防止血小板生成素(TPO)吸附的方法 及含TPO的稳定组合物 【发明背景】
1.发明领域
本发明涉及一种组合物，该组合物包含具有糖链部分的TPO蛋白，更具体地说，本发明涉及含TPO的稳定组合物，该组合物可有效地防止作为活性成分的TPO的损失或滴度降低，所述损失或滴定降低是由于容器壁的吸附或TPO间的缔合或聚合等引起的。本发明还涉及防止由容器壁吸附所引起的TPO滴度减少的方法，所述容器装有本发明的组合物。
2.相关技术的公开
人类TPO(血小板生成素)是作为细胞因子受体超家族的成员之一Mpl的配体而被克隆的一种蛋白(de Sauvage等，自然(伦敦)，369卷，533-565(1994)；Bartley，T.D.等，细胞，77卷，1117-1124(1994))。在患有血小板减少症的动物(如人，鼠，狗等)的血清和血浆中可检测到Mpl配体，已经证实该配体与巨核细胞和血小板的生成有关。
为了开发一种用于治疗血小板减少症的药剂，本发明人通过测定其刺激大鼠骨髓中高度纯化的巨核细胞祖细胞生成巨核细胞的活力，从患有血小板减少症的大鼠的血浆中提纯了大鼠TPO，并且成功地克隆了大鼠TPO的cDNA及基于部分氨基酸序列地人类TPO的cDNA，通过重组DNA技术获得了大量的同源人类TPO(H.Miyazaki等，实验血液学，22卷，838(1994))。这样获得的人类TPO的氨基酸序列与上面所提到的以人类Mpl配体得到的因子的序列一致(参见后文描述的SEQ ID NO：1)。
本发明人发现本发明的TPO对治疗血小板减少症是有效的，因为当将人类TPO施用给患血小板减少症的小鼠时，观察到抑制血小板减少的效果，增强血小板生成的效果和增加的造血功能，所述小鼠发生骨髓抑制，该抑制是由施用制癌剂或免疫抑制剂或放射线或BMT诱导的。
因为TPO的活性高，所以它可以极小量地应用，即它作为活性成分通常每天施用几次，剂量为0.05μg/kg体重-1mg/kg体重，优选0.5μg/kg体重-50μg/kg体重，依病情、性别和施用途径而不同。因此，有必要用极小量的TPO制备包含TPO的药物制剂，但是在这种情况下不可避免地出现因容器(例如小瓶、安瓿等)的吸附而引起TPO的滴度下降，以及滴注时制剂与输注液混合后TPO成分吸附于输注装置(瓶或管)而引起损失。
在这种情况下，本发明人研制了一种含TPO的稳定组合物，它可防止具有糖链部分的TPO蛋白的吸附，当制备TPO药物制剂或当它与输注液混合时，可达到防止TPO滴度降低的目的。结果，现在已发现给含有糖链部分的TPO蛋白添加药用蛋白，纤维素衍生物，表面活性剂或聚乙烯醇可达到这一效果。
发明概述
因此，依照本发明，为防止因容器壁吸附而引起TPO滴度减少提供了一种方法，所述容器装有包含具有糖链部分的TPO蛋白的组合物，该方法包括给组合物添加至少一种药用添加物，所述添加物选自蛋白，纤维素衍生物，表面活性剂和聚乙烯醇。
本发明还提供一种含TPO的组合物，它包含具有糖链部分的TPO蛋白及至少一种选自蛋白，纤维素衍生物，表面活性剂和聚乙烯醇的药用添加物。
附图简述
图1是ELISA测定的表明TPO(1-332)/CHO浓度与相应吸收值之间(450nm/650nm)关系的标准曲线。
图2表明当添加不同浓度的人血清白蛋白(HSA)时，TPO(1-332)/CHO的回收百分率随时间的变化。
发明详述
本发明的TPO可以用氨基酸序列为SEQ ID NO：1的多肽和糖链部分所组成的糖蛋白，只要产品是高纯度的分离的糖蛋白，其制备方法没有具体限制。本发明所应用的TPO也可以是这样一种糖蛋白，它包含多肽和糖链部分，只要能保持TPO活性，多肽的氨基酸序列在SEQ ID NO：1列出的氨基酸序列中可以有部分修改(通过替代、删除、插入和/或添加)，
换言之，也可应用氨基酸序列基本上为SEQ ID NO：1中所示的多肽与糖链部分组成的糖蛋白。术语“氨基酸序列基本上为SEQ ID NO：1所示”指除SEQ ID NO：1中的氨基酸序列外还包括SEQ ID NO：1中的氨基酸序列经部分替代，删除，插入和/或添加而形成的氨基酸序列，只要仍保持TPO活性即可。
已经发现即使SEQ ID NO：1中C末端的氨基酸序列缺失到第152位，或即使N末端的氨基酸残基缺失到第6位，重组的人TPO蛋白还保留TPO活性。具体数据如表1所示。
表1
衍生物 活性
位置1-231 +
位置1-211 +
位置1-191 +
位置1-171 +
位置1-163 +
位置1-157 +
位置1-156 +
位置1-155 +
位置1-154 +
位置1-153 +
位置1-151 +
位置1-150 -
位置7-163 +
位置8-163 -
位置13-231 -
因此，本发明的TPO蛋白是这样一种糖蛋白，它所包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：1中所示的7-151位的一致并且具有TPO活性。更具体而言，糖蛋白包括独立地具有糖链和SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列中1-231，1-211，1-191，1-171，1-163，1-157，1-156，1-155，1-154，1-153，1-151或7-163位的多肽链的糖蛋白。
本发明的TPO蛋白还包括这样一种糖蛋白，它包含多肽链和糖链，其多肽链中至少有一种上述SEQ ID NO：1中7-151序列内或外的氨基酸残基经过替代，删除，插入和/或添加，而TPO活性并没受到破坏。
本发明的TPO蛋白可包括这样的糖蛋白，其中SEQ ID NO：1中所示人类TPO氨基酸序列中，至少Ser1和Ala3被Ala和Val替代；或其中Arg25被Asn替代；或其中His33被Thr替代；或其中Arg25被Asn替代；Glu231被Lys替代；并且包括这样的糖蛋白，其中多肽Thr Ser Ile Gly Tyr ProTyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Val His His His His His His被加到上述糖蛋白的C末端。
本发明还包括这样的糖蛋白，它们在SEQ ID NO：1的序列中至少有下列氨基酸残基的缺失和/或添加，即，其中的His33被删除；或其中Gly116被删除；或其中Arg117被删除；或其中苏氨酸残基插在His33和Pro34间；或其中丙氨酸残基插在His33和Pro34间；或其中甘氨酸残基插在His33和Pro34间；或其中甘氨酸残基插在His33和Pro34间，且Pro38被Ser替代；或其中天冬酰胺残基插在Gly116和Arg117间；或其中丙氨酸残基插在Gly116和Arg117间；或其中甘氨酸残基插在Gly116和Arg117间。本发明TPO蛋白的实例还包括这样的糖蛋白，其中至少Leu129被Arg替代；或其中His133被Arg替代；或其中Met143被Arg替代；或其中Gly82被Leu代替；或其中Gly146被Leu替代；或其中Ser148被Pro替代；或其中Lys59被Arg替代；或其中Gln115被Arg替代。
本发明的TPO蛋白还包括这样的糖蛋白，其中甲硫氨酸和赖氨酸残基分别被加到具有SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列的人类TPO蛋白和上述衍生物的-2和-1位置；或其中甲硫氨酸残基连接于具有SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列的人类TPO蛋白和衍生物的-1位置。
优选地，本发明的TPO蛋白可这样获得：用含有它们的cDNA、染色体DNA或化学合成的DNA的重组载体转化宿主细胞，从宿主细胞中分离和纯化TPO蛋白。作为宿主，可应用真核细胞(例如来自酵母，昆虫或哺乳动物)。哺乳动物细胞的实例包括COS细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，X63.6.5 3.细胞，C-127细胞，BHK(幼仓鼠肾)细胞，人类细胞(如HeLa细胞)等。酵母的实例包括酿酒酵母，甲醇同化酵母(毕赤酵母)等。昆虫细胞的实例包括培养的蚕细胞(例如Sf21细胞)等。
在制备本发明的含TPO稳定组合物时所应用的添加物可以是蛋白，纤维素衍生物，表面活性剂，聚乙烯醇等。这些添加剂的种类不受具体限制，条件是它们能防止TPO吸附于由玻璃，树脂等(包括下面给出的材料)制成的容器、管(输液管)等。
至于蛋白，可以用人血清白蛋白、明胶、牛血清白蛋白、酪蛋白、胶原、人血清球蛋白等。
至于纤维素衍生物，可以用甲基纤维素，羟丙基纤维素，羟乙基纤维素等。
表面活性剂的实例包括聚氧乙烯氢化蓖麻油；聚氧乙烯蓖麻油；聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯，如吐温80，聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯(又名吐温20)等；聚氧乙烯聚氧丙烯甘醇，山梨糖醇酐脂肪酸酯，如山梨醇酐一油酸酯等；蔗糖脂肪酸酯，如蔗糖一月桂酸酯等；芳族季铵盐，如氯苄乙铵，氯苄烷铵等；辛酸钠；和亚硫酸钠。
当把含TPO的组合物制备成水溶液形式的时候，本发明中所应用的上述添加物的浓度范围为0.001％-10％，也希望每重量份的TPO蛋白(作活性成分)对应的添加物的范围为0.02-10000重量份。
此外，本发明含TPO的组合物也可包括稀释剂，助溶剂，抗菌剂，抗氧化剂，赋形剂，等渗剂等等，这依赖于制备组合物的目的。
本发明含TPO的稳定组合物可制备成剂量形式，如溶液剂，悬液剂，片剂，丸剂，胶囊剂，颗粒剂或冷冻干燥制剂，这依赖于各种用药途径，包括胃肠外施用(如注射)，经肺施用，经鼻施用和口服施用。本发明中所应用的TPO和添加物可制备成在开始时应共同存在于同一组合物中，或者可选地将TPO和添加物单独预配制，在应用时混合。
下面的试验和工作实施例对本发明作进一步说明。
实施例
下面的试验实施例中，TPO的酶免疫方法如下进行。
用抗人TPO的单克隆抗体进行酶联免疫吸附实验(FLLSA)
抗人TPO单克隆抗体(即，L3-1的亚克隆L3-1-54)是固相抗体，识别人TPO的HT-1区(与SEQ ID NO：1中所示8-28氨基酸序列一致)，在50mM碳酸盐缓冲液(pH9.2)中配成20μg/ml，96孔微滴度板(Nunc-Immuno Plate MaxiSorpTM，InterMed制，Ca.No.4-42404)中每孔50μl。当板在微板混合仪(ADVANTEC TS-96，东京，日本)上振荡时，固相抗体完全铺散在每孔的底部。用封底器(SUMILON制，Ca.NO.MS-30020)封板，37℃放置2小时，或4℃过夜，以吸附板上的固相抗体。接着用洗涤缓冲液(20mM Tris-HCl/0.5M NaCl/0.1％吐温20(pH 7.5))洗涤后，每孔加入300μl4×Block Ace(Dainippon Pharmaceuticals，日本，Ca.No.UK-B25)，用封板物封板，37℃放置1小时或4℃过夜。用洗涤缓冲液洗4次后，每孔加入50μl的被测样品或用10×Block Ace稀释的已知浓度的TPO标准品，用微板混合仪振荡板，用封板物封板，然后37℃放置2小时，4℃过夜。反应完全后，用洗涤缓冲液洗板4次。接着用生物素标记另一种抗人TPO单克隆抗体(即，L4-1的亚克隆L4-1-31)，它作为首抗识别人TPO的HT-2区(与SEQ ID NO：1所示的47-62氨基酸序列相应)，由10×Block Ace稀释为500ng/ml，每孔50μl，板在微板混合仪上振荡后用封板物封板，然后放置37℃2小时或4℃过夜。反应完全，随后用洗涤缓冲液洗涤(×4)之后，把过氧化酶标记的抗生物素蛋白(超抗生物素蛋白TM-辣根过氧化物酶，Leinco Technologies制，Ca.No.A106)在10×Block Ace中稀释2000倍，每孔加50μl。在微板混合仪上振荡后，用封板物封板，37℃反应1小时。反应完全，随后用洗涤缓冲液洗涤(×4)之后，每孔加入100μl的显色剂，它是在测过氧化酶的显色试剂盒的TMB2显色剂中加入1/100体积的底物溶液而配制成的(试剂盒为SUMILON产，Ca.No.ML-1120T)，微板混合仪上振荡后，封板仪封板，室温下进行反应。约30分钟后，每孔加入100μl的反应终止液，用微板仪振荡以终止颜色反应。用酶标仪(THERMOmax，Molecular Devices产)在波长450nm/650nm处测吸收值。
用已知浓度TPO(1-332)/CHO的吸收值制作标准曲线，用参照实施例(见图1)中描述的步骤来获得吸收值。
在这种情况下，杂交瘤L4-1的亚克隆(L4-1-3 1)和杂交瘤L3-1的亚克隆(L3-1-54)均可制备抗人TPO单克隆单体，已于1994年9月27日保藏于日本国际贸易和工业部，工业科技机构，国家生物科学和人类技术研究所，保藏号分别为FERM BP-4956和FERMBP-4955。上述的亚克隆也已保藏于中国的保藏机构(CCTCC)，保藏号分别是鼠-鼠杂交瘤L4-1-31的为CCTCC-C95003和鼠-鼠杂交瘤L3-1-54的为CCTCC-C95002。试验实施例1
试验样品的制备是把人血清白蛋白加到10mM Tris缓冲液(pH7.5)中，终浓度为0.005％，0.01％，0.02％，0.05％，0.1％，0.2％或0.5％。单用10mM Tris缓冲液(pH 7.5)作为对照。
含3μg TPO的1.5μl溶液是经后面参照实施例的步骤而获得，把它加到含1000μl各样品的玻璃试管中放置于室温。0.5分钟、1小时或2小时后从试管中取10μl溶液，用ELISA测量溶液中TPO的量，以计算它在期望值基础上的回收(％)。
结果如图2所示。图中，BLANK指仅用10mM Tris缓冲液(pH7.5)，HSA指人血清白蛋白。发现人血清白蛋白有阻止吸附的效果。试验实施例2
把用参照实施例中描述的步骤获得的含3μg TPO(即TPO(1-332)/CHO)的2.4μl溶液加到含1000μl溶液的玻璃试管中，试管中溶液的制备是，把表2列出的各种添加物溶到10mM Tris缓冲液(pH7.5)中，终浓度为0.1％，放置24小时后用ELISA测回收率。结果如表2所示。
表2添加物(添加量，1mg/ml) 回收率
(％)人血清白蛋白 83.3纯化的明胶(A型) 108.8纯化的明胶(B型) 85.3甲基纤维素 87.9羟丙基纤维素 86.2羟乙基纤维素 73.7聚乙烯醇(部分皂化产物) 87.7聚氧乙烯氢化蓖麻油 75.2吐温80 81.5聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯 83.0聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)甘醇81.6山梨糖醇酐一油酸酯 118.8蔗糖单月桂酸酯 78.3氯化苄乙氧胺 120.4辛酸钠 69.9亚硫酸钠 75.5未加 59.1
如表中所示，所有被试添加物均可防止TPO与玻璃试管接触时的吸附。
本发明组合物的实施例将在下面给出。实施例1
无菌制备10ml 5mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)中含1000μg TPO，0.025g人血清白蛋白和87.66mg氯化钠的水溶液，每小瓶中分装1ml，随后密封。实施例2
除用0.1g纯化明胶(B型)替代0.025g人血清白蛋白外，重复实施例1的操作配制药品。实施例3
无菌制备10ml 1mM柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中含2500μgTPO，10mg吐温80和0.5g山梨糖醇的水溶液，每小瓶中分装1ml，随后密封。实施例4
无菌制备在10ml 10mM Tris缓冲液(pH6.5)中含2500μgTPO，10mg聚氧乙烯氢化蓖麻油60和81.82mg氯化钠的水溶液，每小瓶中分装1ml，随后密封。
作为参照实施例，下面叙述作为本发明活性成分TPO的制备方法。参照实施例：TPO(1-332)的制备实施例
(1)在一种含10％胎牛血清的(α-极限必需培养基(α-MEM(-)；补充有胸苷和次黄嘌呤)培养板(直径6cm)(Falcon产品)中培养CHO细胞(dhfr-株；Urlaub和Chasin，美国国家科学院院刊，77卷，4216页，1980)，然后用磷酸钙法(Cellphect，Pharmacia制)用质粒pDEF202-hTPO-P1转化生成细胞。
也就是10μg含有SEQ ID NO：2所示插入cDNA的质粒pDEF202-hTPO-P1与120μl缓冲液A和120μl H2O混合，室温下放置10分钟。接着在所得溶液中加入120μl缓冲液B，再次混合然后在室温下放置30分钟。把这种DNA溶液逐滴加到前面提到的板中，然后在CO2培养箱中培养6小时。从培养板中移去培养基后，用α-MEM(-)洗涤2次，然后加入含10％二甲基亚砜的(α-MEM(-)，室温下作用2分钟。接着在培养物中加入含10％透析了的胎牛血清的非筛选培养基(α-MEM(-)，补充有胸苷和次黄嘌呤)，然后培养2天，之后用含10％透析了的胎牛血清的筛选培养基(α-MEM，无次黄嘌呤和胸苷)进行筛选。筛选的方法为，用胰酶处理从每一6cm板中而来的细胞，分到5个新的10cm板中或20个24孔板中，然后继续培养，每2天用筛选培养基更换培养基。检测细胞生长的培养板或孔的上清液中人TPO的活性。确认在培养上清中具有人TPO活性的细胞又以1∶15分到新板或孔中，而这种板或孔中含有存在25nM氨甲喋呤的筛选培养基，这种培养通过允许具有氨甲喋呤抗性的细胞生长而继续影响克隆。这种情况下，CHO细胞的转化也可通过pHTP-1和pMG1的合并转染进行。
用质粒pDEF 202-hTPO-P1转染CHO细胞株(CHO-DUKXB11)已于1995年1月31在布达佩斯协议范围内保藏于日本国际贸易和工业部，工业科技机构，国家生物科学和人类技术研究所，保藏号为FERM BP-4988。上面的CHO细胞系也已委托于中国的保存当局(CCTCC)，保藏号为CCTCC-C95004(指定为CHO28/1/1/3-C6)。
(2)产生人TPO的细胞系CHO的培养和人TPO的纯化
经重复MTX抵抗而获得的产生人TPO的CHO细胞系(CHO28/1/1/3-C6株，对400nM MTX抵抗)以下面的方式培养。用含400nMMTX和10％FCS的DMEM/F-12培养基(GIBCO)培养细胞。用胰酶溶液除去生长的细胞，1×107的细胞在Falcon转动瓶(Falcon 300)中的200ml相同培养基中培养，37℃lrpm的转速培养3天。之后，吸去培养上清，用50ml PBS冲洗剩余的细胞，悬浮在300ml DMEM/F-12培养基(GIBCO)中，该培养基中补充有2μg/ml的胰岛素和10μM的硫酸铜以替代400nM MTX和10％FCS，然后于37℃，1rpm的转速培养4天，以回收培养上清(标明为收获-1)。然后，把上述的300ml产物培养基加到然后在37℃1rpm转速培养4天以回收培养上清的残余细胞中(标明为收获-2)。
大约220L收获-1和-2的联合无血清的CHO细胞培养上清经0.5μm过滤器(FILTER CARTRIDGE，Nihon Pall，日本)进行过滤，经超滤(CENTRASETTETM OMEGA 30k cut，FILTRON)浓缩为5L左右，同时用10mM磷酸钾缓冲液(pH 6.8)交换溶剂。浓缩时加入10μM(终浓度)的蛋白酶抑制物E-64(肽研究所，日本)，所得溶液以流速100ml/分钟上已用10mM磷酸钾缓冲液(pH 6.8)平衡过的SP Sepharose FF柱(直径11cm，床高11cm，Pharmacia)。用平衡缓冲液洗涤后，用含0.3M氯化钠的1700ml 10mM磷酸钾缓冲液(pH 6.8)进行洗脱。洗脱液与363g磷酸铵混合，12000×g离心20分钟，所得上清液以100ml/分钟的流速加样到已用(含1.2M硫酸铵的)10mM磷酸钾缓冲液(pH 6.8)平衡过的MacroPrep Methyl HIC柱(直径6cm，床高30cm，Bio-Rad)加样后，用平衡缓冲液洗柱，用700ml含0.5M硫酸铵的10mM磷酸钾缓冲液(pH6.8)洗脱。洗脱液与80ml丙醇混合，以16ml/分的流速加样到SOURCE 15 PRC柱(直径3.5cm，床高10cm，Pharmacia)。加样后，用含10％丙醇的10mM Tris缓冲液(pH 7.5)(标明为冲洗液A)洗柱，用从净中洗液A到含80％丙醇的10mM Tris缓冲液(pH7.5)(标为冲洗液B)一直到丙醇的浓度达70％所形成的60分钟线性梯度进行洗脱。线性梯度开始后25分钟左右收集到192ml的洗脱级分，把它分成两份，每份上经PBS平衡过的Superdex 200 pg柱(直径10cm，床高56cm，Pharmacia)，以40ml/分的流速进行洗脱。当用SDS-PAGE分析洗脱物时，在保留时间为42-52分钟左右的时候，发现分子量为65,000-100,000，希望为PTO的蛋白出现单条带。Western分析表明这种蛋白质是TPO。当这一样品的部分进行N末端氨基酸分析及氨基酸组成分析时，结果指出大约获得230mg高纯度具有SEQ ID NO：1所示1-322氨基酸序列的TPO。
序列表SEQ ID NO：1的资料： (i)序列特征：
(A)长度：332个氨基酸
(B)类型：氨基酸 (ii)分子类型：蛋白质 (vi)来源：
(A)有机体：人(智人) (xi)序列描述：SEQ ID NO：1：Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu 1 5 10 15Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val
20 25 30His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu
35 40 45Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu
50 55 60Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln65 70 75 80Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln
85 90 95Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu
100 105 110Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe
115 120 125Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu
130 135 140Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala145 150 155 160Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro Asn
165 170 175Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr Ala Ser Ala Arg Thr
180 185 190Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly Phe Arg Ala Lys Ile
195 200 205Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gln Ile Pro Gly
210 215 220Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu Asn Gly Thr Arg Gly Leu Phe225 230 235 240Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro Asp Ile Ser Ser Gly
245 250 255Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gln Pro Gly Tyr Ser
260 265 270Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr Thr Leu Phe Pro Leu
275 280 285Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln Leu His Pro Leu Leu Pro
290 295 300Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu Asn Thr305 310 315 320Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu Gly
325 330SEQ ID NO：2的资料： (i)序列特征：
(A)长度：1086个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性 (ii)分子类型：cDNA到mRNA (vi)来源：
(A)有机体：人(智人) (xi)序列描述：SEQ ID NO：2：GGCCAGCCAG ACACCCCGGC CAGA 24ATG GAG CTG ACT GAA TTG CTC CTC GTG GTC ATG CTT CTC CTA ACT GCA 72Met Glu Leu Thr Glu Leu Leu Leu Val Val Met Leu Leu Leu Thr Ala
-20 -15 -10AGG CTA ACG CTG TCC AGC CCG GCT CCT CCT GCT TGT GAC CTC CGA GTC 120Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val -5 1 5 10CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CAT GTC CTT CAC AGC AGA CTG AGC 168Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser
15 20 25CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT ACA CCT GTC CTG CTG CCT GCT 216Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala
30 35 40GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA ACC CAG ATG GAG GAG ACC AAG 264Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys
45 50 55GCA CAG GAC ATT CTG GGA GCA GTG ACC CTT CTG CTG GAG GGA GTG ATG 312Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met 60 65 70 75GCA GCA CGG GGA CAA CTG GGA CCC ACT TGC CTC TCA TCC CTC CTG GGG 360Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly
80 85 90CAG CTT TCT GGA CAG GTC CGT CTC CTC CTT GGG GCC CTG CAG AGC CTC 408Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu
95 100 105CTT GGA ACC CAG CTT CCT CCA CAG GGC AGG ACC ACA GCT CAC AAG GAT 456Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp
110 115 120CCC AAT GCC ATC TTC CTG AGC TTC CAA CAC CTG CTC CGA GGA AAG GTG 504Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val
125 130 135CGT TTC CTG ATG CTT GTA GGA GGG TCC ACC CTC TGC GTC AGG CGG GCC 552Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala140 145 150 155CCA CCC ACC ACA GCT GTC CCC AGC AGA ACC TCT CTA GTC CTC ACA CTG 600Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu
160 165 170AAC GAG CTC CCA AAC AGG ACT TCT GGA TTG TTG GAG ACA AAC TTC ACT 648Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr
175 180 185GCC TCA GCC AGA ACT ACT GGC TCT GGG CTT CTG AAG TGG CAG CAG GGA 696Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly
190 195 200TTC AGA GCC AAG ATT CCT GGT CTG CTG AAC CAA ACC TCC AGG TCC CTG 744Phe Arg Ala Lys Ile Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu
205 210 215GAC CAA ATC CCC GGA TAC CTG AAC AGG ATA CAC GAA CTC TTG AAT GGA 792Asp Gln Ile Pro Gly Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu Asn Gly220 225 230 235ACT CGT GGA CTC TTT CCT GGA CCC TCA CGC AGG ACC CTA GGA GCC CCG 840Thr Arg Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro
240 245 250GAC ATT TCC TCA GGA ACA TCA GAC ACA GGC TCC CTG CCA CCC AAC CTC 888Asp Ile Ser Ser Gly Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu
255 260 265CAG CCT GGA TAT TCT CCT TCC CCA ACC CAT CCT CCT ACT GGA CAG TAT 936Gln Pro Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr
270 275 280ACG CTC TTC CCT CTT CCA CCC ACC TTG CCC ACC CCT GTG GTC CAG CTC 984Thr Leu Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln Leu
285 290 295CAC CCC CTG CTT CCT GAC CCT TCT GCT CCA ACG CCC ACC CCT ACC AGC 1032His Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser300 305 310 315CCT CTT CTA AAC ACA TCC TAC ACC CAC TCC CAG AAT CTG TCT CAG GAA 1080Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu
320 325 330GGG TAA 1086Gly