一种油茶皂苷化合物、其制备方法、应用及其制备的抗肿瘤药物.pdf

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1、10申请公布号CN104059123A43申请公布日20140924CN104059123A21申请号201410043589322申请日20140130C07J63/00200601C07H15/256200601C07H1/08200601A61K31/704200601A61P35/0020060171申请人苏州大学地址215123江苏省苏州市工业园区仁爱路199号72发明人许琼明杨世林李夏刘艳丽李笑然陈重74专利代理机构北京集佳知识产权代理有限公司11227代理人常亮54发明名称一种油茶皂苷化合物、其制备方法、应用及其制备的抗肿瘤药物57摘要本发明属于药物化学技术领域，公开了一种油茶皂。

2、苷化合物、其制备方法和应用。该油茶皂苷化合物具有式I所示结构。该油茶皂苷化合物对肝癌细胞、乳腺癌细胞、黑素瘤细胞、肺癌细胞具有一定的抑制作用，且能够有效抑制肝肿瘤的生长，说明该油茶皂苷化合物具有显著的抗肿瘤活性，能够应用于制备抗肿瘤药物，51INTCL权利要求书2页说明书20页附图9页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书20页附图9页10申请公布号CN104059123ACN104059123A1/2页21一种油茶皂苷化合物，其特征在于，具有式I所示结构2一种油茶皂苷化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤步骤1获得油茶总皂苷提取物；步骤2取所述油茶总皂苷提取。

3、物，经分离纯化，即得。3根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1具体为取油茶根粉碎后，经提取，得提取液；取所述提取液经浓缩，得流浸膏；取所述流浸膏与水混合，过滤，收集滤液；取所述滤液经大孔树脂分离，以乙醇水混合液洗脱，收集体积比为7030955的乙醇水混合液洗脱组分，得所述油茶总皂苷提取物。4根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤2具体为取所述油茶总皂苷提取物，经减压硅胶色谱柱分离，以氯仿甲醇混合液洗脱，收集体积比为80206040的氯仿甲醇混合液洗脱组分，得第一次纯化物；取所述第一次纯化物经中压反相十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱分离，以甲醇水混合液洗脱，收集体积比为7030901。

4、0的甲醇水混合液洗脱组分，得第二次纯化物；取所述第二次纯化物经动态轴向压缩色谱柱分离，以甲醇水混合液洗脱，收集体积比为7525的甲醇水混合液洗脱组分，得第三次纯化物；取所述第三次纯化物经半制备高效液相色谱柱分离，以甲醇水甲酸混合液洗脱，流速2ML/MIN，收集保留时间为525MIN所对应的洗脱组分，即得；所述甲醇水甲酸混合液为甲醇和水按体积比为7822组成的混合溶液再与占所述混合溶液质量百分含量为02的甲酸混合所得的混合液。5如权利要求2至4中任意一项所述的制备方法制得的油茶皂苷化合物。6如权利要求1或5所述的油茶皂苷化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。7根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述。

5、肿瘤为肝肿瘤、黑素瘤、乳腺肿瘤或肺肿瘤。8一种抗肿瘤药物，其特征在于，其包括如权利要求1或5所述的油茶皂苷化合物和药学上可接受的辅料。9根据权利要求8所述的抗肿瘤药物，其特征在于，其剂型为片剂、颗粒剂、胶囊剂、注权利要求书CN104059123A2/2页3射剂、乳剂或混悬剂。权利要求书CN104059123A1/20页4一种油茶皂苷化合物、其制备方法、应用及其制备的抗肿瘤药物技术领域0001本发明属于药物化学技术领域，特别涉及一种油茶皂苷化合物、其制备方法、应用及其制备的抗肿瘤药物。背景技术0002油茶CAMELLIAOLEIFERAABEL，又称为茶子树、茶油树、白花茶，系山茶科THEACE。

6、AE山茶属CAMELLIALINN常绿小乔木，主要分布于热带及亚热带地区。在我国，油茶产于西南部和东南部地区，遍布17个省区。油茶是重要的木本食用油料树种，与油橄榄、油棕、椰子并称“世界四大木本油料树种”。用油茶的种子榨油即获得茶油，茶油的不饱和脂肪酸含量高达90，其含量远远高于菜油、花生油和豆油；与橄榄油相比，其维生素E的含量高一倍，具有极高的营养价值。油茶还具有较高的药用价值，本草纲目中记载，茶籽，苦寒香毒皂素，主治喘急咳嗽，去疾垢；中华本草也有记载，油茶的根及其根皮具有清热解毒、理气止痛、活血消肿的功效，主治咽喉肿痛、胃痛、牙痛、跌打伤痛和水火烫伤。0003油茶药用部位主要有茶子心、茶油。

7、、油茶根、油茶根皮和油茶叶。从油茶中分离得到的化学成分包括皂苷类、黄酮类、鞣质类、芳香苷类和生物碱类。油茶皂苷又称为油茶皂素，是从油茶籽饼粕中提取出的一种皂类，主要存在于油茶种子、油茶叶、油茶根和油茶根皮中，现多用于日用化工、农药、医药、水产、建材等诸多领域。研究还发现，油茶皂苷具有山茶属植物皂苷的一般通性，味苦、辛辣、发泡特性强；也具有多种良好的生物活性，表现在许多方面，具有溶血作用、鱼毒作用、杀菌抗菌活性、抗炎、抗高血压、抗肿瘤、保护心血管系统、杀虫驱虫、促进植物生长等作用。油茶皂苷多为齐墩果烷型的五环三萜类皂苷，包括苷元、糖、有机酸三部分，但其苷元结构复杂、糖部分种类多和组合方式不同造成。

8、了油茶皂苷类化合物众多，对油茶皂苷的进一步纯化和分离提出了挑战。所以，目前尽管研究发现油茶总皂苷提取物具有抗肿瘤的活性，但是具体是其中哪个单体皂苷发挥的作用，还是未知的，需要对其进行深入的研究。发明内容0004有鉴于此，本发明的发明目的在于提供一种油茶皂苷化合物、其制备方法、应用及其制备的抗肿瘤药物。该油茶皂苷化合物具有显著的抗肿瘤活性，可以应用于制备抗肿瘤药物。0005为了实现本发明的发明目的，本发明采用如下技术方案0006本发明提供了一种油茶皂苷化合物，其具有式I所示结构0007说明书CN104059123A2/20页50008本发明还提供了一种油茶皂苷化合物的制备方法，包括以下步骤000。

9、9步骤1获得油茶总皂苷提取物；0010步骤2取步骤1所得油茶总皂苷提取物，经分离纯化，即得。0011优选地，本发明提供的制备方法中，步骤1具体为0012取油茶根粉碎后，经提取，得提取液；0013取所得提取液经浓缩，得流浸膏；0014取所得流浸膏与水混合，过滤，收集滤液；0015取所得滤液经大孔树脂分离，以乙醇水混合液洗脱，收集体积比为7030955的乙醇水混合液洗脱组分，得油茶总皂苷提取物。0016在本发明的一些实施例中，本发明提供的制备方法步骤1中提取所用的溶液为水或乙醇水混合液。0017在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法步骤1中提取所用的乙醇水混合液中，乙醇的体积百分含量为0。

10、195。0018在本发明的另外一些实施例中，以G/ML计，本发明提供的制备方法步骤1中粉碎的油茶根与提取所用溶液的质量体积比为1520。0019在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法步骤1中提取之前还包括浸渍过程，具体为取步骤1中粉碎的油茶根与提取所用的溶液混合，于3050条件下浸泡6H12H。0020在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法步骤1中浸渍、提取具体为0021取步骤1中粉碎的油茶根与水或乙醇水混合溶液混合，于3050条件下浸泡6H12H，经加热回流，过滤，收集滤液，得提取液。0022本发明提供的制备方法步骤1中的提取，可以通过一次加热回流进行提取，过滤，收集滤液。

11、，得提取液；也可以通过23次加热回流进行提取，分别收集每次加热回流所得提取液，合并每次加热回流所得的提取液，过滤，收集滤液，得提取液。0023在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法步骤1中流浸膏与水的质量比为1520。0024在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法步骤1具体为说明书CN104059123A3/20页60025取油茶根粉碎；以G/ML计，取粉碎的油茶根与水或乙醇水混合溶液按质量体积比1520混合，于3050条件下浸泡6H12H，经加热回流1次3次后，合并每次加热回流所得的提取液，过滤，收集滤液，得提取液。取所得提取液经浓缩，得流浸膏。取所得流浸膏与水按质量比1。

12、520混合，100目300目过滤，收集滤液；将所得滤液离心后，取上清液经D101型大孔树脂分离，依次用水、乙醇体积百分含量为3060的乙醇水混合液、乙醇体积百分含量为7095的乙醇水混合液进行洗脱，收集乙醇体积百分含量为7095乙醇水混合液洗脱组分，得油茶总皂苷提取物。0026优选地，本发明提供的制备方法中，步骤2具体为0027取步骤1所得油茶总皂苷提取物，经减压硅胶色谱柱分离，以氯仿甲醇混合液洗脱，收集体积比为80206040的氯仿甲醇混合液洗脱组分，得第一次纯化物；0028取所得第一次纯化物经中压反相十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱分离，以甲醇水混合液洗脱，收集体积比为70309010的甲醇水混。

13、合液洗脱组分，得第二次纯化物；0029取所得第二次纯化物经动态轴向压缩色谱柱分离，以甲醇水混合液洗脱，收集体积比为7525的甲醇水混合液洗脱组分，得第三次纯化物；0030取所得第三次纯化物经半制备高效液相色谱柱分离，以甲醇水甲酸混合液洗脱，流速2ML/MIN，收集保留时间为525MIN所对应的洗脱组分，即得；十八烷基硅烷半制备色谱柱（C18半制备色谱柱）250MM10MM，5M。0031甲醇水甲酸混合液为甲醇和水按体积比为7822组成的混合溶液再与占所得混合溶液质量百分含量为02的甲酸混合所得的混合液。0032在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法步骤2中所用到的减压硅胶色谱柱中的硅。

14、胶的粒径为60目100目。0033在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法步骤2中减压硅胶色谱分离时，氯仿甲醇混合洗脱为梯度洗脱，洗脱梯度具体为氯仿和甲醇的体积比为90108020703060405050406030702080。0034在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法步骤2中所用到的中压反相十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱的流速为25ML/MIN。0035在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法步骤2中中压反相十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱分离时，甲醇水混合液洗脱为梯度洗脱，洗脱梯度具体为甲醇和水的体积比为505060407030802090101000。0036在本发。

15、明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法步骤2中所用到的动态轴向压缩色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱。0037在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法步骤2中动态轴向压缩色谱柱分离时，甲醇水混合液洗脱为梯度洗脱，洗脱梯度具体为6040752580209010。0038在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法步骤2中所用到的动态轴向压缩色谱柱的流速为150ML/MIN。0039在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法中所用到的半制备高效液相色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶半制备高效液相色谱柱。0040优选地，本发明提供的制备方法步骤2半制备高效液相色谱柱分离后还包括蒸说明。

16、书CN104059123A4/20页7馏，干燥步骤，具体为取半制备高效液相色谱柱分离所得洗脱组分进行蒸馏，干燥，即得。0041在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法中步骤2具体为0042取步骤1所得油茶总皂苷提取物，经减压硅胶柱，以氯仿甲醇系统进行梯度洗脱，洗脱梯度为氯仿和甲醇的体积比为90108020703060405050406030702080，分别收集，合并体积比为8020，7030和6040的氯仿甲醇混合液洗脱组分，得第一次纯化物；0043取所得第一次纯化物经中压反相十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱分离，以甲醇水系统进行梯度洗脱，洗脱梯度为甲醇和水的体积比为50506040703。

17、0802090101000，流速25ML/MIN，分别收集，合并体积比为7030，8020，9010的甲醇水混合液洗脱组分，得第二次纯化物；0044取所得第二次纯化物经动态轴向压缩色谱柱分离，以不同体积比的甲醇水混合液进行梯度洗脱，洗脱梯度为甲醇和水的体积比为6040752580209010，流速为150ML/MIN，收集体积比为7525的甲醇水混合液洗脱组分，得第三次纯化物；0045取所得第三次纯化物经十八烷基硅烷键合硅胶半制备高效液相色谱柱分离，以甲醇水甲酸混合液洗脱，流速2ML/MIN，收集保留时间为525MIN所对应的洗脱组分，将所得洗脱组分进行蒸馏、干燥，得白色不定形粉末状物质，即得。

18、；0046其中，甲醇水甲酸混合液为甲醇和水按体积比为7822组成的混合溶液再与占所得混合溶液质量百分含量为02的甲酸混合所得的混合液。0047本发明还提供了一种油茶皂苷化合物，该油茶皂苷化合物的制备方法包括以下步骤0048步骤1获得油茶总皂苷提取物；0049步骤2取步骤1所得油茶总皂苷提取物，经分离纯化，即得。0050本发明还提供了一种油茶皂苷化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，该油茶皂苷化合物具有式I所示结构，00510052该油茶皂苷化合物的制备方法包括以下步骤0053步骤1获得油茶总皂苷提取物；说明书CN104059123A5/20页80054步骤2取步骤1所得油茶总皂苷提取物，经分离纯化，。

19、即得。0055在本发明的一些实施例中，本发明提供的应用所针对的肿瘤为肝肿瘤、黑素瘤、乳腺肿瘤或肺肿瘤。0056本发明还提供了一种抗肿瘤药物，其包括本发明提供的油茶皂苷化合物和药学上可接受的辅料，该油茶皂苷化合物具有式I所示结构，00570058该油茶皂苷化合物的制备方法包括以下步骤0059步骤1获得油茶总皂苷提取物；0060步骤2取步骤1所得油茶总皂苷提取物，经分离纯化，即得。0061优选地，本发明提供的一种抗肿瘤药物的剂型为片剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂、乳剂或混悬剂。0062本发明提供了一种油茶皂苷化合物、其制备方法、应用及其制备的抗肿瘤药物。该油茶皂苷化合物具有式I所示结构。体外细胞实验结。

20、果证实该油茶皂苷化合物对肝癌细胞、乳腺癌细胞、黑素瘤细胞、肺癌细胞具有一定的抑制作用；体内实验结果证实该油茶皂苷化合物对肝肿瘤具有显著的抑制作用，可以有效抑制肝肿瘤的生长，说明该油茶皂苷化合物具有显著的抗肿瘤活性，可以应用于制备抗肿瘤药物，0063说明书CN104059123A6/20页9附图说明0064图1示实施例1制得的油茶皂苷化合物的高分辨质谱谱图；0065图2示实施例1制得的油茶皂苷化合物的核磁共振氢谱图；0066图3示实施例1制得的油茶皂苷化合物的核磁共振氢谱图局部放大图；0067图4示实施例1制得的油茶皂苷化合物的核磁共振氢谱图局部放大图；0068图5示实施例1制得的油茶皂苷化合物。

21、的核磁共振碳谱图；0069图6示实施例1制得的油茶皂苷化合物的核磁共振碳谱图局部放大图；0070图7示实施例1制得的油茶皂苷化合物的DEPT谱图；0071图8示实施例1制得的油茶皂苷化合物的HSQC谱图；0072图9示实施例1制得的油茶皂苷化合物的HMBC谱图；0073图10示实施例1制得的油茶皂苷化合物的HHCOSY谱图；0074图11示实施例1制得的油茶皂苷化合物的NOESY谱图。具体实施方式0075本发明公开了一种油茶皂苷化合物、其制备方法、应用及其制备的抗肿瘤药物。本领域技术人员可以参考本文内容，获得该油茶皂苷化合物，实现其应用，特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来。

22、说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的制备方法及应用已经通过较佳的实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文制备方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。0076本发明提供的一种油茶皂苷化合物、其制备方法、应用及其制备的抗肿瘤药物中所用到的试剂和原料均可由市场购得。本发明实施例中所用到的某些仪器的型号和生产厂家如下0077化学试剂分析纯，国药集团化学试剂有限公司；电子天平梅特勒托利多仪器（上海）有限公司；旋光仪241PERKINELMERINC,WALTHAM,MA,美国；旋转蒸发仪东京理化器械独资工厂；薄层色谱硅胶板HSGF254，。

23、烟台市芝罘黄务硅胶开发试验厂出品；各种柱色谱用硅胶均为青岛海洋化工厂出品；核磁共振仪500HZVARIANINC,PALOALTO,CA,说明书CN104059123A7/20页10美国；高分辨质谱QTOF2MICROMASS公司，英国；半制备高效液相色谱仪LC20AT，SPD20A，日本岛津公司；中压反相十八烷基硅烷制备液相色谱BCHI色谱系统，C650泵，中压柱460MM26MMID,BCHICORP,FLAWIL,SWISS动态轴向柱色谱NP7000泵NEWSTYLE,NU3000UVVIS检测器NEWSTYLE和十八烷基硅烷柱650MM100MM,30M,1500GNEWSTYLE；十。

24、八烷基硅烷半制备色谱柱（C18半制备色谱柱）250MM10MM，5M，美国KROMSIL公司。0078为了使本技术领域的技术人员能够更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例，进一步阐述本发明0079实施例1具有式I所示结构的油茶皂苷化合物的制备0080提取0081取干燥的油茶根2000G，用粉碎机粉碎成木屑，加入300L体积百分比为70的乙醇水溶液，40条件下浸泡12H后，加热至回流，提取30H，收集提取液，将提取液过滤，减压浓缩，得流浸膏618G。0082大孔树脂富集0083取提取步骤所得的流浸膏，加入60L水，搅拌溶解，用100目滤布过滤，将滤液12000R/MIN离心10MIN，离心后。

25、，得58L上清液，取上清液经D101型大孔树脂进一步分离，依次用100L水、150L30乙醇水溶液、150L70乙醇水溶液进行洗脱，收集70乙醇水溶液洗脱组分，减压浓缩，经检测，所得浓缩液中含有油茶皂苷类化合物，经烘箱100,48H干燥,得褐色浸膏51G,命名为油茶总皂苷提取物。0084第一次纯化物的制备0085取大孔树脂富集所得的油茶总皂苷提取物，经减压硅胶柱（硅胶60100目）分离，以氯仿甲醇系统进行梯度洗脱，洗脱梯度为氯仿和甲醇的体积比为90108020703060405050406030702080，每个梯度1000ML；分别收集每个洗脱组分，并一一标号。将所得洗脱液进行薄层板分析薄层。

26、色谱硅胶板，BAW系统，RF值0407。经检测，以下洗脱组分含有的成分相似8020的氯仿甲醇溶液洗脱组分，7030的氯仿甲醇溶液洗脱组分，6040的氯仿甲醇溶液洗脱组分。合并8020的氯仿甲醇溶液洗脱组分，7030的氯仿甲醇溶液洗脱组分和6040的氯仿甲醇溶液洗脱组分，减压蒸干,即得第一次纯化物155G。0086第二次纯化物的制备0087取所得第一次纯化物，经中压反相十八烷基硅烷制备液相色谱进行分离，以甲醇水系统进行梯度洗脱，洗脱梯度为甲醇和水的体积比为505060407030802090101000，每个梯度1000ML，流速25ML/MIN，检测波长203NM。分段收集洗脱组分，得六个洗脱。

27、组分，一一标记。取洗脱梯度为6040，7030，8020，9010所对应的洗脱组分进行高效分析液相色谱分析，结果表明，洗脱梯度7030，8020，9010所对应的洗脱组分中含有的成分相似（高效分析液相色谱时间为30MIN，检测峰位于20MIN28MIN之间），合并洗脱梯度所对应的洗脱组分，减压浓缩,即得第二次纯化物20ML。0088第三次纯化物的制备0089取第二次纯化物，经动态轴向柱色谱进行分离流速150ML/MIN，检测波长203NM，以体积百分比计，依次用60、75、80和90甲醇水溶液进行洗脱，每个梯度说明书CN104059123A108/20页113000ML，分别收集，得五个洗脱组。

28、分，一一标记。将所得洗脱组分分别经高效分析液相色谱分析（检测峰位于135MIN150MIN之间），收集75洗脱组分（即体积比为7525的甲醇水混合液洗脱组分，高效液相检测峰位于135MIN），减压浓缩,即得第三次纯化物15ML。0090白色不定形粉末状物质的制备0091取第三次纯化物，经C18半制备色谱柱（250MM10MM，5M）进行分离（流速2ML/MIN，检测波长203NM），以甲醇水甲酸混合液（甲醇和水按体积比为7822组成的混合溶液再与占所得混合溶液质量百分含量为02的甲酸混合所得的混合液）进行洗脱，收集525MIN处色谱峰，将所得洗脱组分进行减压浓缩、干燥，得48MG白色不定形粉末。

29、状物质。0092化合物结构鉴定0093将所得白色不定形粉末状物质进行薄层层析、醋酐浓硫酸反应、MOLISH反应鉴定，鉴定结果为薄层层析硫酸乙醇显色结果为紫红色斑点，醋酐浓硫酸反应阳性，MOLISH反应阳性，提示该物质可能为皂苷类化合物。该物质的高分辨质谱谱图见图1，该质谱谱图中的准离子峰M/Z13296129MH，与分子式C64H98O29分子量的计算值MH,M/Z13296116，基本一致，表明该化合物的分子式为C64H98O29。用2NTFA完全酸水解得到单糖，将所得单糖经衍生化后进行GC分析，检测到D葡萄糖醛酸甲酯、D半乳糖、D木糖的存在。0094将所得白色不定形粉末状物质进行核磁共振氢。

30、谱检测、核磁共振碳谱检测和二维核磁共振谱检测。该白色不定形粉末状物质的核磁共振氢谱谱图见图2、图3和图4，其中图3和图4为该物质核磁共振氢谱的局部放大图。该白色不定形粉末状物质的核磁共振碳谱谱图见图5和图6，图6为该物质核磁共振碳谱的局部放大图。该白色不定形粉末状物质的DEPT谱图见图7。该白色不定形粉末状物质的HSQC谱图见图8。该白色不定形粉末状物质的HMBC谱图见图9。该白色不定形粉末状物质的HHCOSY图谱见图10。该白色不定形粉末状物质的NOESY图谱见图11。该白色不定形粉末状物质的核磁共振谱图数据见表1。0095表1白色不定形粉末状物质的核磁共振数据0096POSITIONHCP。

31、OSITIONHC1099M,152M39122OANG2191M,219M262116843410DD110,458452129244363588DQ75,1513675185M4744205D751586112M,150M1875183S2117206M,210M365GLCA84171484D10010419147M4742455M781103713435M85011185M,198M2424457M69812558BRS12565418M7721314396170014479OCH337852315427BRS677GAL16451BRS7321574D1001018说明书CN1040。

32、59123A119/20页120097174862457M84018316M4103435M75219152M,316M4694459M707203655439M76621679D1057886443M445M61922640D105733XYL,23995BRS6441512D75107924152S1192429M76525090S1663413M78526105S1784442M71027190S2145359M,453M67828360D110631GAL384D1101586D75103229119S2962451M73930142S2043445M75521OANG4446M706。

33、116755453M765212906455M,457M6233605DQ75,1513764217D751605210S2140098注表中化学位移以PPM为单位，偶合常数（J）以HZ为单位。0099根据所得核磁共振谱图和数据对该白色不定形粉末状物质进行进一步的结构解析0100该白色不定形粉末状物质的13CNMR谱数据共显示64个碳信号，通过DEPT和HSQC谱分析该化合物共含有11个甲基碳，12个亚甲基碳，31个次甲基碳以及10个季碳。进一步分析13CNMR谱，该谱图显示出四个糖端基碳信号1041,1018,1079和1032，分别是D葡萄糖醛酸甲酯、D半乳糖、D木糖以及另外一个D半乳糖的。

34、端基碳。此外，还有一个位于低场区2100的醛基碳信号。该白色不定形粉末状物质的1HNMR谱中高场区有六个明显的三萜皂苷角甲基氢信号090ME25,105ME26,119ME29,142ME30,152ME24和190ME27；一个连氧亚甲基360H28,D,J110HZ和384H28,D,J110HZ；五个连氧次甲基4101H,DD,J110,45HZ,H3,4271H,BRS,H15,4511H,BRS,H16,6791H,D,J105HZ,H21和6401H,D,J105HZ,H22；一个烯氢质子5581H,BRS,H12以及一个醛基氢质子9951H,BRS,H23。此外，该白色不定形粉末。

35、状物质的1HNMR谱还显示出两组当归酰基信号6051H,DQ,J75,15HZ,21OANG3,2173H,D,J75HZ,21OANG4和2103H,S,21OANG5；5881H,DQ,J75,15HZ,22OANG3,2053H,D,J75HZ,22OANG4和1833H,S,22OANG5。0101HHCOSY谱图中，与连氧次甲基质子相邻的次甲基H4271H,BRS与H4511H,BRS相关,说明它们处在邻位且H451为H16信号，H427为H15信号；H6791H,D,J105HZ与H6401H,D,J105HZ间的相关信号说明它们处在邻位且H679为H21信号，H640为H22信号。

36、。0102对该白色不定形粉末状物质HMBC谱图进行分析得知两个当归酰基分别连说明书CN104059123A1210/20页13在该化合物的21，22位上，因为在HMBC谱图中H6791H,D,J105HZ,H21与C167521OANG1相关，H6401H,D,J105HZ,H22与C168422OANG1相关。结合13CNMR谱和1HNMR谱数据进行综合分析，并且与已知苷元21,22ODIANGELOYL3,15,16,28TETRAHYDROXYOLEAN12EN23AL（HELVETICACHIMICAACTA2013VOL96）核磁数据对比，两者数据基本一致，确定该化合物的苷元结构为2。

37、1,22O二当归酰基15,16,28三羟基齐墩果12烯23醛。0103对该白色不定形粉末状物质的HSQC谱图进行分析，归属了该皂苷上连接的糖的端基碳、氢信号，结果如下H4841H,D,J100HZ,5741H,D,J100HZ,5121H,D,J75HZ和5861H,D,J75HZ,分别连在C1041葡萄糖醛酸甲酯C1,1018半乳糖C1,1079木糖C1,1032半乳糖C1上。另外该化合物苷元3位向低场位约126PPM表明糖链连在苷元3位上，并且在HMBC谱图中，葡萄糖醛酸甲酯的端基质子H484与苷元3位C845相关，进一步证实了糖链连在苷元的3位。经查阅文献发现该化合物糖链与文献中报道的C。

38、AMELLIOSIDEH（BIOORGANICMEDICINALCHEMISTRYLETTERS2010,20,74357439）糖链数据相近，从而推断出该化合物糖链为D木糖12D半乳糖13D半乳糖12D葡萄糖醛酸甲酯。该糖链的连接顺序也可以通过分析HMBC谱图证实HMBC谱图中葡萄糖醛酸甲酯端基质子H484与苷元3位碳C845相关，半乳糖端基质子H574与葡萄糖醛酸甲酯3位碳C850相关，木糖端基质子H512与半乳糖2位碳C840相关，半乳糖2位氢H457与木糖端基碳C1079相关,另一个半乳糖端基质子H586与葡萄糖醛酸甲酯2位碳C781相关,葡萄糖醛酸甲酯2位氢H455与该半乳糖端基碳C。

39、1032相关。此外，四个糖的端基质子偶合常数3JH1,H2较大，表明这四个糖都为构型。0104NOESY谱图中，H6791H,D,J105HZ,H21与H1193H,S,H29相关，提示H21为构型；H4101H,DD,J45,110HZ,H3与H9953H,BRS,H23相关，提示H3为构型；H4511H,BRS,H16与H3601H,D,J110HZ,H28、3841H,D,J110HZ,H28相关，提示H16为构型,H6401H,D,J105HZ,H22与H1423H,S,H30相关，提示H22为构型。0105因此，该化合物具有式I所示结构，0106说明书CN104059123A1311。

40、/20页140107将该化合物命名为21,22O二当归酰基15,16,28三羟基齐墩果12烯23醛3OD木糖12D半乳糖13D半乳糖12D葡萄糖醛酸甲酯苷。0108实施例2具有式I所示结构的油茶皂苷化合物的制备0109提取0110取干燥的油茶根2000G，用粉碎机粉碎成木屑，加入400L体积百分比为01的乙醇水溶液，50条件下浸泡12H后，加热至回流，提取三次，每次05H，收集所有提取液，将提取液过滤，减压浓缩，得流浸膏685G。0111大孔树脂富集0112取提取步骤获得的流浸膏，加入3425L水，搅拌溶解，用300目滤布过滤，将滤液12000R/MIN离心10MIN，离心后，得59L上清液，。

41、取上清液经D101型大孔树脂进一步分离，依次用100L水、150L60乙醇水溶液、100L95乙醇水溶液进行洗脱，收集95乙醇水溶液洗脱组分，减压浓缩，经检测，所得浓缩液中含有油茶皂苷类化合物，经烘箱100,48H干燥,得褐色浸膏51G,命名为油茶总皂苷提取物。0113第一次纯化物的制备0114取大孔树脂富集所得的油茶总皂苷提取物，经减压硅胶柱（硅胶6080目）分离，以氯仿甲醇系统进行梯度洗脱，洗脱梯度为氯仿和甲醇的体积比为90108020703060405050406030702080，每个梯度1000ML；分别收集每个洗脱组分，并一一标号。将所得洗脱液进行薄层板分析薄层色谱硅胶板，BAW系。

42、统，RF值0407。经检测，以下洗脱组分含有的成分相似8020的氯仿甲醇溶液洗脱组分，7030的氯仿甲醇溶液洗脱组分，6040的氯仿甲醇溶液洗脱组分。合并8020的氯仿甲醇溶液洗脱组分，7030的氯仿甲醇溶液洗脱组分和6040的氯仿甲醇溶液洗脱组分，减压蒸干,即得第一次纯化物122G。0115第二次纯化物的制备0116取所得第一次纯化物，经中压反相十八烷基硅烷制备液相色谱进行分离，以甲醇水系统进行梯度洗脱，洗脱梯度为甲醇和水的体积比为505060407030802090101000，每个梯度1000ML，流速25ML/MIN，检测波长203NM。分段收集洗脱组分，得六个洗脱组分，一一标记。取洗。

43、脱梯度为6040，7030，8020，9010所对应的洗脱组分进行高效分析液相色谱分析，结果表明，洗脱梯度7030，8020，9010所对应的洗脱组分中含有的成分相似（高效分析液相色谱时间为30MIN，检测峰位于20MIN28MIN之间），合并洗脱梯度所对应的洗脱组分，减压浓缩,即得第二次纯化物20ML。0117第三次纯化物的制备0118取第二次纯化物，经动态轴向柱色谱进行分离流速150ML/MIN，检测波长203NM，以体积百分比计，依次用60、75、80和90甲醇水溶液进行洗脱，每个梯度3000ML，分别收集，得五个洗脱组分，一一标记。将所得洗脱组分分别经高效分析液相色谱分析（检测峰位于1。

44、35MIN150MIN之间），收集75洗脱组分（即体积比为7525的甲醇水混合液洗脱组分，高效液相检测峰位于150MIN），即得第三次纯化物15ML。0119白色不定形粉末状物质的制备0120取第三次纯化物，经C18半制备色谱柱（250MM10MM，5M）进行分离（流速2ML/说明书CN104059123A1412/20页15MIN，检测波长203NM），以甲醇水甲酸混合液（甲醇和水按体积比为7822组成的混合溶液再与占所得混合溶液质量百分含量为02的甲酸混合所得的混合液）进行洗脱，收集525MIN处色谱峰，将所得洗脱组分进行减压浓缩、干燥，得39MG白色不定形粉末状物质。0121采用实施例1。

45、相同的化合物结构鉴定方法对本实施例制得的白色不定形粉末状物质进行结构鉴定，获得的高分辨质谱谱图、核磁共振氢谱、核磁共振碳谱、DEPT谱图、HSQC谱图、HMBC谱图、HHCOSY谱图、NOESY谱图与实施例1所得的相关谱图数据基本一致，结果显示该白色不定形粉末状物质为具有式I所示结构的化合物，01220123实施例3具有式I所示结构的油茶皂苷化合物的制备0124提取0125取干燥的油茶根2000G，用粉碎机粉碎成木屑，加入100L体积百分比为95的乙醇水溶液中30条件下浸泡10H后，加热至回流，提取两次，每次15H，收集所有提取液，将提取液过滤，减压浓缩，得流浸膏585G。0126大孔树脂富集。

46、0127取提取步骤获得的流浸膏，加入117L水，搅拌溶解，用200目滤布过滤，将滤液12000R/MIN离心10MIN，离心后，得57ML上清液，取上清液经D101型大孔树脂进一步分离，依次用100L水、150L40乙醇水溶液、150L75乙醇水溶液进行洗脱，收集75乙醇水溶液洗脱组分，减压浓缩，经检测，所得浓缩液中含有油茶皂苷类化合物，经烘箱100,48H干燥,得褐色浸膏52G,命名为油茶总皂苷提取物。0128第一次纯化物的制备0129取大孔树脂富集所得的油茶总皂苷提取物，经减压硅胶柱（硅胶60100目）分离，以氯仿甲醇系统进行梯度洗脱，洗脱梯度为氯仿和甲醇的体积比为901080207030。

47、60405050406030702080，每个梯度1000ML；分别收集每个洗脱组分，并一一标号。将所得洗脱液进行薄层板分析薄层色谱硅胶板，BAW系统，RF值0407。经检测，以下洗脱组分含有的成分相似8020的氯仿甲醇溶液洗脱组分，7030的氯仿甲醇溶液洗脱组分，6040的氯仿甲醇溶液洗脱组分。合并8020的氯仿甲醇溶液洗脱组分，7030的氯仿甲醇溶液洗脱组分和6040的氯仿甲醇溶液洗脱组分，减压蒸干,即得第一次纯化物165G。说明书CN104059123A1513/20页160130第二次纯化物的制备0131取所得第一次纯化物，经中压反相十八烷基硅烷制备液相色谱进行分离，以甲醇水系统进行梯。

48、度洗脱，洗脱梯度为甲醇和水的体积比为505060407030802090101000，每个梯度1000ML，流速25ML/MIN，检测波长203NM。分段收集洗脱组分，得六个洗脱组分，一一标记。取洗脱梯度为6040，7030，8020，9010所对应的洗脱组分进行高效分析液相色谱分析，结果表明，洗脱梯度7030，8020，9010所对应的洗脱组分中含有的成分相似（高效分析液相色谱时间为30MIN，检测峰位于20MIN28MIN之间），合并洗脱梯度所对应的洗脱组分，减压浓缩,即得第二次纯化物20ML。0132第三次纯化物的制备0133取第二次纯化物，经动态轴向柱色谱进行分离流速150ML/MIN。

49、，检测波长203NM，以体积百分比计，依次用60、75、80和90甲醇水溶液进行洗脱，每个梯度3000ML，分别收集，得五个洗脱组分，一一标记。将所得洗脱组分分别经高效分析液相色谱分析（检测峰位于135MIN150MIN之间），收集75洗脱组分（即体积比为7525的甲醇水混合液洗脱组分，高效液相检测峰位于145MIN），减压浓缩,即得第三次纯化物150ML。0134白色不定形粉末状物质的制备0135取第三次纯化物，经C18半制备色谱柱（250MM10MM，5M）进行分离（流速2ML/MIN，检测波长203NM），以甲醇水甲酸混合液（甲醇和水按体积比为7822组成的混合溶液再与占所得混合溶液质量百分含量为02的甲酸混合所得的混合液）进行洗脱，收集525MIN处色谱峰，将所得洗脱组分进行减压浓缩、干燥，得53MG白色不定形粉末状物质。0136采用实施例1相同的化。