一株高产精氨酸脱亚胺酶的蜡样芽孢杆菌及其应用.pdf

本发明公开了一株高产精氨酸脱亚胺酶的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)93-11，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2015047。本发明还公开所述蜡样芽孢杆菌在生产L-瓜氨酸中的应用以及一种生产L-瓜氨酸的方法。采用本发明的蜡样芽孢杆菌能将98％以上的精氨酸转化为L-瓜氨酸，而且可以制得纯度达99％以上的L-瓜氨酸。本发明还具有生产成本低，周期短等特点。

1.  一株高产精氨酸脱亚胺酶的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)93-11，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2015047。

2.  权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌在生产L-瓜氨酸中的应用。

3.  一种生产L-瓜氨酸的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)将保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2015047的蜡样芽孢杆菌93-11经种子培养和发酵培养后，得到含精氨酸脱亚胺酶的蜡样芽孢杆菌静息细胞；
2)将步骤1)得到的蜡样芽孢杆菌静息细胞加入到精氨酸水溶液中，调节混合溶液pH为6-7，在37-50℃条件下反应，然后升温至60-100℃使蛋白凝结；
3)从混合溶液中分离纯化L-瓜氨酸。

4.  如权利要求3所述的生产L-瓜氨酸的方法，其特征在于：反应前的混合溶液中蜡样芽孢杆菌静息细胞的重量含量为0.5-1％，精氨酸的重量含量为10-30％。

5.  如权利要求3所述的生产L-瓜氨酸的方法，其特征在于：所述种子培养包括一级种子培养和二级种子培养，
所述一级种子培养的培养基是：0.1-10％蛋白胨，0.1-5％酵母粉，0.1-10％氯化钠，0.1-10％甘油，余量为去离子水，pH为6-7；
所述二级种子培养的培养基是：0.1-5％甘油，0.1-5％玉米浆，0.1-5％精氨酸，余量为去离子水，pH为6-7。

6.  如权利要求3所述的生产L-瓜氨酸的方法，其特征在于：所述发酵培养的培养基是：0.1-5％甘油、0.1-5％玉米浆、0.1-5％精氨酸，0.1-5％无机盐，余量为去离子水，pH为6-7。

7.  如权利要求3所述的生产L-瓜氨酸的方法，其特征在于：所述分离纯化L-瓜氨酸的方法是，包括以下步骤：
1)调节混合溶液pH至3-7，加入活性炭脱色，过滤；将滤液浓缩至波 美度为20-30，冷却结晶，离心收集结晶，烘干后得一次L-瓜氨酸粗品，离心液用于继续分离L-瓜氨酸；
2)调节离心液pH至1-5，上离子交换树脂柱交换，用2-5M氨水洗脱，收集洗脱液；
3)将洗脱液浓缩至波美度为20-30，冷却结晶，离心收集结晶，烘干后得二次L-瓜氨酸粗品，离心液按上述方法再次调节pH至1-5，上离子交换树脂柱交换，用2-5M氨水洗脱，收集洗脱液，浓缩，冷却结晶，离心收集结晶，烘干得到三次L-瓜氨酸粗品；
4)将一、二、三次L-瓜氨酸粗品混合后加10-100倍重量的纯水溶解，再次加入活性炭脱色，将滤液浓缩至波美度为20-30，冷却结晶，离心收集结晶，烘干得到L-瓜氨酸精制纯品。

8.  如权利要求7所述的生产L-瓜氨酸的方法，其特征在于：所述离子交换树脂柱是D001阳离子交换树脂柱。

9.  如权利要求3所述的生产L-瓜氨酸的方法，其特征在于：步骤2)中所述反应的时间是10-50h。

一株高产精氨酸脱亚胺酶的蜡样芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株能高产精氨酸脱亚胺酶的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，本发明还涉及所述蜡样芽孢杆菌在生产L-瓜氨酸中的应用以及一种生产L-瓜氨酸的方法。
背景技术
L-瓜氨酸具有松弛血管，治疗性功能障碍，提高脑力等功能，近年来在食品、药物等领域越来越来受到重视，具有广泛的开发应用前景。目前L-瓜氨酸的生产方法主要有植物提取法，化学合成法、发酵法及酶转化法。其中植物提取法含量低且提取成本高，不适合大规模生产；化学有机合成法环境污染大；发酵法产物浓度较低。相比之下，酶转化法具有专一性强，产物浓度高，生产周期短，成本低等特点。
CN102703339A公开了一种高产精氨酸脱亚胺酶菌株及生产L-瓜氨酸的方法，所述菌株为粪链球菌，该菌株产L-瓜氨酸量达到98g/L。
CN102433290A公开了一株产瓜氨酸的菌株及用该菌株生物合成瓜氨酸的方法，所述菌株是从土壤中筛选而来的粪肠球菌，发酵生产瓜氨酸，或通过发酵获得具有精氨酸脱亚氨酶酶活的静息细胞菌体并添加到浓度为5-20％的精氨酸溶液中转化合成瓜氨酸，转化率可达80％以上。
CN102220390A公开了一种精氨酸发酵联合酶转化制备瓜氨酸的方法，它采用恶臭假单胞菌转化精氨酸，能提高产品收率和降低生产成本。
CN102433289A公开了一株产瓜氨酸的菌株及用该菌株生物合成瓜氨酸的方法，所述菌株为库特氏菌属，以此菌为发酵菌株，通过发酵制备瓜氨酸或用发酵生产的含有精氨酸酶的菌体添加到浓度为5-20％的精氨酸溶液中转化合成瓜氨酸，转化率可达80％以上。
可见，目前主要是利用粪肠球菌、恶臭假单胞菌、变形假单胞菌、库特氏菌属等发酵得到精氨酸脱亚胺酶的静息细胞生物合成瓜氨酸，尚没有利用蜡样芽孢杆菌的报导，且目前水平只能将80％以上的精氨酸底物转化成瓜氨酸，酶活能力仍然没有达到理想的工业水平。
发明内容
本发明的目的是提供一株高产精氨酸脱亚胺酶的蜡样芽孢杆菌和利用该菌株生产L-瓜氨酸的方法，以进一步提高精氨酸的转化率，降低生产成本。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：
本发明以从土壤中获得的蜡样芽孢杆菌为出发菌株，通过N+离子束诱变进行育种，筛选得到一株高产精氨酸脱亚胺酶的蜡样芽孢杆菌突变株93-11，该菌株已于2015年01月20日保藏于位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M2015047，分类命名为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)93-11。
将该菌株培养、发酵后，得到含精氨酸脱亚胺酶的蜡样芽孢杆菌静息细胞，然后转化精氨酸生产L-瓜氨酸，具体包括以下步骤：
1)将保藏编号为CCTCC NO：M 2015047的蜡样芽孢杆菌93-11经种子培养和发酵培养后，得到含精氨酸脱亚胺酶的蜡样芽孢杆菌静息细胞；
2)将步骤1)得到的蜡样芽孢杆菌静息细胞加入到精氨酸水溶液中，调节混合溶液pH为6-7，在温度为37-50℃条件下反应，然后升温至60-100℃使蛋白凝结；
3)从混合溶液中分离纯化L-瓜氨酸。
优选地，反应前的混合溶液中蜡样芽孢杆菌静息细胞的重量含量为0.5-1％，精氨酸的重量含量为10-30％。在该条件下，精氨酸的转化率最高，转化时间最短。
优选地，所述种子培养包括一级种子培养和二级种子培养，
所述一级种子培养的培养基是：0.1-10％蛋白胨，0.1-5％酵母粉，0.1-10％ 氯化钠，0.1-10％甘油，余量为去离子水，pH为6-7；
所述二级种子培养的培养基是：0.1-5％甘油，0.1-5％玉米浆，0.1-5％精氨酸，余量为去离子水，pH为6-7。
采用上述种子培养基，菌株获得最适宜的营养，能快速进入对数生长期，培养时间最短。
优选地，所述发酵培养的培养基是：0.1-5％甘油，0.1-5％玉米浆，0.1-5％精氨酸，0.1-5％无机盐，余量为去离子水，pH为6-7。进一步优选地，所述无机盐为磷酸二氢钾和硫酸镁中的一种或两种组合。
采用上述的发酵培养基，(1)菌体能被诱导大量表达精氨酸脱亚胺酶，收获的静息细胞精氨酸脱亚胺酶活性最高；(2)菌体能获得最适宜的营养，生长旺盛，发酵时间最短且收获量最高。
本发明各培养基中各成分的含量均为重量含量，如0.1-5％甘油，指的是100g培养基中含有甘油0.1-5g。
优选地，所述分离纯化L-瓜氨酸的方法是，包括以下步骤：
1)调节混合溶液pH至3-7，加入活性炭脱色，过滤；将滤液浓缩至波美度为20-30，冷却结晶，离心收集结晶，烘干后得一次L-瓜氨酸粗品，离心液用于继续分离L-瓜氨酸；
2)调节离心液pH至1-5，上离子交换树脂柱交换，用2-5M氨水洗脱，收集洗脱液；
3)将洗脱液浓缩至波美度为20-30，冷却结晶，离心收集结晶，烘干后得二次L-瓜氨酸粗品，离心液按上述方法再次调节pH至1-5，上离子交换树脂柱交换，用2-5M氨水洗脱，收集洗脱液，浓缩，冷却结晶，离心收集结晶，烘干得到三次L-瓜氨酸粗品；
4)将一、二、三次L-瓜氨酸粗品混合后加10-100倍重量的纯水溶解，再次加入活性炭脱色，将滤液浓缩至波美度为20-30，冷却结晶，离心收集结晶，烘干得到L-瓜氨酸精制纯品。
采用上述的分离纯化方法，可以从混合溶液得到纯度达99％以上的L-瓜氨酸，且从混合溶液得到的L-瓜氨酸收率达85％以上。
进一步优选地，所述离子交换树脂柱是D001阳离子交换树脂柱。
优选地，步骤2)中所述反应的时间是10-50h。
本发明的有益效果是：(1)种子培养和发酵培养时间短：其中通过发酵培养获得蜡样芽孢杆菌静息细胞的发酵周期为5-16h，较普通发酵培养时间缩短20％；(2)转化率高：采用本发明的蜡样芽孢杆菌能将98％以上的精氨酸转化为L-瓜氨酸，而现有技术中只能将80％以上的精氨酸转化成L-瓜氨酸；(3)转化时间短，产物浓度高：本发明获得的蜡样芽孢杆菌静息细胞能在10-50小时内使精氨酸转化成L-瓜氨酸，反应后的混合溶液中L-瓜氨酸的浓度可以达到10-29％；(4)产品收率、纯度高：本发明可以制得纯度达99％以上的L-瓜氨酸，且从混合溶液得到的L-瓜氨酸收率达85％以上；(5)分离纯化成本低，周期短。
附图说明
图1是本发明从混合溶液中分离纯化L-瓜氨酸的工艺流程图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的技术方案进行详细地说明。
实施例1 突变菌株的获得
1.制备出发型菌株
以土壤中得到的一株蜡样芽孢杆菌作为出发型菌株，接入含有100ml的培养基中，30-37℃、100-200r/min，培养5-30h，然后，取菌液1ml，加入到9ml无菌水中，混匀，稀释浓度为10倍，依此方法继续稀释10^-2，10^-3和10^-4倍，菌液备用。
所述的培养基组成是：0.1-10％蛋白胨，0.1-5％酵母粉，0.1-10％氯化钠，余量为去离子水，pH为6.0-7.5。
2.N离子束诱变 
取步骤1制备的菌液0.5ml涂于无菌培养皿中并吹干，采用TITAN离子束注入机对菌体进行N离子束注入，能量为30keV，注入剂量为1-5× 10¹⁵ion/cm²，注入后再用5ml无菌水清洗培养皿上的菌体，稀释10³倍后取50μl涂布固体培养基平板，在温度30-37℃恒温培养箱中培养5-30h。
所述的固体培养基的组成是：0.1-10％蛋白胨，0.1-5％酵母粉，0.1-10％氯化钠，0.1-30％琼脂，余量为去离子水，pH为6.0-7.5。
3.高产精氨酸脱亚胺酶突变菌株的筛选
从平板上挑选200-1000株诱变后的菌株接种至斜面培养基上培养5-30h。挑选一环斜面培养基上的菌种，接入50-200ml种子培养基中，30-37℃、100-200r/min，培养5-30h。将种子液按照1-10％的比例接种至100-300ml发酵培养基中，30-37℃、100-200r/min，培养后取发酵液离心，得到含有精氨酸脱亚胺酶的静息细胞，发酵培养时长5-16h，较出发菌株发酵时间缩短20％。
将静息细胞加入到精氨酸溶液中，调PH5-7，在30-37℃下进行转化，合成L-瓜氨酸。将转化后的反应液分别经灭活、稀释，通过安捷伦液相色谱仪，分别对精氨酸、L-瓜氨酸进行定量。选出一株L-瓜氨酸产量最高的突变株93-11，发酵的静息细胞能使98％以上的精氨酸转化为L-瓜氨酸，而出发菌株只能使30％左右的精氨酸转化为L-瓜氨酸。
将该菌株于2015年01月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2015047。
所述的斜面培养基的组成是：0.1-10％蛋白胨，0.1-5％酵母粉，0.1-10％氯化钠，0.1-30％琼脂，余量为去离子水，pH为6.0-7.5。
所述的种子培养基组成是：0.1-10％蛋白胨，0.1-5％酵母粉，0.1-10％氯化钠，0.1-10％甘油，余量为去离子水，PH为6-7。
所述的发酵培养基组成是：0.1-10％蛋白胨，0.1-5％酵母粉，0.1-10％氯化钠，0.1-10％甘油，0.1-5％精氨酸，余量为去离子水，PH为6-7。
所述的液相色谱分析条件如下：仪器型号：agillent 1100，色谱柱：(250*4.6)mm 5um ODS HYPERSIL，柱温：40℃。
实施例2 L-瓜氨酸的生产方法
1.菌株的培养 
包括种子培养和发酵培养，具体步骤如下：
(1)一级种子培养:
一级种子培养基：1％蛋白胨，0.5％酵母粉，1％氯化钠，1％甘油，余量为去离子水，pH为7。
培养方法：取一支甘油管保存的菌种，室温放置至融化，吸取500ul菌液至一级种子摇瓶中，200r/min，37℃培养15h。
(2)二级种子培养:
二级种子培养基：1％甘油，4％玉米浆，0.5％精氨酸，余量为去离子水，pH为7。
培养方法：按5％的体积比接种一级种子至30L二级种子罐中，200r/min，培养15h。
(3)发酵培养
2％甘油，2％玉米浆，2％精氨酸，0.5％磷酸二氢钾，0.5％硫酸镁，余量为去离子水，pH为7。
培养方法：按5％的体积比接种二级种子至400L发酵罐中，37℃、转速500r/m的条件下在发酵培养基中发酵5h。
(4)发酵后处理 
发酵完毕后，得到含1.2％蜡样芽孢杆菌静息细胞的发酵培养液，经冷冻离心机分离得到蜡样芽孢杆菌静息细胞。
2.精氨酸的转化 
将蜡样芽孢杆菌静息细胞加入到精氨酸水溶液中，使混合溶液中蜡样芽孢杆菌静息细胞的重量含量为0.8％，精氨酸的重量含量为20％，在pH为7，45℃条件下反应16h，最后升温至90℃凝结蛋白。
经检测和计算，98.6％的精氨酸转化为L-瓜氨酸，反应后的混合溶液中L-瓜氨酸的含量为19.8％。
3.分离纯化
1)用6M盐酸调节混合溶液pH至5，加入活性炭脱色，40℃保温20min，过滤；将滤液浓缩至波美度为25，然后边搅拌边冷却至0℃以下，使析出 结晶，离心收集结晶，烘干后得一次L-瓜氨酸粗品，离心液用于继续分离L-瓜氨酸；
2)用6M盐酸调节离心液pH至3，以每小时90升的流速与D001阳离子交换树脂柱交换，用3M氨水洗脱，收集洗脱液；
3)将洗脱液浓缩至波美度为25，然后边搅拌边冷却至0℃以下，使析出结晶，离心收集结晶，烘干后得二次L-瓜氨酸粗品，离心液按上述方法再次调节pH至3，上D001阳离子交换树脂柱交换，洗脱，浓缩，冷却结晶，离心收集结晶，烘干得到三次L-瓜氨酸粗品；
4)将一、二、三次L-瓜氨酸粗品加30倍重量的纯化水溶解，再次加入活性炭脱色，过滤，滤液浓缩后，边搅拌边冷却至0℃以下，使析出结晶，离心收集晶体，烘干得到L-瓜氨酸精制纯品。
制得的L-瓜氨酸纯度为99.7％，从混合溶液得到的L-瓜氨酸收率达88.5％。
实施例3 L-瓜氨酸的生产方法
1.菌株的培养 
(1)一级种子培养:
一级种子培养基：0.1％蛋白胨，5％酵母粉，0.1％氯化钠，0.1％甘油，余量为去离子水，pH为6。
培养方法：取一支甘油管保存的菌种，室温放置至融化，吸取100ul菌液至一级种子摇瓶中，100r/min，30℃培养16h。
(2)二级种子培养:
二级种子培养基：5％甘油，5％玉米浆，5％精氨酸，余量为去离子水，pH为6。
培养方法：按1％的体积比接种一级种子至二级种子罐中，100r/min，培养16h。
(3)发酵培养
0.1％甘油，5％玉米浆，0.1％精氨酸，0.1％硫酸镁，余量为去离子水，pH为6。
培养方法：按10％的体积比接种二级种子至400L发酵罐中，30℃、转速100r/m的条件下在发酵培养基中发酵12h。
(4)发酵后处理 
发酵完毕后，得到含3％蜡样芽孢杆菌静息细胞的发酵培养液，经冷冻离心机分离得到蜡样芽孢杆菌静息细胞。
2.精氨酸的转化 
将蜡样芽孢杆菌静息细胞加入到精氨酸水溶液中，使混合溶液中蜡样芽孢杆菌静息细胞的重量含量为0.5％，精氨酸的重量含量为10％，在pH为6，37℃条件下反应10h，最后升温至60℃凝结蛋白。
经检测和计算，98.1％的精氨酸转化为L-瓜氨酸，反应后的混合溶液中L-瓜氨酸的含量为9.87％。
3.分离纯化
1)调节混合溶液pH至3，加入活性炭脱色，20℃保温30min，过滤；将滤液浓缩至波美度为20，冷却结晶，离心收集结晶，烘干后得一次L-瓜氨酸粗品，离心液用于继续分离L-瓜氨酸；
2)调节离心液pH至1，上D001阳离子交换树脂柱交换，用2M氨水洗脱，收集洗脱液；
3)将洗脱液浓缩至波美度为20，冷却结晶，离心收集结晶，烘干后得二次L-瓜氨酸粗品，离心液按上述方法再次调节pH至1，上D001阳离子交换树脂柱交换，洗脱，浓缩，冷却结晶，离心收集结晶，烘干得到三次L-瓜氨酸粗品；
4)将一、二、三次L-瓜氨酸粗品加10倍重量的纯化水溶解，再次加入活性炭脱色，过滤，滤液浓缩后，冷却结晶，离心收集结晶，烘干得到L-瓜氨酸精制纯品。
制得的L-瓜氨酸纯度为99.1％，从混合溶液得到的L-瓜氨酸收率达85.2％。
实施例4 L-瓜氨酸的生产方法
1.菌株的培养 
(1)一级种子培养:
一级种子培养基：10％蛋白胨，0.1％酵母粉，10％氯化钠，10％甘油，余量为去离子水，pH为7。
培养方法：取一支甘油管保存的菌种，室温放置至融化，吸取1000ul菌液至一级种子摇瓶中，200r/min，37℃培养5h。
(2)二级种子培养:
二级种子培养基：0.1％甘油，0.1％玉米浆，0.1％精氨酸，余量为去离子水，pH为7。
培养方法：按10％的体积比接种一级种子至二级种子罐中，200r/min，培养20h。
(3)发酵培养
5％甘油，0.1％玉米浆，5％精氨酸，5％磷酸二氢钾，余量为去离子水，pH为7。
培养方法：按2％的体积比接种二级种子至发酵罐中，37℃、转速100r/m的条件下在发酵培养基中发酵16h。
(4)发酵后处理 
发酵完毕后，得到含2.2％蜡样芽孢杆菌静息细胞的发酵培养液，经冷冻离心机分离得到蜡样芽孢杆菌静息细胞。
2.精氨酸的转化 
将蜡样芽孢杆菌静息细胞加入到精氨酸水溶液中，使混合溶液中蜡样芽孢杆菌静息细胞的重量含量为1％，精氨酸的重量含量为30％，在pH为7，50℃条件下反应50h，最后升温至60℃凝结蛋白。
经检测和计算，98.3％的精氨酸转化为L-瓜氨酸，反应后的混合溶液中L-瓜氨酸的含量为29.66％。
3.分离纯化
1)调节混合溶液pH至7，加入活性炭脱色，过滤；将滤液浓缩至波美度为30，冷却结晶，离心收集结晶，烘干后得一次L-瓜氨酸粗品，离心液用于继续分离L-瓜氨酸；
2)调节离心液pH至5，上D001阳离子交换树脂柱交换，用5M氨水洗脱，收集洗脱液；
3)将洗脱液浓缩至波美度为30，冷却结晶，离心收集结晶，烘干后得二次L-瓜氨酸粗品，离心液按上述方法再次调节pH至5，上D001阳离子交换柱交换，洗脱，浓缩，冷却结晶，离心收集结晶，烘干得到三次L-瓜氨酸粗品；
4)将一、二、三次L-瓜氨酸粗品加100倍重量的纯化水溶解，再次加入活性炭脱色，过滤，滤液浓缩后，冷却结晶，离心收集晶体，烘干得到L-瓜氨酸精制纯品。
制得的L-瓜氨酸纯度为99.4％，从混合溶液得到的L-瓜氨酸收率达86.8％。