《用于制备脐带间充质干细胞的试剂盒.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《用于制备脐带间充质干细胞的试剂盒.pdf（9页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、10申请公布号CN104232572A43申请公布日20141224CN104232572A21申请号201410410920022申请日20140820C12N5/077520100171申请人北京瑞思德生物科技有限公司地址100000北京市朝阳区崔各庄乡马泉营20号二层288室72发明人李梦良张炳强石娟杨升宝王秀芹王娟74专利代理机构北京远大卓悦知识产权代理事务所普通合伙11369代理人史霞54发明名称用于制备脐带间充质干细胞的试剂盒57摘要本发明属于干细胞技术领域，涉及一种用于制备脐带间充质干细胞的试剂盒，该试剂盒包括脐带保存液、脐带洗涤液、脐带分解液、细胞洗涤液、细胞培养液、细胞消化液。
2、、细胞冻存液；脐带保存液为含青霉素100200UG/ML、链霉素100200UG/ML、两性霉素255G/ML的DMEM、DMEM/F12、MEM或RPMI1640培养基；脐带洗涤液为含青霉素100200UG/ML、链霉素100200UG/ML、两性霉素255G/ML的生理盐水、PBS、DHANKS或HBSS；脐带分解液含为含胶原酶12MG/ML、脱氧核糖核酸酶0102MG/ML的DMEM、DMEM/F12、MEM或RPMI1640培养基；细胞洗涤液为PBS、DHANKS或HBSS；细胞培养液为间充质干细胞无血清生长培养基；本发明的试剂盒可在较短时间获得大量脐带间充质干细胞，使用方便。51IN。
3、TCL权利要求书1页说明书7页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页10申请公布号CN104232572ACN104232572A1/1页21一种用于制备脐带间充质干细胞的试剂盒，其特征在于包括脐带保存液、脐带洗涤液、脐带分解液、细胞洗涤液、细胞培养液、细胞消化液、细胞冻存液；所述脐带保存液为含青霉素100200UG/ML、链霉素100200UG/ML、两性霉素255G/ML的DMEM、DMEM/F12、MEM或RPMI1640培养基；所述脐带洗涤液为含青霉素100200UG/ML、链霉素100200UG/ML、两性霉素255G/ML的生理盐水、PBS、DHA。
4、NKS或HBS；所述脐带分解液为含胶原酶12MG/ML、脱氧核糖核酸酶0102MG/ML的DMEM、DMEM/F12、MEM或RPMI1640培养基；所述细胞洗涤液为PBS、DHANKS或HBSS；所述细胞培养液为间充质干细胞无血清生长培养基，该培养基由无血清基础培养基450ML及其添加物50ML组成；所述细胞消化液为含TRYPSINEDTA12525MG/ML的PBS、DHANKS或HBSS溶液；所述细胞冻存液为含DMSO60200MG/ML的间充质干细胞无血清生长培养基。权利要求书CN104232572A1/7页3用于制备脐带间充质干细胞的试剂盒0001技术领域0002本发明属于干细胞技术。
5、领域，涉及一种用于制备脐带间充质干细胞的试剂盒。背景技术0003间充质干细胞来源于发育早期的中胚层和外胚层，最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注，其在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，具有非常广阔的临床应用前景。0004间充质干细胞主要来源于骨髓、脐带、脂肪等。因为随着年龄增长，干细胞数量和增殖能力显著下降，因此，骨髓和脂肪来源的间充质干细胞数量和活性受到一定影响，且获取骨髓和和脂肪均有创，造成供体痛苦，还。
6、可能导致感染、出血和慢性疼痛等。0005脐带间充质干细胞（UMBILICALCORDMESENCHYMALSTEMCELLS，UCMSCS）是指存在于新生儿脐带组织中的一种具有自我更新、多向分化潜能的干细胞，能分化为心脏、肝、肾、肺、胰腺、神经、骨骼、肌肉、脂肪等多种组织细胞，几乎涵盖了人体的所有组织细胞。0006脐带间充质干细胞的获得有组织块贴壁法和胶原酶消化法。组织块贴壁法原代培养时间为两到三周左右，培养时间较长，而采用胶原酶消化法可快速获得大量的贴壁生长的间充质干细胞，该方法简便易行，可更好地保持细胞活力，大大缩短了原代培养时间，本发明即采用胶原酶消化法。0007脐带间充质干细胞具有以下。
7、功能和用途1、修复损伤或病变的组织器官，用于治疗心脑血管疾病、肝病、骨和肌肉衰退性疾病、脑及脊髓神经损伤和老年痴呆等；2、具有较强的免疫调节作用，可用于治疗红斑狼疮和硬皮病等自身免疫性疾病，降低细胞或器官移植后的免疫排斥反应，提高细胞或器官移植的成功率；3、促进造血恢复功能，与单一造血干细胞移植比较，间充质干细胞和造血干细胞共移植能显著提高白血病和难治性贫血等疾病的治疗效果。0008脐带间充质干细胞具有以下优势1、脐带中间充质干细胞含量丰富；2、脐带间充质干细胞增殖能力和分化能力更强；3、可以多次扩增，为临床治疗提供大量的种子细胞，足以满足治疗需要；4、免疫原性低；5、广泛的临床应用和巨大的医。
8、疗前景对心肌梗死、糖尿病、肝硬化、红斑狼疮、帕金森综合症、老年痴呆、脊髓损伤等多种疾病具有一定治疗效果，随着科技进步，可用于组织和器官的修复和再造。0009脐带间充质干细胞具有极其广阔的临床应用前景。因此，开发简单、快速、高新、安全获得大量脐带间充质干细胞方法成为当务之急，而目前现有技术中还未有用于制备脐带间充质干细胞的试剂盒，使得相关科研工作进展缓慢。说明书CN104232572A2/7页4发明内容0010本发明目的是为了弥补现有技术中存在的不足，提供一种使用方便，成本低廉的用于制备获得大量脐带间充质干细胞的试剂盒。0011为实现上述目的，本发明采用的技术方案是一种用于制备脐带间充质干细胞的。
9、试剂盒，包括脐带保存液、脐带洗涤液、脐带分解液、细胞洗涤液、细胞培养液、细胞消化液、细胞冻存液；所述脐带保存液为含青霉素100200UG/ML、链霉素100200UG/ML、两性霉素255G/ML的DMEM、DMEM/F12、MEM或RPMI1640培养基；所述脐带洗涤液为含青霉素100200UG/ML、链霉素100200UG/ML、两性霉素255G/ML的生理盐水、PBS、DHANKS或HBS；所述脐带分解液为含胶原酶12MG/ML、脱氧核糖核酸酶0102MG/ML的DMEM、DMEM/F12、MEM或RPMI1640培养基；所述细胞洗涤液为PBS、DHANKS或HBSS；所述细胞培养液为间。
10、充质干细胞无血清生长培养基，该培养基由无血清基础培养基450ML及其添加物50ML组成，化学成分限定，含L谷氨酰胺，不含酚红和抗生素；所述细胞消化液为含TRYPSINEDTA12525MG/ML的PBS、DHANKS或HBSS溶液；所述细胞冻存液为含DMSO60200MG/ML的间充质干细胞无血清生长培养基。0012本发明提供了一种制备脐带间充质干细胞的试剂盒,该试剂盒中，脐带保存液的作用是保证脐带标本在采集之后的运输过程中的活性，并消灭和预防细菌、真菌；脐带洗涤液的作用是洗涤除去脐带组织的血液细胞，同时消灭和预防细菌、真菌。脐带分解液的作用是消化脐带组织，获得单细胞悬液。细胞洗涤液的作用是洗。
11、涤获得的干细胞。细胞培养液为无血清生长培养基，且化学成分限定，减少动物来源的病原体感染风险，培养脐带间充质干细胞相对于使用胎牛血清而言更安全。细胞消化液的作用是细胞传代时，消化贴壁的间充质干细胞；细胞冻存液的作用是冻存获得的脐带间充质干细胞。0013本发明的用于制备脐带间充质干细胞的试剂盒，可在较短时间（2周内）获得大量脐带间充质干细胞（细胞数量可达1010数量级），并且具有使用方便，成本低廉，无血清，减少动物来源的病原体感染风险，更安全等特点，将在干细胞临床试验及其相关研究中发挥重要作用，应用前景极为广泛。具体实施方式0014下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所需试剂耗材及实验仪。
12、器等均可通过商业途径购得。0015实施例一用于制备脐带间充质干细胞的试剂盒的制备及应用一、用于制备脐带间充质干细胞的试剂盒的制备1、溶液配置本发明的用于制备脐带间充质干细胞的试剂盒包括以下试剂（1）脐带保存液配置方法青霉素（品牌AMRESCO，货号0242）200MG、链霉素（品牌AMRESCO，货号0382）200MG、两性霉素（品牌AMRESCO，货号E437）5MG，溶于1000MLDMEM培养基中022UM过滤除菌即可。说明书CN104232572A3/7页50016（2）脐带洗涤液配置方法青霉素200MG、链霉素200MG、两性霉素5MG，溶于1000ML生理盐水中022UM过滤除菌。
13、即可。0017（3）脐带分解液配置方法胶原酶（品牌SIGMA，货号C6885）1G，脱氧核糖核酸酶（品牌SIGMA，货号C4263）01G溶于1000MLDMEM培养基中，022UM滤器过滤除菌即可。0018（4）细胞洗涤液配置方法PBS，配方为NACL850G、NA2HPO412H2O358G、NAH2PO42H2O039G，加双蒸水至1000ML，调整PH至7274之间，高压灭菌即可。0019（5）细胞培养液配置方法无血清基础培养基品牌LONZA，货号00190620450ML及其添加物品牌LONZA，货号0019212550ML混匀即可。0020（6）细胞消化液配置方法TRYPSIN（胰。
14、蛋白酶）025G、EDTA2NA19728MG溶于上述配好的细胞洗涤液即PBS100ML中，混匀，022UM滤器过滤除菌即可。0021（7）细胞冻存液配置方法10MLDMSO（品牌SIGMA，货号D2650）缓慢加入到90ML上述配好的细胞培养液即间充质干细胞无血清生长培养基中，轻轻混匀即可。00222、各组分的分装试剂盒的规格为1次/盒，每盒中各组分的量为脐带保存液1瓶（50ML/瓶），脐带洗涤液1瓶（50ML/瓶），脐带分解液1瓶（50ML/瓶），细胞洗涤液5瓶（1000ML/瓶），细胞培养液10瓶（1000ML/瓶），细胞消化液2瓶（1000ML/瓶），细胞冻存液2瓶（1000ML/瓶）。
15、。0023按照上述试剂量对试剂盒中各组分进行分装，包装得到用于制备脐带间充质干细胞的试剂盒。试剂盒20保存，有效期2年，使用之前4冰箱内或者37水浴解冻，解冻之后4保存，一个月内用完。0024二、脐带间充质干细胞的制备现用步骤一的试剂盒制备脐带间充质干细胞，具体制备方法包括以下步骤，以5CM脐带为例操作如下所有操纵步骤均在洁净工作台完成1、运输脐带采集脐带5CM，加入等体积的脐带保存液，28恒温保存在疫苗箱中，48H内送至实验室。00252、洗涤脐带吸弃脐带保存液，加入等体积脐带洗涤液，反复振荡几次，至脐带洗涤液澄清即可。00263、分解脐带1）取脐带置于10CM培养皿中，将其剪成数段，并剔除。
16、中间三根血管；2）位于羊膜与血管之间的白色结缔组织即为华尔通氏胶，用长柄有齿镊将其撕下，放入无菌平皿中；3）用无菌长柄手术剪，在离心管中将华尔通氏胶剪切成1MM3左右的组织匀浆块，剪切时间1520MIN；4加入与组织匀浆块等体积的脐带分解液（预热到37），置于恒温振荡培养箱，37，200RPM，消化6090MIN（每20MIN取出轻轻摇匀后放回去），至脐带组织匀浆块呈靡状即可。00274、收集细胞将酶消化后的组织匀浆按照体积比16，加入6倍体积的细胞洗涤液，通过无菌200目滤网过滤除去残留物，吸取1ML悬液计数细胞，为51107个,其余液体400G离心8MIN，弃上清，获得下层细胞。说明书CN。
17、104232572A4/7页600285、细胞种植根据细胞计数，按照10106个ML的密度加入细胞培养液50ML，接种3个T175培养瓶，置于二氧化碳培养箱，培养条件3705，二氧化碳体积分数为（502），每隔3D换液一次。00296、细胞传代45D左右，原代培养细胞达7080融合时，吸弃旧细胞培养液，加细胞洗涤液，静置1MIN，吸弃细胞洗涤液，加入细胞消化液，消化时间为1525MIN，然后加入细胞培养液23ML中止消化，反复吹打瓶底至细胞大部分脱落，移入50ML离心管中，细胞计数，为15108个，400G离心8MIN，弃上清，获得15108个P0代脐带间充质干细胞。按照50105个/ML加入。
18、细胞培养液，接种到15个T175培养瓶，放入二氧化碳培养箱内培养，计为P1代。待3D左右，P1代细胞达8090融合时，同上操作，收获细胞，计数获得78108个P1代脐带间充质干细胞，同上继续传代（每34D可传代一次），直至收获P3代，经细胞计数为211010个脐带间充质干细胞。00307、细胞冻存将上述获得P3代细胞悬液，400G离心8MIN，弃上清，缓慢加入细胞冻存液，轻轻混匀，然后在冻存管上标明细胞名称、代数及冻存日期；放入冻存盒，80冰箱过夜，次日转移到液氮长期保持，待使用时复苏即可。0031可以看出，用本发明的试剂盒，在较短时间内（2周），由少量脐带组织（长5CM），获得大量的脐带间充。
19、质干细胞（211010），表明本发明的试剂盒可以在较短时间内获得大量脐带间充质干细胞。0032实施例二用于制备脐带间充质干细胞的试剂盒的制备及应用一、用于制备脐带间充质干细胞的试剂盒的制备1、溶液配置本发明的用于制备脐带间充质干细胞的试剂盒包括以下试剂（1）脐带保存液配置方法青霉素100MG、链霉素100MG、两性霉素25MG，溶于1000MLDMEM/F12培养基022UM过滤除菌分装即可。0033（2）脐带洗涤液配置方法青霉素100MG、链霉素100MG、两性霉素25MG，溶于1000ML生理盐水022UM过滤除菌分装即可。0034（3）脐带分解液配置方法胶原酶2G、脱氧核糖核酸酶02G溶。
20、于1000MLDMEM/F12培养基中，022UM滤器过滤除菌即可。0035（4）细胞洗涤液配置方法PBS，配方为NACL850G、NA2HPO412H2O358G、NAH2PO42H2O039G，加双蒸水至1000ML，调整PH至7274之间，高压灭菌即可。0036（5）细胞培养液配置方法无血清基础培养基450ML及其添加物50ML无菌混匀即可。0037（6）细胞消化液配置方法TRYPSIN125MG，EDTA2NA9864MG溶于上述配好的细胞洗涤液即PBS100ML中，混匀，022UM滤器过滤除菌即可。0038（7）细胞冻存液配置方法10MLDMSO缓慢加入到90ML上述配好的细胞培养液。
21、即间充质干细胞无血清生长培养基中，轻轻混匀即可。00392、各组分的分装试剂盒的规格为1次/盒，每盒中各组分的量为脐带保存液1瓶（50ML/瓶），脐带洗涤液1瓶（50ML/瓶），脐带分解液1瓶（50ML/瓶），细胞洗涤液5瓶（1000ML/瓶），细胞培养液10瓶（1000ML/瓶），细胞消化液2瓶（1000ML/瓶），细胞冻存液2瓶（1000ML/瓶）说明书CN104232572A5/7页7按照上述试剂量对试剂盒中各组分进行分装，包装得到用于制备脐带间充质干细胞的试剂盒。试剂盒20保存，有效期2年，使用之前4冰箱内或者37水浴解冻，解冻之后4保存，一个月内用完。0040二、脐带间充质干细胞的制。
22、备用步骤一的试剂盒，参考实施例一中方法制备脐带间充质干细胞，并用相同的方法对获得的间充质干细胞进行计数，结果5CM脐带，在2周内扩增得到281010个脐带间充质干细胞，表明本发明的试剂盒可以在较短时间内获得大量脐带间充质干细胞。0041实施例三用于制备脐带间充质干细胞的试剂盒的制备及应用一、用于制备脐带间充质干细胞的试剂盒的制备1、溶液配置本发明的用于制备脐带间充质干细胞的试剂盒包括以下试剂（1）脐带保存液配置方法青霉素150MG、链霉素150MG、两性霉素25MG，溶于1000MLDMEM培养基022UM过滤除菌分装即可。0042（2）脐带洗涤液配置方法青霉素150MG、链霉素150MG、两。
23、性霉素25MG，溶于1000ML生理盐水022UM过滤除菌即可。0043（3）脐带分解液配置方法胶原酶2G、脱氧核糖核酸酶02G溶于1000MLDMEM培养基中，022UM滤器过滤除菌即可。0044（4）细胞洗涤液配置方法PBS，配方为NACL850G、NA2HPO412H2O358G、NAH2PO42H2O039G，加双蒸水至1000ML，调整PH至7274之间，高压灭菌即可。0045（5）细胞培养液配置方法无血清基础培养基450ML及其添加物50ML无菌混匀即可。0046（6）细胞消化液配置方法TRYPSIN025G，EDTA2NA19728MG溶于上述配好的细胞洗涤液即PBS100ML中。
24、，混匀，022UM滤器过滤除菌即可。0047（7）细胞冻存液配置方法15MLDMSO缓慢加入到85ML上述配好的细胞培养液即间充质干细胞无血清生长培养基中，轻轻混匀即可。00482、各组分的分装试剂盒的规格为1次/盒，每盒中各组分的量为脐带保存液1瓶（50ML/瓶），脐带洗涤液1瓶（50ML/瓶），脐带分解液1瓶（50ML/瓶），细胞洗涤液5瓶（1000ML/瓶），细胞培养液10瓶（1000ML/瓶），细胞消化液2瓶（1000ML/瓶），细胞冻存液2瓶（1000ML/瓶）按照上述试剂量对试剂盒中各组分进行分装，包装得到用于制备脐带间充质干细胞的试剂盒。试剂盒20保存，有效期2年，使用之前4冰箱。
25、内或者37水浴解冻，解冻之后4保存，一个月内用完。0049二、脐带间充质干细胞的制备用步骤一的试剂盒，参考实施例一中方法制备脐带间充质干细胞，并用相同的方法对获得的间充质干细胞进行计数，结果5CM脐带，在2周内扩增得到221010个脐带间充质干细胞，表明本发明的试剂盒可以在较短时间内获得大量脐带间充质干细胞。0050实施例四用于制备脐带间充质干细胞的试剂盒的制备及应用一、用于制备脐带间充质干细胞的试剂盒的制备1、溶液配置说明书CN104232572A6/7页8本发明的用于制备脐带间充质干细胞的试剂盒包括以下试剂（1）脐带保存液配置方法青霉素200MG、链霉素200MG、两性霉素5MG，溶于10。
26、00MLRPMI1640培养基中022UM过滤除菌分装即可。0051（2）脐带洗涤液配置方法青霉素200MG、链霉素200MG、两性霉素5MG，溶于1000ML生理盐水022UM过滤除菌分装即可。0052（3）脐带分解液配置方法胶原酶15G、脱氧核糖核酸酶015G溶于1000MLRPMI1640培养基中，022UM滤器过滤除菌即可。0053（4）细胞洗涤液配置方法HBSS，配方NACL80G、KCL04G、葡萄糖1G、KH2PO460MG、NA2HPO4475MG、NAHCO3035G，加双蒸水至1000ML，调节PH至中性7274之间，高压灭菌即可。0054（5）细胞培养液配置方法无血清基础。
27、培养基450ML及其添加物50ML无菌混匀即可。0055（6）细胞消化液配置方法TRYPSIN025G，EDTA2NA19728MG溶于上述配好的细胞洗涤液即HBSS100ML中，混匀，022UM滤器过滤除菌即可。0056（7）细胞冻存液配置方法10MLDMSO缓慢加入到90ML上述配好的细胞培养液即间充质干细胞无血清生长培养基中，轻轻混匀即可。00572、各组分的分装试剂盒的规格为1次/盒，每盒中各组分的量为脐带保存液1瓶（50ML/瓶），脐带洗涤液1瓶（50ML/瓶），脐带分解液1瓶（50ML/瓶），细胞洗涤液5瓶（1000ML/瓶），细胞培养液10瓶（1000ML/瓶），细胞消化液2瓶（。
28、1000ML/瓶），细胞冻存液2瓶（1000ML/瓶）按照上述试剂量对试剂盒中各组分进行分装，包装得到用于制备脐带间充质干细胞的试剂盒。试剂盒20保存，有效期2年，使用之前4冰箱内或者37水浴解冻，解冻之后4保存，一个月内用完。0058二、脐带间充质干细胞的制备用步骤一的试剂盒，参考实施例一中方法制备脐带间充质干细胞，并用相同的方法对获得的间充质干细胞进行计数，结果5CM脐带，在2周内扩增得到291010个脐带间充质干细胞，表明本发明的试剂盒可以在较短时间内获得大量脐带间充质干细胞。0059实施例五用于制备脐带间充质干细胞的试剂盒的制备及应用一、用于制备脐带间充质干细胞的试剂盒的制备1、溶液配。
29、置本发明的用于制备脐带间充质干细胞的试剂盒包括以下试剂（1）脐带保存液配置方法青霉素200MG、链霉素200MG、两性霉素5MG，溶于1000MLDMEM培养基中，022UM过滤除菌，分装即可。0060（2）脐带洗涤液配置方法青霉素200MG、链霉素200MG、两性霉素5MG，溶于1000ML生理盐水中，022UM过滤除菌，分装即可。0061（3）脐带分解液配置方法胶原酶15G、脱氧核糖核酸酶015G溶于1000MLDMEM培养基中，022UM滤器过滤除菌即可。0062（4）细胞洗涤液配置方法DHANKS，配方KCL040G、KH2PO4006G、NACL800G、NAHCO3035G、NA2。
30、HPO412H2O012G，加三蒸水至1000ML，调整PH至7274之间，高压说明书CN104232572A7/7页9灭菌即可。0063（5）细胞培养液配置方法无血清基础培养基450ML及其添加物50ML无菌混匀即可。0064（6）细胞消化液配置方法TRYPSIN025G、EDTA2NA19728MG溶于上述配好的细胞洗涤液即DHANKS100ML中，混匀，022UM滤器过滤除菌即可。0065（7）细胞冻存液配置方法10MLDMSO缓慢加入到90ML上述配好的细胞培养液即间充质干细胞无血清生长培养基中，轻轻混匀即可。00662、各组分的分装试剂盒的规格为1次/盒，每盒中各组分的量为脐带保存液。
31、1瓶（50ML/瓶），脐带洗涤液1瓶（50ML/瓶），脐带分解液1瓶（50ML/瓶），细胞洗涤液5瓶（1000ML/瓶），细胞培养液10瓶（1000ML/瓶），细胞消化液2瓶（1000ML/瓶），细胞冻存液2瓶（1000ML/瓶）按照上述试剂量对试剂盒中各组分进行分装，包装得到用于制备脐带间充质干细胞的试剂盒。试剂盒20保存，有效期2年，使用之前4冰箱内或者37水浴解冻，解冻之后4保存，一个月内用完。0067二、脐带间充质干细胞的制备用步骤一的试剂盒，参考实施例一中方法制备脐带间充质干细胞，并用相同的方法对获得的间充质干细胞进行计数，结果5CM脐带，在2周内扩增得到241010个脐带间充质干细胞，表明本发明的试剂盒可以在较短时间内获得大量脐带间充质干细胞。说明书CN104232572A。