人组织激肽释放酶ELISA试剂盒的制备.pdf

人组织激肽释放酶ELISA试剂盒的制备，实现本发明技术方案如下：一种人组织激肽释放酶含量测定的ELISA试剂盒，其特征在于：a)该试剂盒采用的方法为双抗体夹心法；b)加入了生物素-亲和素放大系统；c)标准品为原核表达并纯化的人组织激肽释放酶；d)其包被抗体为抗人组织激肽释放酶的多克隆抗体，检测抗体为其生物素化的单抗；e)灵敏度为0.3ng/ml-500ng/ml。本发明试剂盒具有灵敏度高，特异性强，重复性好的特点。利用上述表达的融合蛋白最为标准品，其标准曲线的相关系数高达0.99。采用大批量人

1.  一种人组织激肽释放酶含量测定的ELISA试剂盒，其特征在于：
a)该试剂盒采用的方法为双抗体夹心法；
b)加入了生物素-亲和素放大系统；
c)标准品为原核表达并纯化的人组织激肽释放酶；
d)其包被抗体为抗人组织激肽释放酶的多克隆抗体，检测抗体为其生物素化的单抗；
e)灵敏度为0.3ng/ml-500ng/ml。

2.  一种制备权利要求1所述的人组织激肽释放酶含量测定的ELISA试剂盒的方法，其特征在于包括如下步骤：
a)1∶6400倍稀释的包被抗体包被ELISA板，并置于4℃孵育24小时；
b)1％BSA封闭1小时；
c)倍比稀释标准品，并分别加入标准品及1∶10倍稀释的样品，于37℃反应60分钟；
d)加入1∶800倍稀释的检测抗体并于37℃孵育40分钟；
e)加入1∶2000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的亲和素25分钟。
f)TMB显色并读数。

人组织激肽释放酶ELISA试剂盒的制备
技术领域
本发明涉及一种人组织激肽释放酶融合蛋白，是一种人组织激肽释放酶含量检测的ELISA试剂盒。
背景技术
人组织激肽释放酶(HK1)是一类丝氨酸蛋白酶，能促进低分子激肽原释放血管活性肽从而发挥一系列生物活性作用，命名为KLK1。在人和动物的高血压、心血管疾病和肾脏疾病的模型中，均可见到HK含量的降低。我们在转基因的动物模型中发现HK1具有降低血压，改善胰岛素抵抗，改善肾功能的作用。HK1的水平在人的心血管疾病及肾脏疾病的发生发展的过程中可能具有重要的预测价值。因此，建立HK1含量测定的高效检测试剂盒在临床和科研上均有重要的意义。
鉴于HK1在心血管疾病及肾脏疾病中的预测及治疗价值，国外已有KLK1的含量测定ELISA试剂盒。其采用的方法为竞争ELISA法，所用的抗体为一种多克隆抗体。因此，其方法复杂，计算繁琐，易于产生非特异显色而导致结果误差较大并且价格昂贵不符合中国国情，而国内又无此类的试剂盒。针对上述存在的这些问题发明人将采用了最新的双抗体夹心ELISA技术，并加入了生物素-亲和素系统从而简化了操作过程，提高了特异性及灵敏度。我们利用HK1的多克隆抗体包被ELISA板，能尽可能多的捕获到HK1的融合蛋白及HK1，生物素化的单克隆抗体(生物素-HTK)能特异性地识别ELISA板上的HK1的一段特异性的表位。因此，我们生产的人组织激肽释放酶ELISA试剂盒具有灵敏度高，特异性强，操作简便的特点，更重要的是更为经济适用。
发明内容
本发明的目的是提供一种人组织激肽释放酶含量测定的ELISA试剂盒。
实现本发明技术方案如下：
一种人组织激肽释放酶含量测定的ELISA试剂盒，其特征在于：
a)该试剂盒采用的方法为双抗体夹心法；
b)加入了生物素-亲和素放大系统；
c)标准品为原核表达并纯化的人组织激肽释放酶；
d)其包被抗体为抗人组织激肽释放酶的多克隆抗体，检测抗体为其生物素化的单抗；
e)灵敏度为0.3ng/ml-500ng/ml。
人组织激肽释放酶含量测定的ELISA试剂盒的方法，其特征在于包括如下步骤：
a)1∶6400倍稀释的包被抗体包被ELISA板，并置于4℃孵育24小时；
b)1％BSA封闭1小时；
c)倍比稀释标准品，并分别加入标准品及1∶10倍稀释的样品，于37℃反应60分钟；
d)加入1∶800倍稀释的检测抗体并于37℃孵育40分钟；
e)加入1∶2000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的亲和素25分钟。
f)TMB显色并读数。
特异性人组织激肽释放酶融合蛋白多克隆抗体包被反应板的制备方法，通过下列步骤制备而成：
1)人组织激肽释放酶融合蛋白的获得：
a.人组织及肽释放酶融合蛋白(HK-4T1)的原核表达：以pcDNA-HK为模板，用特异性引物PCR扩增KLK1目的基因，目的基因克隆于PEGX-4T1原核表达载体，转化DH5α感受态细菌。根据氨苄青霉素抗性提取克隆，提取转化子的质粒DNA，鉴定，得到与目的片段相一致的片段，判为阳性结果。将目的基因的重组质粒HK/4T1转化大肠杆菌DH5α，经IPTG诱导后，菌体蛋白经SDS-PAGE蛋白电泳及考马斯亮蓝染色显示，大约在55KD处有一条浓染的新增蛋白条带。经Westernbloting鉴定，能与人组织激肽释放酶单克隆抗体发生强阳性反应，HK-4T1融合蛋白具有较强的免疫原性。
b.HK-4T1融合蛋白的大量表达、纯化：经过大量诱导，表达，包涵体纯化得到大量的HK-4T1融合蛋白。
2)抗HK-4T1融合蛋白多克隆抗体的制备：将纯化的融合蛋白与弗氏完全佐剂充分乳化后免疫家兔获得多克隆抗体，经亲和层析纯化作为包被抗体。
3)用0.05M PH9.6碳酸盐包被缓冲液将包被抗体稀释成适宜浓度后，在每个酶标板的反应孔中加入0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用PBST洗3次，每次3分钟，然后拍干；得到人组织激肽释放酶融合蛋白多克隆抗体包被酶标板。
4)每孔加入200ul1％BSA-PBS，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟，拍干并密封，即得到人组织激肽释放酶融合蛋白多克隆抗体包被反应板。
这种人组织激肽释放酶含量检测的ELISA试剂盒，其特征在于：所述试剂盒由上述特异性抗人组织及肽释放酶多克隆抗体包被板、标本稀释液、洗涤液、标准品、生物素化二抗、酶标亲和素、显色液、终止液构成。具体分为：(1)洗涤液：含0.1％Tween-20的磷酸盐缓冲液(PBST)；(2)标本稀释液：含1％BSA的磷酸盐缓冲液(PBS)；(3)标准品：上述人组织激肽释放酶融合蛋白HK-4T1；(4)生物素化二抗：生物素标记的人组织及肽释放酶单克隆抗体；(5)酶标亲和素：辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(Streptavidin/HRP)；(6)显色液：TMB(四甲基联苯胺)使用液；(7)终止液：2M H2SO4溶液。
本发明试剂盒具有灵敏度高，特异性强，重复性好的特点。利用上述表达的融合蛋白最为标准品，其标准曲线的相关系数高达0.99。采用大批量人血浆作为待测样本，其中组内差异及组间差异均低于10％。
附图说明
图1为人组织激肽释放酶融合蛋白HK-4T1的SDS-PAGE。
图2为抗HK-4T1重组蛋白多克隆抗体的SDS-PAGE。
图3为人组织激肽释放酶融合蛋白的Western bloting。
图4为抗HK-4T1重组蛋白多克隆抗体的Western bloting。
图5为该ELISA试剂盒的标准曲线。
具体实施方式
以下实例用来说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
人组织激肽释放酶ELISA试剂盒的制备
1.试剂
(1)包被缓冲液(PH9.60.05M碳酸盐缓冲液)：
Na2CO3    1.59克
NaHCO3    2.93克
加蒸馏水至1000ml；
(2)洗涤缓冲液(PH7.4PBS)：0.15M
KH2PO4            0.2克
Na2HPO4·12H2O    2.9克
NaCl              8.0克
KCl             0.2克
Tween-20 0.1％ 0.5ml加蒸馏水至1000ml；
(3)标本稀释液：
牛血清白蛋白(BSA)0.1克加洗涤缓冲液至100ml；
(4)标准品：
人组织激肽释放酶融合蛋白，为本实验时自产；
(5)生物素化二抗：
生物素标记的抗人组织激肽释放酶单克隆抗体，为本实验室自产；
(6酶标亲和素：
HRP标记链霉亲和素，为武汉博士德生物有限公司生产；
(7)终止液(2M H2SO4)：
蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98％)21.7ml。
(8)底物缓冲液(PH5.0磷酸棗柠檬酸)：
0.2M Na2 HPO4(28.4克/L)25.7ml
0.1M柠檬酸(19.2克/L)24.3ml
加蒸馏水50ml。
(6)TMB(四甲基联苯胺)使用液：
TMB(10mg/5ml无水乙醇)0.5ml
底物缓冲液(PH5.5)        10ml
0.75％H2O2               32μl
2.主要仪器
(1)酶标仪：ELX800Universal Microplate reader
(2)ELISA反应板：Corning incorporated costar R 96Well EIA/RIA plate
3.方法
酶标亲和素抗最适浓度的选择
(1)用100ng/ml生物素化二抗进行包被，洗涤。
(2)将酶标亲和素用稀释液作一系列稀释后分别加入已包被的孔中，保温、洗涤。
(3)加底物显色。加酸终止反应后，读取吸光度(A)，取A值在1.0的酶标亲和素稀释度，作为酶标亲和素的最适滴度为1∶2000。
生物素化二抗最佳浓度的选择
(1)用100ng/ml人组织及肽释放酶融合蛋白进行包被，洗涤。
(2)将生物素化二抗用稀释液作一系列稀释后分别加入已包被的孔中，保温、洗涤。
(3)加入最适滴度稀释的酶标亲和素，保温，洗涤。
(4)加底物显色。加酸终止反应后，读取吸光度(A)，取A值在1.0的生物素化二抗稀释度，作为生物素化二抗的最适滴度为1∶500。
棋盘滴定法选择包被抗体最适滴度
(1)用包被液将包被抗体作一系列稀释后进行包被，洗涤。
(2)将入组织及肽释放酶融合蛋白配比稀释作为标准品，人血浆样本倍比稀释作为阳性对照，样本稀释液作为阴性对照，加样，保温，洗涤。
(3)加入最适滴度稀释的生物素化二抗，保温，洗涤。
(4)加入最适滴度稀释的酶标亲和素，保温，洗涤。
(5)加底物显色。加酸终止反应后，读取吸光度(A)。
(6)选择阳性对照的A值为0.8-1.0间，阴性对照的A值小于0.1的包被抗体的稀释度作为最适包被浓度，其稀释滴度为1∶3200；血浆样本最佳稀释度为1∶10；标准曲线的检测范围为7-1000ng/ml。
试剂盒的构成
所述试剂盒有抗人组织及肽释放酶融合蛋白包被酶标反应板、标本稀释液、生物素化二抗、酶标亲和素、显色液、终止液构成，具体组分为：
(1)洗涤液：含0.1％Tween-20的磷酸盐缓冲液(PBST)；
(2)标本稀释液：含1％BSA的磷酸盐缓冲液(PBS)；
(3)标准品：上述人组织激肽释放酶融合蛋白HK-4T1；
(4)生物素化二抗：生物素标记的人组织及肽释放酶单克隆抗体；
(5)酶标亲和素：辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(Streptavidin/HRP)；
(6)显色液：TMB-H2O2系统；
(7)终止液：2M H2SO4溶液。
利用上述试剂盒采用ELISA法检测血浆中人组织及肽释放酶的含量：
(1)待测血浆，加入1∶10稀释的待测血浆到包被好的酶标反应板，100ul/孔，37℃孵育1小时，洗板3次；
(2)加生物素化二抗，加入1∶500稀释的生物素化二抗，100ul/孔，37℃孵育40分钟，洗板3次；
(3)加酶标亲和素，加入1∶2000稀释的酶标亲和素，100ul/孔，37℃孵育25分钟，洗板3次；
(4)显色，洗板后加入TMB-H2O2系统底物100ul，室温反应10分钟；
(5)每孔加入2MH2SO450ul，终止反应；
(6)结果判断，空白调零，读取450nm波长处吸光度，即OD450值；
(7)计算结果，根据标准曲线计算出血浆中人组织及肽释放酶的含量。
实施例2
与国外试剂盒的比较
国外试剂盒的灵敏度范围为0.4ng/ml-25ng/ml；本试剂盒的灵敏度为0.3ng/ml-500ng/ml，其检测范围高于国外试剂盒。国外试剂盒采用的方法是间接竞争ELISA法，其计算繁琐，而本试剂盒采用的方法是双抗体夹心法，计算更为直观简便。
实施例3
利用此试剂盒检测了124例正常人的血浆中HK1的含量，每组做三个复孔，间隔6个月后再重复一次。其组内差异为1.7％，组间差异为8％。正常人的HK1的血浆含量为252±93ng/ml。