一种动脉粥样硬化大鼠模型的制备方法 技术领域
本发明涉及医药模型技术领域，是一种用于研究动脉粥样硬化病理机制、药理学评价动物模型的制备方法。
背景技术
动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是心脑血管疾病的主要病理基础，其发生的危险因素主要为高血压、高脂血症、吸烟等，导致血管壁形成大小不一的斑块，妨碍相应组织器官的血流供应。建立AS的病理模型可进行病理机制和药理学研究。
现有的采用家兔、鹌鹑等建立的食饵性AS模型有一定的局限性。家兔和鹌鹑主动脉斑块病变处多呈火山口样改变及大量的泡沫细胞在表面堆积，与人类AS斑块的病理类型不一致；家兔和鹌鹑冠状动脉的分支主要发生于心肌内的冠状动脉中小分支，与人类发病的部位也不一致。
大鼠具有饲养方便、抵抗力强、食性与人相近等优点。用高脂饲料添加胆盐和抗甲状腺药物可使血脂升高。但由于大鼠的抗病能力强，形成AS发病周期长，且只能形成类似人类早期的AS病变，而不易形成后期的病变。采用大剂量维生素D3一次性腹腔注射后，虽能快速诱导主动脉AS病变。但由于是一次性注射而未给予高脂饲料喂养，故难以形成冠状动脉等器官性的进一步AS全身性后期病变。
本发明提供一种制作周期短、成本低、病理状态与人体相似的一种诱发动物全身性动脉硬化病变病理模型的方法。本发明动物模型制作方法如下：
1.动物：雄性大鼠；
2.高脂饲料的成分及配比：
基础饲料(参照实验动物管理委员会规定大鼠食用配料)70-95％，
胆固醇1-6％，
猪油3-12％，
白糖0-10％，
胆酸钠0.01-5％，
丙基硫氧嘧啶或甲基硫氧嘧啶0.01-3％；
3.饲料加工方法：
按上述配比将胆固醇、胆酸钠、丙基硫氧嘧啶或甲基硫氧嘧啶、白糖及猪油与基础饲料搅拌均匀后，压制成颗粒，烘干成高脂饲料；
4.模型的制作：按体重给予雄性大鼠注射维生素D3 20-200万单位/kg后，喂食上述高脂饲料7-20周，即成动脉粥样硬化大鼠模型。
取该模型大鼠的主动脉、冠状动脉进行病理观察，可观测到全身性的动脉粥样硬化病理改变，其病变与人类发病状态类似，因此可用于研究动脉粥样硬化的病理学机制及药理学评价。
具体实施方式
实施例1.制作大鼠高脂饲料
将3％胆固醇，0.5％胆酸钠，0.2％丙基硫氧嘧啶，5％白糖，10％猪油(精致猪板油)与81.3％基础饲料(上海西普尔-必凯公司)搅拌均匀后，压制成颗粒即成大鼠高脂饲料。
实施例2.制作动脉粥样硬化大鼠模型
雄性Wistar大鼠20只，体重300±10g，购自中科院上海实验动物中心(合格证号：SCXK沪2002-0010)。随机分成对照组和实验组2组，每组10只。饲养于清洁级动物房。实验组大鼠在腹腔注射维生素D3 60万单位/kg体重后，喂食本发明高脂饲料。正常组大鼠腹腔注射同等体积的生理盐水后，给予普通颗粒饲料(成分同基础饲料，上海西普尔-必凯公司)喂养。8周后处死大鼠，取主动脉、心脏、肝脏、脑、肾脏进行病理观测，观察下列病理学变化。
1.主动脉病变程度观测
①大体观察：沿主动脉瓣至髂动脉分支处取出主动脉，纵向剪开，在10％福尔马林溶液中固定，大体观察，确定斑块面积及部位。
通过大体观察，参照《中药药理研究方法学》、《现代药理实验方法》，病变按照下述标准评分：
0级：内膜表面光滑，无斑块，评0分；
0.5级：内膜有轻度奶油色变化，但无凸出于表面的斑块，评0.5分；
1级：有明显的凸起奶油色斑块，面积小于3mm2，评1分；
2级：斑块面积大于3mm2，评2分；
3级：斑块融合成片，大部分斑块面积大于3mm2，评3分；
4级：斑块几乎覆盖整个动脉内膜，评4分。
结果显示，经油红O大体染色后，对照组未出现阳性斑块。实验组大鼠主动脉出现大量斑块，病变评分达2.5±1.4，斑块区域主要分布于主动脉弓、腹主动脉及髂动脉分叉处。
②病理切片观察：取主动脉弓、胸动脉、腹动脉中段纵切面，石蜡包埋，连续切片，作HE染色及钙质染色。
经石蜡包埋切片后，HE染色光镜下观察，对照组血管细胞排列整齐而完整；实验组病变部位内膜明显增厚，血管内皮细胞排列不完整，平滑肌细胞在内膜增生显著，与大量堆积地泡沫细胞形成典型的动脉粥样硬化斑块。经钙质染色后斑块内显示明显钙化灶。结果显示，实验组大鼠8周后主动脉出现典型的动脉粥样硬化病变。
2.心脏病理观测
①冠状动脉病变：心脏在冠状沟下方和距心尖0.5cm处横断，取其间组织块，石蜡包埋，连续切片，作HE染色。另外，每组3只在心脏相同部位作冰冻切片，进行油红O染色。
参照《中药药理研究方法学》、《现代药理实验方法》，每只动物观察10个动脉断面，冠状动脉病变程度分级按照以下标准评分：
0级：动脉内膜无脂质浸润，评0分；
0.5级：内膜有轻度脂质浸润，评0.5分；
1级：内膜斑块占血管腔面积的1/4，评1分；
2级：内膜斑块占血管腔面积的1/2，评2分；
3级：内膜斑块占血管腔面积的1/2以上，评3分；
4级：斑块几乎堵塞整个管腔，评4分。
对照组大鼠心脏冠状动脉经油红O染色后未发现阳性斑块区域。实验组大鼠出现典型的冠状血管AS病变，病变程度评分为1.9±0.8。病变的冠状血管主要分布于分支比中等大小的分支。病变过程、分布与人类相似、AS病变区主要为内膜增厚，管腔严重狭窄；内皮和平滑肌层细胞排列紊乱，平滑肌增生明显。经冰冻切片、油红O染色后，AS病变区血管壁染色阳性，血管内膜堆积大量泡沫细胞。结果显示，实验组大鼠8周后冠状动脉出现典型的动脉粥样硬化病变。
②心肌病变：经油红O染色，实验组大鼠心肌阳性区域呈片状，病变区心肌细胞胞浆内出现大量红染颗粒。结果显示，实验组大鼠8周后心肌存在脂肪沉积。
3.其它组织病理观测取肝脏、脑、肾脏横断面，进行病理观测。
将大鼠解剖后大体观察，实验组大鼠肝脏呈现乳黄色。冰冻切片经油红O进行脂肪染色呈强阳性。肝细胞特别是肝血窦周围细胞胞浆内出现大量的红染脂质颗粒，证明肝脏存在脂质沉积。脑动脉和肾脏动脉均出现不同程度的粥样硬化病变。
表1.实验组大鼠动脉粥样硬化病变统计表。
主动脉 冠状动脉
编号
心肌脂质沉积 肝脏脂质沉积 肾动脉 脑动脉
病变评分 病变评分
1 1 1 + + + -
2 4 2 + + + +
3 3 2 + + + +
4 3 2 + + + +
5 3 2 + + + +
6 0 0.5 + + + -
7 4 3 + + + +
8 4 3 + + + +
9 1 1 + + + -
10 2 2 + + + -
+：存在病变；-：未检测到病变。
病理结果显示，本发明制备方法能使大鼠主动脉和冠状动脉血管壁均出现大量粥样斑块，心肌、肝脏组织均存在脂肪沉积，脑动脉和肾脏动脉均出现不同程度的粥样硬化病变。结果表明，本发明可用于制备更接近于人类发病状态的全身性动脉粥样硬化大鼠模型，且方法快速简便，为进一步研究动脉粥样硬化的病理机制及药理研究提供了稳定、可靠的动物模型。