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1、10申请公布号CN104164425A43申请公布日20141126CN104164425A21申请号201410327915322申请日20140710C12N15/11200601C12N15/63200601C12N1/21200601C12N1/15200601C12N1/19200601C12N15/82200601A01H5/0020060171申请人东北农业大学地址150030黑龙江省哈尔滨市香坊区木材街59号东北农业大学72发明人孙晓丽朱延明端木慧子王孙婷孙中文74专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司11245代理人关畅54发明名称一种MIRNA、MIRNA的前体、以及它们。
2、的编码基因和应用57摘要本发明公开了一种MIRNA、MIRNA的前体、以及它们的编码基因和应用。本发明保护一种MIRNA，如序列表的序列2所示。编码所述MIRNA的基因也属于本发明的保护范围。本发明还保护一种RNAMIRNA的前体，如序列表的序列1所示。编码所述RNA的基因也属于本发明的保护范围。含有编码所述RNA的基因的DNA分子也属于本发明的保护范围。本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将编码所述MIRNA的基因、编码所述RNA的基因或序列表的序列3自5末端第9387位核苷酸所示的DNA分子导入目的植物，得到耐冷性高于所述目的植物的转基因植物。本发明对于培育耐冷植物，从而增加植物产量具。
3、有重大价值。51INTCL权利要求书1页说明书6页序列表2页附图4页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页序列表2页附图4页10申请公布号CN104164425ACN104164425A1/1页21一种MIRNA，如序列表的序列2所示。2一种RNA，如序列表的序列1所示。3编码权利要求1所述MIRNA的基因。4编码权利要求2所述RNA的基因。5含有权利要求3或4所述基因的DNA分子。6如权利要求5所述的DNA分子，其特征在于所述DNA分子如序列表的序列3自5末端第9387位核苷酸所示。7含有权利要求3所述基因、权利要求4所述基因、权利要求5所述DNA分子或权利。
4、要求6所述DNA分子的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌。8一种培育转基因植物的方法，是将权利要求3所述基因、权利要求4所述基因、权利要求5所述DNA分子或权利要求6所述DNA分子导入目的植物，得到耐冷性高于所述目的植物的转基因植物。9如权利要求8所述的方法，其特征在于所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。10权利要求1所述MIRNA、权利要求2所述RNA、权利要求3所述基因、权利要求4所述基因、权利要求5所述DNA分子或权利要求6所述DNA分子在培育耐冷植物中的应用。权利要求书CN104164425A1/6页3一种MIRNA、MIRNA的前体、以及它们的编码基因和应用技术领域0001本发。
5、明涉及一种MIRNA、MIRNA的前体、以及它们的编码基因和应用。背景技术0002低温冷害严重影响植物生长发育及作物产量，已经成为农作物生产的重要限制因子。作为一种冷敏感型农作物，水稻从种子发芽到成熟的整个生长发育期间都极易受到冷害威胁，严重时致水稻减产3040。因此，解决水稻冷害问题对于提高水稻产量、品质，促进水稻产区的经济发展具有重大的战略意义。随着分子生物学的飞速发展和转基因技术的日趋成熟，通过转基因分子育种培育耐冷转基因水稻已成为可能。0003MIRNAMICRORNA，微小RNA是一类在生物体中广泛存在的长度约为2024NT的内源单链非编码小分子RNA。近年来大量研究表明，MIRNA。
6、通过完全/不完全与靶MRNA3UTR互补结合抑制靶MRNA的翻译或直接介导靶MRNA的降解，进而调控植物生长发育以及逆境胁迫应答等众多重要生物学过程。发明内容0004本发明的目的是提供一种MIRNA、MIRNA的前体、以及它们的编码基因和应用。0005本发明保护一种MIRNA，如序列表的序列2所示。编码所述MIRNA的基因也属于本发明的保护范围。含有编码所述MIRNA的基因的DNA分子也属于本发明的保护范围。含有编码所述MIRNA的基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。0006本发明还保护一种RNAMIRNA的前体，如序列表的序列1所示。编码所述RNA的基因也属于。
7、本发明的保护范围。含有编码所述RNA的基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。0007含有编码所述MIRNA的基因的DNA分子也属于本发明的保护范围。含有编码所述MIRNA的基因的DNA分子具体可如序列表的序列3自5末端第9387位核苷酸所示。含有序列表的序列3自5末端第9387位核苷酸所示的DNA分子的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。所述重组质粒具体可为在PCAMBIA330035SU载体中插入序列表的序列3自5末端第9387位核苷酸所示的双链DNA分子得到的重组质粒PCAMBIAPREMIR1868。0008本发明还保护一种培育转基。
8、因植物的方法，是将编码所述MIRNA的基因、编码所述RNA的基因或序列表的序列3自5末端第9387位核苷酸所示的双链DNA分子导入目的植物，得到耐冷性高于所述目的植物的转基因植物。所述方法具体可为将重组质粒PCAMBIAPREMIR1868导入目的植物，得到耐冷性高于所述目的植物的转基因植物。所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物具体可为水稻，如水稻品种“空育131”。0009所述耐冷性高具体可体现为如下、和中的至少一种说明书CN104164425A2/6页40010在低温环境中，所述转基因植物的存活率高于所述目的植物；0011在低温环境中，所述转基因植物地上部分的游离脯氨酸含量。
9、高于所述目的植物；0012在低温环境中，所述转基因植物叶片的可溶性糖含量高于所述目的植物；0013在低温环境中，所述转基因植物叶片的电导率低于所述目的植物。0014以上任一所述低温环境具体可为4环境。0015本发明还保护编码所述MIRNA的基因、编码所述RNA的基因或序列表的序列3自5末端第9387位核苷酸所示的双链DNA分子在培育耐冷植物中的应用。所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物具体可为水稻，如水稻品种“空育131”。0016本发明对于培育耐冷植物，从而增加植物产量具有重大价值。附图说明0017图1为MIR1868的相对表达量。0018图2为重组质粒的构建流程示意图。0019。
10、图3为PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。0020图4为重组质粒PCAMBIAPREMIR1868的部分元件示意图。0021图5为再生植株PCR鉴定的部分结果。0022图6为PCR阳性植株SOUTHERNBLOT鉴定的结果。0023图7为转基因水稻株系中MIR1868的相对表达量。0024图8为转基因水稻的耐冷性分析的结果。0025图9为转PREMIR1868水稻冷胁迫下生理指标的测定的结果。具体实施方式0026以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实。
11、施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。农杆菌菌株EHA105上海迈其生物科技有限公司。0027PCAMBIA330035SU载体参考文献ADVANCINGURACILEXCISIONBASEDCLONINGTOWARDSANIDEALTECHNIQUEFORCLONINGPCRFRAGMENTS，HUSSAMHNOURELDIN,BJARNEGHANSEN,MORTENHHJACOBKJENSENANDBARBARAAHALKIER，NUCLEICACIDSRESEARCH,2006,318E122。0028水稻品种“空育131”黑龙江省农垦科学院水稻研究所；参考文献孟昭河，黄少。
12、锋，张莉萍，刘国权，刘永巍，刘胜国，水稻新品种空育131特性及优质高产栽培技术，垦殖与稻作，200252829。0029实施例1、MIR1868的发现和表达模式0030一、MIR1868的发现0031发明人通过芯片技术构建水稻苗期冷胁迫MIRNA表达谱，将筛选出的一个MIRNA命名为MIR1868。0032MIR1868的前体序列如序列表的序列1所示。说明书CN104164425A3/6页50033MIR1868的前体序列长度为169BP，其中包含水稻MIR1868成熟体序列见序列表的序列2以及一个发卡结构。0034二、MIR1868的表达模式0035取成熟的、饱满的水稻品种“空育131”的种。
13、子，42处理35天以打破休眠，去皮后用10NACLO水溶液灭菌30分钟，然后用无菌蒸馏水清洗5遍，然后置于黑暗条件下浸种1天，然后将萌动的水稻种子转移至30黑暗培养1天以催芽，然后将萌发的水稻苗转移到YOSHIDA营养液中培养至三叶期28、12H光照；25、12H黑暗，然后将水稻苗置于4光照培养0H、05H、1H、3H、6H、9H、12H或24H，然后分别取地上部分，液氮速冻，备用。0036提取地上部分的总RNA，电泳检测结果表明28S与18S亮度比值接近21，且无降解拖尾，证明总RNA提取质量好。0037将总RNA进行DNA消化后，采用SUPERSCRIPTIII反转录试剂盒进行反转录，合成。
14、CDNA第一链。以CDNA为模板，采用F1和R1组成的引物对进行RTPCR以检测MIR1868，采用F2和R2组成的引物对进行RTPCR以检测OSAELF1基因内参基因，MIR1868的相对表达量见图1。结果表明，MIR1868在水稻冷胁迫来临时，表达量持续下调，冷处理3H下调接近10倍，达到最大幅度。0038F15CCAAGGCATTGTTCTTACCG3；0039R15TTGCAAGAAACACACCGTTT3。0040F25AGCCTCCTCCTCTCGCCAT3；0041F25TGTTCATCTCAGCGGCTTC3。0042实施例2、转基因植物的获得和鉴定0043一、重组质粒的构建0。
15、044重组质粒的构建流程示意图见图2。00451、提取水稻品种“空育131”的叶片的基因组DNA。00462、以步骤1提取的基因组DNA为模板，采用F3和R3组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物394BP。PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图见图3。0047F35GGCTTAAUGCCCAAGCGGTAGTTGTCTC3；0048R35GGTTTAAUCGTTTAGAAGCTCGGGAAGC3。0049PCR扩增产物的核苷酸序列见序列表的序列3。00503、用限制性内切酶PACI和NTBBVCI酶切PCAMBIA330035SU载体，回收约95KB的酶切产物。00514、将步骤3的酶切产。
16、物、步骤2的PCR扩增产物和USER酶NEWENGLANDBIOLABS，37温育20MIN、然后25温育20MIN，得到重组质粒PCAMBIAPREMIR1868。0052重组质粒PCAMBIAPREMIR1868的部分元件示意图见图4。根据测序结果，对重组质粒PCAMBIAPREMIR1868进行结构描述如下在PCAMBIA330035SU载体的两个PACI酶切位点之间插入了序列表的序列3自5末端第9387位核苷酸所示的双链DNA分子。0053二、转基因水稻的获得00541、将重组质粒PCAMBIAPREMIR1868导入农杆菌菌株EHA105，得到重组农杆菌。00552、用步骤1得到的重。
17、组农杆菌的菌液侵染水稻品种“空育131”的胚性愈伤组织20MIN，然后将愈伤组织转接到共培养培养基含20MG/L乙酰丁香酮的NB培养基，PH52，说明书CN104164425A4/6页625黑暗培养24天。00563、完成步骤2后，取愈伤组织，用500MG/L头孢霉素无菌水溶液清洗，然后接种至筛选培养基含15MG/L固杀草和100MG/L阿莫西林克拉维酸钾的NB培养基，PH58，32、24H光照条件下培养6周每两周继代一次。00574、完成步骤3后，取愈伤组织，接种至分化培养基含30G/L山梨醇、2G/L酪蛋白水解物、100MG/L阿莫西林克拉维酸钾、2MG/LKT和002MG/LNAA的MS。
18、培养基，PH58，首先在25、黑暗的条件下培养57天，然后转移至26、16H光照/8H黑暗的条件下培养至愈伤组织表面有绿点产生。00585、完成步骤4后，将有绿点的愈伤组织转移至新的分化培养基，在26、16H光照/8H黑暗的条件下培养至再生芽长度约为2CM。00596、完成步骤5后，将幼苗转移至生根培养基含100MG/L阿莫西林克拉维酸钾的MS培养基，PH58，在26、16H光照/8H黑暗的条件下培养至株高为1015CM且根系发达，共得到17株再生植株T0代。00607、将步骤6得到的再生植株移栽到事先拌好的培养基质培养基质的组成1质量份草炭土1质量份君子兰土3质量份土壤，浇水，先放置在暗光条。
19、件下培养35天，然后移至户外正常培养。00618、分别取17株再生植株的叶片，提取基因组DNA，采用BARSP和BARASP组成的引物对以BAR基因为靶基因，目的片段大小552BP进行PCR鉴定，0062BARSP5ATGAGCCCAGAACGACGCCC3；0063BARASP5TCAAATCTCGGTGACGGGCA3。0064部分结果见图5。图5中，“”代表空白对照水，“NT”代表阴性对照水稻品种“空育131”，“”代表阳性对照重组质粒PCAMBIAPREMIR1868，112为部分再生植株。结果表明，17株再生植株中，11株PCR鉴定为阳性，阳性率为647。00659、分别取PCR鉴定。
20、阳性的11株再生植株的叶片，提取基因组DNA并用限制性内切酶HINDIII酶切，采用地高辛标记的BAR基因片段进行SOUTHERNBLOT鉴定。SOUTHERN杂交采用的探针的核苷酸序列如序列表的序列4所示。0066部分结果见图6。图6中，NT代表阴性对照水稻品种“空育131”，19为部分PCR鉴定阳性的再生植株。11株PCR鉴定阳性的植株中的9株，PREMIR1868均已经成功的整合到水稻基因组中，并且不同植株的插入位点不同，插入的拷贝数不同。006710、分别取SOUTHERNBLOT鉴定阳性的植株的嫩叶，提取总RNA并反转录合成CDNA。以CDNA为模板，采用F1和R1组成的引物对进行R。
21、TPCR以检测MIR1868，采用F2和R2组成的引物对进行RTPCR以检测OSAELF1基因内参基因。部分植株的结果见图7。图7中，WT代表水稻品种“空育131”，13代表不同SOUTHERNBLOT鉴定阳性的植株。结果表明PREMIR1868能够正常的转录，并且在转录水平上的表达量要高于未转基因水稻。006811、将步骤10中SOUTHERNBLOT鉴定阳性的植株自交，每个单株分别收获T1代种子，按照步骤9的方法对T1代种子长成的植株进行SOUTHERNBLOT鉴定；将SOUTHERNBLOT鉴定阳性的T1代植株进行自交，每个单株分别收获T2代种子，按照步骤9的方法对T2代种子长成的植株进。
22、行SOUTHERNBLOT鉴定；对于某一T1代植株来说，如果其自交得到的T2代说明书CN104164425A5/6页7植株均为SOUTHERNBLOT鉴定阳性，该T1代植株为一个纯合的转基因植株，该T1代植株及其自交后代为一个纯合的转基因株系。0069随机取两个纯合的转基因株系OX4株系和OX6株系进行步骤四和步骤五的鉴定。0070三、转空载体水稻的获得0071用PCAMBIA330035SU载体代替重组质粒PCAMBIAPREMIR1868，其它同步骤二，得到转空载体水稻。0072四、转基因水稻的耐冷性分析0073分别取OX4株系的T2代种子、OX6株系的T2代种子、转空载体水稻的T2代种子。
23、和水稻品种“空育131”WT的种子进行如下鉴定00741、取种子，42处理35天以打破休眠，消毒后置于湿润滤纸上黑暗条件下发芽。00752、完成步骤1后，取发芽的种子，移至YOUSHIDA营养液中培养至苗高为3CM。00763、取步骤2得到的幼苗，移至去除底部的96孔板中，使用YOUSHIDA营养液，培养培养条件28、12H光照/25、12H黑暗至3叶期，然后在4、12H光照/12H黑暗的条件下培养4天冷胁迫处理，然后再恢复培养培养条件28、12H光照/25、12H黑暗14天。0077冷胁迫处理前的植株照片见图8A，恢复培养14天后的植株照片见图8B，冷胁迫处理前和恢复培养14天后的存活率见图。
24、8C。存活率为三次试验的平均值，每次试验中每个株系统计100株植株。转空载体水稻的表型和存活率与水稻品种“空育131”的表型和存活率均一致。00784、取步骤2得到的幼苗，移至营养土中，培养培养条件28、12H光照/25、12H黑暗至3叶期，然后在4、12H光照/12H黑暗的条件下培养4天冷胁迫处理，然后再恢复培养培养条件28、12H光照/25、12H黑暗14天。0079冷胁迫处理前的植株照片见图8D，恢复培养14天后的植株照片见图8E，冷胁迫处理前和恢复培养14天后的存活率见图8F。存活率为三次试验的平均值，每次试验中每个株系统计100株植株。转空载体水稻的表型和存活率与水稻品种“空育131。
25、”的表型和存活率均一致。0080步骤3和步骤4的结果表明，转PREMIR1868株系冷胁迫后的存活率显著高于野生型，即PREMIR1868超量表达能够增强水稻对冷胁迫的耐受性。0081五、转PREMIR1868水稻冷胁迫下生理指标的测定0082植物在遭受到冷胁迫时，植物体内的物质含量会发生改变，尤其是细胞体内游离脯氨酸及可溶性糖。由于植物遭受冷害使细胞膜会发生变化，细胞内的这些物质的积累，能够增加胞质的浓度，减少冷害对细胞膜的损害。0083分别取OX4株系的T2代种子、OX6株系的T2代种子、转空载体水稻的T2代种子和水稻品种“空育131”WT的种子进行如下鉴定0084步骤1至3同步骤三的13。
26、。0085检测水稻植株地上部分游离脯氨酸含量的方法参见文献王学奎，植物生理生化实验原理和技术北京高等教育出版社，2006P278279。0086检测叶片中可溶性糖含量的方法参见文献王学奎，植物生理生化实验原理和技说明书CN104164425A6/6页8术北京高等教育出版社，2006P202203。0087检测叶片的电导率的方法参见文献李海林，殷绪明，龙小军低温胁迫对水稻幼苗抗寒性生理生化指标的影响J安徽农学通报，2006115053。0088冷胁迫处理前的植株和刚完成冷胁迫处理的植株地上部分的游离脯氨酸含量见图9A三次试验的平均值，每次试验中每个株系统计100株植株。冷胁迫处理前，转PREMI。
27、R1868水稻体内的游离脯氨酸含量与野生型没有显著差别。冷胁迫处理后，野生型水稻和转PREMIR1868水稻体内的游离脯氨酸含量都急剧增加，但转PREMIR1868水稻体内游离脯氨酸的增加量明显高于野生型水稻。各个阶段转空载体水稻的结果与水稻品种“空育131”均一致。0089冷胁迫处理前的植株和刚完成冷胁迫处理的植株叶片中的可溶性糖含量见图9B三次试验的平均值，每次试验中每个株系统计100株植株。冷胁迫处理前，转PREMIR1868水稻体内的可溶性糖含量即显著高于野生型水稻。冷胁迫处理后，野生型水稻和转PREMIR1868水稻体内的可溶性糖含量含量都急剧增加，但转PREMIR1868水稻体内可。
28、溶性糖的增加量明显高于野生型水稻。各个阶段转空载体水稻的结果与水稻品种“空育131”均一致。0090冷胁迫处理前的植株和刚完成冷胁迫处理的植株叶片的电导率见图9C三次试验的平均值，每次试验中每个株系统计100株植株。冷胁迫处理前，转PREMIR1868水稻的电导率与野生型水稻没有显著差别。冷胁迫处理后，转PREMIR1868水稻的电导率显著低于野生型水稻。各个阶段转空载体水稻的结果与水稻品种“空育131”均一致。0091以上结果表明，在冷胁迫处理后，转PREMIR1868的水稻植株细胞内的可溶性物质含量增多，细胞膜的完整性得到保护，使植株的耐冷性得到了提高。说明书CN104164425A1/2页90001序列表CN104164425A2/2页100002序列表CN104164425A101/4页11图1图2图3说明书附图CN104164425A112/4页12图4图5图6图7说明书附图CN104164425A123/4页13图8说明书附图CN104164425A134/4页14图9说明书附图CN104164425A14。