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1、10申请公布号CN104046681A43申请公布日20140917CN104046681A21申请号201310078921522申请日20130313C12Q1/68200601C12Q1/04200601C12R1/6820060171申请人长江大学地址434023湖北省荆州市南环路1号72发明人余知和曾昭清周建芬程云方74专利代理机构北京市中实友知识产权代理有限责任公司11013代理人熊成香54发明名称一种快速鉴定烟曲霉菌的检测方法57摘要本发明涉及一种快速鉴定烟曲霉菌的检测方法，属真菌分子生物检测技术领域，其特征在于包括如下步骤（1）提取待测烟曲霉菌株的总DNA；（2）选取RPB2基。
2、因作为分子标记，即目的片段，设计特异性引物3条；（3）待测烟曲霉菌株目的片段PCR扩增；（4）琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳检测结果判断待测菌株是否为烟曲霉菌。本发明的检测方法能快速鉴定出烟曲霉菌，具有快速、准确、高效的优点。51INTCL权利要求书1页说明书3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书3页10申请公布号CN104046681ACN104046681A1/1页21一种快速鉴定烟曲霉菌的检测方法，其特征在于包括如下步骤（1）提取待测烟曲霉菌株的总DNA；（2）选取RPB2基因作为分子标记，即目的片段，设计特异性引物3条；（3）待测烟曲霉菌株目的片段PCR。
3、扩增；（4）琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳检测结果判断待测菌株是否为烟曲霉菌。2根据权利要求1所述的一种快速鉴定烟曲霉菌的检测方法，其特征在于设计特异性引物3条，分别为1引物名称F2255，引物序列CCAACAAGCGTGTTCGTTCAG；2引物名称R3044，引物序列TGTCCGTGACGAGAGGCAAAT；3引物名称R3438，引物序列CTGCCGGGTCAGAATCTGT。权利要求书CN104046681A1/3页3一种快速鉴定烟曲霉菌的检测方法技术领域0001本发明涉及一种快速鉴定烟曲霉菌的检测方法，属真菌分子生物检测技术领域。背景技术0002真菌存在于几乎所有的陆地和水生生态系统中。
4、，与人类生产活动和生活关系密切。许多真菌具有重要的经济意义，但也有些种类的真菌会引起植物、动物和人类的病害或产生毒素，会危害人类的健康。0003烟曲霉菌（ASPERGILLUSFUMIGATUS）是自然界中广泛存在的腐生真菌，也是重要的机会致病菌。随着免疫受损人群的增多，系统性曲霉病的90是由烟曲霉菌引起的。同时，烟曲霉菌产生的毒素严重污染粮食与饲料制品，危害人和动物的健康，造成重大的经济损失，烟曲霉菌已成为临床医学和医学微生物家们关注的热点。0004烟曲霉菌的检测技术经历了传统培养鉴别、层析法及色谱法等化学方法检测、免疫学检测、分子生物学检测等。0005近年来，随着高效基因扩增平台、引物设计。
5、方案以及定量扩增技术的发展和应用，包括真菌在内的微生物快速检测与鉴定对于病害诊断、监测和防治具有重要意义。发明内容0006为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种快速鉴定烟曲霉菌的检测方法，具有快速、准确、高效的特点。0007本发明是通过如下技术方案来实现上述目的的。0008本发明提供的一种快速鉴定烟曲霉菌的检测方法，包括如下步骤0009（1）提取待测烟曲霉菌株的总DNA；0010（2）选取RPB2基因作为分子标记，即目的片段，设计特异性引物3条，分别为00111引物名称F2255，引物序列CCAACAAGCGTGTTCGTTCAG；00122引物名称R3044，引物序列TGTCCGT。
6、GACGAGAGGCAAAT；00133引物名称R3438，引物序列CTGCCGGGTCAGAATCTGT；0014（3）待测烟曲霉菌株目的片段PCR扩增；0015（4）琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳检测结果判断待测菌株是否为烟曲霉菌。0016本发明与现有的技术相比具有如下有益效果0017本发明基于已公布的曲霉属真菌烟曲霉、棒曲霉、费氏曲霉、黄曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉和土曲霉等的基因组序列，通过基因组同源性分析，选择RPB2基因作为研究对象，根据RPB2基因存在的12个保守区域的序列比对结果和变异位点，筛选出可用于烟曲霉快速鉴定的特异性引物。通过设计3条引物，对待测烟曲霉菌株的目的基因片段。
7、进行PCR扩增,通过琼脂糖凝胶电泳检测方法判断待测菌株是否为烟曲霉菌。具体实施方式说明书CN104046681A2/3页40018下面结合具体实施例，对本发明作进一步说明。00191、待测曲霉菌株的培养0020待测曲霉菌样品来源于中国科学院微生物研究所、北京大学真菌和真菌病研究中心、吉林大学真菌研究中心，接种至PDA培养基上，置培养箱28培养。00212、待测曲霉菌株的DNA提取0022挑取直径5MM的曲霉菌株菌丝块接种至100MLPD液体培养基中，室温下摇床培养250RPM24周，收集菌体并用无菌生理盐水冲洗数次，灭菌滤纸吸干。取01G菌体在液氮中迅速研磨成粉末，用2W/VCTAB缓冲液抽提。
8、DNA，08琼脂糖凝胶检测DNA样品。00233、目的片段PCR扩增0024PCR反应在ABI2720PCR仪美国加州ABI公司上进行，25L反应体系包括超纯水175L，10BUFFER25L，引物10M各1L，TAQDNA聚合酶125U/L05L，DNTP25MM1L，模板DNA1L。0025PCR反应条件为94C预变性4MIN；94C变性30S，66C或64C退火30S，72C延伸45S，30个循环；72C延伸7MIN。0026引物列表002700284、琼脂糖凝胶电泳检测0029扩增产物经2琼脂糖凝胶电泳检测，引物F2255R3044和F2255R3438的扩增产物分别约800BP和12。
9、00BP。00305、序列测定验证0031目的片段PCR产物送生工生物工程上海股份有限公司，ABI3730XL测序仪双向测序。0032引物F2255/R3044扩增烟曲霉得到的序列为790BP0033CCAACAAGCGTGTTCGTTCAGTCCTCAGTCAAAAGGCACACACTTGGACGCATTGCGAGATTCACC0034CCAGTATGATTCTTGGTGTTTGTGCCAGTATCATTCCCTTCCCGGACCACAACCAGTCGCCTCGTA0035ATACCTACCAGTCTGCAATGGGCAAACAAGCCATGGGTGTGTTTTTGACCAACTTTGACC。
10、AACGAA0036TGGAGACAATGGCAAATATTCTCTATTACCCGCAGAAACCGCTAGCCACAACACGGTCCATGGAAT0037TCCTTCGATTCCGTGAACTACCAGCTGGGCAGAATGCCATCGTCGCCATTGCTTGCTACTCCGGAT0038ACAACCAAGAAGATTCGGTCATCATGAACCAGAGCAGCATCGATCGTGGTCTCTTCCGAAGTCTCT0039TCTATCGCACATACACGGATAGCGAGAAAATGGTTGGCCTGACTGTTGTCGAGCGGTTTGAGAAGC0040CCATGCGCTC。
11、GGATACGATCGGTATGAGAAAGGGCACCTACGATAAGCTCGATGAGGACGGTATCA0041TTGCCCCTGGTGTGCGTGTCTCCGGAGAGGATATTATCATCGGCAAGACCGCCCCGTTGGCACCCG说明书CN104046681A3/3页50042AGGCGGAGGAACTTGGCCAGCGAACCAAGGCACATACCAAGCTGGATGTGTCGACGCCATTAAGAA0043GCACTGAAAATGGTATTGTGGATCAAGTCCTGGTCTCTACCAGCAATGATGACCTCAAGTTCGTCA0044AGGTGCGCAT。
12、GAGAACGACAAAGATTCCTCAGATCGGAGACAAATTTGCCTCTCGTCACGGACA0045引物F2255/R3438扩增烟曲霉得到的序列为1184BP0046CCAACAAGCGTGTTCGTTCAGTCCTCAGTCAAAAGGCACACACTTGGACGCATTGCGAGATTCACC0047CCAGTATGATTCTTGGTGTTTGTGCCAGTATCATTCCCTTCCCGGACCACAACCAGTCGCCTCGTA0048ATACCTACCAGTCTGCAATGGGCAAACAAGCCATGGGTGTGTTTTTGACCAACTTTGACCAACGAA00。
13、49TGGAGACAATGGCAAATATTCTCTATTACCCGCAGAAACCGCTAGCCACAACACGGTCCATGGAAT0050TCCTTCGATTCCGTGAACTACCAGCTGGGCAGAATGCCATCGTCGCCATTGCTTGCTACTCCGGAT0051ACAACCAAGAAGATTCGGTCATCATGAACCAGAGCAGCATCGATCGTGGTCTCTTCCGAAGTCTCT0052TCTATCGCACATACACGGATAGCGAGAAAATGGTTGGCCTGACTGTTGTCGAGCGGTTTGAGAAGC0053CCATGCGCTCGGATACGA。
14、TCGGTATGAGAAAGGGCACCTACGATAAGCTCGATGAGGACGGTATCA0054TTGCCCCTGGTGTGCGTGTCTCCGGAGAGGATATTATCATCGGCAAGACCGCCCCGTTGGCACCCG0055AGGCGGAGGAACTTGGCCAGCGAACCAAGGCACATACCAAGCTGGATGTGTCGACGCCATTAAGAA0056GCACTGAAAATGGTATTGTGGATCAAGTCCTGGTCTCTACCAGCAATGATGACCTCAAGTTCGTCA0057AGGTGCGCATGAGAACGACAAAGATTCCTCAGATCGGA。
15、GACAAATTTGCCTCTCGTCACGGACAGA0058AGGGTACCATTGGTATCACCTACCGGCAGGAAGACATGCCGTTTACACGCGAGGGTGTTTCCCCCG0059ATCTTATCATCAACCCGCATGCTATTCCATCTCGTATGACAATTGCTCACTTGATCGAGTGTCAGC0060TCAGTAAAGTGTCGGCATTACGTGGGTTCGAAGGTGATGCAACACCTTTTACTGATGTTACTGTCG0061ACTCAATCTCTCGTCTGCTTCGGGAGCACGGGTACCAGTCTCGTGGCTTCGAAGTGAT。
16、GTACAATG0062GGCATACTGGACGCAAGCTGGTTGCGCAAGTGTTCTTGGGACCAACGTACTATCAGCGTCTGCGCC0063ACATGGTCGACGACAAGATCCACGCCCGTGCCCGTGGACCGACACAGATTCTGACCCGGCAG0064RNA聚合酶II第二大亚基RNAPOLYMERASEIISECONDLARGESTSUBUNIT,RPB2为单拷贝基因、进化速率慢，已与ITS、RPB1、EF1、TUBULIN等应用于真菌分类和系统发育研究。曲霉属真菌基因组同源性分析表明，RPB2基因存在保守区域和变异位点，设计的两对特异性引物F2255/R3044和F2255/R3438只能扩增出烟曲霉菌的RPB2基因片段，通过琼脂糖凝胶电泳检测可见单一的明亮条带且长度分别约为800BP和1200BP；否则，说明待测菌株为非烟曲霉菌。说明书CN104046681A。