《一种建立康地6号油葵再生体系的方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种建立康地6号油葵再生体系的方法.pdf（9页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 102301960 A (43)申请公布日 2012.01.04 CN 102301960 A *CN102301960A* (21)申请号 201110236887.0 (22)申请日 2011.08.18 A01H 4/00(2006.01) A01G 1/06(2006.01) (71)申请人 新疆康地种业科技股份有限公司 地址 830046 新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 北京南路 416 号盈科中心 27 层 (72)发明人 王沛政 林霞 夏春兰 王志安 李新鹏 (54) 发明名称 一种建立康地 6 号油葵再生体系的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种向日葵康。
2、地 6 号再生体系 方法。通过将康地 6 号自交系子叶接种到附加不 同激素组合的诱导培养基上诱导胚性愈伤， 将诱 导的胚性愈伤转接到分化培养基上高频分化不定 芽， 待不定芽生长到一定程度再将其转入到生长 培养基上中进一步生长， 最后再生植株进行嫁接 移植 ； 诱导培养基配方采用 MS 培养基、 IAA1.2mg/ L 和 6-BA 4.5mg/L ； 分化培养基配方采用 MS 培养 基+IAA 0.01mg/L和6-BA 0.04mg/L ； 生长培养基 配方采用 2/5MS 培养基。该发明对向日葵康地 6 号自交系具有再生频率极高、 操作简单、 周期较短 等特性， 具有重要应用价值。 (51。
3、)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 2 页 CN 102301961 A1/1 页 2 1. 一种建立康地 6 号油葵再生体系的方法， 其特征在于， 所述的具体方法步骤如下 ： (1) 无菌油葵幼苗获得 ： 取康地 6 号油葵种子， 用 70的酒精溶液浸泡 10min， 再用 10的过氧化氢溶液消毒 30min， 最后接种于无激素的 1/2MS 基本培养基上， 培养室温度为 26 -28， 光照时间 16h， 光强 2000LX， 生长 3 天 ； (2) 油葵愈伤组织的诱导 ： 选取生长健壮的无菌苗于靠近生长。
4、点处切取子叶插入培养 基中培养 ； 诱导 2-3 周， 导出大量的愈伤组织 ； 诱导培养基配方采用 MS 培养基、 IAA1.2mg/L 和 6-BA 4.5mg/L ； (3) 不定芽分化进程 ： 将外植体愈伤， 转入分化培养基诱导其分化， 2-3 周在接触培养 基的愈伤表面， 会分化出许多小的不定芽 ； 分化培养基配方采用 MS 培养基 +IAA 0.01mg/L 和 6-BA 0.04mg/L ； 当不定芽伸长到 1cm 时， 及时从愈伤块上切下来， 转至葡萄糖减半的 MS 培养基上培养 ； (4) 不定芽生长 ： 当不定芽进一步伸长到 3cm 时， 再转至无激素的生长培养基上培养， 再。
5、生苗可很快生长成苗 ； 生长培养基配方采用 2/5MS 培养基 ； (5) 再生植株的嫁接 ： 选用生长发育良好的具有 1 片真叶的实生苗做砧木， 4-6 片真叶 的再生苗基部削尖作接穗， 采用劈接法把接穗插入砧木， 用韧性良好的塑料带绑缚结合部 位 ； 嫁接后， 用塑料薄膜罩好保湿， 放于通风并有散射光的地方， 一星期后揭罩通风解除绑 绳进行常规管理。 权 利 要 求 书 CN 102301960 A CN 102301961 A1/5 页 3 一种建立康地 6 号油葵再生体系的方法 发明领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 具体说， 本发明具体涉及一种建立油葵再生体系的技 术领域。 背。
6、景技术 0002 向日葵(Helianthus annuus L.)是世界四大油料作物之一， 也是我国北方地区的 主要油料作物， 其作为油料或蛋白质资源日益受到人们的重视。组织培养不仅可生产大量 的优良无性系， 也可打破种属间的界限， 克服远缘杂交及不亲和性障碍在向日葵新品种的 培育和种性的改良中和基因工程技术的发展和应用中有着巨大的潜力。 尽管向日葵植株再 生方法已经得到长足发展， 各种技术也已有报道， 由于向日葵属于难培养植物， 有许多因素 制约着向日葵的植株再生。 0003 幼胚培养技术在向日葵获得成功的报道越来越多。李映红等 ( 李映红、 郭仲琛、 王 伏 雄 .Immature em。
7、bryo culture of sunflowerJ.Acta Botanica Yunnanica( 云 南植物研究 )， 1998， 10(1) ： 79-86)、 Finer(Finer J J.Direct somatic embryogenesis and plant regeneration from immature embryos of hybrid sunflower(Helianthus annuus L.)on a high sucrose containing mediumJ.Plant Cell Rep.， 1987， 6 ： 372-374)、 Freyssin 等。
8、 (Freyssinet M， Freyssinet G.Fertile plant regeneration from sunflower(Helianthus annuus L.)immature embryosJ.Plant Sci.， 1988， 56 ： 177-181)、 宋英凯等 ( 宋英凯， 张天星， 崔国惠， 等 . 向日葵未成熟胚培养中不定芽的发 生 J). 华北农学报， 1993， 8(2) ： 112-115.刘海学 ( 刘海学， 季静， 王萍， 等 . 向日葵未 成熟胚组织培养及再生芽的研究 (J). 内蒙古民族大学学报 ( 自然科学版 )， 2003， 18(5) 。
9、： 411-414.) 都报道了在向日葵幼胚培养中体细胞胚胎的发生， 从未成熟的合子中诱导出愈 伤组织再由愈伤组织发生体细胞胚胎的间接途径， 但再生器官的发生率不是很高， 一般在 25 -12， 而且形成的芽不易生长成植株， 并且幼胚的获得还限制与生长季节， 如在冬 季使用温室将增加很多管理和种植成本。 并且直到现在利用幼胚向日葵植株体细胞胚胎的 再生仍然很困难， 即使能再生重复前人试验也特别难。 0004 在向日葵器官培养方面， Baker 利用子叶 (Baker M C， Munoa-Fernandez N， Carter C D.Improved shoot development an。
10、d rooting from mature cotyledons of sunflowerJ.Plant Cell， Tissue and Organ Culture， 1999， 58 ： 39-49.) 建立向日葵再 生体系， 包括无菌苗种到1/2MS培养基附加15g/L蔗糖+6g/L琼脂。 取无菌苗切取子叶节接 到MS培养基附加0.5mg/L NAA+1mg/L6BA诱导愈伤4周， 芽诱导利用MS培养基附加0.5mg/L NAA+1mg/L6 BA， 然后转移到 MS 培养基上分化， MS 培养基附加 0.5mg/L BA+0.01mg/L NAA。 最高能产生平均 87不定芽分化， 每。
11、个子叶节最高产生 5.4 个芽。生根培养基利用 1/2MS 并附加少量的 NAA 和炭粉。Puniam 等利用 MS 培养基附加 0.5mg/L BA+0.05mg/LNAA 组合诱 导出向日葵子叶节， 叶片， 茎尖， 下胚轴等不同外置体愈伤， 继而在 MS 培养基附加 0.5mg/L BA+0.1mg/L GA3+500mg/L CA 分化培养基上得到分化不定芽， 分化频率不同品种在 5-80 说 明 书 CN 102301960 A CN 102301961 A2/5 页 4 不等， 最后通过无激素 MS 培养基生根得到全苗。上述国外报道都利用不同的材料和激素配 比， 所得的结果也不尽相同。
12、， 我们也利用过自己材料及其上述报道培养基无法得到相似的 结果。而且有些向日葵品种生根非常困难。因此国外的向日葵再生体系由于所用材料不同 很难加以有效利用。 0005 在向日葵器官培养方面， 国内最早卫志明报道利用 MS 培养基附加 2， 4-D 0.5mg/L 和 6BA0.5mg/L 进行愈伤诱导， 愈伤组织转入分化时， 每升附加 0.2mg/L 的 NAA 和 1mg/L 的 6BA ； 诱导生根的培养基为不加任何激素的 1/2MS 培养基， 得到最高 60的分化率 ( 卫志 明， 许智宏 . 向日葵组织培养和植株再生 J. 植物生理学通讯， 1983(5) ： 42-45.)。马雪 霞。
13、等利用 6 苄基腺嘌呤 (6BA) 和 IAA 之比为 5 1 时， 诱导出最大芽率在为 62.5 ( 马雪 霞， 蓝海燕， 宋荣， 等 . 向日葵的组织培养及芽分化的研究 J). 新疆农业科学， 2002， 39(1) ： 23-24.)。刘海学等 ( 刘海学， 季静， 王萍， 等 . 向日葵未成熟胚组织培养及再生芽的研究 (J). 内蒙古民族大学学报 ( 自然科学版 )， 2003， 18(5) ： 411-414) 利用向日葵未成熟胚进 行诱导， 在 MS+0.03mg/L 的 IAA+1.2mg/L 的 6-BA 的培养基上最高诱导出芽为 73。总体上 诱导出芽的频率与特定基因型有关，。
14、 而且受各种因素影响芽不易长成植株， 如 ： 早熟、 早开 花、 玻璃化现象和褐化现象严重、 生根率低等， 这些都影响其培养效果。 0006 综上所述， 现有技术在向日葵的组织培养方面做了大量的工作， 但还存在一些问 题， 到目前为止建立一个成熟的再生体系， 仍是向日葵组培工作的一个研究重点。 因此在今 后的研究中， 应继续探索建立高效的再生体系， 缩短培养时间， 提高再生频率， 以利于向日 葵的育种及利用基因工程进行向日葵的品种改良。 发明内容 0007 尽管向日葵植株再生方法已经得到长足发展， 但是由于向日葵属于难培养植物， 有许多因素制约着向日葵的植株再生。本发明目的在于建立一种康地 6。
15、 号油葵再生体系的 方法， 该发明对向日葵康地 6 号自交系具有高频再生率， 获得的再生植株时间较短且再生 植株成活率较高等特性。 0008 本发明的技术方案 ： 通过将向日葵康地 6 号自交系接种到附加不同激素组合的 诱导培养基上， 将诱导的向日葵不定芽转接到分化培养基上高频分化再生苗， 再将再生苗 转入到生长培养基上中进一步生长， 得到再生植株， 对再生植株嫁接优化， 再生植株成活率 高。 0009 具体的， 本发明提供了一种建立康地 6 号油葵再生体系的方法， 具体步骤如下 ： 0010 (1) 无菌油葵幼苗获得 ： 取康地 6 号油葵种子， 用 70的酒精溶液浸泡 10min， 用 1。
16、0的过氧化氢溶液消毒30min， 再无菌水冲洗2遍， 最后接种于无激素的1/2MS培养基上， 培养室温度为 26 -28， 光照时间 16h， 光强 2000LX， 生长 3 天。 0011 (2) 油葵愈伤组织的诱导 ： 选取生长健壮的无菌苗于靠近生长点 1-2mm 处切取子 叶， 将子叶切口处插入培养基中5mm深度， 诱导2-3周， 诱导出的大量的愈伤组织 ； 诱导培养 基配方为 ： MS 培养基 +IAA1.2mg/L+6-BA 4.5mg/L ； 0012 (3) 不定芽分化进程 ： 将外植体愈伤， 其 3-4mm 厚， 颜色为淡黄色， 连同子叶和愈伤 转入分化培养基诱导其分化， 愈伤。
17、面接触培养基 ； 2-3 周内在接触培养基的愈伤表面， 会分 化出许多小的不定芽 ； 当不定芽伸长到 1cm 时， 及时从愈伤块上切下来， 转至葡萄糖减半的 说 明 书 CN 102301960 A CN 102301961 A3/5 页 5 MS 培养基上培养 ； 分化培养基配方为 ： MS 培养基、 IAA 0.01mg/L、 6-BA 0.04mg/L ； 0013 (4) 不定芽生长 ： 当不定芽进一步伸长到 3cm 时， 再转至无激素的生长培养基上培 养， 再生苗可很快生长成苗 ； 生长培养基配方为 ： 2/5MS 培养基 ； 0014 (5) 再生植株的嫁接 ： 选用生长发育良好的。
18、具有 1 片真叶的实生苗做砧木， 4 片真 叶的再生苗基部削尖作接穗， 采用劈接法把接穗插入砧木， 用韧性良好的塑料带绑缚结合 部位 ； 嫁接后， 用塑料薄膜罩好保湿， 放于通风并有散射光的地方， 七天后揭罩通风解除绑 绳进行常规管理。 0015 通过实施本发明具体的发明内容， 可以达到以下技术效果 ： 0016 1. 本发明中取康地 6 号油葵种子， 用 70的酒精溶液浸泡， 再用 10的过氧化氢 溶液消毒 30min， 获得无菌苗基本无污染， 生活力强。 0017 2.建立康地1号油葵再生体系的方法， 不定芽诱导率在90-98之间， 每个子叶诱 导不定芽个数 5-10 个不等。并且三个多月。
19、内就能得到长势较好的再生苗， 操作简便快捷。 0018 3. 本发明中省去生根步骤， 获得再生苗直接嫁接成活， 其成活率极高， 节约时间， 并且可以收获到后代种子， 嫁接苗成活率可达 90， 长势良好。 附图说明 0019 图 1 所示为康地 6 号油葵 3-4 日龄无菌苗幼胚接到诱导培养基图。 0020 图 2 所示为向日葵子叶接种到诱导培养基诱导 2 周多的愈伤图。 0021 图 3 所示为诱导的向日葵愈伤接到分化培养基上分化 1 周多时间的不定芽图。 0022 图 4 所示为向日葵不定芽进一步伸长到 3cm 时生长图。 0023 图 5 所示为向日葵再生苗嫁接图。 具体实施方式 0024。
20、 下面， 举实施例说明本发明， 但是， 本发明并不限于下述的实施例。 0025 本发明中涉及到的主要原辅材料和设备有 ： 0026 主要原辅材料 ： 康地 6 号油葵种子是由新疆康地种业公司提供。 0027 主要试剂 ： 70的酒精 ( 分析纯 )， 10的过氧化氢， MS 培养基、 IAA、 6-BA ； NAA ； 灭 菌水 0028 主要仪器 ： SW-CJ 18V 型医用超净工作台， 苏州净化设备安装公司 ； AEL-200 电 子天平， 日本SHIMADZU公司 ； LRH-150-G型光照培养箱， 上海仪器厂 ； 医用高压蒸汽灭菌锅， 上海医用核子仪器厂。 0029 实施例一 ： 。
21、0030 (1) 无菌油葵幼苗获得 ： 取康地 6 号油葵种子， 用 70的酒精溶液浸泡 10min， 无 菌水冲洗 2 遍， 用 10的过氧化氢溶液消毒 30min， 再无菌水冲洗 2 遍， 胚端朝上接种于无 激素的 1/2MS 培养基上， 培养室温度为 26 -28， 光照时间 16h， 光强 2000LX， 生长 3 天。 参见附图 1 0031 (2) 油葵愈伤组织的诱导 ： 选取生长健壮的无菌苗于靠近生长点 1-2mm 处切取子 叶， 将子叶切口处插入培养基中大约5mm深度， 诱导2-3周， 诱导出的大量的愈伤组织， 90 外置体可以获得愈伤组织 ； 诱导培养基配方为 ： MS 培养。
22、基 +IAA1.2mg/L+6-BA 4.5mg/L ； 参 说 明 书 CN 102301960 A CN 102301961 A4/5 页 6 见附图 2 0032 (3) 不定芽分化进程 ： 将外植体愈伤， 其大小约 3-4mm 厚， 颜色为淡黄色， 连同子叶 和愈伤转入分化培养基诱导其分化， 愈伤面接触培养基。2-3 周内在接触培养基的愈伤表 面， 会分化出许多小的不定芽(5-10个)。 当不定芽伸长到1cm时， 及时从愈伤块上切下来， 转至葡萄糖减半的 MS 培养基上培养 ； 高达 90愈伤可以分化不定芽。分化培养基配方为 ： MS 培养基、 IAA 0.01mg/L、 6-BA0.。
23、04mg/L ； 参见附图 3 0033 (4) 不定芽生长 ： 当不定芽进一步伸长到 3cm 时， 参见附图 5， 再转至无激素的 2/5MS生长培养基上培养， 再生苗可很快生长成苗 ； 生长培养基配方为 ： 2/5MS培养基 ； 参见 附图 4 0034 (5) 再生植株的嫁接 ： 选用生长发育良好的具有 1 片真叶的实生苗做砧木， 4 片真 叶的再生苗基部削尖作接穗， 采用劈接法把接穗插入砧木， 用韧性良好的塑料带绑缚结合 部位 ； 嫁接后， 用塑料薄膜罩好保湿， 放于通风并有散射光的地方， 七天后揭罩通风解除绑 绳进行常规管理， 80以上嫁接苗可以成活。参见附图 5 0035 实施例二。
24、 ： 0036 详细的再生体系建立过程如下 ： 无菌油葵幼苗获得 ： 取康地6号油葵种子， 用70 的酒精溶液浸泡10min， 无菌水冲洗2遍， 用0.1的升汞溶液消毒5min， 最后用无菌水冲洗 2 遍， 胚端朝上接种于无激素的 1/2MS 培养基上， 培养室温度为 26 -28， 光照时间 16h， 光强 2000LX， 生长 3 天左右， 长出的无菌苗比较弱小， 部分种子不能萌发。油葵愈伤组织的 诱导 ： 选取萌发的无菌苗于靠近生长点 1-2mm 处切取子叶， 将子叶切口处插入诱导培养基 中大约5mm深度， 诱导2-3周， 诱导出愈伤组织 ； 可能由于升汞对材料的杀伤， 愈伤组织量较 少。
25、， 诱导率大约为 45。诱导培养基配方为 ： MS 培养基 +IAA1.2mg/L+6-BA 4.5mg/L。不定 芽分化进程 ： 将外植体愈伤， 其大小约 3-4mm 厚， 颜色为淡黄色， 连同子叶和愈伤转入分化 培养基诱导其分化， 愈伤面接触培养基。2-3 周内在接触培养基的愈伤表面， 会分化出许多 小的不定芽。当不定芽伸长到 1cm 时， 及时从愈伤块上切下来， 转至葡萄糖减半的 MS 培养 基上培养 ； 分化苗较弱， 分化率大约为72。 分化培养基配方为 ： MS培养基、 IAA 0.01mg/L、 6-BA 0.04mg/L。分化苗生长 ： 当不定芽进一步伸长到大约 3cm 时， 再。
26、转至无激素的 2/5MS 培养基上培养， 可很快生长成苗。 再生植株的嫁接 ： 选用生长发育良好的具有1片真叶的实 生苗做砧木， 4 片真叶的再生苗基部削尖作接穗， 采用劈接法把接穗插入砧木， 用韧性良好 的塑料带绑缚结合部位。嫁接后， 用塑料薄膜罩好保湿， 放于通风并有散射光的地方。一星 期后揭罩通风解除绑绳进行常规管理。 通过这种方式的嫁接苗成活率大约73， 长势一般。 0037 实施例三 ： 0038 本发明包括无菌油葵幼苗获得， 油葵愈伤组织的诱导、 不定芽分化和分化苗生 根以及嫁接成活。详细的再生体系建立过程如下 ： 无菌油葵幼苗获得 ： 取康地 6 号油葵 种子， 用 70的酒精溶。
27、液浸泡 10min， 无菌水冲洗 2 遍， 再用 10的过氧化氢溶液消毒 30min， 最后用无菌水冲洗 2 遍， 胚端朝上接种于无激素的 1/2MS 培养基上， 培养室温度为 26 -28， 光照时间 16h， 光强 2000LX， 生长 3 天左右， 无菌苗长势较健壮。油葵愈伤组织 的诱导 ： 选取生长健壮的无菌苗于靠近生长点 1-2mm 处切取子叶， 将子叶切口处插入诱导 培养基中大约 5mm 深度， 诱导 2-3 周， 诱导出的大量的愈伤组织 ； 诱导培养基配方为 ： MS 培 养基 + 不同激素浓度的 MS 培养基中 ( 见下表 )， 观察不同激素浓度配比下外植体的愈伤发 说 明 书。
28、 CN 102301960 A CN 102301961 A5/5 页 7 生情况。 0039 0040 结果对 2， 4-D 来说与 KT 或 6-BA 的不同浓度组合， 效果都不好， 虽然诱导出的愈伤 量很大， 但多表现为蓬松的白色， 有时透明状， 这样的愈伤很难分化出不定芽。对 IAA 来说， 其 IAA1.2mg/L+6-BA 4.5mg/L， 对愈伤的诱导效果最好， 高达 90。 0041 不定芽分化进程 ： 将 IAA1.2mg/L+6-BA 4.5mg/L 诱导的外植体愈伤， 其大小约 3-4mm 厚， 颜色为淡黄色， 连同子叶和愈伤转入分化培养基诱导其分化， 愈伤面接触培养基。。
29、 2-3 周内在接触培养基的愈伤表面， 会分化出许多小的不定芽。当不定芽伸长到 1cm 时， 及 时从愈伤块上切下来， 转至葡萄糖减半的MS培养基上培养 ； 分化培养基配方为 ： MS培养基、 IAA 0.01mg/L、 6-BA 0.04mg/L。 分化苗生长 ： 当不定芽进一步伸长到大约3cm时， 再转至无 激素的 2/5MS 培养基上培养， 可很快生长成苗。再生植株的嫁接 ： 选用生长发育良好的具 有 1 片真叶的实生苗做砧木， 4 片真叶的再生苗基部削尖作接穗， 采用劈接法把接穗插入砧 木， 用韧性良好的塑料带绑缚结合部位。嫁接后， 用塑料薄膜罩好保湿， 放于通风并有散射 光的地方。一星期后揭罩通风解除绑绳进行常规管理。通过这种方式的嫁接苗成活率可达 90， 长势良好。 说 明 书 CN 102301960 A CN 102301961 A1/2 页 8 图 1 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102301960 A CN 102301961 A2/2 页 9 图 5 说 明 书 附 图 CN 102301960 A 。