添加浓度为0.1mM～10mM、反应温度为4℃～37℃、反应时间为5分钟以上、平均荧光强度阈值为280～1150即可。另外，即使为了除去混入的大量红细胞而进行溶血处理，对癌细胞也没有影响，表 明未受到溶血处理的影响。
[实施例3]
<血细胞的制备>
使用真空采血管(装有EDTA·2K)由人体进行采血。依照HetaSep(STEMCELL公司)的附带资料进行血细胞分离。
<癌细胞的制备>
依照常规方法，利用胰蛋白酶(英杰公司)回收培养后的人前列腺癌细胞系(PC3，DSファーマバイオメディカル公司)。另外，对于作为悬浮细胞系的人胃癌细胞系(SNU-1，ATCC)，不进行胰蛋白酶处理而直接回收。将回收的癌细胞的细胞悬浊液离心，除去上清。用杜尔贝科PBS(-)(ニッスイ公司)再次悬浊，离心后再次除去上清。
在进行溶血处理的情况下，依照氯化铵(STEMCELL公司)的附带资料，使用氯化铵在室温下对回收的血细胞级分进行溶血处理。
<染色>
依照常规方法，使用血细胞计数板计数各细胞的细胞数，将试样分配成10⁵个～10⁶个细胞的试样(细胞悬浊液)。离心除去上清后，添加H-Ala(2-Bacd)-OH(渡边化学工业公司)(表5或表6中记载的终浓度)，使细胞充分悬浊。以表5或表6中记载的温度和时间进行反应(培养)。反应后，添加杜尔贝科PBS(-)，离心并除去上清。使用杜尔贝科PBS再次悬浊，离心并再次除去上清。将使用杜尔贝科PBS(-)再次悬浊、离心并再次除去上清的步骤进行2～3次，对细胞进行充分清洗。使用杜尔贝科PBS(-)再次悬浊，调节浓度后滴加到384孔板中。将微孔板离心，使细胞落到孔底面上。使用荧光显微镜(尼康公司)进行拍摄。使用荧光滤片组：B-2A(尼康公司)。B-2A的波长与实施例2相同。使用图像分析软件(产品名NIS-Elements，尼康公司)对获取的图像进行分析，评价细胞的荧光强度。
将结果示于表5和表6中。表5使用进行了上述溶血处理的末梢血试样，表6使用未进行溶血处理的末梢血试样。
[表5]

[表6]

由该结果表明，在使用H-Ala(2-Bacd)-OH作为标记用物质的情况下，H-Ala(2-Bacd)-OH的添加浓度为1μM～100μM、反应温度为4℃～37℃、反应时间为5分钟以上、平均荧光强度阈值为227～2044即可。另外，即使为了除去混入的大量红细胞而进行溶血处理，对癌细胞也没有影响，表明未受到溶血处理的影响。
[实施例4]
<血细胞的制备>
使用真空采血管(装有EDTA·2K)由人体进行采血。依照HetaSep(STEMCELL公司)的附带资料进行血细胞分离。
<癌细胞的制备>
依照常规方法，利用胰蛋白酶(英杰公司)回收培养后的人前列腺癌细胞系(PC3，DSファーマバイオメディカル公司)。另外，对于作为悬浮细胞系的人胃癌细胞系(SNU-1，ATCC)，不进行胰蛋白酶处理而直接回收。将回收的癌细胞的细胞悬浊液离心，除去上清。用杜尔贝科PBS(+)(ニッスイ公司)再次悬浊，离心后再次除去上清。
在进行溶血处理的情况下，依照氯化铵(STEMCELL公司)的附带资料，使用氯化铵在室温下对回收的血细胞级分进行溶血处理。
<染色>
依照常规方法，使用血细胞计数板计数细胞数，将试样分配成10⁵个～10⁶个细胞的试样(细胞悬浊液)。离心除去上清后，添加溶解于杜尔贝科PBS(+)的氨基乙酰丙酸(商品名为5-氨基乙酰丙酸盐酸盐，コスモ·バイオ公司，表7或表8中记载的终浓度)、与氨基乙酰丙酸同浓度的FeCl₂和与氨基乙酰丙酸同浓度的抗坏血酸，使细胞充分悬浊。以表7或表8中记载的温度和时间进行反应(培养)。调节细胞数后滴加到384孔板中。将微孔板离心，使细胞落到孔底面上。使用荧光显微镜(尼康公司)进行拍摄。
荧光滤片组的波长：EX(激发波长)402±7.5、DM430以上、BA(荧光波长)625±15。
使用图像分析软件(产品名NIS-Elements，尼康公司)对获取的图像进行分析，评价细胞的荧光强度。
将结果示于表7和表8中。表7使用进行了上述溶血处理的末梢血试样，表8使用未进行溶血处理的末梢血试样。
[表7]

[表8]

由该结果表明，在使用氨基乙酰丙酸作为标记用物质的情况下，氨基乙酰丙酸的添加浓度为0.1mM～1mM、反应温度为23℃～37℃、反应时间为30分钟以上即可。另外，即使为了除去混入的大量红细胞而进行溶血处理，对癌细胞也没有影响，表明未受到溶血处理的影响。
[实施例5]
除了在实施例2的<染色>中将标记用物质由2-NBDG变更为6-NBDG(英杰公司)以外，与实施例2同样地操作，对细胞的荧光强度进行评价。将其结果示于表9中。另外，2-NBDG和6-NBDG的终浓度如表9所示。
[表9]

反应条件|有溶血处理，10mM，5分钟，23℃

反应条件|无溶血处理，10mM，5分钟，23℃
由该结果表明，作为标记化的糖，不仅可以使用2位上具有荧光发色团的葡萄糖，而且也可以使用其他位置上具有荧光发色团的葡萄糖。
[实施例6]
与实施例2同样地操作，分别使用人乳腺上皮癌(细胞系名称MCF-7，DSファーマバイオメディカル公司)、人结肠腺癌(细胞系名称SW620，DSファーマバイオメディカル公司)、人前列腺癌(细胞系名称PC3，DSファーマバイオメディカル公司)、人肺泡上皮癌(细胞系名称NCI-H358，DSファーマバイオメディカル公司)、人胃癌(细胞系名称SNU-1，ATCC)和人纤维肉瘤(细胞系名称HT1080，DSファーマバイオメディカル公司)，利用标记化的糖(2-NBDG)进行癌细胞的检测。
将其结果示于表10中。另外，2-NBDG的终浓度如表10所示。
[表10]

反应条件|有溶血处理，10mM，5分钟，23℃
由该结果表明，通过使用2-NBDG作为标记用物质，能够检测各种种类的癌细胞。
[实施例7]
与实施例3同样地操作，分别使用人乳腺上皮癌(细胞系名称MCF-7，DSファーマバイオメディカル公司)、人结肠腺癌(细胞系名称SW620，DSファーマバイオメディカル公司)、人前列腺癌(细胞系名称PC3，DSファーマバイオメディカル公司)、人肺泡上皮癌(细胞系名称NCI-H358，DSファーマバイオメディカル公司)、人胃癌(细胞系名称SNU-1，ATCC)和人纤维肉瘤(细胞系名称HT1080，DSファーマバイオメディカル公司)，利用标记化的氨基酸进行癌细胞的检测。
将其结果示于表11中。另外，标记化的氨基酸H-Ala(2-Bacd)-OH的终浓度如表11所示。
[表11]

反应条件|有溶血处理，10μM，30分钟，37℃
由该结果表明，通过使用H-Ala(2-Bacd)-OH作为标记用物质，能够检测各种种类的癌细胞。
[实施例8]
与实施例4同样地操作，分别使用人乳腺上皮癌(细胞系名称MCF-7，DSファーマバイオメディカル公司)、人结肠腺癌(细胞系名称SW620，DSファーマバイオメディカル公司)、人前列腺癌(细胞系名称PC3，DSファーマバイオメディカル公司)、人肺泡上皮癌(细胞系名称NCI-H358， DSファーマバイオメディカル公司)、人胃癌(细胞系名称SNU-1，ATCC)和人纤维肉瘤(细胞系名称HT1080，DSファーマバイオメディカル公司)，利用氨基乙酰丙酸进行癌细胞的检测。
将其结果示于表12中。另外，氨基乙酰丙酸的终浓度如表12所示。
[表12]

反应条件|有溶血处理，0.3mM，60分钟，37℃
由该结果表明，通过使用氨基乙酰丙酸作为标记用物质，能够以高灵敏度检测各种种类的癌细胞。
[实施例9]
使用真空采血管(装有EDTA·2K)由人体进行采血。依照HetaSep(STEMCELL公司)的附带资料进行血细胞分离。
<癌细胞的制备>
依照常规方法，利用胰蛋白酶(英杰公司)回收培养后的人乳腺上皮癌(细胞系名称MCF-7，DSファーマバイオメディカル公司)、人结肠腺癌(细胞系名称SW620，DSファーマバイオメディカル公司)、人前列腺癌(细胞系名称PC3，DSファーマバイオメディカル公司)、人肺泡上皮癌(细胞系名称NCI-H358，DSファーマバイオメディカル公司)和人纤维肉瘤(细胞系名称HT1080，DSファーマバイオメディカル公司)。另外，对于作为悬浮细胞系的癌细胞系的人胃癌(细胞系名称SNU-1，ATCC)，不进行胰蛋白酶处理而直接回收。将回收的癌细胞的细胞悬浊液离心，除去上 清。用杜尔贝科PBS(-)(ニッスイ公司)再次悬浊，离心后再次除去上清。
<溶血处理>
依照氯化铵(STEMCELL公司)的附带资料，使用氯化铵在室温下对以上述方式回收的血细胞级分进行溶血处理。
<染色>
依照常规方法，使用血细胞计数板计数细胞数，将试样分配成10⁵个～10⁶个细胞的试样(细胞悬浊液)。离心除去上清后，添加H-Ala(2-Bacd)-OH(渡边化学工业公司)和2-NBGD(和光纯药公司)(表13中记载的终浓度)，使细胞充分悬浊。在37℃下使其反应30分钟。反应后，添加杜尔贝科PBS(-)，离心并除去上清。使用杜尔贝科PBS(-)再次悬浊，离心并再次除去上清。将使用杜尔贝科PBS(-)再次悬浊、离心并再次除去上清的步骤进行2～3次，对细胞进行充分清洗。使用杜尔贝科PBS(-)再次悬浊，调节浓度后滴加到384孔板中。将微孔板离心，使细胞落到孔底面上。使用荧光显微镜(尼康公司)进行拍摄(曝光时间1秒)。使用荧光滤片组：B-2A(尼康公司)。
使用图像分析软件(产品名NIS-Elements，尼康公司)对获取的图像进行分析，评价细胞的荧光强度。将其结果示于表13中。
[表13]

由该结果表明，通过组合使用2-NBDG和H-Ala(2-Bacd)-OH，使平均荧光强度阈值为280～490，由此，能够以高灵敏度检测包括单独使用2-NBDG时阳性率低的胃癌细胞、单独使用H-Ala(2-Bacd)-OH时阳性率低的大肠癌细胞在内的各种种类的癌细胞。
[实施例10]
<细胞的制备>
依照常规方法，使用胰蛋白酶(英杰公司)回收培养后的人纤维肉瘤细胞系(HT-1080，DSファーマバイオメディカル公司)和人正常皮肤成纤维细胞系(NHDF，ロンザ公司)。将回收的癌细胞的细胞悬浊液离心，除去上清。然后，使用杜尔贝科PBS(+)(ニッスイ公司)再次悬浊，离心后再次除去上清。
<染色>
依照常规方法，使用血细胞计数板计数细胞数，将试样分配成10⁵个～10⁶个细胞的试样(细胞悬浊液)。离心除去上清后，在添加铁离子和还原剂的条件下，添加溶解于杜尔贝科PBS(+)的0.3mM的氨基乙酰丙酸(商品名为5-氨基乙酰丙酸盐酸盐，コスモ·バイオ公司)、0.3mM的FeCl₂、0.3mM的抗坏血酸，使细胞充分悬浊。在不添加铁离子和还原剂的条件下，仅添加溶解于杜尔贝科PBS(+)的0.3mM的氨基乙酰丙酸，使细胞充分悬浊。在37℃下使其反应60分钟。调节细胞数后滴加到384孔板中。将微孔板离心，使细胞落到孔底面上。
<荧光拍摄>
利用荧光显微镜(尼康公司)在同一视野中对亮视野(物镜×10倍)和荧光(物镜×10倍)进行观察，对假阳性的程度进行确认。将其结果示于表14中。
荧光滤片组：EX(激发波长)402±7.5、DM430以上、BA(荧光波长)625±15。
[表14]

由该结果表明，通过在添加氨基乙酰丙酸的基础上添加FeCl₂和抗坏血酸，能够抑制假阳性的出现率。
[实施例11]
<细胞的制备>
依照常规方法，使用胰蛋白酶(英杰公司)回收培养后的人乳腺上皮癌细胞系(细胞系名称MCF-7，DSファーマバイオメディカル公司)。将回收的癌细胞的细胞悬浊液离心，除去上清。然后，使用杜尔贝科PBS(+)(ニッスイ公司)再次悬浊，离心后再次除去上清。
<染色>
依照常规方法，使用血细胞计数板计数细胞数。分配2.8×10⁵个细胞至一个试样中。向配合有Mg离子和Ca离子的杜尔贝科PBS(+)中添加氨基乙酰丙酸(商品名为5-氨基乙酰丙酸盐酸盐，コスモ·バイオ公司)以使其为1mM，使细胞充分悬浊。在37℃下使其反应。
<荧光检测>
反应开始后，使用i-densy(爱科来公司)测定15分钟、30分钟、60分钟、90分钟时细胞悬浊液的荧光值。荧光值的测定条件为：温调&光量模式下、40℃、增益“3”、LED1(390±20nm：激发)-PD3(642.5±57.5nm：检测)。
将结果示于图7中。图7中，纵轴表示荧光值，横轴表示反应时间。涂黑的四边形为使用未配合Mg离子和Ca离子的杜尔贝科PBS(-) 时的荧光值。涂黑的三角形为使用配合有Mg离子和Ca离子的杜尔贝科PBS(+)时的荧光值。另外，由涂黑的四边形表示的结果为除了将实施例11中的杜尔贝科PBS(+)变更为杜尔贝科PBS(-)以外与实施例11同样地操作而得到的结果。
由该结果表明，通过在添加氨基乙酰丙酸的基础上添加Mg离子和Ca离子，使氨基乙酰丙酸的反应性提高。
[实施例12]
除了在实施例11的染色时添加溶解于杜尔贝科PBS(+)的氨基乙酰丙酸以使其为1mM、并添加10μM的Endo-porter(GeneTools公司)以外，与实施例11同样地操作，测定细胞悬浊液的荧光值。
将结果示于图8中。图8中，纵轴表示荧光值，横轴表示反应时间。涂黑的四边形为使用未配合Mg离子和Ca离子的杜尔贝科PBS(-)时的荧光值。涂黑的圆形为向配合有Mg离子和Ca离子的杜尔贝科PBS(+)中添加Endo-porter时的荧光值。
由该结果表明，通过在添加氨基乙酰丙酸、Mg离子和Ca离子的基础上添加Endo-porter，使氨基乙酰丙酸的反应性进一步提高。
另外，图9将实施例11和实施例12的结果归纳示于一图中。由此表明，与仅添加氨基乙酰丙酸时(涂黑的四边形)相比，通过向氨基乙酰丙酸中添加Mg离子和Ca离子(涂黑的三角形)，使氨基乙酰丙酸的反应性提高，通过向氨基乙酰丙酸中添加Mg离子、Ca离子和Endo-porter(涂黑的圆形)，使氨基乙酰丙酸的反应性进一步提高。
[实施例13]
将实施例3的<染色>中的标记用物质由H-Ala(2-Bacd)-OH变更为H-Lys(DMACA)-OH(渡边化学工业公司)或H-Glu(EDANS)-OH(渡边化 学工业公司)。
另外，配合荧光物质的荧光特性，将荧光滤片组的波长变更为EX(激发波长)365/±10、DM400以上、BA(荧光波长)470±20，除此以外，与实施例2同样地操作，评价细胞的荧光强度。将结果示于表15中。
[表15]

反应条件|有溶血处理，30分钟，37℃
由该结果表明，作为标记化的氨基酸，不仅可以使用标记化的中性氨基酸H-Ala(2-Bacd)-OH，而且也可以使用其他标记化的氨基酸(标记化的碱性氨基酸H-Lys(DMACA)-OH和标记化的酸性氨基酸H-Glu(EDANS)-OH)。另外表明，从阴性率的观点出发，标记化的中性氨基酸H-Ala(2-Bacd)-OH、标记化的酸性氨基酸H-Glu(EDANS)-OH对癌细胞的选择性高。
[实施例14]
<血细胞的制备>
使用真空采血管(装有EDTA·2K)由人体进行采血。依照HetaSep(STEMCELL公司)的附带资料进行血细胞分离。
<癌细胞的制备>
依照常规方法，使用胰蛋白酶(英杰公司)回收培养后的人前列腺癌细胞系(PC3，DSファーマバイオメディカル公司)。将回收的癌细胞的细胞悬浊液离心，除去上清。用杜尔贝科PBS(+)(ニッスイ公司)再次悬浊，离心后再次除去上清。
<血细胞与癌细胞的混合液的制备>
依照常规方法，使用血细胞计数板计数进行血细胞分离后的血细胞悬浊液的细胞数。另外，也同样地计数人前列腺癌细胞系(PC3)的细胞数，以相对于血细胞数为1％的细胞数添加到血细胞悬浊液中。依照氯化铵(STEMCELL公司)的附带资料，使用氯化铵在室温下对添加有人前列腺癌细胞系(PC3)的血细胞悬浊液进行溶血处理。
<染色>
依照常规方法，使用血细胞计数板计数细胞数，将试样分配成10⁵个～10⁶个细胞的试样(细胞悬浊液)。离心除去上清后，添加溶解于杜尔贝科PBS(+)的0.3mM的氨基乙酰丙酸(商品名为5-氨基乙酰丙酸盐酸盐，コスモ·バイオ公司)、0.3mM的FeCl₂和0.3mM的抗坏血酸，使细胞充分悬浊。在37度下进行60分钟反应(培养)。反应后，离心除去上清，依照附带的资料添加FcR封闭试剂(Miltenyi Biotec公司)，在4度下反应30分钟。反应后，分别依照附带的资料添加FITC标记的抗CD45抗体(Miltenyi Biotec公司)、FITC标记的抗CD34抗体(BioLegend公司)、PE标记的抗EpCAM抗体(Miltenyi Biotec公司)，在23度下反应30分钟。反应后，添加杜尔贝科PBS(-)，离心并除去上清。使用杜尔贝科PBS(-)再次悬浊，离心并再次除去上清。将使用杜尔贝科PBS(-)再次悬浊、离心并再次除去上清的步骤进行2～3次，对细胞进行充分清洗。调节细胞数后滴加到384孔板中。将微孔板离心，使细胞落到孔底面上。利用荧光显微镜(尼康公司)进行拍摄。原卟啉9用荧光滤片组1进行检测，PE标记的抗EpCAM抗体用荧光滤片组2进行检测，FITC标记的抗CD45抗体和FITC标记的抗CD34抗体用荧光滤片组3进行检测。
荧光滤片组1的波长：EX(激发波长)402±7.5nm、DM430nm以上、BA(荧光波长)625±15nm。
荧光滤片组2的波长：EX(激发波长)535±25nm、DM575nm以上、 BA(荧光波长)590nm以上。
荧光滤片组3的波长：EX(激发波长)475±15nm、DM505nm以上、BA(荧光波长)525±10nm。
使用图像分析软件(产品名NIS-Elements，尼康公司)对获取的图像进行分析，评价细胞的荧光强度。将其结果示于表16中。
[表16]

由该结果表明，通过在使用氨基乙酰丙酸的基础上使用抗CD34抗体和抗CD45抗体，能够抑制假阳性的出现率。
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