产生复合性状基因座的方法和组合物.pdf

本发明提供了用于将多个独立的转基因座位堆叠进植物的基因组中的组合物和方法。组合物包括包含在基因组窗口内的不同基因组位点整合的至少一个转基因靶位点和至少一个目的基因组座位的植物、种子或植物细胞。可采用植物育种技术使得所述转基因靶位点和所述目的基因组座位可繁育在一起。以该方式，可在基因组窗口内产生多个独立的转基因整合以产生复合性状基因座。对所述复合性状基因座进行设计使得所述转基因靶位点和/或目的基因组座位可彼此独立地分开，从而提供通过以育种方法添加和以育种方法移除特定元件来变更复合性状基因座的有益效果。还可采用各种方法来修饰所述靶位点使得它们含有多种目的多核苷酸。

1.  一种在其基因组中具有包含至少第一转基因靶位点、第二转基因靶位点和目的基因组座位的基因组窗口的植物或种子， 
其中所述基因组窗口长约10cM； 
其中所述目的基因组座位、所述第一转基因靶位点和所述第二转基因靶位点各具有不同的基因组插入位点；并且 
其中所述第一转基因靶位点、所述第二转基因靶位点和所述目的基因组座位各以约10％至约0.1％的比率彼此独立地分开。 

2.  根据权利要求1所述的植物或种子，其中所述基因组窗口长约5cM；其中所述第一转基因靶位点、所述第二转基因靶位点和所述目的基因组座位各以约5％至约0.1％的比率彼此独立地分开。 

3.  根据权利要求1或2所述的植物或种子，其中 
(a)所述第一转基因靶位点或所述第二转基因靶位点与所述目的基因组座位以约5％至约0.1％的比率独立地分开；或者 
(b)所述第一转基因靶位点和所述第二转基因靶位点以约5％至约0.1％的比率彼此独立地分开。 

4.  根据权利要求1、2或3所述的植物或种子，其中所述第一转基因靶位点包含第一重组位点和第二重组位点，其中 
(i)所述第一和所述第二重组位点彼此相异。或者 
(ii)所述第一和所述第二重组位点彼此相异且相容性降低； 
并且所述第二转基因靶位点包含第三重组位点和第四重组位点，其中 
(i)所述第三和所述第四重组位点彼此相异；或者 
(ii)所述第三和所述第四重组位点彼此相异且相容性降低。 

5.  根据权利要求1-4中任一项所述的植物或种子，其中所述第一转基因靶位点或所述第二转基因靶位点距所述目的基因组座位在约5cM以内。 

6.  根据权利要求1-4中任一项所述的植物或种子，其中所述第一转基因靶位点或所述第二转基因靶位点距所述目的基因组座位在约2cM以内。 

7.  根据权利要求1-4中任一项所述的植物或种子，其中所述第一转基因靶位点或所述第二转基因靶位点距所述目的基因组座位在约0.5cM以内。 

8.  根据权利要求1-7中任一项所述的植物或种子，其中所述基因组窗口还包含具有第五重组位点和第六重组位点的第三转基因靶位点，其中 
(i)所述第五和所述第六重组位点彼此相异。或者 
(ii)所述第五和所述第六重组位点彼此相异且相容性降低； 
并且所述第三转基因靶位点具有与所述第一转基因靶位点、所述第二转基因靶位点和所述目的基因组座位不同的基因组插入位点。 

9.  根据权利要求8所述的植物或种子，其中所述第三转基因靶位点距所述目的基因组座位在约5cM以内。 

10.  根据权利要求1-9中任一项所述的植物或种子，其中所述目的基因组座位赋予包含雄性不育、位点特异性重组、非生物胁迫耐受性、变更的磷、变更的抗氧化剂、变更的脂肪酸、变更的必需氨基酸、变更的碳水化合物、除草剂耐受性、昆虫抗性或病害抗性的性状。 

11.  根据权利要求1-10中任一项所述的植物或种子，其中所述目的基因组座位包含转基因。 

12.  根据权利要求1-10中任一项所述的植物或种子，其中所述目的基因组座位包含天然性状。 

13.  根据权利要求1-12中任一项所述的植物或种子，其中所述第一转基因靶位点包含至少一种目的多核苷酸。 

14.  根据权利要求1-12中任一项所述的植物或种子，其中所述第二转基因靶位点包含至少第二目的多核苷酸。 

15.  根据权利要求4所述的植物或种子，其中所述第二转基因靶位点包含与所述第一转基因靶位点相同的相异重组位点。 

16.  根据权利要求4所述的植物或种子，其中所述第二转基因靶位点包含与所述第一转基因靶位点不同的相异重组位点。 

17.  根据权利要求4所述的植物或种子，其中所述第一转基因靶位点和所述第二转基因靶位点的所述相异重组位点包含LOX位点、突变型LOX位点、FRT位点或突变型FRT位点。 

18.  根据权利要求17所述的植物或种子，其中所述第一和所述第二转基因靶位点的所述相异重组位点包含FRT位点或突变型FRT位点。 

19.  根据权利要求17或18所述的植物或种子，其中所述突变型FRT位点包含FRT5位点、FRT6位点、FRT7位点、FRT12位点或FRT87位点。 

20.  根据权利要求15所述的植物或种子，其中所述第一和所述第二转基因靶位点的所述相异重组位点包含FRT1位点和FRT87位点。 

21.  根据权利要求1-20中任一项所述的植物或种子，其中所述植物或种子是单子叶植物。 

22.  根据权利要求21所述的植物或种子，其中所述单子叶植物是玉蜀黍、小麦、水稻、大麦、高粱或黑麦。 

23.  根据权利要求1-20中任一项所述的植物或种子，其中所述植物或种子是双子叶植物。 

24.  根据权利要求23所述的植物或种子，其中所述双子叶植物是大豆、芸苔、向日葵、棉花或苜蓿。 

25.  一种产生第二植物的方法，所述方法包括对第一植物或其部分应用植物育种技术，其中所述第一植物是根据权利要求1-24中任一项所述的植物，并且其中应用所述技术导致产生所述第二植物。 

26.  根据权利要求25所述的方法，其中当与所述第一植物比较时，所述第二植物在所述基因组窗口内包含至少一个另外的转基因靶位点或至少一个另外的目的基因组座位；其中所述另外的转基因靶位点和所述另外的目的基因组座位各自相对于彼此以及相对于所述第一转基因靶位点、所述第二转基因靶位点和所述目的基因组座位具有不同的基因组插入位点。 

27.  根据权利要求26所述的方法，其中所述至少一个另外的转基因靶位点包含目的多核苷酸。 

28.  根据权利要求25所述的方法，其中当与所述第一植物比较时，所述第二植物在所述基因组窗口内包含少至少一个转基因靶位点或少至少一个目的基因组座位。 

29.  一种在植物的基因组中产生复合性状基因座的方法，包括 
(a)提供在基因组窗口内具有至少第一转基因靶位点的第一植物，并且其中所述基因组窗口长约10cM且所述第一植物不包含第一目的基因组座位； 
(b)将所述第一植物与第二植物进行育种，其中所述第二植物在所述基因组窗口中包含所述第一目的基因组座位并且所述第二植物不包含所述第一转基因靶位点；以及， 
(c)从步骤(b)选择包含所述第一转基因靶位点和所述目的基因组座位的子代植物；其中在所述子代植物中所述第一转基因靶位点和所述第一目的基因组座位具有不同的基因组插入位点。 

30.  一种在植物的基因组中产生复合性状基因座的方法，包括 
(a)提供在基因组窗口内具有至少第一转基因靶位点和第二转基因靶位点的第一植物，其中所述基因组窗口长约10cM，并且其中所述第一转基因靶位点和所述第二转基因靶位点具有不同的基因组插入位点，其中所述第一植物不包含第一目的基因组座位； 
(b)将所述第一植物与第二植物进行育种，其中所述第二植物在所述基因组窗口中包含所述第一目的基因组座位，其中所述第二植物在所述基因组窗口中不包含所述第一转基因靶位点或所述第二转基因靶位点；以及， 
(c)从步骤(b)选择包含所述第一转基因靶位点、所述第二转基因靶位点和所述第一目的基因组座位的子代植物； 
其中在所述子代植物中所述第一转基因靶位点、所述第二转基因靶位点和所述第一目的基因组座位各具有不同的基因组插入位点；并且， 
其中所述子代植物中的所述第一转基因靶位点、所述第二转基因靶位点和所述目的基因组座位各以约10％至0.1％的比率彼此独立地分开。 

31.  根据权利要求30所述的方法，其中所述基因组窗口长约5cM，并且其中所述子代植物中的所述第一转基因靶位点、所述第二转基因靶位点和所述目的基因组座位各以约5％至0.1％的比率彼此独立地分开。 

32.  根据权利要求30或31所述的方法，其中 
(a)所述第一转基因靶位点或所述第二转基因靶位点与所述第一目的基因组座位以约5％至约0.1％的比率独立地分开；或者， 
(b)所述子代植物的所述第一转基因靶位点和所述第二转基因靶位点以约5％至约0.1％的比率彼此独立地分开。 

33.  根据权利要求30-32中任一项所述的方法，其中所述方法还包括 
(a)将所述子代植物与包含第二目的基因组座位的第三植物进行育种，其中所述第三植物在所述基因组窗口中包含所述第二目的基因组座位，其中所述第三植物在所述基因组窗口中不包含所述第一转基因靶位点、所述第二转基因靶位点或所述第一目的基因组座位；以及， 
(b)从步骤(a)选择包含所述第一转基因靶位点、所述第二转基因靶位点、所述第一目的基因组座位和所述第二目的基因组座位的第二子代植物； 
其中在所述第二子代植物中所述第一转基因靶位点、所述第二转基因靶位点、所述第一目的基因组座位和所述第二目的基因组座位各具有不同的基因组插入位点；并且， 
其中所述第二子代植物中的所述第一转基因靶位点、所述第二转基因靶位点、所述第一目的基因组座位或所述第二目的基因组座位各以约10％至约0.1％的比率彼此独立地分开。 

34.  根据权利要求30-33中任一项所述的方法，其中 
(a)所述第一转基因靶位点包含第一重组位点和第二重组位点，其中 
(i)所述第一和所述第二重组位点彼此相异，并且所述第一转基因靶位点包含目的多核苷酸；或者 
(ii)所述第一和所述第二重组位点彼此相异且相容性降低，并且所述第一转基因靶位点包含目的多核苷酸；并且 
(b)所述第二转基因靶位点包含第三重组位点和第四重组位点，其中 
(i)所述第三和所述第四重组位点彼此相异；并且所述第二转基因靶位点还包含第二目的多核苷酸；或者 
(ii)所述第三和所述第四重组位点彼此相异且相容性降低；并且所述第二转基因靶位点还包含第二目的多核苷酸。 

35.  根据权利要求30-34中任一项的方法，其中所述第一转基因靶位点和所述第一目的基因组座位的基因组位置彼此相距在5cM以内。 

36.  根据权利要求30-34中任一项的方法，其中所述第一转基因靶位点和所述第一目的基因组座位的基因组位置彼此相距在2cM以内。 

37.  根据权利要求30-34中任一项的方法，其中所述第一转基因靶位点和所述目的基因组座位的基因组位置彼此相距在0.5cM以内。 

38.  根据权利要求30-31中任一项所述的方法，其中所述第一目的基因组座位赋予包含雄性不育、位点特异性重组、非生物胁迫耐受性、变更的磷、变更的抗氧化剂、变更的脂肪酸、变更的必需氨基酸、变更的碳水化合物、除草剂耐受性、昆虫抗性或病害抗性的性状。 

39.  根据权利要求29-38中任一项所述的方法，其中所述第一目的基因组座位包含天然性状、目的转基因或另外的转基因靶位点。 

40.  根据权利要求34所述的方法，其中所述第一转基因靶位点和所述第二转基因靶位点包含相同的相异重组位点。 

41.  根据权利要求34所述的方法，其中所述第一转基因靶位点和所述第二转基因靶位点包含不同的相异重组位点。 

42.  根据权利要求34、40或41所述的方法，其中所述相异重组位点包含LOX位点、突变型LOX位点、FRT位点或突变型FRT位点。 

43.  根据权利要求34、40或41所述的方法，其中所述相异重组位点包含FRT位点或突变型FRT位点。 

44.  根据权利要求42或43所述的方法，其中所述突变型FRT位点包含FRT5位点、FRT6位点、FRT7位点、FRT12位点或FRT87位点。 

45.  根据权利要求34所述的方法，其中所述第一和所述第二转基因靶位点包含FRT1位点和FRT87位点。 

46.  一种变更植物的基因组中的复合性状基因座的方法，包括 
(a)提供在基因组窗口内具有至少第一转基因靶位点、第二转基因靶位点和第一目的基因组座位的第一植物，其中所述基因组窗口长约10cM，并且其中所述第一转基因靶位点、所述第二转基因靶位点、所述第一目的基因组座位具有不同的基因组插入位点； 
其中所述第一植物中的所述第一转基因靶位点、所述第二转基因靶位点或所述第一目的基因组座位各以约10％至约0.1％的比率彼此独立地分开； 
(b)将所述第一植物与第二植物进行育种；以及， 
(c)从步骤(b)选择子代植物，其中所述子代植物的所述基因组窗口不包含所述第一转基因靶位点、所述第二转基因靶位点或所述第一目的基因组座位中的任一者或任两者。 

47.  根据权利要求46所述的方法，其中所述基因组窗口长约5cM，并且其中所述第一植物中的所述第一转基因靶位点、所述第二转基因靶位点或所述第一目的基因组座位各以约5％至约0.1％的比率彼此独立地分开。 

48.  根据权利要求46或47所述的方法，其中 
(a)所述第一植物的所述第一转基因靶位点和所述第二转基因靶位点以约5％至约0.1％的比率彼此独立地分开；或者， 
(b)所述第一植物的所述第一转基因靶位点或所述第二转基因靶位点与所述第一目的基因组座位以约5％至约0.1％的比率独立地分开。 

49.  根据权利要求46、47或48所述的方法，其中 
(a)所述第一转基因靶位点包含第一重组位点和第二重组位点，其中 
(i)所述第一和所述第二重组位点彼此相异，并且所述第一转基因靶位点包含目的多核苷酸；或者 
(ii)所述第一和所述第二重组位点彼此相异且相容性降低，并且所述第一转基因靶位点包含目的多核苷酸；并且， 
(b)所述第二转基因靶位点包含第三重组位点和第四重组位点，其中 
(i)所述第三和所述第四重组位点彼此相异；并且所述第二转基因靶位点还包含第二目的多核苷酸；或者 
(ii)所述第三和所述第四重组位点彼此相异且相容性降低；并且所述第二转基因靶位点还包含第二目的多核苷酸。 

50.  根据权利要求46-49中任一项的方法，其中所述第一转基因靶位点和所述第一目的基因组座位的基因组位置彼此相距在5cM以内。 

51.  根据权利要求46-49中任一项的方法，其中所述第一转基因靶位点和所述第一目的基因组座位的基因组位置彼此相距在2cM以内。 

52.  根据权利要求46-49中任一项的方法，其中所述第一转基因靶位点和所述目的基因组座位的基因组位置彼此相距在0.5cM以内。 

53.  根据权利要求46-49中任一项所述的方法，其中所述目的基因组座位赋予包含雄性不育、位点特异性重组、非生物胁迫耐受性、变更的磷、变更的抗氧化剂、变更的脂肪酸、变更的必需氨基酸、变更的碳水化合物、除草剂耐受性、昆虫抗性或病害抗性的性状。 

54.  根据权利要求46-49中任一项所述的方法，其中所述第一目的基因组座位包含天然性状、目的转基因或另外的转基因靶位点。 

55.  根据权利要求25-54中任一项所述的方法，其中所述植物是单子叶植物。 

56.  根据权利要求55所述的方法，其中所述单子叶植物是玉蜀黍、小麦、水稻、大麦、高粱或黑麦。 

57.  根据权利要求25-54中任一项所述的方法，其中所述植物是双子叶植物。 

58.  根据权利要求57所述的方法，其中所述双子叶植物是大豆、芸苔、向日葵、棉花或苜蓿。 

59.  一种产生植物、种子或植物细胞的文库的方法，其中所述文库中的所述植物、所述种子或所述植物细胞各包含转基因靶位点，所述方法包括： 
(a)向植物细胞的群体中引入包含转基因靶位点的重组构建体； 
(b)鉴别具有所述重组构建体的植物细胞或植物； 
(c)表征所述重组构建体在步骤(b)的所述植物细胞或植物内的基因组插入位点；以及， 
(d)集成所述植物、种子或植物细胞的文库，其中所述文库的每个成员包含具有不同基因组插入位点的转基因靶位点，并且当所述转基因靶位点组合进单个植物基因组中时，所述转基因靶位点彼此独立地分开。 

60.  根据权利要求59所述的方法，其中步骤(d)的所述植物、种子或植物细胞的文库包含植物、种子或植物细胞的群体，其中所述群体的成员在基因组窗口内以约10cM的间隔至约1cM的间隔具有所述转基因靶位点。 

61.  根据权利要求62所述的方法，其中所述群体的成员在基因组窗口内以约2cM的间隔具有所述转基因靶位点。 

62.  根据权利要求60或61所述的方法，其中所述基因组窗口是整个基因组。 

63.  一种鉴别在基因组窗口中具有转基因靶位点的植物或植物细胞的方法，包括 
(a)提供植物、种子或植物细胞的文库，其中所述文库中的所述植物、所述种子或所述植物细胞各包含不同基因组插入位点中的转基因靶位点，其中所述文库的每个成员中的所述转基因靶位点的所述基因组插入位点当存在于相同基因组中时彼此独立地分开；以及， 
(b)鉴别所述文库中的植物、种子或植物细胞的亚群，其中所述亚群的每个成员中的所述转基因靶位点的所述基因组插入位点当存在于相同基因组中时可以约10％至约0.1％的比率彼此独立地分开。 

64.  一种包含植物、种子或植物细胞的群体的植物、种子或植物细胞的文库，所述植物、种子或植物细胞具有稳定掺入进其基因组中的转基因靶位点，其中所述文库的每个成员中的所述转基因靶位点的基因组插入位点当存在于相同基因组中时彼此独立地分开，并且所述群体的成员在基因组窗口内以约10cM的间隔至约1cM的间隔具有所述转基因靶位点。 

65.  根据权利要求64所述的植物、种子或植物细胞的文库，其中所述基因组窗口包含完整的基因组。 

66.  根据权利要求64所述的植物、种子或植物细胞的文库，其中所述基因组窗口长约10cM。 

67.  根据权利要求64、65或66所述的植物、种子或植物细胞的文库，其中所述群体的成员在基因组窗口内以约2cM的间隔具有所述转基因靶位点。 

68.  一种在其基因组中具有包含至少第一转基因靶位点、第二转基因靶位点和目的基因组座位的基因组窗口的植物或种子，其中所述基因组窗口： 
(a)旁侧为至少第一标记和至少第二标记，所述第一标记包含UMC1160、UMC2224、NPI579B、PMCB1、IDP3917、GPM199C、IDP1425、MMP68、UMC2225、STD2C(DBA)、TIDP3300、CSU1171、SUT1或UMC1166，所述第二标记包含AY107207、UMC1568、IDP3783、BNLG1429、IDP209、LTK1或IDP7169；或者， 
(b)旁侧为至少第一标记和至少第二标记，所述第一标记包含UMC1625、UMC2196、UMC2312、BNLG1867、PZA03047、UMC1229、UCK1、RZ390D(CYB5)、MMP20、MMP10、MMP160、PHP20528、UMC2314、UAZ232B(SCI)或UMC2313，所述第二标记包含CDO545、PHP20854、UMC1133、UFG69、MMP76、Y1、BNLG1422、MMP108B、MMP4、UMC1006或RZ444E； 
其中所述目的基因组座位、所述第一转基因靶位点和所述第二转基因靶位点各具有不同的基因组插入位点；并且， 
其中所述第一转基因靶位点、所述第二转基因靶位点和所述目的基因组座位各以约10％至约0.1％的比率彼此独立地分开。 

69.  一种子代植物，所述子代植物从根据权利要求68所述的植物获得。 

70.  根据权利要求68所述的植物，所述植物还包含至少一种变更的靶序列，其中所述至少一种变更的靶序列起源于被双链断裂诱导剂识别和切割的对应靶序列，并且其中所述至少一种变更的靶序列位于所述基因组窗口中。 

71.  一种在植物基因组中产生复合性状基因座的方法，包括 
(a)提供在基因组窗口内具有至少第一转基因靶位点的第一植物，其中所述第一植物不包含第一目的基因组座位，并且其中所述基因组窗口： 
(i)旁侧为至少第一标记和至少第二标记，所述第一标记包含UMC1160、UMC2224、NPI579B、PMCB1、IDP3917、GPM199C、IDP1425、MMP68、UMC2225、STD2C(DBA)、TIDP3300、CSU1171、SUT1或UMC1166，所述第二标记包含AY107207、UMC1568、IDP3783、BNLG1429、IDP209、LTK1或IDP7169；或者 
(ii)旁侧为至少第一标记和至少第二标记，所述第一标记包含UMC1625、UMC2196、UMC2312、BNLG1867、PZA03047、UMC1229、UCK1、RZ390D(CYB5)、MMP20、MMP10、MMP160、PHP20528、UMC2314、UAZ232B(SCI)和UMC2313，所述第二标记包含CDO545、PHP20854、UMC1133、UFG69、MMP76、Y1、BNLG1422、MMP108B、MMP4、UMC1006或RZ444E； 
(b)将所述第一植物与第二植物进行育种，其中所述第二植物在所述基因组窗口中包含所述第一目的基因组座位并且所述第二植物不包含所述第一转基因靶位点；以及， 
(c)从步骤(b)选择包含所述第一转基因靶位点和所述目的基因组座位的子代植物；其中在所述子代植物中所述第一转基因靶位点和所述第一目的基因组座位具有不同的基因组插入位点。 

72.  一种在其基因组中具有包含至少第一转基因靶位点、第二转基因靶位点和目的基因组座位的基因组窗口的植物或种子，其中所述基因组窗口： 
旁侧为至少第一标记和至少第二标记，所述第一标记包含SATT613、SATT284、S60414-TB或SATT462，并且所述第二标记包含SATT481、SATT156或SCT_010； 
其中所述目的基因组座位、所述第一转基因靶位点和所述第二转基因靶位点各具有不同的基因组插入位点；并且， 
其中所述第一转基因靶位点、所述第二转基因靶位点和所述目的基因组座位各以约10％至约0.1％的比率彼此独立地分开。 

73.  一种子代植物，所述子代植物从根据权利要求72所述的植物获得。 

74.  根据权利要求72所述的植物，所述植物还包含至少一种变更的靶序列，其中所述至少一种变更的靶序列起源于被双链断裂诱导剂识别和切割的对应靶序列，并且其中所述至少一种变更的靶序列位于所述基因组窗口中。 

75.  一种在植物基因组中产生复合性状基因座的方法，包括 
(a)提供在基因组窗口内具有至少第一转基因靶位点的第一植物，其中所述第一植物不包含第一目的基因组座位，并且其中所述基因组窗口： 
旁侧为至少第一标记和至少第二标记，所述第一标记包含SATT613、SATT284、S60414-TB或SATT462，并且所述第二标记包含SATT481、SATT156或SCT_010； 
(b)将所述第一植物与第二植物进行育种，其中所述第二植物在所述基因组窗口中包含所述第一目的基因组座位并且所述第二植物不包含所述第一转基因靶位点；以及， 
(c)从步骤(b)选择包含所述第一转基因靶位点和所述目的基因组座位的子代植物；其中在所述子代植物中所述第一转基因靶位点和所述第一目的基因组座位具有不同的基因组插入位点。 

产生复合性状基因座的方法和组合物
对通过EFS-WEB作为文本文件提交的序列表的引用
通过EFS-Web以电子方式将序列表的正式副本作为ASCII格式的序列表提交，该文件名称为428063SEQLIST.txt，创建日期为2013年1月7日，文件大小为12KB，并且该文件与本说明书同时提交。该ASCII格式文档中所含的序列表是本说明书的一部分，并且全文以引用的方式并入本文。
技术领域
本发明涉及植物分子生物学领域。具体地讲，提供了用于变更植物的基因组的方法和组合物。
背景技术
重组DNA技术已使得可以将外来DNA序列插入进生物体的基因组中，从而变更该生物体的表型。最常用的植物转化方法是土壤杆菌(Agrobacterium)感染和生物弹射粒子轰击，在所述方法中转基因以随机方式和以不可预测的拷贝数整合进植物基因组中。
遗憾的是，与这些方法相关的问题可导致农艺经济性减低、进一步研究需要额外的费用、产生额外的转基因事件以及得到产物时间较慢。因而，需要更有效的用于将目的序列的插入靶向进所需的基因组位置、容易地修饰所靶向的多核苷酸和/或在所需整合位点附近堆叠额外的目的多核苷酸的方法。
发明内容
提供了在植物中在包含至少一个转基因靶位点和至少一个目的基因组座位的基因组窗口(genomic window)中产生复合性状基因座的方法和组合物。该组合物提供在其基因组中具有长度约10cM的基因组窗口的植物或种 子，其中该目的基因组座位以及该转基因靶位点具有不同的基因组插入位点并且以约10％至约0.1％的比率彼此独立地分开。该转基因靶位点可包含至少第一重组位点和第二重组位点，并且该第一重组位点和第二重组位点相对于彼此是相异的。该转基因靶位点可还包含目的多核苷酸并且可通过位点特异性整合方法来变更。
另外提供的是在植物的基因组中产生复合性状基因座的方法，该方法包括对在其基因组中具有约10cM的基因组窗口的第一植物应用植物育种技术，该基因组窗口带有至少第一转基因靶位点。该方法包括将所述第一植物与在基因组窗口中包含目的第一基因组座位的第二植物进行育种，并选择包含所述第一转基因靶位点和所述目的第一基因组座位的子代，其中在所述子代植物中所述第一转基因靶位点和所述第一基因组座位具有不同的基因组插入位点。使用这种方法，可将各种转基因靶位点和/或目的多核苷酸引入基因组窗口中。还提供的是通过利用各种育种技术或通过采用位点特异性重组技术来添加、移除或替换转基因靶位点、目的基因组座位或目的多核苷酸来变更复合性状基因座的方法。
另外提供的是包含转基因靶位点的植物、种子或植物细胞的文库和制备该文库的方法。该文库包含植物、种子或植物细胞的群体，各包含具有不同基因组插入位点的转基因靶位点，并且所述转基因靶位点当组合进单个植物基因组中时彼此独立地分开。还提供的是该文库的亚群，其中每个成员在给定基因组窗口内包含具有不同基因组插入位点的转基因靶位点，并且所述转基因靶位点在存在于相同基因组中时以约10％至约0.1％的比率独立地分开。该文库的转基因靶位点可在整个给定基因组窗口以确定的间隔定位，使得所述给定基因组窗口内用于转基因靶位点插入的所有可能位置由该文库群体的成员代表。因而，可将育种技术应用于所述文库的给定亚群以在植物中产生复合性状基因座。
附图说明
图1：A)和B)：示出了通过杂交和/或重转化(retransformation)产生的复合性状基因座的非限制性示例设计。GI指示目的基因，TG表示转基因。A至D是10cM基因组区。
图2：示出了SSI平台II变体a)pPHP35557和b)pPHP44290的T-DNA区。这些质粒是土壤杆菌双元载体中间体的衍生物，该载体中间体与Komari等人(1996)中公布的用于玉米转化的pSB11相关。选择标记基因位于T-DNA左边界序列(LB)附近。供添加性状基因的多克隆位点(未示出)(PHP35557)或Gateway目的位点(destination site)(PHP44290)添加在右T-DNA边界(RB)附近。性状添加区位于一对loxP位点之间，该对loxP位点具有做CRE/lox切除的能力。位点特异性整合(SSI)能力通过在选择标记基因周围设置FRT位点FRT1和FRT87来赋予。
图3：质粒PHP44556的概略示意图。
图4：连接介导的巢式PCR(LMnPCR)的概略示意图。自源于转化程序的T0转基因植物的叶组织提取基因组DNA，然后使用机械力进行随机剪切。DNA剪切产生大量的随机片段，该随机片段的小的子集含有新插入的转基因的一部分，其中该转基因与基因组DNA邻接。带有转基因序列的基因组DNA片段代表基因组插入位点，并且该插入位点旁侧序列(FS)由其中基因组DNA与转基因序列邻接的区域限定。将确定的DNA接头连接至随机基因组片段的末端以方便使用PCR方法来扩增相对稀有的转基因插入片段。使用与该转基因的末端杂交的引物和与该DNA接头杂交的引物设计PCR。扩增的PCR条带应该含有FS，并将其提交进行序列分析，然后确认。序列结果的确认涉及针对玉蜀黍基因组序列数据库对所扩增的PCR序列进行BLAST分析。
图5：A)用于玉蜀黍1号染色体上的复合性状基因座CTL3A的转基因靶位点(TTS)和插入位点(IS)候选。B)用于玉蜀黍6号染色体上的复合性状基因座CTL6A的转基因靶位点(TTS)候选。
图6：玉蜀黍物理图谱上与目的基因组窗口(TRAIT3A)和公共BACS相关的CTL3A复合性状基因座的转基因靶位点(TTS)和插入位点(IS)的示意图。
图7：包含供位点特异性整合(SSI)的转基因靶位点的转基因玉蜀黍事件中的位点特异性整合。
图8：复合性状基因座CTL3A中TTS-3A2处的重组酶介导的盒交换(RMCE)。
图9：玉蜀黍物理图谱上与目的基因组窗口(TRAIT6A)和公共BACS相关的CTL6A复合性状基因座的转基因靶位点(TTS)和插入位点的示意图。
图10：对一个基因组位置处的数个插入的表达分析。
图11：用于基因枪大豆转化以产生转基因位点特异性整合(SSI)靶事件的QC599A DNA片段的示意图谱。标出了用于qPCR测定法的FRT1位点和FRT87位点以及用于反向PCR的三个独特限制位点AflII、NsiI、PciI。GM-SAMS PRO具有由实线指示的内含子。
图12：大豆中FLP重组酶介导的盒交换的示意性描述。在瞬时表达的FLP重组酶的帮助下，事先整合在大豆基因组中的靶DNA与供体DNA在FRT1和FRT87两个位点重组。旁侧为FRT1和FRT87位点的靶DNA盒被替换为旁侧为FRT1和FRT87位点的供体DNA盒，从而导致该供体DNA盒被位点特异性整合至靶标的完全相同的基因组位点。
图13：含有转基因靶标位点的SSI靶株系的鉴别。将单拷贝靶事件的基因组DNA分别用三种限制酶AflII、NsiI和PciI消化，这三种酶均切割QC599A转基因仅一次以及附近旁侧的基因组边界DNA，例如PciI消化。将所得的混合的基因组边界和QC599A转基因DNA片段通过自我连接环化、PCR扩增并测序。将使用两组引物(用于5′边界和3′边界每一者)进行的两轮PCR扩增用于特异性扩增边界-QC599A DNA片段。
图14：包含大豆19号染色体上的复合性状基因座CTL-LA的基因组窗口中的转基因SSI靶位点TTS-LA1和TTS-LA2以及一个目的基因(TRAITLA)的遗传位置。SSI靶位点TTS-LA1和TTS-LA2独立地产生并通过杂交合在一起。
具体实施方式
下文将参考附图更完整地描述本发明，其中示出了本发明的一些但并非全部实施例。事实上，这些发明可以多种不同形式呈现，不应理解为受限于本文所述的实施例；更确切地说，提供这些实施例以使得本公开将满足适用的法律要求。同样的编号在全文中是指同样的要素。
本发明所属领域的技术人员借助于上述说明和相关附图中所展示的教导内容，将想到本文阐明的本发明的许多修改形式和其他实施例。因此，应理解，本发明不应限于所揭示的具体实施例，而是意在将修改形式和其 它实施例包括在所附权利要求书的范围内。虽然本文中采用特定术语，但所述术语仅在一般性和描述性意义上使用而并非用于限制目的。
I.概述
提供了用于将多个独立的转基因座位堆叠进植物的基因组中的组合物和方法。组合物包括包含在基因组窗口内的不同基因组位点处整合的至少一个转基因靶位点和至少一个目的基因组座位的植物、种子或植物细胞。可采用植物育种技术使得该转基因靶位点和该至少一个目的基因组座位可繁育为单个复合性状基因座。以该方式，可在基因组窗口内产生多个独立的转基因整合以产生复合性状基因座。如本文所用，“复合性状基因座”是确定的基因组窗口内的染色体片段，其包含至少一个转基因靶位点和至少一个目的基因组座位，其中该靶位点和该目的基因组座位在该确定的基因组窗口内具有不同的基因组插入位点。对该复合性状基因座进行设计使得在减数分裂期间该转基因靶位点和/或目的基因组座位可彼此独立地分开。这使得性状能在繁育中增添进复合性状基因座中以及在繁育中从复合性状基因座中消除。因而，本文所述的方法提供了能够通过在繁育中增添和消除复合性状基因座的特定元件来变更复合性状基因座的有益效果。还可采用多种方法来进一步修饰该转基因靶位点和/或目的基因座使得它们含有多种目的多核苷酸。
II.组合物
A.基因组窗口
本文提供在其基因组中具有基因组窗口的植物或种子。如本文所用，“基因组窗口”是植物基因组中的希望产生复合性状基因座的染色体片段，或者包含通过本文提供的方法产生的复合性状基因座的染色体片段。在基因组窗口中产生复合转基因性状基因座之前，基因组窗口可包括例如一种或多种性状。如本文所用，“性状”是指由具体基因或基因群组赋予的表型。
基因组窗口长度可以是约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多厘摩(cM)。或者，基因组窗口长度可以是约1-10cM、约2-8cM、约2-5cM、约3-10cM、约3-6cM、约4-10cM、约4-7cM、约5-10cM、约5-8cM、约6-10cM、约6-9cM、约7-10cM、约8-10cM或约9-10cM。在一个实施例中，基因组窗口长度为约10厘摩(cM)或 长度为约5cM。“厘摩”(cM)或者“图距单位(map unit)”是两个连接的基因、标记、靶位点、目的基因组座位、基因座或者它们的任何配对之间的距离，其中1％的减数分裂产物是重组的。因此，一厘摩与等于两个连接的基因、标记、靶位点、基因座、目的基因组座位或者它们的任何配对之间的1％平均重组频率的距离相当。
基因组窗口可包含多种组分。这类组分可包括例如转基因靶位点、天然基因、目的基因组座位、重组位点和目的多核苷酸。基因组窗口可包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个转基因靶位点，使得每个转基因靶位点在基因组窗口内具有不同的基因组插入位点。此外，基因组窗口可包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个目的基因组座位，各个目的基因组座位具有不同的基因组插入位点。所谓“不同的基因组插入位点”意指基因组窗口的各组分(即转基因靶位点和目的基因组座位)在不同的位置处插入进基因组中并因此各组分可彼此独立地分开。例如，基因组窗口可包含转基因靶位点和/或目的基因组座位的组合，使得每个靶位点或目的基因组座位在基因组窗口内具有不同的基因组插入位点。
本文提供的基因组窗口的组分具有不同的基因组插入位点并因而可彼此独立地分开。如本文所用，“独立地分开”用于指在减数分裂期间任何两个或更多个基因、转基因、天然基因、突变基因、靶位点、目的基因组座位、标记等彼此遗传分开。测量两个遗传元件是否独立地分开的测定法是本领域已知的。照此，本文提供的基因组窗口内的任何两个或更多个基因、转基因、天然基因、突变基因、靶位点、目的基因组座位、标记等具有彼此以适当距离定位的基因组插入位点，从而它们通常以约10％或更低的比率独立地分开。因而，本文提供的基因组窗口的组分可以约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％的比率彼此独立地分开。或者，本文提供的基因组窗口的组分可以约10-0.1％、约10-0.5％、约10-1％、约10-5％、约9-0.1％、约9-0.5％、约9-1％、约9-5％、约8-0.1％、约8-0.5％、约8-1％、约8-4％、约7-0.1％、约7-0.5％、约7-1％、约7-4％、约6-0.1％、约6-1％、约6-0.5％、约6-3％、约5-0.1％、约5-1％、约5-0.5％、约4-0.1％、约4-1％、约4-0.5％、约3-0.1％、约3-1％、约3-0.5％、约2-0.1％、约2-0.5％、约1-0.1％或约1-0.5％的比率彼此独立地分开。例 如，如果基因组窗口包含彼此相距约5cM的转基因靶位点和目的基因组座位，则转基因靶位点和目的基因组座位将以约5％的比率独立地分开。
在一个实施例中，基因组窗口包含至少第一转基因靶位点、第二转基因靶位点和至少一个目的基因组座位，其中转基因靶位点和目的基因组座位每一者具有不同的基因组插入位点并且以约10％至约0.1％的比率彼此独立地分开。
任何给定的基因组窗口可还包含至少一个变更的靶序列，该变更的靶序列起源于被双链断裂诱导剂识别和切割的对应靶序列。如本文所用，“双链断裂诱导剂”是指任何能在靶序列中产生双链断裂的核酸酶。“靶序列”是指植物细胞基因组中的包含双链断裂诱导剂的识别序列的多核苷酸序列，双链断裂是在该识别序列处诱导。“变更的靶序列”是指当与未变更的靶序列相比时包含至少一个变更的靶序列。“变更”可包括例如：(i)置换至少一个核苷酸，(ii)缺失至少一个核苷酸，(iii)插入至少一个核苷酸，或者(iv)(i)-(iii)的任何组合。照此，可在任何给定的基因组窗口中产生用于基因组窗口的各种组分(即转基因靶位点或目的基因组座位)的插入位点。产生变更的靶序列的方法是已知的，并且在2011年3月23日提交的美国临时申请No.61/466,602中公开，将该专利申请以引用的方式全文并入本文。
在具体的实施例中，基因组窗口旁侧为至少第一标记和第二标记。玉米的1号染色体上的这类标记的非限制性例子包括例如UMC1160、UMC2224、NP1579B、PMCB1、IDP3917、GPM199C、IDP1425、MMP68、UMC2225、STD2C(DBA)、TIDP3300、CSU1171、SUT1、UMC1166、AY107207、UMC1568、IDP3783、BNLG1429、IDP209、LTK1和IDP7169。表2示出了玉米1号染色体上的标记的公共IBM2遗传图谱位置。玉米6号染色体上的标记的非限制性例子包括例如UMC1625、UMC2196、UMC2312、BNLG1867、PZA03047、UMC1229、UCK1、RZ390D(CYB5)、MMP20、MMP10、MMP160、PHP20528、UMC2314、UAZ232B(SCI)、UMC2313、CDO545、PHP20854、UMC1133、UFG69、MMP76、Y1、BNLG1422、MMP108B、MMP4、UMC1006和RZ444E。表6A示出了玉米6号染色体上的标记的公共IBM2遗传图谱位置。大豆的19号染色体上的这类标记的非限制性例子包括例如SATT613、SATT284、 S60414-TB、SATT462、SATT481、SATT156和SCT_010。表11示出了大豆19号染色体上的标记的公共遗传图谱位置。
B.基因组窗口的组分
i.转基因靶位点和变更方法
转基因靶位点可包含多种组分。如本文所用，所谓“靶位点”是指包含具有至少一个重组位点的核苷酸序列的多核苷酸。所谓“转基因靶位点”意指这样的靶位点：其对于植物基因组而言在序列上和/或在基因组位置上都是非天然的。在一些实施例中，转基因靶位点可包含至少1、2、3、4、5、6或更多个重组位点供位点特异性重组。在一个实施例中，转基因靶位点包含第一重组位点和第二重组位点。在这类实施例中，所述第一和第二重组位点可相对于彼此是相异的，或者相对于彼此可以是相异的并且具有降低的相容性。当提供以适当的重组酶时，这类第一和第二重组位点能够与它们对应的或相同的重组位点重组。
一条或多条间插序列可存在于靶位点的重组位点之间。特别关注的间插序列将包括接头、衔接子、选择性标记、目的多核苷酸、其他重组位点、启动子和/或其他有助于载体构建或分析的位点。在重组位点之间则可采用各种目的多核苷酸。变更靶位点的方法在本文别的地方更详细地论述。此外，靶位点的重组位点可位于多种位置，包括例如内含子序列、编码序列或非翻译区内。
本文提供的方法和组合物中采用的重组位点可以是“对应的”位点或“相异的”位点。所谓“对应的重组位点”或“一组对应的重组位点”意指重组位点具有相同的或对应的核苷酸序列。一组对应的重组位点在存在适当重组酶时将会有效地彼此重组(即对应的重组位点是会引起重组的(recombinogenic))。
在其他实施例中，重组位点是相异的。所谓“相异的重组位点”或“一组相异的重组位点”意指重组位点是不同的(即，具有至少一个核苷酸不同)。
“一组相异的重组位点”内的重组位点可相对于于彼此是会引起重组的或者相对于彼此具有降低的相容性。所谓“会引起重组的”意指该组重组位点能够彼此重组。
在其他实施例中，一组相异的重组位点可包含相对于彼此具有降低的相容性的重组位点组。所谓“降低的相容性”意指该组重组位点在存在适当的重组酶时，与在它们的同种(cognate)位点上所见到的重组效率相比将具有降低的重组效率。在一些实施例中，相容性降低将导致位点之间不重组。在其他实施例中，相容性降低将导致位点之间的重组水平极低。因而，用于本文所提供的方法和组合物中的彼此之间相容性降低的合适重组位点包括那些彼此以低于90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、15％、10％、5％、4％或3％的频率重组(或切除)的位点。在一些实施例中，彼此之间的相容性降低的重组位点彼此以低于切除测定法中标准条件下的可检测限值、低于2％、1.5％、1％、0.75％、0.5％、0.25％、0.1％、0.075、0.005％、0.001％的频率重组(或切除)。“相异重组位点组”内的每个重组位点是生物活性的并因而可与相同位点重组。
在一些实施例中，基因组窗口包含具有彼此相异的第一和第二重组位点的转基因靶位点和具有彼此相异的第三和第四重组位点的第二转基因靶位点。在其他实施例中，基因组窗口包含具有彼此相异且相容性降低的第一和第二重组位点的第一转基因靶位点和具有彼此相异且相容性降低的第三和第四重组位点的第二转基因靶位点。在一些情况下，第一转基因靶位点和第二转基因靶位点以约5％至约0.1％的比率彼此独立地分开。因而，本文提供的各个靶位点中的任一个均可以约10-0.1％、约10-0.5％、约10-1％、约10-5％、约9-0.1％、约9-0.5％、约9-1％、约9-5％、约8-0.1％、约8-0.5％、约8-1％、约8-4％、约7-0.1％、约7-0.5％、约7-1％、约7-4％、约6-0.1％、约6-0.5％、约6-1％、约6-3％、约5-0.1％、约5-0.5％、约5-1％、约4-0.1％、约4-.05％、约4-1％、约3-0.1％、约3-0.5％、约3-1％、约2-0.1％、约2-0.5％、约1-0.1％或约1-0.5％的比率彼此独立地分开。本文提供的各个靶位点在基因组窗口中可彼此相距约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10cM或更多。或者，各个靶位点在基因组窗口中可彼此相距约0.5-10cM、约1-10cM、约2-10cM、约2-5cM、约3-10cM、约3-6cM、约4-10cM、约4-7cM、约5-10cM、约5-8cM、约6-10cM、约6-9cM、约7-10cM、约8-10cM、约9-10cM、约0.1-0.5cM、约0.1-1cM、约0.1-2cM、约0.1-3cM、约0.1-4cM、约0.1-5cM、约0.1-6cM、约0.1-7cM、约0.1-8cM、约0.1-9cM或约0.1-10cM。
在一特定的实施例中，第二转基因靶位点的重组位点与第一转基因靶位点的相异位点不同。或者，第二转基因靶位点可包含与第一转基因靶位点相同的相异位点。在另一实施例中，基因组窗口包含具有彼此相异的第五和第六重组位点的第三转基因靶位点。在又一实施例中，基因组窗口包含具有彼此相异且相容性降低的第五和第六重组位点的第三转基因靶位点。在所有这类情况下，第一、第二和第三转基因靶位点具有不同的基因组插入位点。
各种重组位点可应用于本文提供的方法和组合物中(即应用于本文所公开的各个转基因靶位点或目的基因组座位中)。所谓“重组位点”意指重组位点及其活性变体。许多重组系统是本领域已知的并且本领域技术人员将知道要与目的重组系统一起使用的适当重组位点。如本文别的地方更详细论述的，可采用重组位点的各种组合，包括相异位点组和对应的重组位点和/或相异重组位点和/或彼此相异且相容性降低的位点可用于本文提供的各种方法和组合物中。因此，任何合适的重组位点或重组位点组可用于本文，包括FRT位点、FRT位点的生物活性变体(即突变型FRT位点)、LOX位点、LOX位点的生物活性变体(即突变型LOX位点)、它们的任何组合或本领域已知的重组位点的任何其他组合。FRT位点的例子包括例如野生型FRT位点(FRT1)(SEQ ID NO：1)以及各种突变型FRT位点，包括但不限于FRT5(SEQ ID NO：2)、FRT6(SEQ ID NO：3)、FRT7(SEQ ID NO：4)、FRT12(SEQ ID NO：5)和FRT87(SEQ ID NO：6)。参见例如美国专利No.6,187,994。还可参见美国公开No.2011-0047655，将其以引用的方式并入本文。
还可使用来自Cre/Lox位点特异性重组系统的重组位点。这类重组位点包括例如，野生型LOX位点和突变型LOX位点。对突变型LOX位点的重组活性的分析在Lee等人(1998)Gene(《基因》)216：55-65中给出，将该文献以引用的方式并入本文。还可参见例如，Schlake和Bode(1994)Biochemistry(《生物化学》)33：12746-12751；Huang等人(1991)Nucleic Acids Research(《核酸研究》)19：443-448；Sadowski(1995)，载于Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology(《核酸研究与分子生物学进展》)第51卷，第53-91页；Cox(1989)，载于Mobile DNA(《移动DNA》)，Berg和Howe(编辑)美国微生物学会(American  Society of Microbiology)，华盛顿哥伦比亚特区，第116-670页；Dixon等人(1995)Mol.Microbiol.(《分子微生物学》)18：449-458；Umlauf和Cox(1988)EMBO(欧洲分子生物学组织)7：1845-1852；Buchholz等人(1996)Nucleic Acids Research(《核酸研究》)24：3118-3119；Kilby等人(1993)Trends Genet.(《遗传学趋势》)9：413-421；Rossant和Geagy(1995)Nat.Med.(《自然医学》)1：592-594；Albert等人(1995)The Plant J.(《植物杂志》)7：649-659；Bayley等人(1992)Plant Mol.Biol.(《植物分子生物学》)18：353-361；Odell等人(1990)Mol.Gen.Genet.(《分子遗传学与普通遗传学》)223：369-378；Dale和Ow(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)88：10558-10562；Qui等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)91：1706-1710；Stuurman等人(1996)Plant Mol.Biol.(《植物分子生物学》)32：901-913；Dale等人(1990)Gene(《基因》)91：79-85；Albert等人(1995)The Plant J.(《植物杂志》)7：649-659以及WO 01/00158；所有这些文献均以引用方式并入本文。
在一特定的实施例中，第一和第二重组位点中的至少一者包含FRT1(SEQ ID NO：1)、FRT5(SEQ ID NO：2)、FRT6(SEQ ID NO：3)、FRT7(SEQ ID NO：4)、FRT12(SEQ ID NO：5)或FRT87(SEQ ID NO：6)。在一特定的实施例中，靶位点的第一和第二重组位点包含FRT1位点和FRT87位点。
重组位点的活性变体和片段(即SEQ ID NO：1-6)也为本文提供的组合物和方法所涵盖。重组位点的片段保留了该重组位点的生物活性并因而有利于适当重组酶存在下的重组事件。因而，重组位点的片段可为至少约5、10、15、20、25、30、35、40个核苷酸，以及最多至该重组位点的全长。活性变体可与天然重组位点具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，其中该活性变体保留生物活性并因而有利于适当重组酶存在下的重组事件。测量重组位点的生物活性的测定法是本领域已知的。参见例如Senecoll等人(1988)(《分子生物学杂志》)201：406-421；Voziyanov等人(2002)Nucleic Acid Research(《核酸研究》)30：7；美国专利No.6,187,994；WO/01/00158；以及Albert等人(1995)The Plant Journal(《植物杂志》)7：649-659。
在本文所提供的方法和组合物中也采用重组酶。所谓“重组酶”意指催化相容的重组位点之间的位点特异性重组的天然多肽。关于位点特异性重组酶的综述，参见；Sauer(1994)Current Opinion in Biotechnology(《生物技术新见》)5：521-527；以及Sadowski(1993)FASEB(美国实验生物学学会联合会)7：760-767；将这两篇文献的内容以引用的方式并入本文。本方法中所用的重组酶可以是天然存在的重组酶或该重组酶的生物活性片段或变体。可用于本方法和组合物中的重组酶包括来自整合酶和解离酶家族的重组酶、其生物活性变体和片段以及任何其他天然存在的或重组产生的可催化指定的DNA重组位点之间的保守位点特异性重组的酶或其变体。
重组酶的整合酶家族具有超过一百个成员并且包括例如FLP、Cre、Int和R。关于整合酶家族的其他成员，参见例如Esposito等人(1997)Nucleic Acid Research(《核酸研究》)25：3605-3614以及Abremski等人(1992)Protein Engineering(《蛋白质工程》)5：87-91，将这两篇文献以引用的方式并入本文。其他重组系统包括例如：链霉菌噬菌体phi C31(Kuhstoss等人(1991)J.Mol.Biol.(《分子生物学杂志》)20：897-908)；来自芝田硫化叶菌(Sulfolobus shibatae)的SSV1位点特异性重组系统(Maskhelishvili等人(1993)Mol.Gen.Genet.(《分子遗传学与普通遗传学》)237：334-342)；以及基于逆转录病毒整合酶的整合系统(Tanaka等人(1998)Gene(《基因》)17：67-76)。在其他实施例中，重组酶是不需要辅因子和超螺旋底物的重组酶。这类重组酶包括Cre(SEQ ID NO：7)、FLP(SEQ ID NO：8)或它们的活性变体或片段(SEQ ID NO：9和10)。
FLP重组酶是催化这样的位点特异性反应的蛋白质，该反应涉及在DNA复制过程中扩增酿酒酵母(S.cerevisiae)的两微米质粒的拷贝数。如本文所用，FLP重组酶是指催化两个FRT位点之间的位点特异性重组的重组酶。已经克隆并表达了FLP蛋白。参见例如Cox(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(《美国科学院院刊》)80：4223-4227。供在本方法中使用和与本组合物一起使用的FLP重组酶可源于酵母属(Saccharomyces)。还可使用植物偏好的密码子合成构成重组酶的多核苷酸以便在目的植物中最佳表达。催化位点特异性重组事件的由包含玉蜀黍偏好的密码子的核苷酸序列编码的重组FLP酶(FLPm)(SEQ ID NO：10)是已知的。参见例如美国专利5,929,301，将该专利以引用的方式并入本文。FLP的另外的功能变体和片 段是已知的。参见例如，Buchholz等人(1998)Nat.Biotechnol.(《自然生物技术》)16：617-618；Hartung等人(1998)J.Biol.Chem.(《生物化学杂志》)273：22884-22891；Saxena等人(1997)Biochim Biophys Acta(《生物化学和生物物理杂志》)1340(2)：187-204；以及Hartley等人(1980)Nature(《自然》)286：860-864，将以上所有文献以引用的方式并入本文。
噬菌体重组酶Cre可催化两个lox位点之间的位点特异性重组。Cre重组酶是本领域已知的。参见例如Guo等人(1997)Nature(《自然》)389：40-46；Abremski等人(1984)J.Biol.Chem.(《生物化学杂志》)259：1509-1514；Chen等人(1996)Somat.Cell Mol.Genet.(《体细胞和分子遗传学》)22：477-488；Shaikh等人(1977)J.Biol.Chem.(《生物化学杂志》)272：5695-5702；以及Buchholz等人(1998)Nat.Biotechnol.(《自然生物技术》)16：617-618，将以上所有文献以引用的方式并入本文。Cre多核苷酸序列也可用植物偏好的密码子合成。这类序列(moCre)在WO 99/25840(将其以引用的方式并入本文)中进行描述并在SEQ ID NO：9中示出。
还认识到，嵌合重组酶可用于本方法。所谓“嵌合重组酶”意指能够催化来源于不同重组系统的重组位点之间的位点特异性重组的重组融合蛋白。也就是说，如果一组功能重组位点(特征为彼此相异)被用于本方法和组合物中并且包含FRT位点和LoxP位点，则将需要嵌合FLP/Cre重组酶或其活性变体或片段，或者作为另一种选择，可能要分别提供两种重组酶。这类嵌合重组酶或其活性变体或片段的制备和使用方法在WO 99/25840中描述，将该专利以引用的方式并入本文。
通过利用本文所提供的转基因靶位点中的重组位点的各种组合，本方法提供了目的多核苷酸被位点特异性整合进植物基因组中的特定位点中的机制。本方法还允许另外的目的多核苷酸后续插入进该特定基因组位点中。
如本文所用，所谓“提供”意指任何允许氨基酸序列和/或多核苷酸与所叙述的组分合在一起的方法。将核苷酸序列引入进植物中的多种方法是本领域已知的。任何手段均可用于将重组系统的各种组分(即转基因靶位点和适当的重组酶)合在一起，包括例如转化和有性杂交。另参见 WO99/25884，将该专利以引用的方式并入本文。此外，可通过将多肽或mRNA引入进细胞中来提供重组酶。
重组酶(即FLP或Cre)的活性变体或片段也为本文提供的组合物和方法所涵盖。这类活性变体可与天然重组酶具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，其中所述活性变体保留生物活性并因而实现重组事件。重组酶活性的测定法是已知的，通常是测量该酶对含有重组位点的DNA底物的总体活性。例如，为了测定FLP活性，含有两个反向FRT位点的环状质粒中的DNA序列的反转可检测为限制酶位点的位置的改变。该测定法在Vetter等人(1983)PNAS(《美国国家科学院院刊》)80：7284中描述。或者，可测定由该酶引起的DNA从线性分子切除或者分子间的重组频率，如例如以下文献中所描述的：Babineau等人(1985)Journal of Biological Chemistry(《生物化学杂志》)260：12313；Meyer-Leon等人(1987)Nucleic Acid Res(《核酸研究》)15：6469；以及Gronostajski等人(1985)Journal of Biological Chemistry(《生物化学杂志》)260：12328。或者，还可通过切除旁侧为会引起重组的FRT位点的序列来测定重组酶活性，在移除时将激活可测定的标记基因。
ii.目的基因组座位
如本文所用，“目的基因组座位”包含遗传在一起的一组特定的多态性。给定的基因组座位可包含但不限于转基因、天然基因或额外的转基因靶位点，该额外的转基因靶位点可包含相异的重组位点对或彼此相异且相容性降低的重组位点对。
目的基因组座位可以是例如任何赋予性状如转基因或天然性状的修饰。在一个实施例中，目的基因组座位包含天然性状。如本文所用，“天然性状”是指自然界中存在的性状。在另一个实施例中，目的基因组座位包含转基因。
可杂交进植物的基因组窗口中的目的基因组座位的数目是至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个。任何所需性状均可在给定的目的基因组座位处引入进基因组中。这类性状包括但不限于赋予昆虫抗性、病害抗性、除草剂耐受性、雄性不育、非生物胁迫耐 受性、变更的磷、变更的抗氧化剂、变更的脂肪酸、变更的必需氨基酸、变更的碳水化合物或涉及位点特异性重组的序列的性状。
在具体的实施例中，给定的目的基因组座位与植物中所需的和/或有利的表型相关联。例如，赋予昆虫抗性、病害抗性或除草剂耐受性的性状将是植物中所需的。在其他实施例中，该基因组座位与影响植物的农艺特性的性状不相关联。
给定的目的基因组座位在基因组窗口内具有其自己的基因组插入位点。例如，基因组窗口内的目的基因组座位和转基因靶位点将在基因组内具有不同的基因组插入位点。给定的转基因靶位点可距离目的基因组座位在约10cM、9cM、8cM、7cM、6cM、5cM、4cM、3cM、2cM、1cM、0.9cM、0.8cM、0.7cM、0.6cM、0.5cM、0.4cM、0.3cM、0.2cM或0.1cM以内，使得该靶位点和目的基因组座位具有不同的基因组插入位点。或者，给定的转基因靶位点可距离目的基因组座位在约0.5-10cM、约1-10cM、约2-10cM、约2-5cM、约3-10cM、约3-6cM、约4-10cM、约4-7cM、约5-10cM、约5-8cM、约6-10cM、约6-9cM、约7-10cM、约8-10cM、约9-10cM、约0.1-0.5cM、约0.1-1cM、约0.1-2cM、约0.1-3cM、约0.1-4cM、约0.1-5cM、约0.1-6cM、约0.1-7cM、约0.1-8cM、约0.1-9cM或约0.1-10cM以内，使得该靶位点和目的基因组座位具有不同的基因组插入位点。在一特定的实施例中，第一转基因靶位点或第二转基因靶位点距离目的基因组座位在约5cM以内。在又一个实施例中，第一或第二转基因靶位点距离目的基因组座位在2cM或1cM以内。在其中基因组窗口包含第三转基因靶位点的这类情况中，该第三转基因靶位点可距离目的基因组座位在约5cM以内。
在一些实施例中，第一转基因靶位点和第二转基因靶位点以约5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％的比率与目的基因组座位独立地分开。或者，第一转基因靶位点和第二转基因靶位点以约5-0.1％、约5-1％、约5-0.5％、约4-0.1％、约4-0.5％、约4-1％、约3-0.1％、约3-.05％、约3-1％、约2-0.1％、约2-0.5％、约1-0.1％或约1-0.5％的比率与目的基因组座位独立地分开。
C.目的多核苷酸
可通过本文其他地方论述的转化方法或育种方法在本文所公开的方法和组合物的目的转基因靶位点或基因组座位中将任何目的多核苷酸(即，“目的多肽”或“目的基因”)提供给植物细胞。已经认识到任何目的多核苷酸均可提供、整合进植物基因组中的基因组窗口内并在植物中表达。目的多核苷酸或目的基因可包含例如转基因或天然基因。本文所公开的方法可使至少1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种目的多核苷酸整合进基因组窗口中。
有多种表型变化是值得关注的，包括修饰植物中的脂肪酸组成、变更植物的氨基酸含量、变更植物的病原体防御机制等等。这些结果可通过在植物中表达异源产物(即目的多核苷酸)、在植物中增加内源产物的表达来实现。或者，这些结果可通过在植物中减少一种或多种内源产物(特别是酶或辅因子)的表达来实现。这些改变导致转化植物的表型变化。
目的多核苷酸反映出作物开发的参与者的商业市场和利益。目的作物和市场在变化，并且随着发展中国家打开世界市场，也将出现新的作物和技术。另外，随着我们对农艺性状和特性如产量和杂种优势的理解的增加，对用于转化的基因的选择将会相应变化。目的基因的大体类别包括例如涉及信息的那些基因(如锌指)、涉及通信的那些基因(如激酶)和涉及看家的那些基因(如热休克蛋白)。转基因的更具体类别例如包括编码对农艺学、昆虫抗性、病害抗性、除草剂抗性、不育性、籽粒特性和商业产品重要的性状的基因。一般而言，目的基因包括涉及油脂、淀粉、碳水化合物或营养物质代谢的那些基因以及影响仁大小、蔗糖载量等的那些基因。
目的多核苷酸/多肽包括但不限于除草剂耐受性编码序列、杀昆虫编码序列、杀线虫编码序列、抗微生物编码序列、抗真菌编码序列、抗病毒编码序列、非生物和生物胁迫耐受性编码序列、或修饰植物性状例如产量、籽粒质量、营养成分、淀粉质量和数量、固氮和/或氮利用、以及含油脂含量和/或油组成的序列。更具体的目的多核苷酸包括但不限于：改善作物产量的基因、改善作物合意性的多肽、变更磷含量的基因(如植酸酶编码基因)、变更抗氧化剂含量或组成的基因(如变更生育酚和三烯生育酚含量的基因)、变更碳水化合物的基因、编码赋予非生物胁迫(如干旱、氮、温度、盐度、毒性金属或痕量元素)抗性的蛋白质的基因，或赋予对毒素 如杀虫剂和除草剂的抗性、或对生物胁迫如真菌、病毒、细菌、昆虫和线虫的攻击以及与这些生物体相关的病害发展的抗性的那些基因。
目的多核苷酸还可以是产生供进行位点特异性DNA整合的位点的基因。这包括引入可用于FLP/FRT系统的FRT位点和/或可用于Cre/Loxp系统的Lox位点。这些系统及其他系统在本文其他地方进行了详细的描述。
“除草剂抗性蛋白”或由“除草剂抗性编码核酸分子”表达生成的蛋白质包括这样的蛋白质，其赋予细胞与未表达该蛋白质的细胞相比耐受更高浓度除草剂的能力，或赋予细胞与未表达该蛋白质的细胞相比对某种浓度除草剂耐受更长时间的能力。除草剂抗性性状可通过如下基因引入进植物中：编码对起到抑制乙酰乳酸合酶(ALS)的作用的除草剂(特别是磺酰脲类除草剂)的抗性的基因、编码对起到抑制谷氨酰胺合酶的作用的除草剂如膦丝菌素或basta的抗性的基因(如bar基因)、编码对草甘膦的抗性的基因(如EPSP合酶基因和GAT基因)、编码对HPPD抑制剂的抗性的基因(如HPPD基因)或本领域已知的其他这类基因。参见例如美国专利No.7,626,077、No.5,310,667、No.5,866,775、No.6,225,114、No.6,248,876、No.7,169,970、No.6,867,293和美国临时申请No.61/401,456，将所述专利每一者以引用的方式并入本文。
除了使用传统的育种方法之外，还可通过遗传方式变更农艺上重要的性状如油脂含量、淀粉含量和蛋白质含量。修饰包括增加油酸、饱和油和不饱和油的含量、提高赖氨酸和硫的水平、提供必需氨基酸以及对淀粉进行改性。美国专利No.5,703,049、No.5,885,801、No.5,885,802和No.5,990,389中描述了Hordothionin蛋白修饰，将这些专利以引用的方式并入本文。另外的例子是美国专利No.5,850,016中描述的由大豆2S白蛋白编码的富含赖氨酸和/或硫的种子蛋白以及Williamson等人，(1987)Eur.J.Biochem.(《欧洲生物化学杂志》)165：99-106中描述的来自大麦的胰凝乳蛋白酶抑制剂，将上述专利和文献的公开内容以引用的方式并入本文。
还可在目的多核苷酸上编码可增加例如用于乙醇生产的淀粉，或提供蛋白质的表达的商业性状。经转化的植物的另一个重要商业用途是生产聚合物和生物塑料，如美国专利No.5,602,321中所述。诸如β-酮硫解酶、PHB酶(聚羟基丁酸酯合酶)和乙酰乙酰辅酶A还原酶(参见Schubert等 人(1988)J.Bacteriol.(《细菌学杂志》)170：5837-5847)之类的基因有利于聚羟基烷酸酯(PHA)的表达。
可通过定点诱变产生编码序列的衍生物来增加预选氨基酸在所编码的多肽中的水平。例如，编码大麦高赖氨酸多肽(BHL)的基因源自大麦胰凝乳蛋白酶抑制剂(1996年11月1日提交的系列号为08/740,682的美国申请和WO 98/20133，将它们的公开内容以引用方式并入本文)。其他蛋白质包括富含甲硫氨酸的植物蛋白质，如来自葵花籽的蛋白质(Lilley等人(1989)Proceedings of the World Congress on Vegetable Protein Utilization in Human Foods and Animal Feedstuffs(《植物蛋白在人类食品和动物饲料中的利用世界大会会议录》)，Applewhite编辑(美国油脂化学家协会(American Oil Chemists Society)，伊利诺州香槟市(Champaign，Illinois))，第497-502页；将该文献以引用方式并入本文)；来自玉米的蛋白质(Pedersen等人(1986)J.Biol.Chem.(《生物化学杂志》)261：6279；Kirihara等人(1988)Gene(《基因》)71：359；将这两篇文献均以引用方式并入本文)；以及来自水稻的蛋白质(Musumura等人(1989)Plant Mol.Biol.(《植物分子生物学》)12：123，将该文献以引用方式并入本文)。其他农艺上重要的基因编码胶乳、Floury 2、生长因子、种子贮藏因子和转录因子。
改善作物产量的多核苷酸包括矮化基因，如Rht1和Rht2(Peng等人(1999)Nature(《自然》)400：256-261)以及增加植物生长的那些，如铵诱导型谷氨酸脱氢酶。改善作物合意性的多核苷酸包括例如允许植物具有减少的饱和脂肪含量的那些多核苷酸、提高植物营养价值的那些多核苷酸、以及增加籽粒蛋白的那些多核苷酸。改善盐耐受性的多核苷酸是增加或允许植物在与已引入耐盐基因的该植物的天然环境相比更高盐度的环境中生长的那些多核苷酸。
不育基因也可编码在表达盒中，为物理去雄提供备选方案。以这种方式使用的基因的例子包括雄性组织偏好的基因和具有雄性不育表型的基因(如QM)，在美国专利No.5,583,210中有描述。其他基因包括激酶和编码对雄性或雌性配子体发育有毒的化合物的那些。
影响氨基酸生物合成的多核苷酸/多肽包括例如邻氨基苯甲酸合酶(AS；EC 4.1.3.27)，该酶催化植物、真菌和细菌中从芳族氨基酸途径分支到色氨酸生物合成的第一反应。在植物中，色氨酸生物合成的化学过程处于 叶绿体区室中。参见例如美国专利公开20080050506，将其以引用的方式并入本文。另外的目的序列包括分支酸丙酮酸裂解酶(CPL)，其是指编码催化分支酸转化为丙酮酸和pHBA的酶的基因。表征最充分的CPL基因已从大肠杆菌中分离并具有GenBank登录号M96268。参见美国专利No.7,361,811，将其以引用的方式并入本文。
该目的多核苷酸序列可编码涉及提供病害或害虫抗性的蛋白质。所谓“病害抗性”或“害虫抗性”意指植物避开作为植物-病原体相互作用的后果的有害症状。害虫抗性基因可编码对严重影响产量的害虫如根虫、切根虫、欧洲玉蜀黍螟等的抗性。病害抗性基因和昆虫抗性基因，如用于抗细菌保护的溶菌酶或天蚕抗菌肽(cecropin)，或者用于抗真菌保护的蛋白质如防御素、葡聚糖酶或几丁质酶，或者用于防治线虫或昆虫的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)内毒素、蛋白酶抑制剂、胶原酶、凝集素或糖苷酶，都是可用的基因产物的例子。编码病害抗性性状的基因包括解毒基因，如对伏马毒素(fumonosin)的解毒基因(美国专利No.5,792,931)；无毒力(avr)和病害抗性(R)基因(Jones等人(1994)Science(《科学》)266：789；Martin等人(1993)Science(《科学》)262：1432；以及Mindrinos等人(1994)Cell(《细胞》)78：1089)等等。
此外，已经认识到目的多核苷酸可还包含与所靶向的目的基因序列的信使RNA(mRNA)的至少一部分互补的反义序列。构建反义核苷酸以与对应的mRNA杂交。可对反义序列作出修饰，只要该序列能杂交对应的mRNA并干扰其表达。以此方式，可使用与对应的反义序列具有70％、80％或85％序列同一性的反义构建体。此外，反义核苷酸的部分可用来破坏靶基因的表达。一般而言，可使用至少50个核苷酸、100个核苷酸、200个核苷酸或者更多个核苷酸的序列。
另外，目的多核苷酸还可以以有义取向使用来抑制植物中的内源基因的表达。用有义取向的多核苷酸抑制植物中的基因表达的方法是本领域已知的。该方法通常涉及用包含这样的启动子的DNA构建体转化植物，该启动子有效连接至对应于该内源基因的转录物的核苷酸序列的至少一部分，能驱动在植物中的表达。通常，这种核苷酸序列与内源基因的转录物的序列具有实质的序列同一性，通常高于约65％的序列同一性、约85％的序列 同一性或高于约95％的序列同一性。参见美国专利No.5,283,184和No.5,034,323；将这些专利以引用方式并入本文。
目的多核苷酸还可以是表型标记。表型标记是可筛选或可选择的标记，其包括可视标记和选择标记，无论它是阳性还是阴性选择标记。可使用任何表型标记。具体地讲，可选择的或可筛选的标记包含这样的DNA区段，该DNA区段使得可以常常在特定条件下鉴别或选取或者不选取含有它的分子或细胞。这些标记可编码活性，例如但不限于RNA、肽或蛋白质的产生，或者可为RNA、肽、蛋白质、无机和有机化合物或者组合物等提供结合位点。
选择标记的例子包括但不限于：包含限制酶位点的DNA区段；编码能提供对抗原本有毒的化合物的抗性的产物的DNA区段，所述有毒化合物包括抗生素如壮观霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、四环素、Basta、新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT))；编码原本在受体细胞中缺乏的产物的DNA区段(如tRNA基因、营养缺陷型标记)；编码可容易鉴别的产物的DNA区段(例如表型标记如β-半乳糖苷酶、GUS；荧光蛋白如绿色荧光蛋白(GFP)、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、红色荧光蛋白(RFP)，以及细胞表面蛋白)；PCR新引物位点的产生(如两个之前不并置的DNA序列的并置)、限制性内切核酸酶或其他DNA修饰酶、化学剂等不作用或者作用的DNA序列的加入；以及使其得以鉴定的特定修饰(如甲基化)所需的DNA序列的加入。
另外的选择标记包括能赋予对除草化合物如草铵膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)的抗性的基因。参见例如Yarranton，(1992)Curr Opin Biotech(《生物技术新见》)3：506-11；Christopherson等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)89：6314-8；Yao等人，(1992)Cell(《细胞》)71：63-72；Reznikoff，(1992)Mol Microbiol(《分子微生物学》)6：2419-22；Hu等人，(1987)Cell(《细胞》)48：555-66；Brown等人，(1987)Cell(《细胞》)49：603-12；Figge等人，(1988)Cell(《细胞》)52：713-22；Deuschle等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)86：5400-4；Fuerst等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)86：2549-53；Deuschle等人，(1990)Science(《科学》)248：480-3；Gossen，(1993)博士论文，海德堡大学 (University of Heidelberg)；Reines等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)90：1917-21；Labow等人，(1990)Mol Cell Biol(《分子细胞生物学》)10：3343-56；Zambretti等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)89：3952-6；Baim等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)88：5072-6；Wyborski等人，(1991)Nucleic Acids Res(《核酸研究》)19：4647-53；Hillen和Wissman，(1989)Topics Mol Struc Biol(《分子结构生物学专题》)10：143-62；Degenkolb等人，(1991)Antimicrob Agents Chemother(《抗微生物剂化学疗法》)《抗微生物剂和化学疗法》)35：1591-5；Kleinschnidt等人，(1988)Biochemistry(《生物化学》)27：1094-104；Bonin，(1993)博士论文，海德堡大学；Gossen等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)89：5547-51；Oliva等人，(1992)Antimicrob Agents Chemother(《抗微生物剂化学疗法》)36：913-9；Hlavka等人，(1985)Handbook of Experimental Pharmacology(《实验药理学手册》)，第78卷(柏林斯普林格出版社(Springer-Verlag，Berlin))；Gill等人，(1988)Nature(《自然》)334：721-4。
还提供了目的多核苷酸/多肽的活性变体或片段。这种活性变体可与天然的目的多核苷酸/多肽具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，其中该活性变体保留天然多核苷酸/多肽的生物活性。
D.植物
还涵盖在其基因组中具有本文提供的基因组窗口的植物、植物细胞或种子。还提供包含至少一个复合性状基因座的植物、植物细胞或种子。所述植物、植物细胞或种子的基因组窗口和复合性状基因座可包含任何本文描述的各种转基因靶位点、目的基因组座位或目的多核苷酸的任何组合。
如本文所用，术语植物包括植物细胞、植物原生质体、从中可再生出植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、在植物或植物部分中完好的植物块和植物细胞如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、仁、穗、穗轴、壳、茎、根、根尖、花药等。谷粒旨在表示由商业种植者出于栽培或繁殖物种之外的目的所生产的成熟种子。再生的植物的子代、变体和突变体也包括在本文内，只要这些部分包含所述的DNA构建体。
本文所提供的转化植物或转化植物细胞是其中已针对目的基因实现了遗传变更(如转化)的植物或植物细胞，或者是从经如此变更的植物或细胞遗传下来并包含该变更的植物或植物细胞。“转基因”是已经通过转化程序引入基因组中的基因。因此，“转基因植物”是含有转基因的植物，而不论该转基因是通过转化还是通过育种引入该特定植物中的；从而，该定义涵盖了最初转化植物的后代。“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供测量主题(subject)植物或植物细胞的表型变化的参考点。对照植物或植物细胞可例如包括：(a)野生型植物或细胞，即具有与用于进行遗传变更的起始材料相同的基因型的植物或细胞，该遗传变更会得到主题植物或细胞；(b)具有与起始材料相同的基因型但已用无效构建体(即，用不表达该转基因的构建体，如包含标记基因的构建体)转化的植物或植物细胞；(c)为主题植物或植物细胞的子代中的非转化分离子的植物或植物细胞；(d)在遗传上与主题植物或植物细胞相同但不暴露于会引起转基因的表达的条件或刺激因素的植物或植物细胞；或者(e)处于构建体不被表达的条件下的主题植物或植物细胞本身。
已被转化而具有任何本文提供的各种组分(即转基因靶位点、目的基因组座位、位点特异性重组酶、重组位点、目的多核苷酸或其任何活性变体或片段)植物细胞可培养成全植物。从单一植物原生质体转化体或从各种转化的外植体再生、发育和培育植物是本领域熟知的。参见例如McCormick等人(1986)Plant Cell Reports(《植物细胞报道》)5：81-84；Weissbach和Weissbach，载于：Methods for Plant Molecular Biology(《植物分子生物学方法》)，(编辑)，美国学术出版社公司(Academic Press，Inc.)，加州圣地亚哥市(San Diego，Calif.)，1988年)。该再生和生长方法通常包括以下步骤：选择经转化的细胞，将那些个体化的(individualized)细胞培养经过胚发育的通常阶段经过生根小植株阶段。类似地再生转基因胚和种子。之后将所得的转基因生根苗种植在适当的植物生长培养基如土壤中。优选地，使再生的植物自花授粉以提供纯合的转基因植物。另外，将从再生的植物获得的花粉与农艺上重要的株系的种子培育植株进行杂交。反过来，用来自这些重要株系的植物的花粉对再生的植物进行授粉。可以培育两代或更多代以确保所需表型特性的表达得到稳定保持和遗传，然后收获种子以确保已经实现所需表型特征的表达。这样，本文给出的组合物 提供了转化种子(也称为“转基因种子”)，其在其基因组中稳定整合了本文所提供的多核苷酸，例如转基因靶位点。
本文提供的各种组分(即转基因靶位点、目的基因组座位、位点特异性重组酶、重组位点、目的多核苷酸或其任何活性变体或片段)可用于任何植物物种(包括但不限于单子叶植物和双子叶植物)的转化。目的植物物种的例子包括但不限于玉米(玉蜀黍)(Zea mays)、芸苔属(Brassica)物种(如，甘蓝型油菜(B.napus)、芜菁(B.rapa)、芥菜(B.juncea))，尤其是可用作种子油来源的那些芸苔属物种、苜蓿(Medicago sativa)、水稻(Oryza sativa)、黑麦(Secale cereale)、高粱(Sorghum bicolor，Sorghum vulgare)、粟(如，珍珠粟(Pennisetum glaucum)、黄米(Panicum miliaceum)、谷子(Setaria italica)、龙爪稷(Eleusine coracana))、向日葵(Helianthus annuus)、红花(Carthamus tinctorius)、小麦(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotiana tabacum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、落花生(Arachis hypogaea)、棉花(海岛棉(Gossypium barbadense)、陆地棉(Gossypium hirsutum))、甘薯(Ipomoea batatus)、木薯(Manihot esculenta)、咖啡(Coffea spp.)、椰子(Cocos nucifera)、菠萝(Ananas comosus)、柑橘(Citrus spp.)、可可(Theobroma cacao)、茶(Camellia sinensis)、香蕉(Musa spp.)、鳄梨(Persea americana)、无花果(Ficus casica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica)、橄榄(Olea europaea)、木瓜(Carica papaya)、腰果(Anacardium occidentale)、澳洲坚果(Macadamia integrifolia)、杏树(Prunus amygdalus)、糖用甜菜(Beta vulgaris)、甘蔗(Saccharum spp.)、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物和针叶树。
蔬菜包括番茄(Lycopersicon esculentum)、莴苣(如Lactuca sativa)、青豆(Phaseolus vulgaris)、利马豆(Phaseolus limensis)、豌豆(Lathyrus spp.)和黄瓜属(Cucumis)的成员如黄瓜(C.sativus)、香瓜(C.cantalupensis)和甜瓜(C.melo)。观赏植物包括杜鹃(Rhododendron spp.)、八仙花(Macrophylla hydrangea)、朱槿(Hibiscus rosasanensis)、玫瑰(Rosa spp.)、郁金香(Tulipa spp.)、水仙(Narcissus spp.)、矮牵牛(Petunia hybrida)、康乃馨(Dianthus caryophyllus)、一品红(Euphorbia pulcherrima)和菊花。
可采用的针叶树包括例如松树如火炬松(Pinus taeda)、沼泽松(Pinus elliotii)、美国黄松(Pinus ponderosa)、黑松(Pinus contorta)和蒙特利松(Pinus  radiata)；花旗松(Pseudotsuga menziesii)；西铁杉(Tsuga canadensis)；北美云杉(Picea glauca)；红杉(Sequoia sempervirens)；枞树(true firs)如银枞(Abies amabilis)和胶枞(Abies balsamea)；以及雪松如西方红雪松(Thuja plicata)和阿拉斯加黄雪松(Chamaecyparis nootkatensis)。在具体的实施例中，植物是作物植物(例如玉米、苜蓿、向日葵、芸苔、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、小米、烟草等等)。在其他实施例中，玉米和大豆植物是最佳的，在另外其他实施例中，玉米植物是最佳的。
其他的目的植物包括提供目的种子的谷物植物、油料种子植物和豆科植物。目的种子包括谷物种子，如玉米、小麦、大麦、水稻、高粱、黑麦等。油料种子植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔、玉蜀黍、苜蓿、棕榈、椰子等。豆科植物包括荚果类(beans)和豌豆。荚果类包括瓜尔豆、槐豆、胡芦巴、大豆、四季豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等等。
已经认识到具有稳定掺入的DNA构建体的植物可进一步就位点特异性整合潜能、农艺潜能和拷贝数目进行表征。参见美国专利No.6,187,994。
取决于掺入进基因组窗口中的目的多核苷酸，包含本文提供的目的多核苷酸的转基因植物、植物细胞或种子可具有表型变化，包括但不限于变更的病原体或昆虫防御机制、增加的对一种或多种除草剂的抗性、增加的抵抗胁迫性环境条件的能力、经修饰的产生淀粉的能力、经修饰的淀粉产生的水平、变更的油脂含量和/或组成、变更的碳水化合物含量和/或组成、变更的脂肪酸含量和/或组成、变更的磷含量和/或组成、变更的抗氧化剂含量和/或组成、经修饰的利用、分配和/或储存氮的能力等等。
III.产生和变更复合性状基因座的方法
A.形成复合性状基因座
基因组窗口的组分(即转基因靶位点和/或目的基因组座位)可通过多种方法合在一起。一个这种方法是使包含在给定基因组窗口中具有不同基因组插入位点的各种靶位点和/或目的基因组座位的植物杂交，并选择已经经历重组事件使得转基因靶位点和/或目的基因组座位的所需组合存在于同一植物中的植物。可从而采用这类育种技术来在植物中产生复合性状基因座。
如本文所用，“育种”是对活生物体的遗传操纵。通过利用植物的授粉方法的技术将植物进行育种。如果花粉从一朵花转移至相同植株的同一朵花或另一朵花，则植物是自花授粉。当相同家系或株系内的个体用于授粉时，则植物是近缘授粉。如果花粉来自不同家系或株系的不同植株上的花时，则植物是异花授粉。在育种应用中，育种者最初选择两株或更多株亲本植株并使其杂交。视上下文而定，本文所用的“杂交”可指简单的X×Y杂交或指回交过程。
本文提供了使用育种技术来建立复合性状基因座或来使复合性状基因座分开的方法。例如，可使在基因组窗口内包含第一转基因靶位点的第一植株(并且该第一植株不包含第一目的基因组座位)与在同一基因组窗口内包含第一目的基因组座位的第二植株(并且该第二植株在基因组窗口内不包含所述第一转基因靶位点)杂交。然后选择在基因组窗口内包含第一转基因靶位点和第一目的基因组座位二者的子代植株。选择包含靶位点和目的基因组座位二者的子代植株可通过多种方法进行。例如，可进行表型分析，据此检测子代植株中标记或所引入的序列的活性。测定对目的基因组座位和靶位点有特异性的标记的备选方法包括诸如PCR、杂交、同工酶电泳、限制性片段长度多态性(RFLPs)、随机扩增多态性DNA(RAPDs)、任意引物PCR(AP-PCR)、DNA扩增指纹分析(DAF)、序列特征化扩增区域(Sequence Characterized Amplified Region，SCARs)、扩增片段长度多态性(AFLPs)、简单序列重复(SSRs)和单核苷酸多态性(SNPs)之类的技术。
在非限制性的实施例中，复合性状基因座可包含(1)在所述基因组窗口中具有不同基因组插入位点的转基因靶位点和目的基因组座位；(2)在所述基因组窗口中具有不同基因组插入位点的2个转基因靶位点和一个目的基因组座位；(3)在所述基因组窗口中具有不同基因组插入位点的2个转基因靶位点和2个目的基因组座位；(4)包含一种或多种目的多核苷酸的目的基因组座位和靶位点，其中所述目的基因组座位和转基因靶位点具有不同的基因组插入位点；(5)包含转基因的转基因靶位点和目的基因组座位，各具有不同的基因组插入位点；(6)包含天然性状的转基因靶位点和目的基因组座位，各具有不同的基因组插入位点；(7)包含第一和第二相异重组位点的转基因靶位点，和目的基因组座位，各具有不同的基因组插入位点；(8)目的基因组座位、包含第一和第二相异重组位点的第一转基因靶位点和包含 第三和第四相异重组位点的第二转基因靶位点，其中所述目的基因组座位、第一转基因靶位点和第二转基因靶位点每一者具有不同的基因组插入位点；(9)目的基因组座位、包含第一和第二相异重组位点的第一转基因靶位点、包含第三和第四相异重组位点的第二转基因靶位点和包含第五和第六相异重组位点的第三转基因靶位点，其中所述目的基因组座位、第一转基因靶位点、第二转基因靶位点和第三转基因靶位点具有不同的基因组插入位点；(10)第一转基因靶位点和第二转基因靶位点(其中第二转基因靶位点包含与第一转基因靶位点不同的相异重组位点)以及目的基因组座位，各具有不同的基因组插入位点；(11)第一转基因靶位点、第二转基因靶位点(其中第二转基因靶位点包含与第一转基因靶位点相同的相异重组位点)和目的基因组座位，各具有不同的基因组插入位点；(12)第一转基因靶位点、第二转基因靶位点(其中相异重组位点包含FRT位点和突变型FRT位点)和目的基因组座位，各具有不同的基因组插入位点；(13)第一转基因靶位点和第二转基因靶位点(其中相异重组位点包含FRT5、FRT6、FRT7、FRT12或FRT87位点)和目的基因组座位，各具有不同的基因组插入位点；或者(14)第一转基因靶位点和第二转基因靶位点(其中相异重组位点包含FRT1和FRT87位点)以及目的基因组座位，各具有不同的基因组整合位点。
可在植物基因组中的基因组窗口内产生包含多个靶位点、目的基因组座位和/或目的多核苷酸的复合性状基因座。图1提供了两种性状如何可以以例如彼此相距5cM的遗传距离被堆叠进基因组中的非限制性例子。使在基因组窗口内包含第一转基因靶位点并且不具有第一目的基因组座位的第一植株与在基因组窗口内的不同基因组插入位点包含目的基因组座位的第二转基因植株(并且第二植株不包含第一转基因靶位点)杂交。约5％的来自该杂交的植物子代将具有在基因组窗口内的不同基因组插入位点整合的第一转基因靶位点和第一目的基因组座位二者。可使在限定的基因组窗口中具有两个位点的子代植株进一步与在限定的基因组窗口内包含第二转基因靶位点和/或第二目的基因组座位并且缺少第一转基因靶位点和第一目的基因组座位的第三转基因植株杂交。然后选择具有在基因组窗口内的不同基因组插入位点整合的第一转基因靶位点、第一目的基因组座位和第二目的基因组座位的子代。这类方法可用于产生包含复合性状基因座的转基因 植物，该复合性状基因座具有在基因组窗口内的不同位点整合的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个转基因靶位点和/或目的基因组座位。以这种方式，可产生多个复合性状基因座。
在一个非限制性的实施例中，在植物基因组中产生复合性状基因座的方法包括提供第一植株，该第一植株在长度为约10cM的基因组窗口内具有至少第一转基因靶位点并且不包含第一目的基因组区。该基因组窗口可具有任何所需长度，如本文别的地方所述的。该方法涉及将该第一植株与在相同基因组窗口内的不同基因组插入位点包含第一目的基因组座位并且不包含该第一转基因靶位点的第二植株进行育种，并且选择包含该第一转基因靶位点和该目的基因组座位的子代。在另一个实施例中，该方法还涉及提供在基因组窗口内具有第一转基因靶位点和第二转基因靶位点的第一植株，所述第一转基因靶位点和第二转基因靶位点具有不同的基因组插入位点，其中该第一植株不包含目的基因组座位。将该第一植株与第二植株进行育种，其中该第二植株在基因组窗口内包含目的基因组座位并且不包含该第一和第二转基因靶位点，并且选择包含该第一转基因靶位点、该第二转基因靶位点和该目的基因组座位的子代植物，所述第一转基因靶位点、第二转基因靶位点和目的基因组座位全部在基因组窗口具有不同的基因组插入位点。该子代植物的第一转基因靶位点、第二转基因靶位点和目的基因组座位可以约10-0.1％、约10-0.5％、约10-1％、约10-5％、约9-0.1％、约9-0.5％、约9-1％、约9-5％、约8-0.1％、约8-0.5％、约8-1％、约8-4％、约7-0.1％、约7-0.5％、约7-1％、约7-4％、约6-0.1％、约6-0.5％、约6-1％、约6-3％、约5-0.1％、约5-0.5％、约5-1％、约4-0.1％、约4-0.5％、约4-1％、约3-0.1％、约3-0.5％、约3-1％、约2-0.1％、约2-0.5％、约1-0.1％或约1-0.5％的比率彼此独立地分开。
以该方式，已经认识到可使本文提供的植物杂交以产生包含本文所述的各种基因组窗口、转基因靶位点、目的基因组座位和/或目的多核苷酸的任何组合的复合性状基因座。
B.变更复合性状基因座
前面的部分描述了通过将靶位点和/或目的基因组座位添加至基因组窗口从而制备复合性状基因座来产生复合性状基因座的各种方法。已经认识到还可通过移除或育种除去某些转基因靶位点和/或目的基因组座位来变更 复合性状基因座。对本文提供的复合性状基因座进行设计，使得各转基因靶位点和/或目的基因组座位具有不同的基因组插入位点并且可独立地分开。这种设计使得性状能在育种中添加进基因组窗口中并且还使得性状能在育种中从基因组窗口移除。
可采用上面描述的将性状组合进基因组窗口中的育种方法来通过育种移除性状而从基因组窗口移除性状。
通过育种移除来变更复合性状基因座的方法包括提供包含待移除的转基因靶位点和/或目的基因组座位的第一植株，并使该第一植株与在基因组窗口中不具有该特定转基因靶位点和/或目的基因组座位的第二植株杂交。然后就选择缺少该转基因靶位点和/或目的基因组座位的所得的子代。例如，可使包含各在基因组窗口内具有不同的基因组插入位点的第一转基因靶位点、第二转基因靶位点和目的基因组座位的第一植株与第二植株杂交。选择其中该基因组窗口不包含所述第一转基因靶位点或所述第一目的基因组座位中的任一者或任两者的子代植物。以该方式，可从该复合性状基因座移除至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个靶位点和/或目的基因组座位。
在该方法的一个实施例中，第一植株在基因组窗口内具有至少第一转基因靶位点、第二转基因靶位点和第一目的基因组座位。第一植株的基因组窗口长约10cM，并且第一转基因靶位点、第二转基因靶位点和第一目的基因组座位的每一者具有不同的基因组插入位点并且以约10％至约0.1％的比率彼此独立地分开。该方法还包括将第一植株与第二植株育种并选择其中子代的基因组窗口不包含所述第一转基因靶位点、所述第二转基因靶位点或所述第一目的基因组座位中的任一者或任二者的子代。在另一个实施例中，所述第一植株的基因组窗口长约5cM，并且该第一植株的第一转基因靶位点、第二转基因靶位点和第一目的基因组座位以约5％至约0.1％的比率彼此独立地分开。在又一实施例中，第一转基因靶位点或第二转基因靶位点以约5％至约0.1％的比率与第一植株的第一目的基因组座位独立地分开。
C.变更转基因靶位点的方法
本文提供的转基因靶位点包含至少一个重组位点，如本文别的地方描述的，其可用于将一种或多种目的多核苷酸直接插入进靶位点中。因而， 可通过位点特异性整合方法操纵包含多个靶位点的复合性状基因座。这类方法在WO 99/25821中详细描述，将该专利以引用的方式并入本文。该方法使得能通过采用位点特异性重组在建立的复合性状基因座的转基因靶位点内移除、添加和/或替代多种目的多核苷酸。或者，可在将植物用于育种方法来产生复合性状基因座之前变更该植物中的转基因靶位点。
可通过任何本领域已知的转化方法将转基因靶位点引入进植物基因组中。例如，将转基因靶位点作为多核苷酸构建体提供并引入进植物或植物细胞中。然后，可采用位点特异性整合来将转基因靶位点插入进植物的基因组中。参见例如美国专利No.6,187,994、No.6,262,341、No.6,330,545和No.6,331,661以及编号为2011-0047655的美国专利公开，将这些专利和专利公开以引用的方式全文并入本文。一旦产生，可将包含转基因靶位点的这种植株用于上面论述的育种方法中以及用于多种操纵靶位点内的序列的方法中。这类方法采用位点特异性重组系统的各种成分，如本文别的地方详细描述的。
该方法还包括向包含整合的转基因靶位点的植物细胞中引入转移盒。该转移盒包含用于将目的多核苷酸掺入进植物基因组内的转基因靶位点中的各种成分。如本文所定义的，“转移盒”包含至少第一重组位点、目的多核苷酸和第二重组位点，其中所述第一和第二重组位点是相异的并且对应于转基因靶位点中的重组位点。在一些实施例中，转移盒的第一和第二重组位点是相异的并且彼此具有降低的相容性并且对应于转基因靶位点中的重组位点。已经认识到可将重组位点的任何组合用于转移盒中以提供目的多核苷酸。
在一个实施例中，转移盒包含第一重组位点、第一目的多核苷酸和第二重组位点。在这类方法中，转移盒的所述第一和第二重组位点是可分别与转基因靶位点的第一和第二重组位点会发生重组(即相同的或对应的)。
在一特定的实施例中，转移盒还包含至少一个与驱动在植物细胞中表达的启动子有效连接的编码区。如本文别的地方论述的，提供了在转基因靶位点和转移盒的重组位点处识别并实现重组的重组酶。重组酶可通过本领域已知的任何手段提供并且在本文别的地方有详细描述。在一特定的实 施例中，转移盒的编码区编码重组酶，该重组酶有利于转移盒和转基因靶位点的第一和第二重组位点之间的重组。
另外，提供了选择至少一个在转基因靶位点处具有转移盒整合的植物细胞的方法。选择在转基因靶位点处具有整合的植物细胞，例如选择表达选择标记的细胞的方法是本领域已知的并且在本文别的地方有描述。
照此，可变更复合性状基因座内的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个转基因靶位点以包含各种目的多核苷酸。因而，本文提供的方法具有通过育种方法和通过位点特异性整合方法两者来变更复合性状基因座的有益效果。通过这类方法，可将任何目的多核苷酸从植物中的复合性状基因座中移除和/或引入其中。
IV.引入方法
本文提供的方法包括向植物细胞、植物或种子中引入各种多核苷酸构建体或多肽，包括但不限于本文提供的各种转基因靶位点、目的基因组座位、转基因、包含第一和第二相异重组位点或彼此具有降低的相容性的第一和第二相异重组位点的靶位点、位点特异性重组酶、转移盒、目的多核苷酸或其任何活性变体或片段。
所谓“引入”意指将序列(多肽或多核苷酸)以使得该序列能够到达植物细胞的内部的方式呈送给植物。本文提供的方法不取决于将序列引入进植物中的具体方法，只要多核苷酸或多肽进入植物的至少一个细胞的内部即可。将序列引入进植物中的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法、病毒介导的方法和有性育种。因而，在将多核苷酸构建体插入进细胞中的语境中的“引入”意指“转染”或“转化”或“转导”并且包括指代多核苷酸构建体掺入进植物细胞中，其中该多核苷酸构建体可掺入进细胞的基因组中。
在一些实施例中，本方法和组合物中采用的植物细胞、植物和种子具有稳定掺入进其基因组中的DNA构建体。所谓“稳定掺入”或“稳定引入”意指多核苷酸引入进植物中使得该核苷酸序列整合进植物的基因组中并且能够被其子代所遗传。可将任何规程用于该DNA构建体或本文采用的各种组分的稳定掺入。
转化规程以及将多肽或多核苷酸序列引入进植物中的规程，可根据要进行转化的植物或植物细胞的类型(即单子叶植物或双子叶植物)而异。 将多肽和多核苷酸引入进植物细胞中的合适方法包括显微注射(Crossway等人(1986)Biotechniques(《生物技术》)4：320-334)、电穿孔(Riggs等人(1986)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国国家科学院院刊》)83：5602-5606)、土壤杆菌介导的转化(美国专利No.5,563,055和美国专利No.5,981,840)、直接基因转移(Paszkowski等人(1984)EMBO J.(《欧洲分子生物学组织杂志》)3：2717-2722)和弹道粒子加速(参见例如美国专利No.4,945,050、美国专利No.5,879,918、美国专利No.5,886,244和5,932,782；Tomes等人(1995)，载于：Plant Cell，Tissue，and Organ Culture：Fundamental Methods(《植物细胞、组织和器官培养：基础方法》)，Gamborg和Phillips编辑(柏林斯普林格出版社)；McCabe等人(1988)Biotechnology(《生物技术》)6：923-926)；以及Lecl转化(WO 00/28058)。还可参见Weissinger等人(1988)Ann.Rev.Genet.(《遗传学年评》)22：421-477；Sanford等人(1987)Particulate Science and Technology(《粒子科学和技术》)5：27-37(洋葱)；Christou等人(1988)Plant Physiol.(《植物生理学》)87：671-674(大豆)；McCabe等人(1988)Bio/Technology(《生物/技术》)6：923-926(大豆)；Finer和McMullen(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.(《体外细胞发育生物学》)27P：175-182(大豆)；Singh等人(1998)，Theor.Appl.Genet.(《理论与应用遗传学》)96：319-324(大豆)；Datta等人(1990)Biotechnology(《生物技术》)8：736-740(水稻)；Klein等人(1988)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)85：4305-4309(玉蜀黍)；Klein等人(1988)Biotechnology(《生物技术》)6：559-563(玉蜀黍)；美国专利No.5,240,855、No.5,322,783和No.5,324,646；Klein等人(1988)Plant Physiol.(《植物生理学》)91：440-444(玉蜀黍)；Fromm等人(1990)Biotechnology(《生物技术》)8：833-839(玉蜀黍)；Hooykaas-Van Slogteren等人(1984)Nature(《自然》)(伦敦)311：763-764；美国专利No.5,736,369(谷类)；Bytebier等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)84：5345-5349(百合科)；De Wet等人(1985)，The Experimental Manipulation of Ovule Tissues(《胚珠组织的实验操作》)，Chapman等人编辑，纽约朗文出版社(Longman，New York)，第197-209页(花粉)；Kaeppler等人(1990)Plant Cell Reports(《植物细胞报道》)9：415-418以及Kaeppler等人(1992)Theor.Appl.Genet.(《理论与应 用遗传学》)84：560-566(晶须介导的转化)；D′Halluin等人(1992)Plant Cell(《植物细胞》)4：1495-1505(电穿孔)；Li等人(1993)Plant Cell Reports(《植物细胞报道》)12：250-255以及Christou和Ford(1995)Annals of Botany(《植物学年鉴》)75：407-413(水稻)；Osjoda等人(1996)Nature Biotechnology(《自然生物技术》)14：745-750(经由根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)转化玉蜀黍)；将所有这些文献和专利以引用方式并入本文。
在其他实施例中，可以通过使植物与病毒或病毒核酸接触将任何本文所采用的多核苷酸引入植物中。一般地讲，这类方法涉及将所需的多核苷酸掺入在病毒DNA或RNA分子内。已经认识到，本文所提供的方法或组合物中采用的序列可最初作为病毒多聚蛋白的一部分来合成，其以后可通过体内或体外蛋白水解加工而产生所需的重组蛋白质。此外，已经认识到，本文所采用的启动子还涵盖用于通过病毒RNA聚合酶进行的转录的启动子。涉及病毒DNA或RNA分子的用于将多核苷酸引入植物中并表达其中所编码的蛋白质的方法是本领域已知的。参见(例如)美国专利No.5,889,191、No.5,889,190、No.5,866,785、No.5,589,367、No.5,316,931以及Porta等人(1996)Molecular Biotechnology(《分子生物技术》)5：209-221；将这些专利和文献以引用方式并入本文。
“瞬时转化”意指将多核苷酸引入宿主(即植物)中并进行暂时表达。这类瞬时转化方法包括但不限于直接将任何组分(即靶位点、目的基因组座位、重组位点、位点特异性重组酶、目的多核苷酸或其活性变体和片段)引入植物中或者将转录物引入植物中。这类方法包括例如显微注射或粒子轰击。参见例如Crossway等人(1986)Mol Gen.Genet.(《分子遗传学和基因组学》)202：179-185；Nomura等人(1986)Plant Sci.(《植物科学》)44：53-58；Hepler等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.(《美国科学院院刊》)91：2176-2180以及Hush等人(1994)The Journal of Cell Science(《细胞科学杂志》)107：775-784，将以上所有文献以引用的方式并入本文。或者，可使用本领域已知的技术将多核苷酸瞬时转化进植物中。这类技术包括病毒载体系统以及将多核苷酸以避免该DNA随后释放的方式进行沉淀。因此，可能从粒子结合的DNA发生转录，但将它释放出来以整合进基因组 中的频率大大降低。此类方法包括使用聚乙基亚胺(PEI；Sigma #P3143)包被的粒子。
已转化的细胞可以根据常规方式培育成植株。参见例如McCormick等人(1986)Plant Cell Reports(《植物细胞报道》)5：81-84。然后可使这些植物生长，用相同的转化植株或不同的植株进行授粉，所得的子代具有所鉴定的所需表型特征的组成型表达。可以培育两代或更多代以确保所需表型特性的表达得到稳定保持和遗传，然后收获种子以确保已经实现所需表型特征的表达。这样，提供了所述DNA构建体稳定掺入进其基因组中的转化种子(也称为“转基因种子”)。
V.多核苷酸
本文提供包含复合性状基因座的各种组分或用于变更本文提供的复合性状基因座的各种组分(即各种转基因靶位点、目的基因组座位、转基因、重组位点、位点特异性重组酶、转移盒、目的多核苷酸或其任何活性变体或片段)的多核苷酸。
术语“多核苷酸”、“多核苷酸序列”、“核酸序列”和“核酸片段”在本文可互换使用。这些术语涵盖核苷酸序列等。多核苷酸可以为RNA或DNA的聚合物，其为单链或双链的，并且任选含有合成的、非天然的或变更的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的多核苷酸可以由一段或多段cDNA、基因组DNA、合成DNA或其混合物构成。术语“多核苷酸”的使用并不旨在将本发明局限于包含DNA的多核苷酸。本领域普通技术人员会认识到，多核苷酸可包含核糖核苷酸以及包含核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合。这种脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸既包括天然存在的分子也包括合成的类似物。本文所提供的多核苷酸还涵盖所有形式的序列，包括但不限于单链形式、双链形式、发夹结构、茎-环结构等。
本文所提供的组合物可包含分离的或实质上纯化的多核苷酸。“分离的”或“纯化的”多核苷酸实质上或基本上不含通常在该多核苷酸的天然环境中存在的、与该多核苷酸相伴随或相互作用的成分。因此，分离的或纯化的多核苷酸，当通过重组技术生产时实质上不含其他细胞物质或培养基，或者当通过化学法合成时实质上不含化学前体或其他化学品。最佳的是，“分离的”多核苷酸不含在衍生该多核苷酸的生物体的基因组DNA中天然位于该多核苷酸的旁侧的序列(即位于该多核苷酸的5′和3′端的序 列)(最佳的是蛋白质编码序列)。例如，在多个实施例中，分离的多核苷酸可含有小于约5kb、4kb、3kb、2kb、lkb、0.5kb或0.1kb的在衍生该多核苷酸的细胞的基因组DNA中天然位于该多核苷酸的旁侧的核苷酸序列。
还提供的是包含各种靶位点、转基因、目的基因组座位、转移盒、重组位点、位点特异性重组酶、目的多核苷酸或任何其活性变体或片段的重组多核苷酸。术语“重组多核苷酸”和“重组DNA构建体”在本文可互换使用。重组构建体包含核酸序列(如自然界中不在一起的调控序列和编码序列)的人工或异源组合。例如，转移盒可包含限制位点和异源目的多核苷酸。在其他实施例中，重组构建体可包含源自不同来源的调控序列和编码序列，或者源自相同来源、但是以不同于自然界中存在的方式排列的调控序列和编码序列。此类构建体可单独使用或可与载体结合使用。如果使用载体，则载体的选择取决于本领域技术人员熟知的将用于转化宿主细胞的方法。例如，可使用质粒载体。技术人员充分认识到为了成功转化、选择和繁殖包含任何本文所提供的分离的核酸片段的宿主细胞而必须存在于载体上的遗传元件。技术人员还将认识到，不同的独立转化事件将导致不同的表达水平和表达模式(Jones等人EMBO J.(《欧洲分子生物学学会杂志》)4：2411-2418(1985)；De Almeida等人Mol.Gen.Genetics(《分子遗传学与普通遗传学》)218：78-86(1989))，因而必须对多个事件进行筛选以获得显示所需表达水平和表达模式的细胞系。此类筛选可以通过对DNA的DNA印迹分析、对mRNA表达的RNA印迹分析、对蛋白表达的免疫印迹分析、或表型分析等等来实现。
在具体的实施例中，可在表达盒中提供一种或多种本文所述的多核苷酸供在目的植物或其他生物体或细胞中表达。该表达盒可包括与本文所提供的多核苷酸有效连接的5′和3′调控序列。“有效连接”旨在意指两个或更多个元件之间的功能性连接。例如，目的多核苷酸与调控序列(即启动子)之间的有效连接是可使该目的多核苷酸得以表达的功能连接。有效连接的元件可以是连续的或非连续的。当用来指两个蛋白质编码区域的连接时，所谓有效连接意指所述编码区域处于相同的阅读框中。表达盒可另外含有至少一个待共转化进该生物体中的额外基因。或者，可在多个表达盒上提供额外的基因。这种表达盒设有多个限制位点和/或重组位点，以使重 组多核苷酸的插入处于调控区域的转录调节之下。表达盒可另外含有选择标记基因。
表达盒可在5′-3′转录方向上包括在植物中起作用的转录和翻译起始区(即启动子)、本文提供的重组多核苷酸以及转录和翻译终止区(即终止区)。调控区(即启动子、转录调控区和翻译终止区)和/或本文提供的多核苷酸对宿主细胞而言或彼此之间而言可以是天然的/同功的。或者，调控区和/或本文提供的多核苷酸对宿主细胞而言或彼此之间而言可以是异源的。如本文所用，指涉序列的“异源”为起源于外来物种的序列，或者，如果起源于相同物种的话，则是通过蓄意人为干预对其天然形式在组成和/或基因座方面进行实质性修饰的序列。例如，有效连接至异源多核苷酸的启动子来自与衍生这种多核苷酸的物种不同的物种，或者如果来自于相同/相似的物种，则一者或者两者由它们的原始形式和/或基因座经实质修饰而来，或者该启动子不是该有效连接的多核苷酸的天然启动子。或者，调控区和/或本文提供的重组多核苷酸可以是完全合成的。
终止区可以对于转录起始区而言是天然的，可以对于有效连接的重组多核苷酸而言是天然的，可以对于植物宿主而言是天然的，或者可以衍自对于该启动子、该重组多核苷酸、该植物宿主或它们的任何组合而言别的来源(即外来的或异源的)。便利的终止区可获自根癌土壤杆菌的Ti质粒，如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。另参见Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet.(《分子遗传学与普通遗传学》)262：141-144；Proudfoot(1991)Cell(《细胞》)64：671-674；Sanfacon等人(1991)Genes Dev.(《基因和发育》)5：141-149；Mogen等人(1990)Plant Cell(《植物细胞》)2：1261-1272；Munroe等人(1990)Gene(《基因》)91：151-158；Ballas等人(1989)Nucleic Acids Res.(《核酸研究》)17：7891-7903；以及Joshi等人(1987)Nucleic Acids Res.(《核酸研究》)15：9627-9639。
在制备表达盒时，可对多个DNA片段进行操纵，以提供处于正确取向的DNA序列。为此目的，可应用衔接子或接头将DNA片段连接在一起，或者可涉及其他的操纵以提供便利的限制位点、去除多余的DNA、去除限制位点等。出于这个目的，可涉及到体外诱变、引物修复、限制酶切、退火、再置换(如转换和颠换)。
可将多个启动子用于本文提供的表达盒中。启动子可基于所需的结果来选择。已经认识到，可通过在表达盒中使用不同启动子来调节目的多核苷酸表达的时序、位置和/或水平而增强不同的应用。如果需要，这种表达构建体还可含有启动子调控区(如，赋予诱导型表达或组成型表达，由环境或发育调节的表达，或细胞或组织特异性/选择性表达的启动子调控区)、转录起始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点和/或多腺苷酸化信号。
在一些实施例中，本文所提供的表达盒可以与用于在植物中表达的组成型启动子、组织偏好型启动子或其他启动子组合。组成型启动子的例子包括花椰菜花叶病毒(CaMV)35S转录起始区、源自根癌农杆菌T-DNA的1′-或2′-启动子、泛素1启动子、Smas启动子、肉桂醇脱氢酶启动子(美国专利No.5,683,439)、Nos启动子、pEmu启动子、rubisco启动子、GRPl-8启动子和源自技术人员已知的各种植物基因的其他转录起始区。如果低水平表达是所需的，则可使用弱启动子。弱组成型启动子包括例如Rsyn7启动子的核心启动子(WO 99/43838和美国专利No.6,072,050)、核心35S CaMV启动子等。其他组成型启动子包括例如美国专利No.5,608,149、No.5,608,144、No.5,604,121、No.5,569,597、No.5,466,785、No.5,399,680、No.5,268,463和No.5,608,142。还可参见美国专利No.6,177,611，将其以引用方式并入本文。
诱导型启动子的例子为Adhl启动子(其可由低氧或冷应激诱导)、Hsp70启动子(其可由热应激诱导)、PPDK启动子和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶启动子(两者均可由光诱导)。还可使用的是化学诱导型启动子，如受安全剂(safener)诱导的In2-2启动子(美国专利No.5,364,780)、受雌激素诱导的ERE启动子、以及受植物生长素诱导的、绒毡层特异性的但在愈伤组织中也有活性的Axigl启动子(PCT US01/22169)。
在发育控制下的启动子的例子包括优先在某些组织(如叶、根、果实、种子或花)中起始转录的启动子。示例性启动子是花药特异性启动子5126(美国专利No.5,689,049和No.5,689,051)。种子偏好的启动子的例子包括但不限于27kDγ玉米醇溶蛋白基因启动子和蜡质基因启动子，Boronat，A.等人(1986)Plant Sci.(《植物科学》)47：95-102；Reina，M.等人Nucl.Acids Res.(《核酸研究》)18(21)：6426；以及Kloesgen，R.B.等人 (1986)Mol.Gen.Genet.(《分子遗传学与普通遗传学》)203：237-244。在胚、果皮和胚乳中表达的启动子在美国专利No.6,225,529和PCT公布WO 00/12733中有公开。将这些专利各自的公开内容全文以引用方式并入本文中。
可将化学调节启动子用于通过施加外源化学调节剂来调控基因在植物中的表达。取决于目标，启动子可以是化学诱导型启动子，其中施用化学物质可诱导基因表达，或者是化学抑制型启动子，其中施用化学物质可抑制基因表达。化学诱导型启动子是本领域已知的，包括但不限于玉蜀黍In2-2启动子(其通过苯磺酰胺除草剂安全剂激活)、玉蜀黍GST启动子(其通过用作出土前(pre-emergent)除草剂的疏水性亲电化合物激活)和烟草PR-1a启动子(其通过水杨酸激活)。其他值得关注的化学调节启动子包括类固醇响应型启动子(参见例如，糖皮质激素诱导型启动子，载于：Schena等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)88：10421-10425；以及McNellis等人(1998)Plant J.(《植物杂志》)14(2)：247-257)和四环素诱导型和四环素阻遏型启动子(参见例如，Gatz等人(1991)Mol.Gen.Genet.(《分子遗传学与普通遗传学》)227：229-237；以及美国专利No.5,814,618和No.5,789,156)，将这些专利和文献以引用方式并入本文。
可利用组织偏好的启动子来靶向目的多核苷酸在特定植物组织内的增强表达。组织偏好的启动子是本领域已知的。参见例如Yamamoto等人(1997)Plant J.(《植物杂志》)12(2)：255-265；Kawamata等人(1997)Plant Cell Physiol.(《植物细胞生理学》)38(7)：792-803；Hansen等人(1997)Mol.Gen Genet.(《分子遗传学与普通遗传学》)254(3)：337-343；Russell等人(1997)Transgenic Res.(《转基因研究》)6(2)：157-168；Rinehart等人(1996)Plant Physiol.(《植物生理学》)112(3)：1331-1341；Van Camp等人(1996)Plant Physiol.(《植物生理学》)112(2)：525-535；Canevascini等人(1996)Plant Physiol.(《植物生理学》)112(2)：513-524；Yamamoto等人(1994)Plant Cell Physiol.(《植物细胞生理学》)35(5)：773-778；Lam(1994)Results Probl.Cell Differ.(《细胞分化的结果与问题》)20：181-196；Orozco等人(1993)Plant Mol Biol.(《植物分子生物学》)23(6)：1129-1138；Matsuoka等人(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA(《美国科学院院 刊》)90(20)：9586-9590；以及Guevara-Garcia等人(1993)Plant J.(《植物杂志》)4(3)：495-505。如有必要，可对这种启动子进行修饰以用于弱表达。
叶偏好的启动子是本领域已知的。参见例如Yamamoto等人(1997)Plant J.(《植物杂志》)12(2)：255-265；Kwon等人(1994)Plant Physiol.(《植物生理学》)105：357-67；Yamamoto等人(1994)Plant Cell Physiol.(《植物细胞生理学》)35(5)：773-778；Gotor等人(1993)Plant J.(《植物杂志》)3：509-18；Orozco等人(1993)Plant Mol.Biol.(《植物分子生物学》)23(6)：1129-1138；以及Matsuoka等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)90(20)：9586-9590。此外，还可使用cab和rubisco的启动子。参见例如Simpson等人(1958)EMBO J(《欧洲分子生物学组织杂志》)4：2723-2729以及Timko等人(1988)Nature(《自然》)318：57-58。
根偏好的启动子是已知的，可选自许多可从文献得到的启动子，或者从多种相容物种从头分离。参见例如Hire等人(1992)Plant Mol.Biol.(《植物分子生物学》)20(2)：207-218(大豆根特异性的谷氨酰胺合成酶基因)；Keller和Baumgartner(1991)Plant Cell(《植物细胞》)3(10)：1051-1061(法国菜豆的GRP 1.8基因中的根特异性控制元件)；Sanger等人(1990)Plant Mol.Biol.(《植物分子生物学》)14(3)：433-443(根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的甘露氨酸合酶(MAS)基因的根特异性启动子)；以及Miao等人(1991)Plant Cell(《植物细胞》)3(1)：11-22(编码细胞溶胶谷氨酰胺合成酶(GS)的全长cDNA克隆，其在大豆的根和根瘤中表达)。另参见Bogusz等人(1990)，Plant Cell(《植物细胞》)，2(7)：633-641，其中描述了从来自固氮非豆科植物榆科山黄麻(Parasponia andersonii)和相关的非固氮非豆科植物鸡屎藤山麻黄(Trema tomentosa)的血红蛋白基因分离的两个根特异性启动子。将这些基因的启动子连接至β-葡糖醛酸酶报告基因并引入非豆科植物烟草(Nicotiana tabacum)和豆科植物百脉根(Lotus corniculatus)二者中，在这两种情况中根特异性启动子活性得以保持。Leach和Aoyagi(1991)描述了他们对毛根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的高度表达的roIC和roID根诱导基因的分析(参见Plant Science(《植物科学》)(Limerick)79(1)：69-76)。他们得出结论认为，增 强子和组织偏好的DNA决定子在那些启动子中是分离的。Teeri等人(1989)使用与lacZ的基因融合表明，编码章鱼氨酸合酶的土壤杆菌T-DNA基因在根尖的表皮中特别活跃，且TR2′基因在完整植物中是根特异性的并且通过叶组织中的创伤刺激，这是与杀昆虫或杀幼虫基因一起使用的特别理想的特性组合(参见EMBO J.(《欧洲分子生物学组织杂志》)8(2)：343-350)。与nptII(新霉素磷酸转移酶II)融合的TRl′基因显示了相似的特性。另外的根优选的启动子包括VfENOD-GRP3基因启动子(Kuster等人(1995)Plant Mol.Biol.(《植物分子生物学》)29(4)：759-772)；和roIB启动子(Capana等人(1994)Plant Mol.Biol.(《植物分子生物学》)25(4)：681-691。还可参见美国专利No.5,837,876、No.5,750,386、No.5,633,363、No.5,459,252、No.5,401,836、No.5,110,732和No.5,023,179。菜豆蛋白基因(Murai等人(1983)Science(《科学》)23：476-482以及Sengopta-Gopalen等人(1988)PNAS(《美国国家科学院院刊》)82：3320-3324)。
含有本文提供的多核苷酸的表达盒还可包含选择标记基因用于转化细胞的选择。选择标记基因被利用于转化细胞或组织的选择。选标记基因包括编码抗生素抗性的基因，如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的那些基因，以及赋予对除草化合物的抗性的基因，所述除草化合物为例如草铵膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)和磺脲。另外的选择标记包括表型标记如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白如绿色荧光蛋白(GFP)(Su等人(2004)Biotechnol.Bioeng.(《生物技术和生物工程》)85：610-9以及Fetter等人(2004)Plant Cell(《植物细胞》)16：215-28)、青色荧光蛋白(CYP)(Bolte等人(2004)J.Cell Science(《细胞科学杂志》)117：943-54以及Kato等人(2002)Plant Physiol.(《植物生理学》)129：913-42)以及黄色荧光蛋白(来自Evrogen的PhiYFP.TM.；参见Bolte等人(2004)J.Cell Science(《细胞科学杂志》)117：943-54)。对于另外的选择标记，通常参见Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.(《生物技术新见》)3：506-511；Christopherson等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)89：6314-6318；Yao等人(1992)Cell(《细胞》)71：63-72；Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.(《分子微生物学》)6：2419-2422；Barkley等人(1980)，载于：The Operon(《操纵子》)，第177-220 页；Hu等人(1987)Cell(《细胞》)48：555-566；Brown等人(1987)Cell(《细胞》)49：603-612；Figge等人(1988)Cell(《细胞》)52：713-722；Deuschle等人(1989)Proc.Natl.Acad.Aci.USA(《美国科学院院刊》)86：5400-5404；Fuerst等人(1989)Proc.Nail.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)86：2549-2553；Deuschle等人(1990)Science(《科学》)248：480-483；Gossen，(1993)，海德尔堡大学博士论文；Reines等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)90：1917-1921；Labow等人(1990)Mol.Cell.Biol.(《分子细胞生物学》)10：3343-3356；Zambretti等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)89：3952-3956；Baim等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)88：5072-5076；Wyborski等人(1991)Nucleic Acids Res.(《核酸研究》)19：4647-4653；Hillenand-Wissman(1989)Topics Mol.Struc.Biol.(《分子结构生物学主题》)10：143-162；Degenkolb等人(1991)Antimicrob.Agents Chemother.(《抗微生物剂化学疗法》)35：1591-1595；Kleinschnidt等人(1988)Biochemistry(《生物化学》)27：1094-1104；Bonin，(1993)，海德尔堡大学博士论文；Gossen等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)89：5547-5551；Oliva等人(1992)Antimicrob.Agents Chemother.(《抗微生物剂化学疗法》)36：913-919；Hlavka等人(1985)Handbook of Experimental Pharmacology(《实验药理学手册》)，第78卷(柏林斯普林格出版社(Springer-Verlag，Berlin))；Gill等人(1988)Nature(《自然》)334：721-724。将这些公开内容以引用的方式并入本文。上面关于选择标记基因的名单并不意指是限制性的。可将任何选择标记基因用于本文给出的组合物中。
如果合适，可为了增加在转化植物中的表达对所述方法和组合物中采用的序列(即目的多核苷酸、重组酶等)进行优化。也就是说，可使用植物偏好的密码子来合成基因以改善表达。有关宿主偏好的密码子用法的论述，参见例如Campbell和Gowri(1990)Plant Physiol.(《植物生理学》)92：1-11。本领域可获得用于合成植物偏好的基因的方法。参见例如，美国专利No.5,380,831和No.5,436,391，以及Murray等人(1989)Nucleic Acids Res.(《核酸研究》)17：477-498，将所述专利和文献以引用方式并入本文。
VI.包含转基因靶位点的文库和制备方法
本文提供产生包含本文所述的各种转基因靶位点中的任一者的植物、种子或植物细胞的文库的方法。该方法包括将包含转基因靶位点的重组构建体引入植物、种子或植物细胞的群体中。所谓“群体”意指一群或一批植物、种子或植物细胞。该群体可包含2个或更多个(即5、10、100、300、500、700、900、1100、1300、1500、1700、1900、2100、2300、2500、2900、3100、3300、3500、3700、3900、4000、4096、10⁴、10⁵、10⁶个或更多个)植物、种子或植物细胞。如本文所用，“文库”是包含稳定掺入进其基因组中的至少一个转基因靶位点的植物、种子或植物细胞的群体。
为了产生植物文库，将包含转基因靶位点的重组构建体引入进植物细胞的群体中。可通过任何本领域已知的的手段引入重组构建体。该方法包括鉴别具有该重组构建体的植物或植物细胞并表征该重组构建体的基因组插入位点。有多种方法可供鉴别至少一个在其基因组中包含转基因靶位点的植物细胞并表征基因组插入位点。这类方法包括但不限于根据选择标记进行的选择、PCR方法、测序方法、核酸酶消化、DNA印迹以及它们的任何组合。参见例如美国专利申请12/147,834，将该专利申请全文以引用的方式并入本文。
重组构建体可在植物基因组中的任何位置整合。在一个实施例中，集成植物、种子或植物细胞的文库使得该文库的每个成员包含具有不同基因组插入位点的靶位点，并且当组合进单个植物基因组中时，可彼此独立地分开。在这些情形中，转基因靶位点的整合位点在植物基因组中彼此相距约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10cM或更远。或者，转基因靶位点的整合位点在植物基因组中彼此相距约1-10cM、约2-10cM、约2-5cM、约3-10cM、约3-6cM、约4-10cM、约4-7cM、约5-10cM、约5-8cM、约6-10cM、约6-9cM、约7-10cM、约8-10cM、约9-10cM、约0.5-1％、约0.5-5％、约0.5-10％、约0.1-1cM、约0.1-2cM、约0.1-3cM、约0.1-4cM、约0.1-5cM、约0.1-6cM、约0.1-7cM、约0.1-8cM、约0.1-9cM或约0.1-10cM。
在一些实施例中，植物、种子或植物细胞的文库包含这样的群体，其中所述群体的成员在确定的基因组窗口内以约10cM至约1cM的间隔具有 转基因靶位点。所谓“间隔”意指存在着以距离另一转基因靶位点确定的距离定位的转基因靶位点。例如，在10cM基因组窗口内以1cM间隔定位的转基因靶位点意指在该基因组窗口内每1cM距离有一个靶位点，使得该基因组窗口为靶位点所饱和。所谓“饱和”意指该文库包含这样的成员的群体，所述成员在整个基因组窗口上以约10cM间隔至约0.1cM间隔、约10cM间隔至约0.5cM间隔、约5cM间隔至约0.1cM间隔、约4cM间隔至约0.1cM间隔、约3cM间隔至约0.1cM间隔、或约2cM间隔至约0.1cM间隔具有转基因靶位点。
在一些实施例中，植物、种子或植物细胞的文库包含这样的群体，其中所述群体的成员在确定的基因组窗口内以约10cM至约1cM间隔具有转基因靶位点。所述确定的基因组窗口可具有任何长度，包括长度为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、250、500、750、1000、2000、3000、4000、5000cM或最多至整个基因组。基因组窗口可为约1-5cM、约1-10cM、约10-30cM、约30-60cM、约60-100cM、约100-500cM、约500-1000cM、约1000-2500cM、约2500-5000cM或最多至基因组的整个长度。在基因组窗口是整个基因组的情形中，植物、种子或植物细胞文库以每个确定的间隔包含转基因靶位点，使得整个基因组为转基因靶位点所饱和。
本文还包涵鉴别在给定的基因组窗口内具有转基因靶位点的植物或植物细胞的方法。可从该文库选择植物、种子或植物细胞的亚群，使得文库每个成员内的转基因靶位点具有不同的基因组插入位点并且在存在于相同基因组中时以约10％至约0.1％的比率彼此独立地分开。
在另一个实施例中，该文库包含植物、种子或植物细胞的群体，其中文库每个成员中转基因靶位点的基因组插入位点在存在于相同基因组中时彼此独立地分开，并且该群体的成员在基因组窗口内以10cM的间隔至约1cM的间隔定位。
这些文库可用于通过使该文库内的植物杂交或使该文库内的植物与来自包含不同转基因靶位点的文库的植物杂交来在任何给定基因组窗口中产生复合性状基因座。以该方式，可将多个转基因靶位点在给定基因组窗口内合并进单个植物基因组中。
VII.片段、变体和序列比较
本文还提供了各种重组位点、位点特异性重组酶和目的多核苷酸的活性变体或片段。本文别的地方描述了这些成分每一者的生物活性。
所谓“片段”，意指多核苷酸的一部分或由其编码的氨基酸序列从而由其编码的蛋白质的一部分。多核苷酸的片段可编码保留天然蛋白质的生物活性的蛋白质片段(即重组酶的片段可实现重组事件)。如本文所用，“天然”多核苷酸或多肽分别包含天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。因而，多核苷酸的片段可在至少约20个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸以及最多至全长多核苷酸的范围内。本方法或组合物中所采用的编码蛋白质的生物活性部分的多核苷酸片段将编码至少15、25、30、50、100、150、200或250个连续的氨基酸，或最多至全长蛋白质中存在的总氨基酸数目。或者，可用作杂交探针的多核苷酸片段通常不编码保留生物活性的片段蛋白质。因此，核苷酸序列的片段可在至少约10、20、30、40、50、60、70、80个核苷酸或最多至全长序列的范围内。
“变体”序列具有高度的序列相似性。对于多核苷酸，保守变体包括由于遗传密码的简并性而编码天然多肽之一的氨基酸序列的那些序列。诸如这些变体之类的变体可用众所周知的分子生物学技术，例如用聚合酶链反应(PCR)技术和杂交技术来鉴别。变体多核苷酸也包括以合成法衍生的核苷酸序列，如那些例如通过使用定点诱变产生但仍编码蛋白质的核苷酸序列。通常，通过已知的序列比对程序和参数测定，特定多核苷酸的变体将与该特定多核苷酸具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。
特定多核苷酸(即参比核苷酸序列)的变体还可通过比较变体多核苷酸所编码的多肽与该参比多核苷酸所编码的多肽之间的序列同一性百分数来进行评价。因而，例如，编码与重组酶具有给定的序列同一性百分数的多肽的分离的多核苷酸是本领域已知的。任何两条多肽之间的序列同一性百分数可用所述的序列比对程序和参数来计算。若任何给定的多核苷酸对是通过比较它们编码的两条多肽所具有的序列同一性百分数进行评价，则该两条编码的多肽之间的序列同一性百分数为至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。
所谓“变体”蛋白质意指通过如下手段而衍生自天然蛋白质的蛋白质：在天然蛋白质的N末端和/或C末端缺失(所谓的截短)或添加一个或多个氨基酸；在天然蛋白质中的一个或者多个位点缺失或添加一个或多个氨基酸；或在天然蛋白质中的一个或多个位点置换一个或多个氨基酸。变体蛋白质是有生物活性的，即它们继续具有天然蛋白质的所需生物活性。这类变体可例如由遗传多态性或由人类操纵而得到。通过已知的序列比对程序和参数测定，天然蛋白质的生物活性变体将与该天然蛋白质的氨基酸序列具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。蛋白质的生物活性变体可与该蛋白质相差少至1-15个氨基酸残基、少至1-10个如6-10个、少至5个、少至4个、3个、2个或甚至1个氨基酸残基。
以下术语用于描述两条或更多条多肽或多核苷酸之间的序列关系：如本文所用，“参比序列”是用作序列比较的基础的确定的序列。参比序列可以是指定序列的一部分或全部。序列关系可使用计算机执行的算法分析和描述。两条或更多条多核苷酸或者两条或更多条多肽之间的序列关系可通过这样来测定：产生所述序列的最佳比对，并对该比对中的匹配和空位进行打分，这可得到序列同一性百分数和序列相似性百分比。多核苷酸关系还可根据每一者所编码的多肽的比较来描述。用于序列比较和分析的许多程序和算法是本领域所熟知的。
除非另有规定，否则本文提供的序列同一性/相似性值是指使用GAP版本10(GCG，Accelrys公司，加利福尼亚州圣地亚哥市(San Diego，CA))采用以下参数获得的值：对于核苷酸序列的同一性百分数和相似性百分数，使用空位产生罚分权重(gap creation penalty weight)50和空位长度延伸罚分权重(gap length extension penalty weight)3以及nwsgapdna.cmp打分矩阵；对于氨基酸序列的同一性百分数和相似性百分数，使用空位产生罚分权重8和空位长度延伸罚分权重2以及BLOSUM62打分矩阵(Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci USA(《美国科学院院刊》)89：10915)；以及它们的任何等同程序。所谓“等同程序”意指任何这样的序列比较程序，其对于任何两条所考虑的序列，相比于GAP版本10所产 生的对应的比对，能产生出具有相同的核苷酸或氨基酸残基匹配和相同的序列同一性百分数的比对。
GAP使用Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.(《分子生物学杂志》)48：443-453的算法来寻找两个完整序列的比对，该比对使匹配数最大而使空位数最小。GAP考虑所有可能的比对和空位位置，并产生具有最大数目的匹配碱基和最少的空位的比对。它使得可以提供以匹配碱基数为单位的空位产生罚分和空位延伸罚分。GAP对于其插入的每个空位，必须利用匹配的空位产生罚分数。如果选择大于零的空位延伸罚分，GAP对于每个插入的空位必须另外利用空位长度乘以空位延伸罚分。
GAP给出该家族中的具有最佳比对的一个成员。可能存在这个家族的许多成员，但其他成员没有更好的品质。GAP显示用于比对的四个优值因素：品质、比率、同一性和相似性。品质是为了将序列进行比对而最大化的指标(metric)。比率是品质除以较短区段中的碱基数。同一性百分数是实际匹配的符号的百分数。相似性百分数是相似的符号的百分数。将对应于空位的符号忽略。当一对符号的评分矩阵值大于或等于0.50(相似性阈值)时，评定为相似性。
如本文所用，“序列同一性”或“同一性”在两条多核苷酸或多肽序列的语境中是指当进行比对以获得最大对应时两条序列中相同的残基。差别在于保守置换的序列(特别是多肽)被称为具有“序列相似性”或“相似性”。作出这个调整的手段是本领域技术人员公知的。通常，这涉及将保守置换评定为部分错配而不是完全错配，从而增加序列同一性百分数。因而，例如，如果相同的氨基酸给予1分，非保守置换给予0分，则保守置换给予0至1之间的分数。保守性置换的打分使用所选择的打分矩阵(对于GAP默认BLOSUM62)来计算。
蛋白质可以各种方式进行变更，包括氨基酸置换、缺失、截短和插入。这类操纵的方法是本领域公知的。例如，重组酶蛋白的氨基酸序列变体可通过DNA中的突变来制备。诱变以及核苷酸序列变更的方法是本领域众所周知的。参见例如Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)82：488-492；Kunkel等人(1987)Methods in Enzymol.(《酶学方法》)154：367-382；美国专利No.4,873,192；Walker和Gaastra编辑(1983)Techniques in Molecular Biology(《分子生物学技术》)(纽约麦克 米伦出版公司(MacMillan Publishing Company，New York))以及其中所引用的参考文献。有关不影响目的蛋白质的生物活性的适当氨基酸置换的指导，可见于Dayhoff等人(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure(《蛋白序列和结构图表集》)(华盛顿特区国家生物医学研究基金会(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.))的模型，将该文献以引用方式并入本文。保守置换，如将一个氨基酸用另一具有相似性质的氨基酸进行交换，可以是优选的。
变体多核苷酸和蛋白质还涵盖衍生自诱变和重组程序(如DNA改组)的序列和蛋白质。使用这样一种程序，可操纵一条或多条不同的编码序列以产生具有所需特性的新蛋白质。这样，从包含具有实质的序列同一性且可体外或体内同源重组的序列区的相关多核苷酸的群体产生了重组多核苷酸的文库。这种DNA改组的策略是本领域已知的。参见例如Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)91：10747-10751；Stemmer(1994)Nature(《自然》)370：389-391；Crameri等人(1997)Nat Biotech.(《自然生物技术》)15：436-438；Moore等人(1997)(《分子生物学杂志》)272：336-347；Zhang等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)94：4504-4509；Crameri等人(1998)Nature(《自然》)391：288-291；以及美国专利No.5,605,793和No.5,837,458。
本文所公开的方法和组合物的非限制性例子如下：
1.一种在其基因组中具有包含至少第一转基因靶位点、第二转基因靶位点和目的基因组座位的基因组窗口的植物或种子，其中所述基因组窗口长约10cM；
其中所述目的基因组座位、所述第一转基因靶位点和所述第二转基因靶位点具有不同的基因组插入位点；以及
其中所述第一转基因靶位点、所述第二转基因靶位点和所述目的基因组座位各以约10％至约0.1％的比率彼此独立地分开。
2.实施例1的植物或种子，其中所述基因组窗口长约5cM；
其中所述第一转基因靶位点、所述第二转基因靶位点和所述目的基因组座位各以
约5％至约0.1％的比率彼此独立地分开。
3.实施例1或2的植物或种子，其中(a)所述第一转基因靶位点或 所述第二转基因靶位点以约5％至约0.1％的比率独立地与所述目的基因组座位分离；或者，(b)所述第一转基因靶位点和所述第二转基因靶位点以约5％至约0.1％的比率彼此独立地分开。
4.实施例1、2或3的植物或种子，其中所述第一转基因靶位点包含第一重组位点和第二重组位点，其中
(i)所述第一和所述第二重组位点彼此相异；或者(ii)所述第一和所述第二重组位点彼此相异且相容性降低；
并且所述第二转基因靶位点包含第三重组位点和
第四重组位点，其中(i)所述第三和所述第四重组位点彼此相异；
或者(ii)所述第三和所述第四重组位点彼此相异且相容性降低。
5.实施例1-4中任一项的植物或种子，其中所述第一转基因靶位点或所述第二转基因靶位点距所述目的基因组座位在约5cM以内。
6.实施例1-4中任一项的植物或种子，其中所述第一转基因靶位点或所述第二转基因靶位点距所述目的基因组座位在约2cM以内。
7.实施例1-4中任一项的植物或种子，其中所述第一转基因靶位点或所述第二转基因靶位点距所述目的基因组座位在约0.5cM以内。
8.实施例1-7中任一项的植物或种子，其中所述基因组窗口还包含具有第五重组位点和第六重组位点的第三转基因靶位点，其中(i)所述第五和所述第六重组位点彼此相异；或者(ii)所述第五和所述第六重组位点彼此相异且相容性降低；
并且所述第三转基因靶位点具有与所述第一转基因靶位点、所述第二转基因靶位点和所述目的基因组座位不同的基因组插入位点。
9.实施例8的植物或种子，其中所述第三转基因靶位点距所述目的基因组座位在约5cM以内。
10.实施例1-9中任一项的植物或种子，其中所述目的基因组座位赋予包含雄性不育、位点特异性重组、非生物胁迫耐受性、变更的磷、变更的抗氧化剂、变更的脂肪酸、变更的必需氨基酸、变更的碳水化合物、除草剂耐受性、昆虫抗性或病害抗性的性状。
11.实施例1-10中任一项的植物或种子，其中所述目的基因组座位包含转基因。
12.实施例1-10中任一项的植物或种子，其中所述目的基因组座位包含天然性状。
13.实施例1-12中任一项的植物或种子，其中所述第一转基因靶位点包含至少一种目的多核苷酸。
14.实施例1-12中任一项的植物或种子，其中所述第二转基因靶位点包含至少第二目的多核苷酸。
15.实施例4的植物或种子，其中所述第二转基因靶位点包含与所述第一转基因靶位点相同的相异重组位点。
16.实施例4的植物或种子，其中所述第二转基因靶位点包含与所述第一转基因靶位点不同的相异重组位点。
17.实施例4的植物或种子，其中所述第一转基因靶位点和所述第二转基因靶位点的所述相异重组位点包含LOX位点、突变型LOX位点、FRT位点或突变型FRT位点。
18.实施例17的植物或种子，其中所述第一和所述第二转基因靶位点的所述相异重组位点包含FRT位点或突变型FRT位点。
19.实施例17或18的植物或种子，其中所述突变型FRT位点包含FRT5位点、FRT6位点、FRT7位点、FRT12位点或FRT87位点。
20.实施例15的植物或种子，其中所述第一和所述第二转基因靶位点的所述相异重组位点包含FRT1位点和FRT87位点。
21.实施例1-20中任一项的植物或种子，其中所述植物或种子是单子叶植物。
22.实施例21的植物或种子，其中所述单子叶植物是玉蜀黍、小麦、水稻、大麦、高粱或黑麦。
23.实施例1-20中任一项的植物或种子，其中所述植物或种子是双子叶植物。
24.实施例23的植物或种子，其中所述双子叶植物是大豆、芸苔、向日葵、棉花或苜蓿。
25.一种产生第二植物的方法，所述方法包括对第一植物或其部分应用植物育种技术，其中所述第一植物是实施例1-24中任一项的植物，并且其中应用所述技术导致产生所述第二植物。
26.实施例25的方法，其中当与所述第一植物比较时，所述第二植物在所述基因组窗口内包含至少一个另外的转基因靶位点或至少一个另外的目的基因组座位；其中所述另外的转基因靶位点和所述另外的目的基因组座位各自相对于彼此以及相对于所述第一转基因靶位点、所述第二转基因靶位点和所述目的基因组座位具有不同的基因组插入位点。
27.实施例26的方法，其中所述至少一个另外的转基因靶位点包含目的多核苷酸。
28.实施例25的方法，其中当与所述第一植物比较时，所述第二植物在所述基因组窗口内包含少至少一个转基因靶位点或少至少一个目的基因组座位。
29.一种在植物基因组中产生复合性状基因座的方法，包括
(a)提供在基因组窗口内具有至少第一转基因靶位点的第一植物，并且其中所述基因组窗口长约10cM且所述第一植物不包含第一目的基因组座位；(b)将所述第一植物与第二植物进行育种，其中所述第二植物在所述基因组窗口中包含所述第一目的基因组座位并且所述第二植物不包含所述第一转基因靶位点；以及，(c)从步骤(b)选择包含所述第一转基因靶位点和所述目的基因组座位的子代植物；其中在所述子代植物中所述第一转基因靶位点和所述第一目的基因组座位具有不同的基因组插入位点。
30.一种在植物基因组中产生复合性状基因座的方法，包括
(a)提供在基因组窗口内具有至少第一转基因靶位点和第二转基因靶位点的第一植物，其中所述基因组窗口长约10cM，并且其中所述第一转基因靶位点和所述第二转基因靶位点具有不同的基因组插入位点，其中所述第一植物不包含第一目的基因组座位；
(b)将所述第一植物与第二植物进行育种，其中所述第二植物在所述基因组窗口中包含所述第一目的基因组座位，其中所述 第二植物在所述基因组窗口中不包含所述第一转基因靶位点或所述第二转基因靶位点；以及，
(c)从步骤(b)选择包含所述第一转基因靶位点、所述第二转基因靶位点和所述第一目的基因组座位的子代植物；其中在所述子代植物中所述第一转基因靶位点、所述第二转基因靶位点和所述第一目的基因组座位各具有不同的基因组插入位点；
以及，
其中所述子代植物中的所述第一转基因靶位点、所述第二转基因靶位点和所述目的基因组座位各以约10％至0.1％的比率彼此独立地分开。
31.实施例30的方法，其中所述基因组窗口长约5cM，并且其中所述子代植物中的所述第一转基因靶位点、所述第二转基因靶位点和所述目的基因组座位各以约5％至0.1％的比率彼此独立地分开。
32.实施例30或31的方法，其中(a)所述第一转基因靶位点或所述第二转基因靶位点与所述第一目的基因组座位以约5％至约0.1％的比率独立地分开；或者，(b)所述子代植物的所述第一转基因靶位点和所述第二转基因靶位点以约5％至约0.1％的比率彼此独立地分开。
33.实施例30-32中任一项的方法，其中所述方法还包括(a)将所述子代植物与包含第二目的基因组座位的第三植物进行育种，其中所述第三植物在所述基因组窗口中包含所述第二目的基因组座位，其中所述第三植物在所述基因组窗口中不包含所述第一转基因靶位点、所述第二转基因靶位点或所述第一目的基因组座位；以及(b)从步骤(a)选择包含所述第一转基因靶位点、所述第二转基因靶位点、所述第一目的基因组座位和所述第二目的基因组座位的第二子代植物；并且
其中在所述第二子代植物中所述第一转基因靶位点、所述第二转基因靶位点、所述第一目的基因组座位和所述第二目的基因组座位各具有不同的基因组插入位点；并且，
其中所述第二子代植物中的所述第一转基因靶位点、所述第二转基因靶位点、所述第一目的基因组座位或所述第二目的基因组座位各以约10％至约0.1％的比率彼此独立地分开。
34.根据实施例30-33中任一项的方法，其中
(a)所述第一转基因靶位点包含第一重组位点和第二重组位点，其中(i)所述第一和所述第二重组位点彼此相异，并且所述第一转基因靶位点包含目的多核苷酸；或者(ii)所述第一和所述第二重组位点彼此相异且相容性降低，并且所述第一转基因靶位点包含目的多核苷酸；并且，
(b)所述第二转基因靶位点包含第三重组位点和第四重组位点，其中(i)所述第三和所述第四重组位点彼此相异；并且所述第二转基因靶位点还包含第二目的多核苷酸；或者
(ii)所述第三和所述第四重组位点彼此相异且相容性降低；并且所述第二转基因靶位点还包含第二目的多核苷酸。
35.实施例30-34中任一项的方法，其中所述第一转基因靶位点和所述第一目的基因组座位的基因组位置彼此相距在5cM以内。
36.实施例30-34中任一项的方法，其中所述第一转基因靶位点和所述第一目的基因组座位的基因组位置彼此相距在2cM以内。
37.实施例30-34中任一项的方法，其中所述第一转基因靶位点和所述目的基因组座位的基因组位置彼此相距在0.5cM以内。
38.实施例30-31中任一项的方法，其中所述第一目的基因组座位赋予包含雄性不育、位点特异性重组、非生物胁迫耐受性、变更的磷、变更的抗氧化剂、变更的脂肪酸、变更的必需氨基酸、变更的碳水化合物、除草剂耐受性、昆虫抗性或病害抗性的性状。
39.实施例29-38中任一项的方法，其中所述第一目的基因组座位包含天然性状、目的转基因或另外的转基因靶位点。
40.实施例34的方法，其中所述第一转基因靶位点和所述第二转基因靶位点包含相同的相异重组位点。
41.实施例34的方法，其中所述第一转基因靶位点和所述第二转基因靶位点包含不同的相异重组位点。
42.实施例34、40或41的方法，其中所述相异重组位点包含LOX位点、突变型LOX位点、FRT位点或突变型FRT位点。
43.实施例34、40或41的方法，其中所述相异重组位点包含FRT位点或突变型FRT位点。
44.实施例42或43的方法，其中所述突变型FRT位点包含FRT5位点、FRT6位点、FRT7位点、FRT12位点或FRT87位点。
45.实施例34的方法，其中所述第一和所述第二转基因靶位点包含FRT1位点和FRT87位点。
46.一种变更植物基因组中的复合性状基因座的方法，包括
(a)提供在基因组窗口内具有至少第一转基因靶位点、第二转基因靶位点和第一目的基因组座位的第一植物，其中所述基因组窗口长约10cM，并且其中所述第一转基因靶位点、所述第二转基因靶位点、所述第一目的基因组座位具有不同的基因组插入位点；
其中所述第一植物中的所述第一转基因靶位点、所述第二转基因靶位点或所述第一目的基因组座位各以约10％至约0.1％的比率彼此独立地分开；
(b)将所述第一植物与第二植物进行育种；
(c)从步骤(b)选择子代植物，其中所述子代植物的所述基因组窗口不包含所述第一转基因靶位点、所述第二转基因靶位点或所述第一目的基因组座位中的任一者或任两者。
47.实施例46的方法，其中所述基因组窗口长约5cM并且其中所述第一植物中的所述第一转基因靶位点、所述第二转基因靶位点或所述第一目的基因组座位各以约5％至约0.1％的比率彼此独立地分开；
48.实施例46或47的方法，其中(a)所述第一植物的所述第一转基因靶位点和所述第二转基因靶位点以约5％至约0.1％的比率彼此独立地分开；或者，(b)所述第一植物的所述第一转基因靶位点或所述第二转基因靶位点与所述第一目的基因组座位以约5％至约0.1％的比率独立地分开。
49.实施例46、47或48的方法，其中
(a)所述第一转基因靶位点包含第一重组位点和第二重组位点，其中(i)所述第一和所述第二重组位点彼此相异，并且所述第一转基因靶位点包含目的多核苷酸；或者(ii)所述第一和所述第二重组位点彼此相异且相容性降低，并且所述第一转基因靶位点包含目的多核苷酸；并且，
(b)所述第二转基因靶位点包含第三重组位点和第四重组位点，其中(i)所述第三和所述第四重组位点彼此相异；并且所述第二转基因靶位点还包含第二目的多核苷酸；或者
(ii)所述第三和所述第四重组位点彼此相异且相容性降低；并且所述第二转基因靶位点还包含第二目的多核苷酸。
51.实施例46-49中任一项的方法，其中所述第一转基因靶位点和所述第一目的基因组座位的基因组位置彼此相距在2cM以内。
52.实施例46-49中任一项的方法，其中所述第一转基因靶位点和所述目的基因组座位的基因组位置彼此相距在0.5cM以内。
53.实施例46-49中任一项的方法，其中所述目的基因组座位赋予包含雄性不育、位点特异性重组、非生物胁迫耐受性、变更的磷、变更的抗氧化剂、变更的脂肪酸、变更的必需氨基酸、变更的碳水化合物、除草剂耐受性、昆虫抗性或病害抗性的性状。
54.实施例46-49中任一项的方法，其中所述第一目的基因组座位包含天然性状、目的转基因或另外的转基因靶位点。
55.实施例25-54中任一项的方法，其中所述植物是单子叶植物。
56.实施例55的方法，其中所述单子叶植物是玉蜀黍、小麦、水稻、大麦、高粱或黑麦。
57.实施例25-54中任一项的方法，其中所述植物是双子叶植物。
58.实施例57的方法，其中所述双子叶植物是大豆、芸苔、向日葵、棉花或苜蓿。
59.一种产生植物、种子或植物细胞的文库的方法，其中所述文库中的所述植物、所述种子或所述植物细胞各包含转基因靶位点，所述方法包括：(a)向植物细胞的群体中引入包含转基因靶位点的重组构建体；(b)鉴别具有所述重组构建体的植物细胞或植物；(c)表征所述重组构建体在步骤(b)的所述植物细胞或植物内的基因组插 入位点；以及，(d)集成所述植物、种子或植物细胞的文库，其中所述文库的每个成员包含具有不同基因组插入位点的转基因靶位点，并且当所述转基因靶位点组合进单个植物基因组中时，所述转基因靶位点彼此独立地分开。
60.实施例59的方法，其中步骤(d)的所述植物、种子或植物细胞的文库包含植物、种子或植物细胞的群体，其中所述群体的成员在基因组窗口内以约10cM至约1cM的间隔具有所述转基因靶位点。
61.实施例62的方法，其中所述群体的成员在基因组窗口内以约2cM间隔具有所述转基因靶位点。
62.实施例60或61的方法，其中所述基因组窗口是整个基因组。
63.一种鉴别在基因组窗口中具有转基因靶位点的植物或植物细胞的方法，包括(a)提供植物、种子或植物细胞的文库，其中所述文库中的所述植物、所述种子或所述植物细胞各包含不同基因组插入位点中的转基因靶位点，其中所述文库的每个成员中的所述转基因靶位点的所述基因组插入位点当存在于相同基因组中时彼此独立地分开；以及(b)鉴别所述文库中的植物、种子或植物细胞的亚群，其中所述亚群的每个成员中的所述转基因靶位点的所述基因组插入位点当存在于相同基因组中时以约10％至约0.1％的比率彼此独立地分开。
64.一种包含植物、种子或植物细胞的群体的植物、种子或植物细胞的文库，所述植物、种子或植物细胞具有稳定掺入进其基因组中的转基因靶位点，其中所述文库的每个成员中的所述转基因靶位点的基因组插入位点当存在于相同基因组中时彼此独立地分开，并且所述群体的成员在基因组窗口内以约10cM间隔至约1cM间隔具有所述转基因靶位点。
65.实施例64的植物、种子或植物细胞的文库，其中所述基因组窗口包含完整的基因组。
66.实施例64的植物、种子或植物细胞的文库，其中所述基因组窗口长约10cM。
67.实施例64、65或66的植物、种子或植物细胞的文库，其中所述群体的成员在基因组窗口内以约2cM的间隔具有所述转基因靶位点。
68.一种在其基因组中具有包含至少第一转基因靶位点、第二转基因靶位点和目的基因组座位的基因组窗口的植物或种子，其中所述基因组窗口：(a)旁侧为至少第一标记和至少第二标记，所述第一标记包含UMC1160、UMC2224、NPI579B、PMCB1、IDP3917、GPM199C、IDP1425、MMP68、UMC2225、STD2C(DBA)、TIDP3300、CSU1171、SUT1或UMC1166，所述第二标记包含AY107207、UMC1568、IDP3783、BNLG1429、IDP209、LTK1或IDP7169；或者
(b)旁侧为至少第一标记和至少第二标记，所述第一标记包含UMC1625、UMC2196、UMC2312、BNLG1867、PZA03047、UMC1229、UCK1、RZ390D(CYB5)、MMP20、MMP10、MMP160、PHP20528、UMC2314、UAZ232B(SCI)或UMC2313，所述第二标记包含CDO545、PHP20854、UMC1133、UFG69、MMP76、Y1、BNLG1422、MMP108B、MMP4、UMC1006或RZ444E；
其中所述目的基因组座位、所述第一转基因靶位点和所述第二转基因靶位点各具有不同的基因组插入位点；并且，
其中所述第一转基因靶位点、所述第二转基因靶位点和所述目的基因组座位各以约10％至约0.1％的比率彼此独立地分开。
69.一种子代植物，所述子代植物从实施例68的植物获得。
70.实施例68的植物，所述植物还包含至少一种变更的靶序列，其中所述至少一种变更的靶序列起源于被双链断裂诱导剂识别和切割的对应靶序列，并且其中所述至少一种变更的靶序列位于所述基因组窗口中。
71.一种在植物基因组中产生复合性状基因座的方法，包括
(a)提供在基因组窗口内具有至少第一转基因靶位点的第一植物，其中所述第一植物不包含第一目的基因组座位，并且其中所述基因组窗口：(i)旁侧为至少第一标记和至少第二标 记，所述第一标记包含UMC1160、UMC2224、NPI579B、PMCB1、IDP3917、GPM199C、IDP1425、MMP68、UMC2225、STD2C(DBA)、TIDP3300、CSU1171、SUT1或UMC1166，所述第二标记包含AY107207、UMC1568、IDP3783、BNLG1429、IDP209、LTK1或IDP7169；或者(ii)旁侧为至少第一标记和至少第二标记，所述第一标记包含UMC1625、UMC2196、UMC2312、BNLG1867、PZA03047、UMC1229、UCK1、RZ390D(CYB5)、MMP20、MMP10、MMP160、PHP20528、UMC2314、UAZ232B(SCI)或UMC2313，所述第二标记包含CDO545、PHP20854、UMC1133、UFG69、MMP76、Y1、BNLG1422、MMP108B、MMP4、UMC1006或RZ444E；
(b)将所述第一植物与第二植物进行育种，其中所述第二植物在所述基因组窗口中包含所述第一目的基因组座位并且所述第二植物不包含所述第一转基因靶位点；以及，(c)从步骤(b)选择包含所述第一转基因靶位点和所述目的基因组座位的子代植物；其中在所述子代植物中所述第一转基因靶位点和所述第一目的基因组座位具有不同的基因组插入位点。
72.一种在其基因组中具有包含至少第一转基因靶位点、第二转基因靶位点和目的基因组座位的基因组窗口的植物或种子，其中所述基因组窗口：旁侧为至少第一标记和至少第二标记，所述第一标记包含SATT613、SATT284、S60414-TB或SATT462，并且所述第二标记包含SATT481、SATT156或SCT_010；
其中所述目的基因组座位、所述第一转基因靶位点和所述第二转基因靶位点各具有不同的基因组插入位点；并且，其中所述第一转基因靶位点、所述第二转基因靶位点和所述目的基因组座位各以约10％至约0.1％的比率彼此独立地分开。
73.一种子代植物，所述子代植物从实施例72的植物获得。
74.实施例72的植物，所述植物还包含至少一种变更的靶序列，其中所述至少一种变更的靶序列起源于被双链断裂诱导剂识别和切割 的对应靶序列，并且其中所述至少一种变更的靶序列位于所述基因组窗口中。
75.一种在植物的基因组中产生复合性状基因座的方法，包括
(a)提供在基因组窗口内具有至少第一转基因靶位点的第一植物，其中所述第一植物不包含第一目的基因组座位，并且其中所述基因组窗口：旁侧为至少第一标记和至少第二标记，所述第一标记包含SATT613、SATT284、S60414-TB或SATT462，并且所述第二标记包含SATT481、SATT156或SCT_010；(b)将所述第一植物与第二植物进行育种，其中所述第二植物在所述基因组窗口中包含所述第一目的基因组座位并且所述第二植物不包含所述第一转基因靶位点；以及，(c)从步骤(b)选择包含所述第一转基因靶位点和所述目的基因组座位的子代植物；其中在所述子代植物中所述第一转基因靶位点和所述第一目的基因组座位具有不同的基因组插入位点。
以下实例以说明性方式而不是以限制性方式提供。
实验
实例1
包含用于位点特异性整合(ssi)的转基因靶位点的玉米文库的产生
如下所述针对玉米开发了一种产生一大批转基因植物或者包含用于位点特异性重组(SSI)的多个转基因靶位点(TTS)中的任一者的植物、种子或植物细胞的“文库”的方法。
SSI平台II载体的开发
使用Komari等人，1996中描述的原始共整合土壤杆菌双元系统的衍生构建体开发了用于玉米的土壤杆菌转化的载体。这些载体携带必要的分子元件以使得能基于来自酵母的FLP/FRT系统进行位点特异性整合(SSI)。将具有FRT位点以利于重组酶介导的盒交换(Recombinase Mediated Cassette Exchange，RMCE)(Seibler和Bode，1997)的土壤杆菌构建体命名为SSI平台II载体。除了FRT位点，SSI平台II载体的中间体包括多克隆位点或用于克隆的Invitrogen^TM目的位点以有效地引入供转化的性状基因(图2)。SSI平台II载体的另一特征是包括处于引入性状基因的区域的旁侧的loxP位点以允许在需要时利用cre/lox切除来移除性状基因。 包括在SSI平台II载体中的元件允许在转基因靶位点(TTS)将新的基因或多个基因添加至现有的基因，包括例如采用FRT1和FRT87。如果将cre/lox切除与新基因的SSI引入联合使用，则可在转基因靶位点处对现有基因进行有效置换。SSI平台II载体可用于在转基因靶位点上设置值以及为修饰被认为具有高价值的转基因靶位点的基因内容提供的灵活性。
SSI平台II载体的一个通用特征是设置FRT位点，FRT位点建立了基因俘获构造(gene-trapping configuration)。FRT1位点设置在启动子(例如玉蜀黍泛素启动子UBIZMPRO，如图2中所示)与玉蜀黍密码子优化的草胺膦乙酰转移酶的编码区(MO-PAT，PHP35557，图2A)或磷酸甘露糖异构酶(PMI，PHP44290，图2B)选择标记基因之间。FRT87位点设置在SSI平台II载体的SSI区中的最后的选择标记基因的终止子序列(例如PIN II终止子(PINII TERM)或钙花叶病毒35S终止子(CAMV35S TERM)，如图2A中所示)的下游(3′)。一些载体包含第二选择标记，如FRT1与FRT87之间的MO-PAT，其由水稻(Oryza sativa)肌动蛋白启动子(OS-ACTIN PRO，图2B)驱动。在引入未包括在靶位点中并且以与针对SSI平台II载体所述相同的方式含有处于编码序列上游的FRT1位点的具有无启动子选择标记基因的DNA序列后，重组插入恢复。该无启动子标记构建体(称为SSI供体构建体)通过基因枪方法引入进具有转基因靶位点的细胞中。在成功RMCE后，初始的靶位点标记(MO-PAT、PMI)不再表达，并且新引入的来自供体构建体的标记因为在FRT1处的重组和在基因俘获物上游捕获启动子而得以表达(参见美国专利No.7,102,055)。选择标记和可视标记二者均可用于该俘获物中以指示成功的位点特异性整合。
在选择标记基因或处于左T-DNA边界(LB)区的基因周围包括FRT1位点和FRT87位点的构建体中间体在图2中示出。为了简洁起见仅示出了该构建体的T-DNA区。PHP35557是pSB11样载体(Komari等人，1996)的衍生物，其中在形成最终的共整合构建体之前添加性状基因。PHP44290是pSB1样中间体与pSB11样中间体(Komari等人，1996)之间的共整合产物，并且Invitrogen^TM目的位点被用于供经由克隆进行基因引入的位点中(图2)。一种SSI平台II载体(PHP44556)的例子在图3中示出。产生了大量的相关构建体，所述构建体不同之处在于基因数目、基因活性、基因序列、启动子、转录终止元件、基因相对于彼此的取向以及 基因在loxP位点之间的位置。将每个新的构建体用于制备多株玉米转化株(n＝20至100)，每株转化株具有独特的转基因靶位点。基于SSI平台II的该转化工作的结果是玉米中的大量的转基因靶位点，其携带元件以有利于位点特异性整合和/或性状基因切除并因而具有供基因添加或基因置换的能力。
玉米SSI文库的开发
转基因植物的第一群体使用玉蜀黍近交系(Maize Inbred line1，MI1)生成并且涉及构建自SSI平台II的16种构建体。这些构建体全部在T-DNA区中与图2中所示的两个构建体中的一个或另一个相同，不同的是loxP位点之间的基因中的计划变异。
通过如(Djukanovic等人，2006)中所述的改良的土壤杆菌介导的转化程序，用这些构建体转化玉米未成熟胚。从经灭菌的籽粒切取8到10天的胚并置于液体培养基(4.0g/I N6基础盐(Sigma C-1416)、1.0ml/l Eriksson维生素混合物(Sigma E-1511)、1.0mg/l盐酸硫胺素、1.5mg/l2，4D、0.690g/l L-脯氨酸、68.5g/l蔗糖、36g/l葡萄糖，pH5.2)中。在收集胚后，将培养基替换为1ml的土壤杆菌悬浮液，该悬浮液的浓度为在550nm光学密度为0.175-0.45。在室温下温育五分钟后，将胚悬浮液倾倒于装有4.0g/l N6基础盐(Sigma C-1416)、1.0ml/l Eriksson维生素混合物(Sigma E-1511)、1.0mg/l盐酸硫胺素、1.5mg/l2，4D、0.690g/l L-脯氨酸、30.0g/l蔗糖、0.85mg/l硝酸银、0.1nM乙酰丁香酮、3.0g/l Gelrite，pH5.8的板上。将胚于暗处21℃下温育3-5天，然后在新的板上于暗处28℃下温育3-7天，该新板装有4.0g/l N6基础盐(Sigma C-1416)、1.0ml/l Eriksson维生素混合物(Sigma E-1511)、1.0mg/l盐酸硫胺素、1.5mg/l2，4D、0.690g/l L-脯氨酸、30.0g/l蔗糖、0.5g/l MES、0.85mg/l硝酸银、100mg/l羧苄青霉素、9.0g/l琼脂，pH5.8。然后将胚转移至新的板上3-4周，该新板装有4.0g/l N6基础盐(Sigma C-1416)、1.0ml/l Eriksson维生素混合物(Sigma E-1511)、1.0mg/l盐酸硫胺素、1.5mg/l2，4D、0.690g/l L-脯氨酸、30.0g/l蔗糖、0.5g/l MES、0.85mg/l硝酸银、1.5mg/l双丙氨磷、100mg/l羧苄青霉素、6.0g/l琼脂，pH5.8。在第一选择培养基上3-4周后，将胚在4.0g/l N6基础盐(Sigma C-1416)、1.0ml/l Eriksson维生素混合物(Sigma E-1511)、1.0mg/l盐酸硫胺素、1.5mg/l2，4D、0.690g/l L-脯氨酸、30.0g/l蔗糖、0.5g/l MES、0.85mg/l硝酸银、 3mg/l双丙氨磷(用于moPAT选择)、100mg/l羧苄青霉素、6.0g/l琼脂，pH5.8上每2-4周进行分培直至鉴定到转基因事件。通过将小的组织部分转移至成熟培养基上来诱导再生，该培养基含有4.3g/l MS盐(Gibco11117：纽约格兰德岛(Grand Island，NY)，Gibco公司)、5.0ml/l MS维生素母液、100mg/l肌醇、0.1μM ABA、0.5mg/l玉米素、1mg/l IAA、60.0g/l蔗糖、3.0mg/l双丙氨磷、100mg/l羧苄青霉素、6.0g/l琼脂，pH5.6)。将板于暗处28℃下温育二周。将体细胞胚转移至含有4.3g/l MS盐(Gibco11117：纽约格兰德岛Gibco公司)、5.0ml/l MS维生素母液、100mg/L肌醇、40.0g/l蔗糖、3.0mg/l双丙氨磷、6.0g/l琼脂，pH5.6的培养基上，并在人造光下于28℃温育。一周后，将小植株移进装有相同培养基的玻璃管中并培养直至对它们进行采样和/或将它们移栽至土壤。
在使用玉蜀黍近交系1和相对有限数目的具有可用的旁侧序列数据的插入物进行探索性工作后，选择另一种玉蜀黍近交系(玉蜀黍近交系2，MI2)来继续和扩展该工作。因为相较于玉蜀黍近交系1有优越的遗传学特性以及相当的转化效率的组合而选取MI2。大量的具有旁侧序列数据的玉蜀黍近交系2转基因靶位点的集合是主要的目标。用于开发该新转基因靶位点集合的构建体和分子方法类似于MI1，但是转化方法有变动，尤其是在组织培养基的配方方面。用于MI2的组织培养方法可见于Cho，M-J等人，2011(US20110165561)，更多细节见于Wu，X.E.等人(US20100192253)。类似的方法用于这两种玉蜀黍近交系以回收转基因植物至温室、采样和下游处理。
针对T-DNA拷贝数以及针对转基因靶位点基因组旁侧序列对转基因植株(靶株系)进行分析。将实时定量PCR(qPCR)用于评估T-DNA的拷贝数。高品质的转基因靶位点定义为以单拷贝存在于转基因植物中的转基因靶位点以及不包括超出T-DNA左边界或右边界(RB、LB)的来自土壤杆菌载体的额外序列的转基因靶位点。针对每个构建体的T-DNA边界内的每个基因开发了一种特异性、独立的qPCR测定法。此外，将多个qPCR测定法用于检测土壤杆菌构建体在T-DNA边界之外的独特序列(通常称为载体骨架序列)。如果根据qPCR分析T-DNA内的所有基因被评定为单拷贝并且未检测到载体骨架序列，则该转基因靶位点被描述为单拷贝转基因靶位点(单拷贝插入)。将具有单拷贝转基因靶位点的那些转基因植物继续在 温室里培养并用于进一步分析。来自玉米SSI文库的每个独立的单拷贝转基因靶位点视为独特的实体和用于位点特异性整合的潜在候选物。
将含有单拷贝T-DNA插入的转基因植物作为第一或第二代转基因植物进行采样供旁侧序列分析以便开始对转基因靶位点的进一步表征。从每株植物取多份叶样品并汇集以供DNA提取。通过使用Omega Bioteck E-Z96植物DNA试剂盒按照制造商的推荐提取DNA。通过反向PCR(IPCR)或连接介导的巢式PCR(LMnPCR)(图4)进行旁侧序列分析，然后对PCR产物进行测序。对于这两种方法二者，设计位点特异性引物来扩增正好T-DNA RB和LB内侧。如果使用IPCR，则用4-8种不同的在接近外侧引物结合位点的T-DNA序列中切割一次的限制酶消化基因组DNA样品。所述酶可在处于转基因靶位点之外但邻近转基因靶位点的基因组序列中的未知位点以及基因组中的许多其他位点切割一次。然后将在每个末端具有类似限制性切割的DNA片段置于连接反应中以获得自身连接而生成由T-DNA的一部分和一段基因组DNA组成的小DNA环。用在该小环的T-DNA序列的每个末端处设计的向外引物进行巢式PCR。PCR可扩增含有T-DNA的末端和转基因靶位点的邻接基因组序列(旁侧序列)的产物。将小体积的PCR产物用ExoSAP处理以清除剩余的引物和dNTP，然后使用桑格法对净化的扩增子进行测序。如果使用LMnPCR方法，则将基因组DNA机械剪切成较小的片段并使用具有3′至5′外切核酸酶活性的Klenow片段将片段的末端转化为平末端。接着将片段通过在3′末端添加dA尾来进行加工以防止平末端片段连接，并提供互补的悬突端供衔接子连接至片段。如果使用桑格法对扩增子进行测序，则将衔接子连接至片段上并用衔接子特异性引物和针对T-DNA边界序列设计的引物进行巢式PCR。如果使用Solexa法对扩增子进行测序，则将索引衔接子(indexed adapter)连接至DNA片段的末端供混合扩增子测序(pooled amplicon sequencing)并使用DNA特异性芯片在2100Bioanalyzer上运行以检验产物的大小和浓度。通过仅使用其中在各个单独的碱基判定(base call)中置信度高的最佳质量的读出结果，将来自Solexa的序列结果进行去卷积、比较和评价。将完成的序列数据用于针对整个玉蜀黍基因组序列进行BLAST分析。该方法预测了转基因靶位点位于10个玉米染色体中哪个染色体上以及来自染色体的该区域的相关数据，如转基因靶序列供SSI的遗传位置和该位置处的标记。并不是全部样品都能 够以该方式解析，但在第一轮分析后根据来自T-DNA边界中的至少一者的序列数据，全部样品的大约70％能够被分配到给特定的染色体(表1A和1B)。通过详细的BLAST分析，一部分转基因靶位点被预测为间断内源基因。间断内源基因的转基因靶位点被视为不期望的并弃去。将来自包含其余的转基因靶位点的事件的种子作为种子保持于可在需要时容易存取的集合中。给予该集合的初期名称为“插入位点文库”，其是指相对大量的经表征的样品、涵盖全部10个玉蜀黍染色体的转基因靶位点分布以及允许我们按需通达玉蜀黍基因组中的特定位点的后续的种子集合。
表1A：玉蜀黍近交系1的样品数目和旁侧序列结果